Przygotowanie pojedynczych komór jajeczkowych Drosophila do obrazowania na żywo

Podsumowanie

Komora jajowa Drosophila stanowi doskonały model do badania mechanizmów lokalizacji mRNA. Aby uchwycić dynamiczne zdarzenia leżące u podstaw procesów lokalizacji, wymagane jest szybkie obrazowanie tkanek żywych w wysokiej rozdzielczości. W niniejszym materiale przedstawiamy protokół preparatyki i obrazowania żywych próbek przy minimalnej ingerencji w ich strukturę.

Streszczenie

Obrazowanie żywych komórek jest istotną techniką stosowaną w wielu tkankach Drosophila, które służą jako modele do badania zagadnień takich jak specyfikacja osi, różnicowanie komórkowe i organogeneza ¹. Prawidłowe przygotowanie próbek doświadczalnych jest kluczowym, często pomijanym etapem. Celem przygotowania jest zapewnienie istotności fizjologicznej oraz ustanowienie optymalnych warunków obrazowania. Aby zachować żywotność tkanek, krytyczne jest unikanie odwodnienia, hipoksji, przegrzania lub degradacji medium ².

Komora jajowa Drosophila jest dobrze ugruntowanym systemem do badania zagadnień związanych, lecz nie ograniczonych do, wzorowania ciała, lokalizacji mRNA oraz organizacji cytoszkieletu ^3,4. W przypadku komór jajowych we wczesnych i środkowych stadiach rozwoju, montaż w oleju halowęglowym sprzyja przeżywalności, ponieważ umożliwia swobodną dyfuzję tlenu, zapobiega odwodnieniu i hipoksji oraz posiada doskonałe właściwości optyczne do mikroskopii. Obrazowanie białek fluorescencyjnych jest możliwe dzięki wprowadzeniu transgenów do komory jajowej lub fizycznemu wstrzyknięciu znakowanego RNA, białek lub przeciwciał ^5-7. Na przykład dodanie konstruktów MS2 do genomu zwierząt umożliwia obserwację mRNA w oocycie w czasie rzeczywistym ⁸. Konstrukty te pozwalają na znakowanie mRNA in vivo poprzez wykorzystanie oddziaływania pętli spinki RNA bakteriofaga MS2 z jego białkiem kapsydu ⁹.

W niniejszym materiale przedstawiamy protokół ekstrakcji jajników oraz izolacji pojedynczych ovarioli i komór jajowych u samicy Drosophila. Szczegółowy opis oogenezy u Drosophila można znaleźć w pracy Allana C. Spradlinga (1993, przedruk 2009) ¹⁰.

Protokół

1. Przygotowanie Drosophila przed sekcją (według E. Gavis, Princeton University)

1. Usuń dorosłe osobniki z rzadko zasianej butelki i przenieś butelkę do temperatury 25 °C przed rozpoczęciem eksperymentu. Gdy zaczną wykluwać się nowe osobniki dorosłe, odczekaj dwa dni.
2. Weź fiolkę z muchami zawierającą około 10ml stałej pożywki i dodaj 0,5-0,7 grama suchych drożdży (patrz tabela), trzymając fiolkę pod kątem 45 stopni. Nie zasypuj drożdżami całej powierzchni pożywki.
3. Dodaj do drożdży kilka kropel wody, wystarczającą do ich nawilżenia (Rycina 1A). Ustaw fiolkę pod kątem 45 stopni i odczekaj około 3 minut, aż drożdże wchłoną wodę (Rycina 1B).

Uwaga: Alternatywnie można przygotować pastę drożdżową w osobnym pojemniku, a następnie przenieść ją do fiolki za pomocą szpatułki.

4. Znieczul muchy w fiolce poprzez wstrzyknięcie gazu CO₂. Gdy przestaną się poruszać, przenieś nieprzytomne muchy na podkładkę do sortowania z CO₂ (Rycina 1C).
5. Wyizoluj 10-15 samic i 5 samców pożądanego genotypu pod stereomikroskopem, używając pędzelka z cienkim włosiem (Rycina 1D). Samce są łatwo rozpoznawalne po obecności chwytników, ciemnych wystających struktur w części tylnej ciała.
6. Przenieś wybrane muchy do fiolki z pożywką drożdżową (Rycina 1E). Inkubuj w temperaturze 25 °C przez 24-60 godzin. Stosuj krótsze okresy inkubacji, aby uzyskać większy odsetek komór jajowych we wczesnej i średniej fazie, oraz dłuższe okresy dla komór jajowych w późnej fazie.

2. Disekcja jajnika Drosophila

1. Nanieś małą kroplę oleju halowęglowego na szkiełko nakrywkowe nr 1,5 o wymiarach 22 x 50 mm (Rycina 2A). Odstaw przygotowane szkiełko nakrywkowe w miejsce, w którym nie będzie przeszkadzać.
2. Uśpij muchy w fiolce z drożdżami poprzez wstrzyknięcie gazu CO₂ i przełóż je na podkładkę z CO₂.
3. Za pomocą ostrych pęsety z cienkimi końcówkami chwyć pojedynczą, dobrze odżywioną samicę w przedniej części odwłoka (nie pomiędzy odwłokiem a tułowiem) (Rycina 2B-C).
4. Przytrzymaj samicę pęsetą i obejrzyj pod mikroskopem stereoskopowym, mniej więcej 2-3 cm nad przygotowanym szkiełkiem nakrywowym.
5. Nadal trzymając samicę za przednią część, użyj drugiej pęsety, aby usunąć tkankę z samego końca odwłoka (Rycina 2D). Uwaga: tkanka jelita zazwyczaj zostanie wyciągnięta wraz z końcem odwłoka. Wytrzyj usuniętą tkankę z pęsety.
6. Trzymając nadal samicę za przednią część, użyj oczyszczonej pęsety, aby delikatnie ścisnąć lub masować odwłok, przesuwając się od przodu ku tyłowi. Masuj odwłok w taki sam sposób, w jaki wyciska się pastę do zębów z tubki.
7. Z odwłoka zostaną wypchnięte dwie duże, nieprzezroczyste struktury, które przykleją się do końcówki pęsety (Rycina 2E-F). Są to sparowane jajniki.
8. Dotknij jajnikami kropli oleju halowęglowego na szkiełku poniżej.
9. Powtórz sekcję 1-2 razy, aby uzyskać łącznie 4-6 jajników w oleju na szkiełku nakrywowym (Rycina 2G).

3. Izolacja ovariol

Uwaga: Każdy jajnik zawiera około 16 owarioli składających się z 6 do 10 komór jajowych na różnych etapach rozwoju, ułożonych podobnie jak paciorki na sznurku¹⁰.

Uwaga: Przed izolacją owariol należy dostosować źródło światła w mikroskopie stereoskopowym tak, aby oświetlenie padało na próbkę pod małym kątem. Zapewnia to kontrast i umożliwia wizualizację komór jajowych we wczesnym stadium rozwoju.

1. W oleju oddziel dwa jajniki, usuwając tkankę łączną na końcu tylnym (w przypadku starszych stadiów) za pomocą zamkniętej pęsety (Rycina 3A).
2. Zorientuj pojedynczy jajnik tak, aby najstarsze stadia znajdowały się po lewej stronie, a najmłodsze po prawej. Komory jajeczne w stadium młodym są przezroczyste i tworzą bardziej zaostrzony koniec jajnika.
3. Trzymając pęsetę w dominującej dłoni, delikatnie chwyć tylną część jajnika, najlepiej za pozostałości tkanki łącznej. Przytrzymując jajnik pęsetą, użyj sondy sekcyjnej (lub igły wolframowej), aby wyizolować poszczególne owariolami (Rycina 3B-D).

Uwaga: Poszczególne ovaria będą pękać w przypadku wczesnych stadiów (od germarium do stadium 10), ponieważ starsze stadia są zbyt duże, aby można było je oddzielić od całego jajnika.

Uwaga: Przebicie oocytu w późnym stadium rozwoju za pomocą sondy do mikrodysekcji spowoduje wyciek cytoplazmy do oleju, co znacznie utrudni wyodrębnienie poszczególnych owarioli. W przypadku przebicia oocytu w późnym stadium należy przejść do pracy z nowym jajnikiem.

4. Po oddzieleniu owarioli od jajnika, za pomocą sondy do sekcji przesuń ją na środek kropli oleju i ustaw w pozycji wymaganej do przeprowadzenia eksperymentu. Uwaga: Owariole w oleju osiadają i przylegają do szkła.
5. Powtarzaj ten proces (3.3-3.4), aż uzyskasz 15-25 pojedynczych owarioli. Uwaga: Może to wymagać sekcji wielu jajników. Cały proces powinien zająć mniej niż 15 minut.

Uwaga: Zaleca się wypreparowanie po jednym jajniku z kilku much, zamiast obu jajników z mniejszej liczby osobników, aby zwiększyć liczbę n much w eksperymencie.

Uwaga: Nieostrożne obchodzenie się z owariolą spowoduje uszkodzenie oocytów i może doprowadzić do powstania artefaktów w eksperymencie.

Uwaga: Oocyty zaczną wykazywać zmiany fenotypowe wynikające ze stresu 40 minut po wyizolowaniu z jajnika (porównaj rysunek 7E z F).

6. Gdy owariole znajdą się w odpowiedniej orientacji (Rycina 3E), należy użyć sondy sekcyjnej i zamkniętej pęsety, aby usunąć nadmiar tkanki jajnika z oleju. Materiał ten można zebrać z pęsety za pomocą ręcznika papierowego.

4. Izolowanie pojedynczych komór jajowych w późnym stadium (według E. Gavis, Princeton University)

1. Trzymając pęsetę w dominującej dłoni, chwyć tylną część wyizolowanego jajnika, najlepiej za pozostałości tkanki łącznej. Przytrzymując jajnik pęsetą, wprowadź sondę sekcyjną do tylnego końca jajnika w pobliżu pęsety (Rysunek 4A). Unikaj przebijania komór jajowych, wprowadzając sondę pomiędzy komory jajowe w późnym stadium rozwoju.
2. Przeciągnij igłę sekcyjną przez jajnik, aż wyjdzie ona w obrębie komór jajowych we wczesnym stadium (Rysunek 4B). Jeśli czynność zostanie wykonana prawidłowo, sonda usunie tkankę łączną utrzymującą ovaria i komory jajowe w późnym stadium na miejscu.
3. Powtarzaj krok 4.2, aż ovaria zostaną rozłożone na szkiełku nakrywce. Uwaga: Krok ten jest zakończony, gdy komory jajowe nie będą już ułożone jedna na drugiej.
4. Za pomocą sondy sekcyjnej rozdziel późne oocyty, aby umożliwić łatwe obrazowanie (Rysunek 4C).

Uwaga: Przebicie oocytu podczas sekcji komór jajowych w późnych stadiach nie jest tak krytyczne, jak w przypadku sekcji poszczególnych owarioli w stadiach młodszych.

Uwaga: W przypadku komór jajowych w stadium 14 należy użyć pęsety, aby uchwycić wyrostki grzbietowe w celu ich zorientowania.

5. Przygotowanie do iniekcji

Uwaga: W przypadku iniekcji oocytów w stadium średnim, należy zorientować owariole prostopadle do długiej osi szkiełka podstawowego.

1. Włącz mikroskop obrazujący [w naszym przypadku DeltaVision Core od Applied Precision] i załaduj odpowiednie ustawienia obrazowania (rycina 5A-B).
2. Włącz aparat do iniekcji (rycina 5C).
3. Napełnij igłę iniekcyjną za pomocą końcówki do ładowania (rycina 5D-E). Roztwory przeznaczone do iniekcji należy krótko odwirować z dużą prędkością, aby uniknąć powstania osadów, które mogłyby zablokować igłę iniekcyjną.
4. Przymocuj napełnioną igłę iniekcyjną do injektora. Należy uważać, aby nie złamać igły (rycina 5F).
5. Aby ułatwić udrażnianie igieł, umieść mały kawałek szkła 2x10 mm z pociętej lub pękniętej lamielki z jednej strony kropli oleju zawierającej ovariola. Upewnij się, że fragment szkła jest pokryty olejem. Szkło to będzie służyć do uderzania końcówką igły w celu jej przełamania lub udrożnienia.

6. Iniekcja fluorescencyjnego RNA

Przed rozpoczęciem: Przygotuj aparat do iniekcji oraz sterowniki mikromanipulatora w taki sposób, aby igła iniekcyjna znajdowała się nad środkiem pola widzenia.

1. Zamocuj próbkę do wstrzyknięcia na stole mikroskopu.
2. Wybierz obiektyw 20x. Można również zastosować obiektywy o większym lub mniejszym powiększeniu.

Uwaga: W przypadku korzystania z zautomatyzowanego stolika z funkcją odwiedzania punktów zaleca się zaznaczenie wszystkich oocytów w stadium 8-9 przeznaczonych do iniekcji przed rozpoczęciem pracy. Umożliwia to łatwe lokalizowanie i iniekcję wybranych oocytów.

3. Obniż igłę do iniekcji, aż dotknie ona oleju. Wycentruj końcówkę igły nad obiektywem.
4. Wyłącz światło w pomieszczeniu i włącz oświetlenie w polu jasnym mikroskopu. Wybierz pierwszy punkt (oocyt) z listy zaznaczonych punktów. Patrząc przez okulary, ustaw ostrość na oocycie (Rysunek 6A).
5. Obniż igłę ręcznie, aż znajdzie się ona w tej samej płaszczyźnie ostrości co oocyt i będzie widoczna obok niego.
6. Za pomocą sterowników manipulatora przesuń końcówkę igły do iniekcji, aż znajdzie się ona wewnątrz oocytu. Szybki ruch wbijający jest często skuteczniejszy niż powolne posuwanie. Po wprowadzeniu igły wstrzyknij niewielką objętość i wizualnie oceń efekty, powtarzając czynność w razie potrzeby. Jeśli iniekcja przebiegła pomyślnie, cytoplazma wewnątrz oocytu zostanie przemieszczona; jeśli nie jest to widoczne, powtórz proces. Obrazowanie fluorescencyjne nie jest konieczne do stwierdzenia, czy materiał został wstrzyknięty. Po iniekcji wyjmij igłę z wnętrza oocytu (Rysunek 6B-G).
7. Dokładna ilość wstrzykniętego płynu jest trudna do ilościowego określenia. Aby zwiększyć objętość iniekcji, należy dostosować ciśnienie lub czas impulsu wtrysku, lekko odłamać końcówkę igły w celu zwiększenia otworu lub zastosować wielokrotne impulsy iniekcji.

Uwaga: Cały proces iniekcji, jeśli zostanie wykonany prawidłowo, powinien trwać mniej niż 10 sekund. Wielokrotne nakłuwanie lub zbyt długie pozostawianie igły wewnątrz oocyta spowoduje poważne uszkodzenie komory jaja.

8. Przed wybraniem kolejnego oznakowanego oocytu, unieś igłę do iniekcji wystarczająco wysoko w oleju, aby nie dotknęła ona innych oocytów na drodze przemieszczania się.
9. Przy nowym oocycie powtórz krok 6.6. Postępuj w ten sposób, aż wszystkie wymagane oocyty zostaną zainiektowane.

Uwaga: W przypadku popełnienia błędu podczas iniekcji, należy przejść do następnego oznakowanego oocyta. Nie należy tracić czasu na uszkodzone oocyty.

Uwaga: Igła może zostać zapchana podczas sesji iniekcji. W takim przypadku należy przesunąć igłę obok odłamka szkła znajdującego się w oleju na szkiełku nakrywkowym. Gdy szkło i igła znajdą się w tej samej płaszczyźnie ogniskowania, należy delikatnie uderzyć igłą w szkło (rycina 6H). Aby sprawdzić, czy igła została odblokowana, należy nacisnąć przycisk iniekcji i zweryfikować, czy z końcówki igły wypływa ciecz.

10. Po zainiekowaniu wszystkich oocytów ręcznie przesuń igłę w górę, wyjmując ją z oleju, i ustaw ją poza drogą wiązki światła mikroskopu. Upewnij się, że znajduje się ona w bezpiecznej pozycji, aby uniknąć uszkodzenia wzroku.

Uwaga: Jeśli między izolacją komory jajowej a iniekcją do oocytu upłynął dłuższy czas, oocyty będą trudne do iniekcji i wykażą zmiany fenotypowe związane ze stresem. Podobne problemy mogą wystąpić w przypadku nieostrożnego obchodzenia się z oocytem lub iniekcji zbyt dużych objętości (por. Ryciny 6I, J, K).

7. Projekt eksperymentu obrazowania na żywo

1. Wybierz z listy pierwszy zainfekowany oocyt. Sprawdź, czy iniekcja została wykonana wewnątrz oocytu, wykonując obrazowanie jednej klatki w fluorescencji (jak na Rysunku 6G).
2. Skonfiguruj parametry eksperymentalne, w tym: długość fali wzbudzenia, ścieżkę emisji, czas wzbudzenia, stos Z (Z-stack) oraz odstępy czasowe między pomiarami. Uwaga: Więcej informacji na ten temat znajduje się w pracy Parton R., et al. (2010) ².
3. Zbierz zestaw danych.

8. Reprezentatywne wyniki

In vitro syntetyzowane RNA grk znakowane Alexa-546 wstrzyknięte do komory jajowej Me31B::GFP (Rysunek 7A). RNA lokalizuje się w przednio-grzbietowej części oocytu i tworzy czapkę wokół jądra (Rysunek 7B). Więcej przykładów lokalizacji RNA znajduje się w pracy MacDougall N., et al. (2003) ¹¹.

Oocyty w stadium średnim i późnym, wykazujące ekspresję białka znakowanego fluorescencyjnie (Tau-GFP, rysunek 7C) lub systemów znakowania RNA (grk*mCherry, rysunek 7D), mogą być obrazowane bez konieczności iniekcji.

Rysunek 1.

Rycina 2.

Rysunek 3.

Rysunek 4.

Rycina 5.

Rycina 6.

Rycina 7.

Dyskusja

Obrazowanie żywych komórek jest potężną metodą badania procesów komórkowych w czasie rzeczywistym. Poza prostą obserwacją w polu jasnym, zastosowanie znaczników fluorescencyjnych w białkach i RNA stało się podstawą wielu przełomowych odkryć. W niniejszym materiale przedstawiliśmy protokół obrazowania poszczególnych żywych oocytów, który może być wykorzystywany w połączeniu z analizami genetycznymi i biochemicznymi.

W niniejszym protokole wyjaśniamy również, jak eksperymentalnie manipulować żywymi oocytami za pomocą iniekcji. Istnieje wiele możliwości w kwestii materiału do wstrzykiwania, w tym syntetyzowany in vitro RNA znakowany fluorescencyjnie, aby ocenić zdolność struktury drugorzędowej do kierowania lokalizacją RNA (Ball i Davis, niepublikowane) oraz przeciwciała hamujące funkcję białek ⁶. W przyszłych badaniach prawdopodobnie wprowadzone zostaną do żywych oocytów inne komponenty znakujące oraz machineria komórkowa, co umożliwi testowanie mechanizmów molekularnych.

Zachowanie żywotności i zdrowia tkanki jest kluczowe podczas pracy z żywymi komórkami. W niniejszym protokole wskazujemy szereg etapów, które mogą prowadzić do stresu komory jajowej. Na przykład, mimo że olej jest lepszy do obrazowania, przedłużona hodowla w oleju może wywołać stres komory jajowej. Można to łatwo monitorować w świetle przechodzącym, badając morfologię i położenie jąder komórkowych oraz błonę oocytu, która w warunkach stresu ulega zniekształceniu i pęcherzykowaniu (porównaj Rycina 7E (brak stresu) z Rycina 7F (stres)). Komory jajowe w stadium 9 wykazują lokalizację RNA i migrację komórek brzeżnych ¹² przez wiele godzin. Jednak komora jajowa w stadium 7/8 zaczyna wykazywać negatywne skutki przebywania w oleju halokarbonowym po około 40 minutach od usunięcia jajnika z samicy. Komory jajowe w późniejszych stadiach, od 11 do 14, mogą rozwijać się prawidłowo zarówno w oleju, jak i w mediach wodnych ze względu na wydzielanie skorupki jaja przez komórki pęcherzyka na tych etapach ¹³. Doniesiono, że dodatek insuliny do wodnego medium dla owadów może utrzymać oocyty w stadium 9 do 6 godzin ¹⁴, a germaria do 14 godzin ¹⁵. We wszystkich przypadkach należy unikać gwałtownych manipulacji komorą jajową, ponieważ powoduje to stres oocytów i zmniejsza ich żywotność. Obrazowanie mniejszej liczby komór jajowych i dbałość o delikatne obchodzenie się z każdą z nich jest najlepszym sposobem na zapewnienie optymalnej żywotności.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Narzędzia używane podczas sekcji powinny być czyste, ale nie muszą być autoklawowane. Przed rozpoczęciem przemyć narzędzia ETOH i pozostawić do wyschnięcia.
Pędzel z cienkim końcem (Artists Sable, okrągły, rozmiar 00 lub 0)	Dowolny dostawca		Ważne jest zastosowanie pędzla dobrej jakości
Halocarbon Products Corporation, Series 95	Halocarbon Products Corp.		Europejski dystrybutor: Solvadis (GMBH) Należy pamiętać o napowietrzeniu poprzez przepuszczanie powietrza przez olej.
Szkiełko nakrywkowe - nr 1.5, 22 x 50mm	International- No1-VWR Cat=631-0137-22-50mm	Menzel-Glaser-22-40mm-MNJ 400-070T
Dumont No.5 - Dumostar	Fine Science Tools	11253-20	Końcówka „Biologie” jest również dobra, ale bardziej delikatna
Sonda sekcyjna	Fine Science Tools	10140-01
Mikroskop sekcyjny	Olympus Corporation	SZ61
Podkładka CO2	Genesee Scientific	59-114 (789060 Dutscher)	Europejski dystrybutor: Dutscher www.dutscherscientific.com/ Własnoręczne wykonanie podkładek do much jest również stosunkowo łatwe
KimCare	Kimberly-Clark Corporation	KLEW3020
Mikroskop- DeltaVision	Applied Precision	DC-CORE
Mikromanipulator	Burleigh	Burleigh PCS-5000 series, TS-5000-300	http://www.ldgi-burleigh.com/ (dawniej Exfo)
Aparat do iniekcji	Tritech Research, Inc.	MINJ-1	Zmodyfikowany o uchwyt do końcówek Eppendorf Femptotips
Igła do iniekcji	Eppendorf	930000043	Różne końcówki są lepiej dopasowane do różnych zastosowań
Końcówki do nakładania 20μl	Eppendorf	5242956.003
Suche drożdże aktywne	Fleischman’s	#2192