Przygotowanie pojedynczych komór jajeczkowych Drosophila do obrazowania na żywo

Podsumowanie

Komora jajowa Drosophila stanowi doskonały model do badania mechanizmów lokalizacji mRNA. Aby uchwycić dynamiczne zdarzenia leżące u podstaw procesów lokalizacji, wymagane jest szybkie obrazowanie tkanek żywych w wysokiej rozdzielczości. W niniejszym materiale przedstawiamy protokół preparatyki i obrazowania żywych próbek przy minimalnej ingerencji w ich strukturę.

Streszczenie

Obrazowanie żywych komórek jest istotną techniką stosowaną w wielu tkankach Drosophila, które służą jako modele do badania zagadnień takich jak specyfikacja osi, różnicowanie komórkowe i organogeneza ¹. Prawidłowe przygotowanie próbek doświadczalnych jest kluczowym, często pomijanym etapem. Celem przygotowania jest zapewnienie istotności fizjologicznej oraz ustanowienie optymalnych warunków obrazowania. Aby zachować żywotność tkanek, krytyczne jest unikanie odwodnienia, hipoksji, przegrzania lub degradacji medium ².

Komora jajowa Drosophila jest dobrze ugruntowanym systemem do badania zagadnień związanych, lecz nie ograniczonych do, wzorowania ciała, lokalizacji mRNA oraz organizacji cytoszkieletu ^3,4. W przypadku komór jajowych we wczesnych i środkowych stadiach rozwoju, montaż w oleju halowęglowym sprzyja przeżywalności, ponieważ umożliwia swobodną dyfuzję tlenu, zapobiega odwodnieniu i hipoksji oraz posiada doskonałe właściwości optyczne do mikroskopii. Obrazowanie białek fluorescencyjnych jest możliwe dzięki wprowadzeniu transgenów do komory jajowej lub fizycznemu wstrzyknięciu znakowanego RNA, białek lub przeciwciał ^5-7. Na przykład dodanie konstruktów MS2 do genomu zwierząt umożliwia obserwację mRNA w oocycie w czasie rzeczywistym ⁸. Konstrukty te pozwalają na znakowanie mRNA in vivo poprzez wykorzystanie oddziaływania pętli spinki RNA bakteriofaga MS2 z jego białkiem kapsydu ⁹.

W niniejszym materiale przedstawiamy protokół ekstrakcji jajników oraz izolacji pojedynczych ovarioli i komór jajowych u samicy Drosophila. Szczegółowy opis oogenezy u Drosophila można znaleźć w pracy Allana C. Spradlinga (1993, przedruk 2009) ¹⁰.

Protokół

1. Przygotowanie Drosophila do sekcji (zgodnie z metodą E. Gavis, Princeton University)

1. Usunąć osobniki dorosłe z rzadko zasianej butelki i przenieść butelkę do temperatury 25 °C przed rozpoczęciem eksperymentu. Po pojawieniu się nowych osobników dorosłych odczekać dwa dni.
2. Przygotować fiolkę z muchami zawierającą około 10ml stałej pożywki i dodać 0,5-0,7 grama suchych drożdży (patrz tabela), trzymając fiolkę pod kątem 45 stopni. Nie należy pokrywać drożdżami całej powierzchni pożywki.
3. Dodać do drożdży kilka kropel wody, w ilości wystarczającej do ich nawilżenia (Rysunek 1A). Umieścić fiolkę pod kątem 45 stopni i odczekać około 3 minut, aż drożdże wchłoną wodę (Rysunek 1B).

Uwaga: Alternatywnie można przygotować pastę z drożdży w osobnym pojemniku, a następnie przenieść ją do fiolki za pomocą szpatułki.

4. Zanurz muchy w fiolce w narkozie, wstrzykując gaz CO₂. Gdy przestaną się poruszać, przelej nieprzytomne muchy na podkładkę do sortowania pod CO₂ (Rycina 1C).
5. Wyizoluj 10-15 samic i 5 samców pożądanego genotypu pod stereomikroskopem, używając pędzla z cienkim włosiem (Rycina 1D). Samce można łatwo rozpoznać po obecności chwytników, ciemnych wystających struktur w części tylnej ciała.
6. Przenieś wybrane muchy do fiolki z drożdżami (Rycina 1E). Przechowuj w temperaturze 25 °C przez 24-60 godzin. Inkubuj przez krótszy czas, aby uzyskać większy odsetek komór jajowych we wczesnym i średnim stadium, oraz przez dłuższy czas, aby uzyskać komory jajowe w późnym stadium.

2. Disekcja jajnika Drosophila

1. Nanieś małą kroplę oleju halowęglowego na szkiełko podstawowe nr 1,5 o wymiarach 22 x 50 mm (Rysunek 2A). Odstaw przygotowane szkiełko w miejsce, w którym nie będzie przeszkadzać.
2. Uśpij muchy w fiolce z drożdżami, wstrzykując gaz CO₂, a następnie przelej je na podkładkę z CO₂.
3. Za pomocą ostrych pęsety z cienkimi końcówkami chwyć pojedynczą, dobrze odżywioną samicę w przedniej części odwłoka (nie między odwłokiem a klatką piersiową) (Rysunek 2B-C).
4. Przytrzymaj samicę pęsetą i obserwuj ją pod mikroskopem stereoskopowym, mniej więcej 2-3 cm nad przygotowanym szkiełkiem.
5. Trzymając samicę w przedniej części, użyj drugiej pęsety, aby usunąć tkankę z najbardziej tylnej części ciała samicy (Rysunek 2D). Uwaga: tkanka jelita zazwyczaj zostanie wyciągnięta wraz z końcem tylnym. Wytrzyj usuniętą tkankę z pęsety.
6. Nadal trzymając samicę w przedniej części, użyj oczyszczonej pęsety, aby delikatnie ścisnąć lub masować odwłok, przesuwając się od przodu ku tyłowi. Masuj odwłok w ten sam sposób, w jaki wyciska się pastę do zębów z tubki.
7. Z odwłoka zostaną wypchnięte dwie duże, nieprzezroczyste struktury, które przykleją się do końcówki pęsety (Rysunek 2E-F). Są to sparowane jajniki.
8. Dotknij jajnikami kropli oleju halowęglowego na szkiełku poniżej.
9. Powtórz sekcję 1-2 razy, aby uzyskać łącznie 4-6 jajników w oleju na szkiełku (Rysunek 2G).

3. Izolowanie ovarioli

Uwaga: Każdy jajnik zawiera około 16 owarioli, składających się z 6 do 10 komór jajowych na różnych etapach rozwoju, ułożonych jak paciorki na sznurku¹⁰.

Uwaga: Przed wyizolowaniem owarioli należy ustawić źródło światła w mikroskopie operacyjnym tak, aby oświetlenie padało na próbkę pod małym kątem. Zapewni to odpowiedni kontrast próbki i umożliwi wizualizację komór jajowych we wczesnym stadium rozwoju.

1. W oleju oddziel dwa jajniki, usuwając tkankę łączną na końcu tylnym (w przypadku starszych stadiów) za pomocą zamkniętej pęsety (Rycina 3A).
2. Zorientuj pojedynczy jajnik tak, aby stadia najstarsze znajdowały się po lewej stronie, a stadium najmłodsze po prawej. Komory jajeczne w stadium młodym są przezroczyste i tworzą bardziej spiczasty koniec jajnika.
3. Trzymając pęsetę w dominującej dłoni, delikatnie chwyć tylną część jajnika, najlepiej za pozostałości tkanki łącznej. Przytrzymując jajnik pęsetą, użyj sondy sekcyjnej (lub igły wolframowej), aby wyodrębnić poszczególne owariolany (Rycina 3B-D).

Uwaga: Poszczególne owariole będą pękać pomiędzy młodymi stadiami (od germarium do stadium 10), ponieważ starsze stadia są zbyt duże, aby można było je oddzielić od pełnego jajnika.

Uwaga: Przebicie oocyty w późnym stadium rozwoju za pomocą sondy sekcyjnej spowoduje wycieknięcie cytoplazmy do oleju i znacznie utrudni wyodrębnienie poszczególnych owarioli. W przypadku przebicia oocyty w późnym stadium należy przejść do pracy z nowym jajnikiem.

4. Po oddzieleniu owarioli od jajnika, należy za pomocą zgłębnika sekcyjnego przesunąć go na środek kropli oleju i ustawić w orientacji wymaganej do przeprowadzenia eksperymentu. Uwaga: Ovariole w oleju opadną i przywrą do szkła.
5. Powtórz ten proces (3.3-3.4) aż do uzyskania 15-25 pojedynczych owarioli. Uwaga: Może to wymagać sekcji wielu jajników. Cały proces powinien zająć mniej niż 15 minut.

Uwaga: Zaleca się wypreparowanie jednego jajnika z kilku much zamiast obu jajników z mniejszej liczby osobników, aby zwiększyć liczbę n much biorących udział w eksperymencie.

Uwaga: Nieostrożne obchodzenie się z owariolą spowoduje uszkodzenie oocytów i może doprowadzić do powstania artefaktów w eksperymencie.

Uwaga: Oocyty zaczną wykazywać zmiany fenotypowe wywołane stresem 40 minut po wyjęciu z jajnika (porównaj rysunek 7E z F).

6. Gdy ovaria będą w odpowiedniej orientacji (Rysunek 3E), należy za pomocą sondy do sekcji i zamkniętej pęsety usunąć nadmiar tkanki jajnika z oleju. Materiał ten można zebrać z pęsety, wycierając ją w ręcznik papierowy.

4. Izolowanie poszczególnych komór jajowych w stadium późnym (zgodnie z metodą E. Gavis, Princeton University)

1. Trzymając pęsetę w dominującej ręce, uchwyć tylną część wyizolowanego jajnika, najlepiej za pozostałości tkanki łącznej. Przytrzymując jajnik pęsetą, wprowadź sondę sekcyjną do tylnego końca jajnika w pobliżu pęsety (Rycina 4A). Unikaj przebijania komór jajowych, wprowadzając sondę pomiędzy komory jajowe na późnym etapie rozwoju.
2. Przeciągnij igłę sekcyjną przez jajnik, aż wyjdzie ona przy komorach jajowych na wczesnym etapie rozwoju (Rycina 4B). Prawidłowe wykonanie tego kroku spowoduje usunięcie tkanki łącznej utrzymującej owariole i komory jajowe na późnym etapie rozwoju na miejscu.
3. Powtarzaj krok 4.2, aż owariole zostaną rozłożone na szkiełku nakrywkowym. Uwaga: Krok ten jest zakończony, gdy komory jajowe nie będą już ułożone jedna na drugiej.
4. Za pomocą sondy sekcyjnej rozdziel późne oocyty, aby umożliwić łatwe obrazowanie (Rycina 4C).

Uwaga: Przebicie oocyta podczas sekcji komór jajowych w późnej fazie nie jest tak krytyczne, jak w przypadku sekcji poszczególnych owarioli w młodszych stadiach.

Uwaga: W przypadku komór jajowych w stadium 14 należy użyć pincety do uchwycenia wyrostków grzbietowych w celu ich orientacji.

5. Przygotowanie do iniekcji

Uwaga: W przypadku iniekcji oocytów w średniej fazie rozwoju, należy zorientować owariole prostopadle do długiej osi szkiełka podstawowego.

1. Włączyć mikroskop obrazujący [w naszym przypadku DeltaVision Core firmy Applied Precision] i załadować odpowiednie ustawienia obrazowania (Rycina 5A-B).
2. Włączyć aparat do iniekcji (Rycina 5C).
3. Napełnić igłę iniekcyjną za pomocą końcówki ładującej (Rycina 5D-E). Roztwory przeznaczone do iniekcji należy krótko odwirować z dużą prędkością, aby uniknąć powstania osadów, które mogłyby zablokować igłę.
4. Przymocować napełnioną igłę iniekcyjną do injektora. Należy uważać, aby nie złamać igły (Rycina 5F).
5. W celu ułatwienia udrażniania igieł, umieścić mały kawałek szkła o wymiarach 2x10 mm z pękniętego lub złamanego szkiełka podstawowego po jednej stronie kropli oleju zawierającej owariole. Należy upewnić się, że fragment szkła jest pokryty olejem. Szkło to będzie służyć jako podłoże do uderzenia końcówką igły w celu jej złamania lub udrożnienia.

6. Iniekcja fluorescencyjnego RNA

Przed rozpoczęciem: Przygotuj aparat do iniekcji oraz sterowniki mikromanipulatora w taki sposób, aby igła iniekcyjna znajdowała się nad środkiem pola widzenia.

1. Zamocuj próbkę do wstrzyknięcia na stoliku mikroskopu.
2. Wybierz obiektyw 20x. Można również użyć obiektywów o większym lub mniejszym powiększeniu.

Uwaga: W przypadku korzystania z zautomatyzowanego stolika z funkcją odwiedzania punktów zaleca się zaznaczenie wszystkich oocytów w stadium 8-9 przed rozpoczęciem iniekcji. Umożliwia to łatwe odnalezienie i iniekcję wybranych oocytów.

3. Obniż igłę do wstrzykiwania, aż dotknie ona oleju. Wycentruj czubek igły nad obiektywem.
4. Wyłącz oświetlenie pomieszczenia i włącz oświetlenie w polu jasnym mikroskopu. Wybierz pierwszy punkt (oocyt) z listy zaznaczonych punktów. Patrząc przez okulary, ustaw ostrość na oocycie (Rysunek 6A).
5. Obniż ręcznie igłę, aż znajdzie się ona w tej samej płaszczyźnie ostrości co oocyt i będzie widoczna obok niego.
6. Za pomocą sterowników manipulatora przesuń czubek igły do wstrzykiwania, aż znajdzie się on wewnątrz oocytu. Szybki ruch wbijający jest często skuteczniejszy niż powolne posuwanie. Po wprowadzeniu igły wstrzyknij niewielką objętość i wizualnie oceń efekty, powtarzając czynność w razie potrzeby. Jeśli wstrzyknięcie przebiegło pomyślnie, cytoplazma wewnątrz oocytu zostanie przesunięta; jeśli nie jest to widoczne, powtórz czynność. Nie jest konieczne obrazowanie w fluorescencji, aby stwierdzić, czy materiał został wstrzyknięty. Po wstrzyknięciu wyjmij igłę z wnętrza oocytu (Rysunek 6B-G).
7. Dokładna ilość wstrzykniętego płynu jest trudna do określenia ilościowo. Aby zwiększyć wstrzykniętą objętość, dostosuj ciśnienie lub czas impulsu wstrzykiwania, delikatnie odłam czubek igły, aby powiększyć otwór, lub zastosuj powtarzalne impulsy wstrzykiwania.

Uwaga: Cały proces wstrzykiwania powinien trwać mniej niż 10 sekund przy prawidłowym wykonaniu. Wielokrotne nakłuwanie lub zbyt długie pozostawienie igły wewnątrz oocyta spowoduje poważne uszkodzenie komory jaja.

8. Przed wybraniem kolejnego oznakowanego oocyta, unieś igłę do wstrzykiwania wystarczająco wysoko w oleju, aby nie zetknęła się z innymi oocytami na drodze przemieszczania.
9. Przy nowym oocycie powtórz krok 6.6. Postępuj w ten sposób, aż wszystkie wymagane oocyty zostaną poddane iniekcji.

Uwaga: Jeśli podczas iniekcji popełniono błąd, należy przejść do następnego oznakowanego oocytu. Nie należy tracić czasu na uszkodzone oocyty.

Uwaga: Podczas sesji iniekcji igła może zostać zatkana. W takim przypadku należy przesunąć igłę w pobliże odłamka szkła w oleju na szkiełku nakrywkowym. Gdy szkło i igła znajdą się w tej samej płaszczyźnie ogniskowania, należy delikatnie uderzyć igłą w szkło (Rysunek 6H). Aby sprawdzić, czy igła została odblokowana, należy nacisnąć przycisk iniekcji i zweryfikować, czy z końcówki igły wypływa ciecz.

10. Po wstrzyknięciu wszystkich oocytów, ręcznie podnieś igłę, wyjmij ją z oleju i skieruj poza drogę wiązki mikroskopu. Upewnij się, że znajduje się ona w bezpiecznej pozycji, aby uniknąć uszkodzenia wzroku.

Uwaga: Jeśli pomiędzy izolacją komór jajowych a wstrzyknięciem do oocytu upłynął zbyt długi czas, oocyty będą trudne do iniekcji i wykażą zmiany fenotypowe związane ze stresem. Podobne problemy mogą wystąpić w przypadku niewłaściwego obchodzenia się z oocytem lub wstrzyknięcia zbyt dużych objętości (por. rys. 6I, J, K).

7. Projekt eksperymentu obrazowania na żywo

1. Wybierz z listy pierwszy wstrzyknięty oocyt. Sprawdź, czy wstrzyknięcie nastąpiło wewnątrz oocytu, wykonując obrazowanie jednej klatki w fluorescencji (jak na rysunku 6G).
2. Skonfiguruj parametry eksperymentalne, w tym: długość fali wzbudzenia, ścieżkę emisji, czas wzbudzenia, stos Z (Z-stack) oraz odstępy czasowe między pomiarami. Uwaga: Więcej informacji na ten temat znajduje się w publikacji Parton R., et al. (2010) ².
3. Zgromadź zestaw danych.

8. Reprezentatywne wyniki

In vitro zsyntetyzowane RNA grk znakowane Alexa-546 wstrzyknięte do komory jajeczka Me31B::GFP (Rycina 7A). RNA lokalizuje się w grzbietowej części przedniej oocytu i tworzy czepkę wokół jądra (Rycina 7B). Więcej przykładów lokalizacji RNA znajduje się w pracy MacDougall N. i in. (2003) ¹¹.

Oocyty w stadium średnim i późnym, wykazujące ekspresję białek znakowanych fluorescencyjnie (Tau-GFP, Rysunek 7C) lub systemów znakowania RNA (grk*mCherry, Rysunek 7D), mogą być obrazowane bez konieczności mikroiniekcji.

Rycina 1.

Rysunek 2.

Rycina 3.

Rysunek 4.

Rycina 5.

Rycina 6.

Rycina 7.

Dyskusja

Obrazowanie żywych komórek jest potężną metodą badania procesów komórkowych w czasie rzeczywistym. Poza prostą obserwacją w polu jasnym, zastosowanie znaczników fluorescencyjnych w białkach i RNA stało się podstawą wielu przełomowych odkryć. W niniejszym materiale przedstawiliśmy protokół obrazowania poszczególnych żywych oocytów, który może być wykorzystywany w połączeniu z analizami genetycznymi i biochemicznymi.

W niniejszym protokole wyjaśniamy również, jak eksperymentalnie manipulować żywymi oocytami za pomocą iniekcji. Istnieje wiele możliwości w kwestii materiału do wstrzykiwania, w tym syntetyzowany in vitro RNA znakowany fluorescencyjnie, aby ocenić zdolność struktury drugorzędowej do kierowania lokalizacją RNA (Ball i Davis, niepublikowane) oraz przeciwciała hamujące funkcję białek ⁶. W przyszłych badaniach prawdopodobnie wprowadzone zostaną do żywych oocytów inne komponenty znakujące oraz machineria komórkowa, co umożliwi testowanie mechanizmów molekularnych.

Zachowanie żywotności i zdrowia tkanki jest kluczowe podczas pracy z żywymi komórkami. W niniejszym protokole wskazujemy szereg etapów, które mogą prowadzić do stresu komory jajowej. Na przykład, mimo że olej jest lepszy do obrazowania, przedłużona hodowla w oleju może wywołać stres komory jajowej. Można to łatwo monitorować w świetle przechodzącym, badając morfologię i położenie jąder komórkowych oraz błonę oocytu, która w warunkach stresu ulega zniekształceniu i pęcherzykowaniu (porównaj Rycina 7E (brak stresu) z Rycina 7F (stres)). Komory jajowe w stadium 9 wykazują lokalizację RNA i migrację komórek brzeżnych ¹² przez wiele godzin. Jednak komora jajowa w stadium 7/8 zaczyna wykazywać negatywne skutki przebywania w oleju halokarbonowym po około 40 minutach od usunięcia jajnika z samicy. Komory jajowe w późniejszych stadiach, od 11 do 14, mogą rozwijać się prawidłowo zarówno w oleju, jak i w mediach wodnych ze względu na wydzielanie skorupki jaja przez komórki pęcherzyka na tych etapach ¹³. Doniesiono, że dodatek insuliny do wodnego medium dla owadów może utrzymać oocyty w stadium 9 do 6 godzin ¹⁴, a germaria do 14 godzin ¹⁵. We wszystkich przypadkach należy unikać gwałtownych manipulacji komorą jajową, ponieważ powoduje to stres oocytów i zmniejsza ich żywotność. Obrazowanie mniejszej liczby komór jajowych i dbałość o delikatne obchodzenie się z każdą z nich jest najlepszym sposobem na zapewnienie optymalnej żywotności.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Narzędzia używane do sekcji powinny być czyste, ale nie muszą być autoklawowane. Przetrzyj narzędzia ETOH i poczekaj, aż wyschną przed rozpoczęciem pracy.
Pędzel z cienkim włosiem (Sable, okrągły, rozmiar 00 lub 0)	Dowolny dostawca		Ważne jest zastosowanie pędzla dobrej jakości
Halocarbon Products Corporation, seria 95	Halocarbon Products Corp.		Europejski dystrybutor: Solvadis (GMBH) Należy pamiętać o natlenieniu poprzez przepuszczanie powietrza przez olej.
KapturCoverage slip - No. 1.5, 22 x 50mm	International- No1-VWR Kat=631-0137-22-50mm	Menzel-Glaser-22-40mm-MNJ 400-070T
Dumont No.5 - Dumostar	Fine Science Tools	11253-20	Końcówka „Biologie” jest również dobra, lecz bardziej delikatna
Sonda sekcyjna	Fine Science Tools	10140-01
Mikroskop stereoskopowy	Olympus Corporation	SZ61
Podkładka z CO2	Genesee Scientific	59-114 (789060 Dutscher)	Europejski dystrybutor: Dutscher www.dutscherscientific.com/ Własnoręczne wykonanie podkładek dla muszek jest również stosunkowo proste
KimCare	Kimberly-Clark Corporation	KLEW3020
Mikroskop DeltaVision	Applied Precision	DC-CORE
Mikromanipulator	Burleigh	Burleigh seria PCS-5000, TS-5000-300	http://www.ldgi-burleigh.com/ (dawniej Exfo)
Aparat do iniekcji	Tritech Research, Inc.	MINJ-1	Zmodyfikowany o uchwyt do końcówek Eppendorf Femptotips
Igła do iniekcji	Eppendorf	930000043	Różne końcówki są lepiej dopasowane do różnych zastosowań
Końcówki do nakładania 20μl	Eppendorf	5242956.003
Suche drożdże aktywne	Fleischman’s	#2192