Artykuł metodologiczny

Disekcja i hodowla eksplantów dopaminergicznych i prążkowiowych myszy w trójwymiarowych testach w matrycy kolagenowej

25.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/3691

⸱

23 marca 2012

 ,  , 
1Department of Neuroscience & Pharmacology, Rudolf Magnus Institute for Neuroscience, University Medical Center Utrecht

W tym artykule

Podsumowanie

Eksplanty z układu dopaminergicznego śródmózgowia oraz prążkowia są wykorzystywane w teście z matrycą kolagenową do analizy in vitro rozwoju szlaków mezostriatalnych i striatonigralnych. W tym teście wzrost i prowadzenie aksonów mogą być manipulowane oraz kwantyfikowane. Metodę tę można również zmodyfikować w celu oceny innych obszarów lub sygnałów molekularnych.

Streszczenie

Neurony dopaminergiczne śródmózgowia (mdDA) rzutują za pośrednictwem przyśrodkowego pęczka przedmózgowia do kilku obszarów w telencefalonie, w tym do prążkowia1. W sposób odwrotny, neurony kolczyste w prążkowiu, które tworzą drogę prążkowio-czarną (bezpośrednią), unerwiają istotę czarną2. Rozwój tych traktów aksonalnych zależy od kombinacyjnego działania wielu sygnałów wzrostu i prowadzenia aksonów, w tym cząsteczek uwalnianych przez neuryty lub przez (pośrednie) regiony docelowe3,4. Czynniki rozpuszczalne te można badać in vitro, hodując eksplantaty mdDA i/lub prążkowia w matrycy kolagenowej, która zapewnia trójwymiarowe podłoże dla aksonów, naśladując środowisko zewnątrzkomórkowe. Ponadto matryca kolagenowa umożliwia tworzenie stosunkowo stabilnych gradientów białek uwalnianych przez inne eksplantaty lub komórki umieszczone w pobliżu (np. patrz odnośniki 5 i 6). W niniejszym opracowaniu opisujemy metody oczyszczania kolagenu z ogona szczura, mikrodysekcji eksplantatów dopaminergicznych i prążkowia, ich hodowli w żelach kolagenowych oraz późniejszej analizy immunohistochemicznej i ilościowej. Najpierw izolowane są mózgi embrionów mysich w stadium E14.5, a następnie przeprowadzana jest mikrodysekcja eksplantatów dopaminergicznych i prążkowia. Eksplantaty te są następnie (współ)hodowane w żelach kolagenowych na szkiełkach podstawowych przez 48 do 72 godzin in vitro. Następnie projekcje aksonalne są wizualizowane przy użyciu markerów neuronalnych (np. tyrozynowej hydroksylazy, DARPP32 lub βIII tubuliny), a wzrost aksonów oraz reakcje przyciągania lub odpychania aksonów są ilościowo określane. Ta preparatyka neuronalna stanowi przydatne narzędzie do badań in vitro nad komórkowymi i molekularnymi mechanizmami wzrostu i prowadzenia aksonów mezoprążkowiowych i prążkowio-czarnych podczas rozwoju. Z wykorzystaniem tego testu możliwe jest również ocenienie innych (pośrednich) celów dla aksonów dopaminergicznych i prążkowia lub testowanie specyficznych sygnałów molekularnych.

Protokół

1. Przygotowanie kolagenu z ogona szczura

  1. Zebrać ogony od 6–10 dorosłych szczurów (ogony można przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia).
  2. Namoczyć ogony w 95% etanolu przez noc w temperaturze pokojowej (RT).

Disekcja ogonów szczura (w komorze z laminarnym przepływem powietrza):
(narzędzia nieużywane należy przechowywać w 70% etanolu; należy upewnić się, że wszystkie roztwory, narzędzia i szkło laboratoryjne używane podczas tej procedury są sterylne)

  1. Aby pobrać ścięgna z ogonów, odetnij końcówkę ogona. Przytrzymaj szerszy koniec ogona pęsetą. Użyj drugiej pęsety, aby uchwycić, zgiąć i złamać ogon w pobliżu pierwszej pęsety. Rozdziel tkanki, a ścięgna pozostaną wewnątrz (Rycina 1A,B).
  2. Zbierz ścięgna do sterylnej H2O, a po zebraniu wszystkich ścięgien przenieś je do nowej płytki Petriego ze sterylną H2O.
  3. Pobierz 2-3 ścięgna i rozdrobnij je za pomocą dwóch pęset w nowej płytce Petriego ze sterylną H2O. Usuń tkanki inne niż ścięgna, np. żyły (tkanka ścięgnista jest błyszcząca i refleksyjna; Rycina 1C). Po usunięciu wszystkich tkanek innych niż ścięgna, z każdego ogona uzyskuje się około 100-150 mg ścięgien.
  4. Przenieś ścięgna do 300 ml sterylnego 3% kwasu octowego i mieszaj powoli przez noc w temperaturze 4 °C.
  5. Dodaj kolejne 200 ml sterylnego 3% kwasu octowego i mieszaj powoli przez noc w temperaturze 4 °C.
  6. Wirowarkuj roztwór kwasu octowego zawierający ścięgna przy ~2700 xg przez 120 min w temperaturze 4 °C, aby uzyskać osad z nierozpuszczonych ścięgien i tkanek innych niż ścięgna.
  7. W czasie wirowania przygotuj rurki do dializy:
    • odetnij kawałki o długości 40 cm
    • gotuj w 500 μM EDTA przez 5 min
    • schłodź w sterylnej H2O
  8. Zwiąż węzeł na jednym końcu rurki do dializy i wypełnij rurkę nadpłynem z wirowanego roztworu ścięgien, wykonując czynność na lodzie w dygestorium do hodowli tkankowych za pomocą pipety automatycznej i pipety 25 ml. Unikaj powstawania pęcherzyków powietrza. Zwiąż drugi koniec rurki i przechowuj rurki na sterylnej folii aluminiowej na lodzie, aż wszystkie kawałki rurek zostaną wypełnione (Rycina 1D).
  9. Przygotuj 10 l sterylnego 0,1X MEM, pH 4,0, w dygestorium do hodowli tkankowych. Dodaj pływak do rurek i umieść je w schłodzonym roztworze 0,1X MEM w zlewce o pojemności 10 l. Dializuj przez noc w temperaturze 4 °C przy powolnym mieszaniu. Dializa ta usuwa nadmiar kwasu, utrzymując niskie pH.
  10. Wymień roztwór na nowy, schłodzony 10 l 0,1X MEM i mieszaj przez noc w temperaturze 4 °C.
  11. Powtórz poprzedni krok, wymieniając roztwór na nowy, schłodzony 10 l 0,1X MEM i mieszaj przez noc w temperaturze 4 °C.
  12. Rozlej roztwór kolagenu do sterylnych probówek 50 ml. Przechowuj alikwoty w temperaturze 4 °C. Przechowywać od 6 do 12 miesięcy; zapas kolagenu należy manipulować wyłącznie w dygestorium do hodowli tkankowych.
  13. Ważne jest sprawdzenie, czy oczyszczony kolagen wymaga rozcieńczenia (w 0,1x MEM), aby uzyskać optymalne wyniki w teście macierzy kolagenowej. W związku z tym przygotuj serię rozcieńczeń kolagenu (kolagen nierozcieńczony, 1:1, 1:2 i 1:5) i przeprowadź testy macierzy kolagenowej zgodnie z poniższym opisem, aby określić optymalne rozcieńczenie kolagenu.

2. Disekcja dopaminergicznego śródmózgowia7,8

  1. Wypreparować zarodki myszy w stadium E14.5 z macicy matki i przechowywać w pożywce L15 w lodzie do momentu użycia.

Wszystkie kolejne etapy sekcji przeprowadza się w medium L15 na lodzie.

  1. Wypreparować mózg.
  2. Usunąć telencefalon, przecinając tkankę wzdłuż przyśrodkowej części każdego pęcherzyka telencefalicznego (pęcherzyki telencefaliczne można wykorzystać do przygotowania eksplantów prążkowia).
  3. Usunąć osłonę oponową.
  4. Wykonać cięcie grzbietowo-brzuszne tuż rostralnie od zgięcia śródmózgowia.
  5. Wykonać kolejne cięcie grzbietowo-brzuszne tuż caudalnie od zgięcia śródmózgowia.
  6. Za pomocą noża do mikrodysekcji wykonać cięcie rostro-caudalne wzdłuż linii pośrodkowej grzbietu, aby odsłonić leżącą poniżej brzuszną tkankę śródmózgowia. Należy uważać, aby nie uszkodzić brzusznej części śródmózgowia, ponieważ znajdują się w niej neurony dopaminergiczne (Rycina 2).
  7. Wykonać dwa cięcia rostro-caudalne, bocznie i równolegle do linii pośrodkowej brzusznej, aby usunąć grzbietową tkankę śródmózgowia.
  8. Za pomocą noża do mikrodysekcji podzielić pozostałą brzuszną tkankę śródmózgowia na eksplanty.
  9. Przechowywać eksplanty w medium L15 z dodatkiem 5% FBS w lodzie do momentu użycia.

3. Disekcja prążkowia

Wszystkie etapy sekcji przeprowadza się w medium L15 na lodzie.

  1. Użyć pęcherzyków końcowych wypreparowanych podczas sekcji śródmózgowia.
  2. Usunąć wzgórze, przecinając tkankę między wzgórzem a prążkowiem za pomocą pęsety.
  3. Wykonać cięcie mediolateralne rostralnie względem prążkowia, aby usunąć struktury rostralne, takie jak cebulka węchowa. Powtórzyć ten krok dla tkanki znajdującej się kaudalnie względem prążkowia.
  4. Ułożyć pozostały plaster tak, aby uzyskać widok koronarny prążkowia (Rycina 2).
  5. Prążkowie można rozpoznać jako nieco mniej gęstą (bardziej przezroczystą) część tkanki. Wypreparować prążkowie i pociąć na eksplantaty za pomocą noża do mikrodysekcji. Należy unikać nieco ciemniejszej tkanki blisko linii środkowej, która zawiera migrujące neurony bocznego i przyśrodkowego wybrzuszenia zwojowego.
  6. Przechowywać eksplantaty w medium L15 zawierającym 5% FBS na lodzie do momentu użycia.

4. Testy montażu matrycy kolagenowej

Przygotowanie kolagenu (wszystkie etapy w lodzie, należy używać schłodzonych końcówek do pipet)

  1. Wymieszać 860 μl rozcieńczonego kolagenu ze 100 μl 10x MEM oraz 40 μl 1M wodorowęglanu sodu (NaHCO3) i przechowywać w lodzie. Jeśli na tym etapie kolagen się ogrzeje, ulegnie on zestaleniu.
  2. Nanieść kroplę 20 μl (o średnicy około 5 mm) przygotowanego kolagenu na szkiełko podstawowe w dołku 4-dołkowej płytki Nunc i pozostawić w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C i przy 5%CO2 na 30 min (wystarczające jest otoczenie o naturalnym stężeniu O2). Podczas tej inkubacji kolagen przejdzie w stan żelu.

Przygotowanie kokultury w żelu kolagenowym

  1. Po żelatynizacji kolagenu, za pomocą pipety z końcówką 200 μl przenieść eksplant dopaminergiczny lub prążkowiowy do kolagenu.
  2. Przybliżyć eksplanty do siebie za pomocą igły. Zachować między nimi odstęp odpowiadający w przybliżeniu średnicy jednego eksplantu (~200-300 μm) (Rysunek 2).
  3. Usunąć nadmiar medium i dodać 20 μl przygotowanego kolagenu na wierzch eksplantów. Często powoduje to przemieszczanie się eksplantów. Ponownie ustawić eksplanty za pomocą igły, zgodnie z opisem w punkcie 4.4.
  4. Pozostawić kolagen do stężenia przez 15 min w temperaturze pokojowej, a następnie przez 30 min w 37 °C i 5% CO2.
  5. Po zastygnięciu kolagenu dodać 400 μl medium do eksplantów i inkubować przez 2-3 dni w inkubatorze CO2 w 37 °C i 5% CO2.

5. Analiza metodą immunohistochemii i kwantyfikacja

Immunohistochemia

  1. Aby utrwalić eksplanty, należy delikatnie dodać 400 μl 8% paraformaldehydu (PFA) w PBS do 400 μl pożywki (rozcieńczając tym samym PFA do 4%) i pozostawić na 1 godzinę w RT.
  2. Przemyć 3x przez 15 min w PBS w RT.
  3. Inkubować w buforze blokującym (BB; PBS + 1% FBS + 0,1% Triton X-100) przez 2 godziny.
  4. Inkubować przez noc z przeciwciałem pierwotnym w BB w 4 °C. W przypadku aksonów dopaminergicznych należy użyć przeciwciał anty-tyrozynohydroksylaza (1:1000)7, dla aksonów prążkowiowych przeciwciał anty-DARPP32 (1:500)9, a w celu wizualizacji wszystkich aksonów anty-βIII tubuliny (1:3000)7.
  5. Przemyć 5x przez 1 godzinę w PBS w RT.
  6. Inkubować z przeciwciałem wtórnym sprzężonym z odpowiednim fluorophorem (1:500) w BB przez noc w 4 °C. Od tego etapu należy minimalizować ekspozycję eksplantów na światło (np. przykryć je folią aluminiową).
  7. Przemywać przez noc w PBS w 4 °C, a następnie kilkakrotnie przemyć w ciągu następnego dnia.
  8. Zamontować eksplanty na szkiełkach przedmiotowych, używając medium montażowego Prolong Antifade. Nanieść kroplę o objętości ~10 μl na szklane szkiełko przedmiotowe. Wziąć szkiełko nakrywkowe i delikatnie położyć je na kropli medium montażowego stroną z eksplantem skierowaną w dół. Aby uniknąć uwięzienia pęcherzyków powietrza pod nakrywką, należy bardzo powoli opuszczać ją na kroplę medium montażowego.

Ilościowe oznaczenie poprzez obliczenie stosunku P/D

  1. Należy wykonać cyfrowe zdjęcia eksplantów przy użyciu mikroskopu epifluorescencyjnego (Rysunek 3).
  2. Na podstawie tych zdjęć należy podzielić każdy eksplant na ćwiartki, aby wyznaczyć ćwiartkę proksymalną (tzn. część eksplantu najbliższą eksplantowi sąsiedniemu) oraz ćwiartkę dystalną (część eksplantu najdalej oddaloną od eksplantu sąsiedniego) (Rysunek 2, 4).
  3. Należy zmierzyć długość 20 najdłuższych neurytów wyrastających z eksplantu zarówno w ćwiartce proksymalnej, jak i dystalnej.
  4. Średnią długość 20 najdłuższych neurytów należy wykorzystać do obliczenia stosunku P/D dla każdego pojedynczego eksplantu. Stosunek P/D > 1 wskazuje na przyciąganie aksonów, natomiast stosunek < 1 wskazuje na odpychanie aksonów.
  5. W niektórych przypadkach gęsty wzrost neurytów uniemożliwia ocenę długości pojedynczych neurytów. W takich sytuacjach kwantyfikację można przeprowadzić poprzez pomiar odległości między krawędzią eksplantu a czołem wzrostu aksonów w ćwiartkach proksymalnej i dystalnej.

6. Reprezentatywne obrazy

Po udanej hodowli eksplantów dopaminergicznych i prążkowiowych, przy użyciu mikroskopii w polu jasnym lub poprzez wizualizację immunocytochemiczną przeciwko βIII tubulinie (nie pokazano), widoczna jest duża liczba aksonów. Podzbiór tych aksonów będzie stanowił aksony dopaminergiczne lub prążkowiowe, co można zwizualizować za pomocą immunocytochemii (Rycina 3). Poprzez podzielenie eksplantów na kwadranty zgodnie z opisem i wyznaczenie stosunków P/D, można ilościowo określić domniemany efekt przyciągania lub odpychania aksonów (Rycina 3E).

Proces preparowania ścięgien, schemat żyły i ścięgna w szalce Petriego, zestaw laboratoryjny do badania biologicznego.
Rycina 1. Zdjęcia ilustrujące przygotowanie kolagenu ze ścięgien ogona szczura. A) Rozciągnięcie ogona szczura odsłania ścięgna. B) Ścięgna są widoczne jako sznurowate pęczki. C) Ścięgna łatwo odróżnić od żył po ich błyszczącym, białym wyglądzie. D) Po rozpuszczeniu ścięgien w kwasie octowym roztwór przenosi się do membrany dializacyjnej. Aby utrzymać niską temperaturę rozpuszczonego kolagenu, probówki umieszcza się na sterylnej folii aluminiowej na lodzie.

Proces od sekcji do kwantyfikacji; schemat eksplantów, macierzy kolagenowej i etapów wypustek aksonalnych.
Rycina 2. Schemat przedstawiający poszczególne etapy procedury. Odpowiednie obszary mózgu są wycinane i dzielone w celu przygotowania eksplantów. Pojedynczy eksplant śródmózgowia oraz eksplant prążkowia są umieszczane w bliskim sąsiedztwie w macierzy kolagenowej i inkubowane przez 48-72 godziny w 37 °C. Aksony są wizualizowane za pomocą fluorescencyjnej immunohistochemii, a następnie oblicza się stosunek P/D w celu kwantyfikacji odpowiedzi chemotropowych.

Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej przedstawiające formowanie się sieci neuronalnej, z widocznym wzrostem aksonów w kolorze zielonym i czerwonym.
Rysunek 3. Reprezentatywne wyniki ukazujące wzrost aksonów w kulturze w macierzy kolagenowej. A) Eksplant śródmózgowia barwiony przeciwciałem przeciwko tyrozynowej hydroksylazie, wykazujący wypustki aksonalne. Linia przerywana oznacza sąsiedni eksplant. B) Powiększenie obrazu A, przedstawiające poszczególne neuryty i stożki wzrostu (strzałki). C) Eksplant prążkowia barwiony przeciwciałem przeciwko DARPP32. D) Powiększenie obrazu C, przedstawiające poszczególne neuryty. E) Przykład kwantyfikacji stosunku P/D. Eksplanty są podzielone na równe kwadranty. Kwadrant proksymalny jest zwrócony w stronę sąsiedniego eksplantu, natomiast kwadrant dystalny jest od niego oddalony. Paski skali oznaczają 100 μm.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisany tutaj test z macierzą kolagenową był stosowany i udoskonalany przez wiele różnych laboratoriów w ciągu ostatnich dziesięcioleci w celu zbadania różnorodnych cząsteczek kierujących wzrostem aksonów oraz układów neuronalnych (np. patrz odniesienia 5-8). Badania te wykazały, że test ten jest potężnym narzędziem do badania efektów i regulacji cząsteczek kierujących wzrostem aksonów wydzielanych przez różne (pośrednie) tkanki docelowe.

Należy jednak zauważyć, że macierz kolagenowa stanowi ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie mamy nic do ujawnienia.

Podziękowania

Test macierzy kolagenowej został opracowany i udoskonalony dzięki pracy wielu różnych grup badawczych w ciągu ostatnich dwóch do trzech dekad. Opisane tutaj podejścia dla eksplantów dopaminergicznych i prążkowiowych w znacznym stopniu korzystają z tych badań. Ponadto autorzy pragną podziękować Asheecie Prasad za pomoc w przygotowaniu kultur eksplantów prążkowia. Prace w laboratorium były finansowane przez Human Frontier Science Program Organization (Career Development Award), Holenderską Organizację Badań i Rozwoju w Dziedzinie Zdrowia (ZonMW-VIDI i ZonMW-TOP), Unię Europejską (mdDA-NeuroDev, FP7/2007-2011, Grant 222999) (dla RJP) oraz Holenderską Organizację Badań Naukowych (TopTalent; dla ERES).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Płodowa surowica cielęcaBioWhittaker14-801F
Glutamina (200mM)PAA LaboratoriesM11-004
HepesVWR international441476L
β-merkapto–etanolMerck & Co., Inc.444203
Minimum Essential Media (MEM)GIBCO, by Life Technologies61100-087
NeurobasalGIBCO, by Life Technologies21103-049
B27GIBCO, by Life Technologies17504-044
Pożywka L-15 Leibovitz’aGIBCO, by Life Technologies11415-049
Penicylina-streptomycynaGIBCO, by Life Technologies15070-063
Odczynnik antyblaknący Prolong GoldInvitrogenP36930
Membrana do dializySpectrum Labs132660
Królicze przeciwciało anty-tyrozynowa hydroksylazaPel-Freez BiologicalsP40101-0
Królicze przeciwciało anty-Darpp32 (H-62)Santa Cruz Biotechnology, Inc.Sc-11365
Mysie przeciwciało anty-βIII tubulinaSigma-AldrichT8660
Wtórne przeciwciała znakowane Alexa FluorInvitrogen

Bibliografia

  1. van den Heuvel, D. M., Pasterkamp, R. J. Getting connected in the dopamine system. Prog. Neurobiol. 85, 75-93 (2008).
  2. Lobo, M. K. Molecular profiling of striatonigral and striatopallidal medium spiny neurons past, present, and future. Int. Rev. Neurobiol. 89, 1-35 (2009).
  3. Dickson, B. J. Molecular mechanisms of axon guidance. Science. 298, 1959-1964 (2002).
  4. Chilton, J. K. Molecules mechanisms of axon guidance. Dev. Biol. 292, 13-24 (2006).
  5. Lumsden, A. G., Davies, A. M. Chemotropic effect of specific target epithelium in the developing mammalian nervous system. Nature. 323, 538-539 (1986).
  6. Tessier-Lavigne, M., Placzek, M., Lumsden, A. G., Dodd, J., Jessel, T. M. Chemotropic guidance of developing axons in the mammalian central nervous system. Nature. 336, 775-778 (1988).
  7. Kolk, S. M., Gunput, R. A., Tran, T. S., van den Heuvel, D. M., Prasad, A. A., Hellemons, A. J., Adolfs, Y., Ginty, D. D., Kolodkin, A. L., Burbach, J. P., Smidt, M. P., Pasterkamp, R. J. Semaphorin 3F is a bifunctional guidance cue for dopaminergic axons and controls their fasciculation, channeling, rostral growth, and intracortical targeting. J. Neurosci. 29, 12542-12557 (2009).
  8. Fenstermaker, A. G., Prasad, A. A., Bechara, A., Adolfs, Y., Tissir, F., Goffinet, A., Zou, Y., Pasterkamp, R. J. Wnt/planar cell polarity signaling controls the anterior-posterior organization of monoaminergic axons in the brainstem. J. Neurosci. 30, 16053-16064 (2010).
  9. Arlotta, P., Molyneaux, B. J., Jabaudon, D., Yoshida, Y., Macklis, J. D. Ctip2 controls the differentiation of medium spiny neurons and the establishment of the cellular architecture of the striatum. J. Neurosci. 28, 622-632 (2008).
  10. De Wit, J., Toonen, R. F., Verhage, M. Matrix-dependent local retention of secretory vesicle cargo in cortical neurons. J. Neurosci. 29, 23-37 (2009).
  11. Gähwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. Organotypic slice cultures: a technique has come of age. Trends Neurosci. 20, 471-477 (1997).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Eksplanty dopaminergicznetechnika mikrosekcjiwzrost akson wanaliza immunohistochemicznastosunek proksymalno dystalnymarkery neuronalnehodowla tr jwymiarowasekcja m zgu embrionalnego

Powiązane artykuły