Ocena zmian teratogennych w modelu ekspozycji płodowej na alkohol u rybek danio pręgowanych

Podsumowanie

Aby zrozumieć molekularne mechanizmy uszkodzeń rozwojowych wywołanych przez etanol, opracowaliśmy model ekspozycji na etanol u rybek danio (zebrafish) i badamy zmiany fizyczne, komórkowe oraz genetyczne występujące po takiej ekspozycji¹. Następnie dążymy do znalezienia potencjalnych interwencji i ich szybkiego przetestowania w tym modelu zwierzęcym.

Streszczenie

Zespół alkoholowy płodu (FAS) jest ciężką postacią ekspozycji embrionalnej na etanol. Charakteryzuje się on typowymi wadami twarzy i narządów, w tym opóźnieniem rozwoju psychicznego wynikającym z zaburzonego i uszkodzonego rozwoju mózgu. Spektrum zaburzeń alkoholowych płodu (FASD) to termin obejmujący kontinuum wad wrodzonych występujących w wyniku spożywania alkoholu przez matkę, które dotyczy około 4% dzieci urodzonych w Stanach Zjednoczonych. Biorąc pod uwagę, że 50% kobiet w wieku rozrodczym deklaruje spożywanie alkoholu, a połowa wszystkich ciąż jest niezaplanowana, niezamierzona ekspozycja pozostaje aktualnym problemem². Aby jak najlepiej zrozumieć uszkodzenia wywołane przez etanol oraz stworzyć model do testowania potencjalnych interwencji, opracowaliśmy model rozwojowej ekspozycji na etanol z wykorzystaniem embrionu danio pręgowanego. Danio pręgowane są idealne do tego rodzaju badań teratogennych^3-8. Każda para składa setki jaj, które można następnie zebrać bez szkody dla dorosłych ryb. Embrion danio pręgowanego jest przezroczysty i może być łatwo obrazowany przy użyciu wielu rodzajów barwień. Analiza tych embrionów po ekspozycji na etanol w różnych dawkach, czasie trwania i sposobach aplikacji pokazuje, że ogólne wady rozwojowe wywołane przez etanol są spójne z ludzkimi wadami wrodzonymi. W niniejszym opracowaniu opisano podstawowe techniki stosowane do badania i manipulacji w modelu FAS u danio pręgowanych.

Protokół

1. Obróbka zarodków etanolem

1. Zarodki danio pręgowanego pochodzące z krzyżówek typu dzikiego hodowano w temperaturze 28 °C w 5 ml wody dla zarodków (woda Milli-Q z dodatkiem 60 mg/L Instant Ocean). Różne linie zarodków typu dzikiego wykazują nieco różną tolerancję na ekspozycję na etanol⁹.
2. Ekspozycję na etanol rozpoczynano w stadium kopułki (~4,3 godziny po zapłodnieniu, hpf) na wybrany czas, do maksymalnie 24-godzinnego impulsu. Stadium początkowe to jest w przybliżeniu równoważne stadium implantacji zarodków ssaków, bezpośrednio przed gastrulacją. Stosowane stężenia etanolu mieściły się w zakresie 0,2%-2,5%, objętość/objętość. Badania wykazały, że od 25-50% roztworu zawartego w wodzie przenika do rozwijającego się zarodka^{10, 11}. Zarodki utrzymywano w temperaturze 28 °C przez wybrany czas. Po zakończeniu ekspozycji na etanol roztwór etanolowo-wodny usuwano i zastępowano trzykrotnym płukaniem w zwykłej wodzie dla danio pręgowanego, a następnie utrzymywano przez określony czas. Specyfika wady zależy od czasu rozpoczęcia, dawki oraz czasu trwania impulsu etanolu.

2. Pobieranie embrionów do analizy RNA, hybrydyzacji in situ, barwienia przeciwciałami oraz barwienia chrząstki

1. W celu wyizolowania mRNA do qPCR, embriony w tym samym wieku zbiera się do probótek Eppendorf. Po usunięciu wody z akwarium dodaje się bufor lizujący z TCEP. Do fizycznej dysocjacji embrionów w roztworze lizującym wykorzystuje się zautomatyzowany homogenizator. Następnie roztwór przepuszcza się przez kolumnę do wstępnego oczyszczania (preclear), która usuwa wszelkie niedysocjowane duże fragmenty. Otrzymany roztwór zawiera wszystkie makrocząsteczki uwolnione w procesie lizy. RNA jest następnie ekstrahowane poprzez naniesienie roztworu na kolumnę, po czym następuje etap przemywania i traktowanie DNazą. Elucję przeprowadza się przy użyciu wody lub roztworu elucyjnego dostarczonego przez producenta (5'-Prime). RNA można przekształcić w cDNA przy użyciu standardowych technik qPCR lub wykorzystać w analizie mikromacierzowej.
2. Do hybrydyzacji in situ oraz barwienia przeciwciałami, embriony od 6 do 24 hpf utrwalano w 4% paraformaldehydzie przez noc w temperaturze 4 °C. Następnie przeprowadzano 3 przemycia w PBS + 0,1% Tween (PBT), aby zapobiec sklejaniu się embrionów. Embriony przenoszono następnie przez serię 3 przemyć w mieszaninie metanol:PBT do 100% metanolu, po czym można je przechowywać w temperaturze -20 °C. Tak przygotowane embriony mogą być wykorzystane do hybrydyzacji in situ lub barwienia przeciwciałami. Niektóre przeciwciała nie działają po traktowaniu metanolem, dlatego należy wziąć pod uwagę to zastrzeżenie i przetestować konkretne przeciwciało, aby sprawdzić, czy będzie ono skuteczne po obróbce metanolem.
3. Do barwienia chrząstki embriony muszą zostać wyhodowane do 5 lub 6 dni po zapłodnieniu (dpf). Następnie są one utrwalane w 4% paraformaldehydzie przez noc w temperaturze 4 °C, a następnie poddawane 3 przemyciom w PBT.

3. Ocena zmian w ekspresji genów indukowanych etanolem oraz ich następstw rozwojowych

1. Aby określić, jakie poziomy ekspresji genów uległy zmianie, wybrane geny bada się za pomocą qPCR oraz hybrydyzacji in situ. qPCR wykonuje się przy użyciu starterów zaprojektowanych w oprogramowaniu Integrated DNA Technologies (IDT), a następnie waliduje na 3 oddzielnych próbkach biologicznych. Po walidacji starterów qPCR przeprowadza się na cDNA otrzymanym z zebranych próbek RNA. Każdą próbkę analizuje się w trzech powtórzeniach. Reakcje PCR przeprowadzane są z użyciem Platinum SYBR Green qPCR Super mix (Invitrogen) na termocyklerze Chroma-4 PCR (BioRad) lub podobnym urządzeniu PCR z wielokolorowym systemem detekcji. Oprócz badanych genów kluczowe jest zastosowanie kontrolnego zestawu starterów w celu zniwelowania niewielkich różnic w przygotowaniu cDNA lub RNA. W przypadku embrionów danio pręgowanego stosujemy gapdh: 5'GAAGGTGGGAAACTGGTCAT3' oraz 5'TTGCACCACCCTTAATGTGA3'. Analizowane geny są następnie normalizowane do poziomów gapdh, a względna kwantyfikacja ekspresji genów jest obliczana przy użyciu modyfikacji metody Pfaffla opartej na 2^{- Ct}, z prezentacją danych jako krotność różnicy w grupie doświadczalnej względem typu dzikiego¹². Standardowe obliczenia zakładają, że wszystkie geny duplikują DNA dwukrotnie w każdym cyklu, i tym samym wyrażają dane jako stosunek zmiany w genie doświadczalnym do zmiany w genie referencyjnym, zapisany jako potęga liczby całkowitej „2”, która reprezentuje wydajność podwajania DNA na cykl w idealnej reakcji PCR. Metoda Pfaffla zastępuje ogólną wartość „2” rzeczywistą wydajnością dla wybranych starterów PCR, wyznaczoną przez eksperymentatora. Pozwala to na dokładniejsze odzwierciedlenie różnic w reakcjach PCR. Pełny wzór to:
   

   (Wydajność genu doświadczalnego)(Ct próbki kontrolnej-Ct próbki traktowanej)

   -------------------------------------------------------------------------------------

   (Wydajność genu referencyjnego)(Ct próbki kontrolnej - Ct próbki traktowanej)

2. Do hybrydyzacji in situ konstruuje się ryboprony znakowane digoksigeniną (dig) z plazmidów zawierających fragmenty interesującego genu. Embriony w tym samym wieku poddaje się działaniu rybopronów w warunkach standardowych¹³, a następnie wykrywa je za pomocą przeciwciał anty-dig sprzężonych z fosfatazą alkaliczną, co umożliwia lokalizację znakowanych rybopronów poprzez reakcję barwną (NBT/BCIP). Embriony są następnie wizualizowane za pomocą stereomikroskopu Leica (Rycina 1B-G).
3. Aby ocenić rozwój morfogenetyczny, embriony zbiera się w wybranym czasie i bada pod stereomikroskopem. W przypadku kształtu somytów obrazuje się żywe embriony ¹⁴. Do pomiaru odległości międzyocznej i długości ciała embriony utrwala się w PFA. We wszystkich przypadkach obrazy wybranego obszaru są rejestrowane pod stereomikroskopem przy stałym powiększeniu, a pomiary wykonywane są w oprogramowaniu Adobe Photoshop ^10,14.
4. Aby zbadać wpływ traktowania na rozwijające się struktury chrzęstne u larw danio pręgowanego, stosuje się barwienie błękitem Alciana. Utrwalone larwy danio pręgowanego traktuje się roztworem błękitu Alciana rozpuszczonego w 80% etanolu i 20% lodowatego kwasu octowego (alkohol kwasowy) przez kilka godzin lub przez noc. Larwy odbarwia się w kilku przemyciach alkoholem kwasowym, a następnie przenosi do roztworu 1% KOH i 3% nadtlenku wodoru w celu dalszego przejaśnienia komórek pigmentowych. Ryby muszą mieć co najmniej 4 dni, aby struktury chrzęstne były widoczne; są one lepiej zdefiniowane u osobników w wieku 5 lub 6 dni.
5. Śmierć komórek w żywych embrionach ocenia się za pomocą pomarańczowej akrydyny (AO). AO nie przenika przez membrany żywych komórek i wiąże się z DNA w komórkach o uszkodzonych błonach, w tym w tych przechodzących apoptozę i nekrozę. Żywe embriony inkubuje się z 5 mg/ml AO w PBS przez 1 godzinę, a następnie płucze 3 razy w PBS. Następnie embriony obrazuje się za pomocą mikroskopu konfokalnego. Cyfrowe obrazy z serii Z są łączone w celu stworzenia kompozytów.

4. Manipulacja zarodkiem danio pręgowanego

1. Po zidentyfikowaniu genów, których ekspresja ulega zmniejszeniu pod wpływem etanolu, można podjąć próbę ich uzupełnienia poprzez wstrzyknięcie mRNA zaprojektowanego w celu zastąpienia brakującego genu. Modyfikowane mRNA z czapką (capped mRNA) jest transkrybowane z linearyzowanych plazmidów DNA przy użyciu zestawów do transkrypcji in vitro polimerazą RNA, zgodnie z instrukcjami producenta (mMessage Machine, Applied Biosystems). Do jaj zebrafish na etapie 1-2 komórek wstrzykuje się od 25-200 pg/nl RNA w roztworze 0.1 M KCl. Następnie zarodkom pozwala się na regenerację przed poddaniem ich działaniu etanolu, jak opisano powyżej (Rysunek 5).
2. W przypadku transkryptów genów, których poziom wzrasta pod wpływem etanolu, można je zredukować lub przeprowadzić tzw. „wyciszenie” (knock-down) przy użyciu technologii antysensownych morfolino. Antysensowne morfolino (AMOs) są projektowane przez firmę Gene Tools i blokują translację RNA na białko lub blokują dojrzewanie i splicing RNA, w zależności od potrzeb eksperymentalnych. Działanie morfolino ogranicza ilość aktywnego białka dla docelowego genu; deficyt ten można zmierzyć za pomocą przeciwciał, jeśli są one dostępne. Efektywność morfolino blokujących splicing RNA można zmierzyć za pomocą RT-PCR, aby wykryć względne ilości transkryptów zsplicowanych i niezsplicowanych. Miareczkowanie morfolino może prowadzić do aktywności zależnej od dawki¹⁵. AMOs rozcieńcza się do stężeń roboczych (zmiareczkowane stężenia od pg do ng) w roztworze Danieau (58 mM NaCl, 0.7 mM KCl, 0.4 mM MgSO₄, 0.6 mM Ca(NO₃)₂, 5 mM HEPES, pH 7.6). Iniekcję przeprowadza się na etapie 1-2 komórek, a następnie pozwala się zarodkom na rozwój przed poddaniem ich działaniu etanolu, jak opisano powyżej.

5. Reprezentatywne wyniki

Ekspozycja zarodków danio pręgowanego na etanol prowadzi do szeregu wad rozwojowych i genetycznych, które są powiązane z fenotypami występującymi u innych kręgowców. Udokumentowaliśmy nieprawidłowy rozwój tkanek osiowych, w tym notochordu (dane nie pokazano¹⁴). Opóźnienie rozwojowe wywołane przez etanol najwyraźniej prowadzi do zaburzenia prawidłowego wydłużania się notochordu, co skutkuje jego skróceniem, a niekiedy przerwaniem ciągłości (dane nie pokazano¹⁴). To wczesne opóźnienie i wada notochordu prawdopodobnie przyczyniają się częściowo do późniejszych nieprawidłowości w somytach (Rycina 2), które utraciły swój wyraźny kształt w literę V (chevron), widoczny w nieleczonych kontrolach, i bardziej przypominają somyty w kształcie litery U, charakterystyczne dla fenotypów obserwowanych przy zredukowanym sygnale sonic¹⁴. Kąt somytów można zmierzyć przy użyciu standardowego oprogramowania; kąt ten zwiększa się z 92,1 ± 4,6° w nieleczonych kontrolach do 122,6 ± 6,6° w zarodkach traktowanych etanolem (p < 0,001).

Kolejnym następstwem ekspozycji na etanol, które może wynikać z wczesnego opóźnienia rozwojowego i późniejszych wad notochordu, jest skrócenie długości zarodka (Rycina 3). Nawet przy pomiarach zarodków uwzględniających zakrzywienie wywołane ekspozycją na etanol, ekspozycja ta prowadzi do skrócenia tułowia, co jest zależne od dawki etanolu, na którą wystawiony był zarodek (Rycina 3E¹⁴). Wynik ten jest podobny do utrzymującego się niskiego wzrostu przed okresem dojrzewania u dzieci eksponowanych na etanol podczas rozwoju^{16, 17}, co sugeruje, że model danio pręgowanego jest istotny dla zrozumienia tej wady wrodzonej u ludzi.

Jedną z klasycznych cech FAS jest charakterystyczny wygląd twarzy, obejmujący niedorozwój żuchwy, wąskie szczeliny oczne oraz wygładzone wgłębienie nadwargowe. Wiele z tych cech wiąże się z redukcją tkanek linii środkowej. Na modelach zwierzęcych wykazano, że silna ekspozycja na etanol prowadzi do jeszcze bardziej wyraźnych fenotypów, w tym synoftalmii i cyklopii. Podczas narażania embrionów danio pręgowanego na zwiększone dawki etanolu, odległość międzygałkowa (IOD) zmniejsza się w sposób zależny od dawki (Rysunek 4), co jest zgodne z naturą ludzkiej wady wrodzonej. Cyklopia występuje jedynie przy bardzo wysokich dawkach, ale niższe dawki powodują znaczną redukcję IOD (Rysunek 4), co sugeruje, że model zwierzęcy ten wykazuje podobną wadę w rozwoju linii środkowej twarzy¹⁰.

Aby zrozumieć mechanizm leżący u podstaw wad ciała i twarzy wywołanych ekspozycją na etanol, dążyliśmy do ustalenia zmian w ekspresji genów, które występują wczesnym etapie rozwoju i mogą racjonalnie przyczyniać się do późniejszych defektów rozwojowych. Realizujemy to na dwa sposoby: ekstrakcja mRNA z embrionów pozwala na ilościową ocenę poziomów ekspresji genów w embrionach traktowanych etanolem w porównaniu z grupą kontrolną (Rysunek 1A). Dodatkowo możemy przeprowadzić hybrydyzację in situ, aby przyjrzeć się wzorcowi ekspresji genów, niezależnie od tego, czy sygnał uległ zmniejszeniu (Rysunek 1B-G¹⁸). W tym przykładzie pokazano dwa geny, których ekspresja zmniejsza się po ekspozycji na etanol: gli1 oraz six3b. Analiza wzorca in situ dla six3b wykazała zmniejszenie zasięgu przestrzennego ekspresji tego genu (Rysunek 1 E-G) w embrionach eksponowanych na etanol. Podobne zmniejszenie odnotowano w przypadku genu gsc (Rysunek B-D). Zarówno six3b, jak i gsc ulegają ekspresji w tkankach przeznaczonych do tworzenia tkanek linii środkowej czaszkowo-twarzowej. Zatem redukcja tych genów w 8 hpf jest spójna ze zmniejszeniem IOD stwierdzonym w późniejszym czasie, co pokazano na Rysunku 4.

Po zidentyfikowaniu genów pod wpływem etanolu można zastosować mechanizmy pozwalające na zwiększenie lub zmniejszenie ich ekspresji. W tym konkretnym przykładzie za pomocą qPCR wykazaliśmy obniżenie poziomu dwóch genów (gli1 oraz six3b). Postanowiliśmy wstrzyknąć mRNA, aby sprawdzić, czy odwrócenie tych zmian genetycznych może poprawić wyniki. W tym doświadczeniu zamiast wstrzykiwania gli1, zdecydowaliśmy się wstrzyknąć shh, ligand zwiększający poziomy gli1. W przypadku six3b, byliśmy w stanie wstrzyknąć sam six3b. Nie stwierdzono żadnych zmian po wstrzyknięciu six3b (dane nie przedstawiono), jednak udało się zasadniczo zniwelować wady morfologiczne w embrionach danio pręgowanego dzięki dodatkowym iniekcjom shh (Rycina 5).

Rysunek 1. Ekspozycja na etanol zmienia wczesny wzorzec i poziomy ekspresji wybranych genów rozwojowych. A) Wyniki qPCR dla embrionów w 8 hpf. Przedstawiono wyniki dla dwóch genów: six3b oraz gli1. Wyniki ukazano jako średnią z trzech oddzielnych eksperymentów przy dawce etanolu 2,5%. Ekspresja obu genów jest obniżona w sposób istotny w porównaniu z kontrolą (test t, p < 0,05). B-G) Hybrydyzacja in situ embrionów danio pręgowanego w 8 hpf. W tym punkcie czasowym wzorce dla gsc i six3b są zmienione w porównaniu z grupami kontrolnymi. (Zmodyfikowano za zgodą Loucks et al. 2007).

Rycina 2. Rozwój somitów u zarodków poddanych działaniu preparatu jest zaburzony. Strukturę i kąty somitów badano w 48 hpf. U zarodków kontrolnych (A) somity mają kształt ostrosłupa i ostry kąt. U ryb danio pręgowanego poddanych działaniu etanolu obserwuje się więcej somitów w kształcie litery I lub U oraz mniej ostre kąty. (Zmodyfikowano za zgodą Loucks and Ahlgren 2009).

Rycina 3. Traktowanie etanolem znacząco zmniejsza długość ciała u danio pręgowanego. Długość embrionów niepoddanych działaniu etanolu oraz tych eksponowanych na etanol zmierzono w 5. dobie po zapłodnieniu. Znaczący spadek długości zaobserwowano u wszystkich traktowanych embrionów (ANOVA, p < 0,001). B-D. Odnotowano niewielki, lecz istotny spadek całkowitej długości embrionów traktowanych 1,0% i 1,5% etanolem, natomiast większy spadek zaobserwowano u embrionów otrzymujących dawki 2,0% i 2,5% etanolu. E. Aby skontrolować różnice w wielkości w obrębie każdego wysiewu, embriony kontrolne dla każdego eksperymentu znormalizowano do wartości 100, a traktowane embriony z tego samego miotu wyrażono jako procent wartości 100. (Zmodyfikowano za zgodą Loucks i Ahlgren 2009).

Rycina 4. Ekspozycja na etanol prowadzi do zmniejszenia odległości międzyocznej (iod) u embrionów danio pręgowanego. A) Widoki frontalne embrionów obrazują fenotypy oczu prawidłowych oraz zrośniętych. B) Różne dawki etanolu podane przez 3 godziny podczas gastrulacji skutkują zmniejszeniem iod w badaniu ryb po 24 godzinach. Zrośnięte oczy i cyklopia są obserwowane wyłącznie przy najwyższej badanej dawce (2,4%). * oznacza istotne statystycznie zmniejszenie iod w porównaniu z grupą kontrolną. (zmodyfikowano za zgodą Ahlgrena, 2004).

Rysunek 5. shh-NmRNA odwraca ogólne wady wywołane ekspozycją zarodków zebrafish na etanol. Zarodki w stadium jednej lub dwóch komórek wstrzyknięto 100 pg/nl shh-NmRNA, a połowę z nich poddano działaniu standardowych dawek etanolu od 4,3 do 24 hpf. Zarodki przeanalizowano w 5 dpf. Zarodki traktowane 2,0% etanolem wykazują krótsze, wygięte grzbietowo ogony, somity w kształcie litery I oraz wady oczu, w tym cyklopię. Odwrócenie tych fenotypów zaobserwowano u 71/76 wstrzykniętych zarodków (93%). W tych zarodkach ciało jest proste, somity mają kształt szewrona, a oczy są całkowicie rozdzielone.

Dyskusja

Metody opisane w niniejszym materiale oraz przedstawione wyniki stanowią jedynie zarys możliwości wykorzystania danio pręgowanych do badania wad rozwojowych. Ze względu na łatwy dostęp do zarodka, dużą liczbę jaj w każdym cyklu tarła oraz wysoką powtarzalność wyników, kręgowce te są idealne do badań teratogennych. Ryby można również modyfikować tak, aby zawierały cząsteczki fluorescencyjne, służące jako wizualny reporter dla konkretnego genu lub interesującej badacza ścieżki sygnałowej¹⁹. W badaniach nad etanolem zastosowane dawki wydają się dość wysokie w porównaniu z poziomem alkoholu we krwi ssaków. Poziomy te odzwierciedlają jednak stężenie w wodzie, a nie cały etanol nie dociera do zarodka.

Podsumowując, opisane i szczegółowo omówione powyżej metody sugerują, że embriony danio pręgowanego są niezwykle użyteczne w modelowaniu ludzkich wad wrodzonych związanych z ekspozycją na etanol. Ponadto zmiany w ekspresji genów zaobserwowane u danio pręgowanego zostały potwierdzone przez innych badaczy w modelach ssaków²⁰, co sugeruje, że wpływ etanolu na rozwój jest zachowany u wszystkich kręgowców. Wiele z zaprezentowanych powyżej technik można zastosować w przypadku innych czynników środowiskowych lub farmakologicznych, aby szybko i łatwo wykrywać potencjalne teratogeny oraz określać mechanizmy leżące u podstaw teratogenezy wywoływanej przez konkretną substancję.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zestaw do izolacji RNA z tkanek: 5-Prime PerfectPure	Fisher Scientific	FP2302410
Platinum SYBR green qPCR SuperMix-UDG	Invitrogen	11733038
Zestaw do wysokowydajnej transkrypcji RNA z cappingiem mMessage mMachine	Applied Biosystems	Zależnie od polimerazy RNA w plazmidzie