Ocena zmian teratogennych w modelu ekspozycji płodowej na alkohol u rybek danio pręgowanych

Podsumowanie

Aby zrozumieć molekularne mechanizmy uszkodzeń rozwojowych wywołanych przez etanol, opracowaliśmy model ekspozycji na etanol u rybek danio (zebrafish) i badamy zmiany fizyczne, komórkowe oraz genetyczne występujące po takiej ekspozycji¹. Następnie dążymy do znalezienia potencjalnych interwencji i ich szybkiego przetestowania w tym modelu zwierzęcym.

Streszczenie

Zespół alkoholowy płodu (FAS) jest ciężką postacią ekspozycji embrionalnej na etanol. Charakteryzuje się on typowymi wadami twarzy i narządów, w tym opóźnieniem rozwoju psychicznego wynikającym z zaburzonego i uszkodzonego rozwoju mózgu. Spektrum zaburzeń alkoholowych płodu (FASD) to termin obejmujący kontinuum wad wrodzonych występujących w wyniku spożywania alkoholu przez matkę, które dotyczy około 4% dzieci urodzonych w Stanach Zjednoczonych. Biorąc pod uwagę, że 50% kobiet w wieku rozrodczym deklaruje spożywanie alkoholu, a połowa wszystkich ciąż jest niezaplanowana, niezamierzona ekspozycja pozostaje aktualnym problemem². Aby jak najlepiej zrozumieć uszkodzenia wywołane przez etanol oraz stworzyć model do testowania potencjalnych interwencji, opracowaliśmy model rozwojowej ekspozycji na etanol z wykorzystaniem embrionu danio pręgowanego. Danio pręgowane są idealne do tego rodzaju badań teratogennych^3-8. Każda para składa setki jaj, które można następnie zebrać bez szkody dla dorosłych ryb. Embrion danio pręgowanego jest przezroczysty i może być łatwo obrazowany przy użyciu wielu rodzajów barwień. Analiza tych embrionów po ekspozycji na etanol w różnych dawkach, czasie trwania i sposobach aplikacji pokazuje, że ogólne wady rozwojowe wywołane przez etanol są spójne z ludzkimi wadami wrodzonymi. W niniejszym opracowaniu opisano podstawowe techniki stosowane do badania i manipulacji w modelu FAS u danio pręgowanych.

Protokół

1. Obróbka zarodków etanolem

1. Zarodki danio pręgowanego pochodzące z krzyżówek typu dzikiego hodowano w temperaturze 28 °C w 5 ml wody do zarodków (woda Milli-Q z dodatkiem 60 mg/L Instant Ocean). Różne linie zarodków typu dzikiego wykazują nieco inną tolerancję na ekspozycję na etanol⁹.
2. Ekspozycję na etanol rozpoczynano w stadium kopuły (~4,3 godziny po zapłodnieniu, hpf) na wybrany czas, do maksymalnie 24-godzinnego impulsu. Stadium początkowe to jest w przybliżeniu odpowiednikiem stadium implantacji zarodków ssaków, tuż przed gastrulacją. Stężenia etanolu wynoszą od 0,2% do 2,5%, objętość/objętość. Badania wykazały, że od 25% do 50% roztworu zawartego w wodzie przenika do rozwijającego się zarodka^{10, 11}. Zarodki utrzymuje się w temperaturze 28 °C przez wybrany czas. Po zakończeniu ekspozycji na etanol roztwór etanolowo-wodny usuwa się i zastępuje trzykrotnym przemyciem standardową wodą dla danio pręgowanego, a następnie inkubuje przez wybrany czas. Specyfika wady zależy od momentu rozpoczęcia, dawki oraz czasu trwania impulsu etanolu.

2. Pobieranie embrionów do analizy RNA, hybrydyzacji in situ, barwienia przeciwciałami oraz barwienia chrząstki

1. W celu pobrania mRNA do qPCR, embriony w tym samym wieku zbierane są do probówek Eppendorf. Po usunięciu wody z zebrafish dodawany jest bufor lizujący z TCEP. Do fizycznej dysocjacji embrionów w roztworze lizującym wykorzystuje się zmotoryzowany pulveryzator. Następnie roztwór przepuszcza się przez kolumnę do wstępnego oczyszczania (preclear), która usuwa wszelkie niedysocjowane duże fragmenty. Otrzymany roztwór zawiera wszystkie makrocząsteczki uwolnione w procesie lizy. RNA jest następnie ekstrahowane poprzez przepuszczenie roztworu przez kolumnę, a następnie poddane etapom płukania i traktowaniu DNazą. Elucję przeprowadza się przy użyciu wody lub roztworu elucyjnego dostarczonego przez producenta (5'-Prime). RNA może zostać przekształcone w cDNA przy użyciu standardowych technik qPCR lub wykorzystane w analizie mikroarray.
2. Do hybrydyzacji in situ i barwienia przeciwciałami, embriony od 6 do 24 hpf utrwalano w 4% paraformaldehydzie przez noc w temperaturze 4 °C. Następnie przeprowadzano 3 płukania w PBS + 0,1% Tween (PBT), aby zapobiec sklejaniu się embrionów. Embriony przenoszono następnie przez serię 3 płukań w metanolu:PBT do 100% metanolu, po czym mogły być one przechowywane w temperaturze -20 °C. Tak przygotowane embriony mogą być wykorzystane do hybrydyzacji in situ lub barwienia przeciwciałami. Niektóre przeciwciała nie działają po traktowaniu metanolem, dlatego należy wziąć pod uwagę to zastrzeżenie i przetestować konkretne przeciwciało, aby sprawdzić, czy będzie ono skuteczne po obróbce metanolem.
3. Do barwienia chrząstki embriony muszą zostać doprowadzone do 5 lub 6 dni po zapłodnieniu (dpf). Następnie utrwala się je w 4% paraformaldehydzie przez noc w temperaturze 4 °C, a następnie przeprowadza 3 płukania w PBT.

3. Ocena zmian w ekspresji genów indukowanych etanolem oraz konsekwencji rozwojowych

1. Aby określić zmiany poziomów ekspresji genów, analizowane geny badane są za pomocą qPCR oraz hybrydyzacji in situ. qPCR przeprowadza się przy użyciu starterów zaprojektowanych w oprogramowaniu Integrated DNA Technologies (IDT), a następnie walidowanych na 3 oddzielnych próbkach biologicznych. Po walidacji starterów qPCR wykonuje się na cDNA otrzymanym z zebranych próbek RNA. Każda próbka jest analizowana w trzech powtórzeniach. Reakcje PCR przeprowadzane są z użyciem Platinum SYBR Green qPCR Super mix (Invitrogen) na urządzeniu Chroma-4 PCR (BioRad) lub podobnym termocyklerze z systemem detekcji wielokolorowej. Oprócz badanych genów krytyczne jest zastosowanie zestawu starterów kontrolnych w celu zrównoważenia niewielkich różnic w przygotowaniu cDNA lub RNA. W przypadku zarodków danio-pręgowanego stosujemy gapdh: 5'GAAGGTGGGAAACTGGTCAT3' oraz 5'TTGCACCACCCTTAATGTGA3'. Analizowane geny są następnie normalizowane względem poziomów gapdh, a względną kwantyfikację ekspresji genów oblicza się za pomocą wariantu metody Pfaffla opartej na 2^{- Ct}, prezentując dane jako krotność różnicy między grupą eksperymentalną a grupą typu dzikiego¹². Standardowe obliczenia zakładają, że wszystkie geny duplikują DNA dwukrotnie w każdym cyklu, i tym samym wyrażają dane jako stosunek zmiany w genie eksperymentalnym do zmiany w genie referencyjnym, zapisany jako obliczenia potęgowe z podstawą „2”, która reprezentuje wydajność podwojenia DNA na cykl w idealnej reakcji PCR. Metoda Pfaffla zastępuje generyczną wartość „2” rzeczywistą wydajnością starterów PCR wyznaczoną przez eksperymentatora. Pozwala to na dokładniejsze odzwierciedlenie różnic w reakcjach PCR. Pełny wzór to:
   

   (Wydajność genu eksperymentalnego)(Ct próbki kontrolnej - Ct próbki traktowanej)

   -------------------------------------------------------------------------------------

   (Wydajność genu referencyjnego)(Ct próbki kontrolnej - Ct próbki traktowanej)

2. Do hybrydyzacji in situ konstruuje się ryboproby znakowane digoksigeniną (dig) z plazmidów zawierających fragmenty interesującego genu. Zarodki w tym samym wieku poddaje się działaniu ryboprob w standardowych warunkach¹³, a następnie wykrywa za pomocą przeciwciał anty-dig sprzężonych z fosfatazą alkaliczną, co pozwala na lokalizację znakowanych ryboprob za pomocą reakcji barwnej (NBT/BCIP). Zarodki są następnie wizualizowane za pomocą mikroskopu stereoskopowego Leica (Rycina 1B-G).
3. Aby ocenić rozwój morfogenetyczny, zarodki zbiera się w wybranym czasie i bada pod mikroskopem stereoskopowym. W przypadku kształtu somitów obrazowane są żywe zarodki ¹⁴. Do pomiaru odległości międzyocznej i długości ciała zarodki utrwalane są w PFA. W każdym przypadku obrazy interesującego obszaru są rejestrowane za pomocą mikroskopu stereoskopowego przy stałym powiększeniu, a pomiary wykonywane są w oprogramowaniu Adobe Photoshop ^10,14.
4. Aby zbadać wpływ traktowania na rozwijające się struktury chrzęstne w larwach danio-pręgowanego, stosujemy barwienie błękitem Alcian. Utrwalone larwy danio-pręgowanego traktuje się roztworem błękitu Alcian rozpuszczonym w 80% etanolu: 20% octu lodowego (alkohol kwasowy) przez kilka godzin lub przez noc. Larwy są odbarwiane w kilku płukaniach alkoholem kwasowym, a następnie przenoszone do roztworu 1% KOH i 3% nadtlenku wodoru w celu dalszego przejrzyszczania komórek pigmentowych. Larwy danio-pręgowanego muszą mieć co najmniej 4 dni, aby wykazać struktury chrzęstne, które są lepiej zdefiniowane u ryb w wieku 5 lub 6 dni.
5. Śmierć komórek w żywych zarodkach ocenia się za pomocą pomarańczowej akrydyny (AO). AO nie przenika przez błony żywych komórek i wiąże się z DNA w komórkach o uszkodzonych błonach, w tym w tych przechodzących apoptozę i nekrozę. Żywe zarodki inkubuje się z 5 mg/ml AO w PBS przez 1 godzinę, po czym wykonuje się 3 płukania w PBS. Zarodki są następnie obrazowane za pomocą mikroskopu konfokalnego. Cyfrowe obrazy z serii Z są łączone w celu stworzenia kompozytów.

4. Manipulacja zarodkiem rybki danio

1. Po zidentyfikowaniu genów, których ekspresja ulega obniżeniu pod wpływem etanolu, można podjąć próbę ich uzupełnienia poprzez wstrzyknięcie mRNA zaprojektowanego w celu zastąpienia brakującego genu. mRNA z czapką jest transkrybowane z linearyzowanych plazmidów DNA przy użyciu zestawów do transkrypcji RNA polimerazą in vitro, zgodnie z instrukcjami producenta (mMessage Machine, Applied Biosystems). Do jaj zebrafish w stadium 1-2 komórek wstrzykuje się od 25-200 pg/nl RNA w roztworze 0,1 M KCl. Następnie pozwala się zarodkom na regenerację przed poddaniem ich działaniu etanolu, jak opisano powyżej (Rysunek 5).
2. W przypadku transkryptów genów, których poziom wzrasta pod wpływem etanolu, można je zredukować lub wyciszyć („knock-down”) przy użyciu technologii antysensownych morfolino. Antysensowne morfolino (AMOs) są projektowane przez firmę Gene Tools i blokują translację RNA na białko lub blokują dojrzewanie i splicing RNA, w zależności od potrzeb eksperymentalnych. Działanie morfolino ogranicza ilość aktywnego białka dla ukierunkowanego genu; deficyt ten można zmierzyć przy użyciu przeciwciał, jeśli są one dostępne. Wydajność morfolino blokujących splicing RNA można zmierzyć za pomocą RT-PCR, aby wykryć względne ilości transkryptów splicowanych i niesplicowanych. Miareczkowanie morfolino może prowadzić do aktywności zależnej od dawki¹⁵. AMOs są rozcieńczane do stężeń roboczych (miareczkowane stężenia od pg do ng) w roztworze Danieau (58 mM NaCl, 0,7 mM KCl, 0,4 mM MgSO₄, 0,6 mM Ca(NO₃)₂, 5 mM HEPES, pH 7,6). Iniekcja odbywa się w stadium 1-2 komórek, a następnie pozwala się zarodkom na rozwój przed poddaniem ich działaniu etanolu, jak opisano powyżej.

5. Reprezentatywne wyniki

Narażenie zarodków danio pręgowanego na etanol prowadzi do szeregu wad rozwojowych i genetycznych, które są powiązane z fenotypami występującymi u innych kręgowców. Udokumentowaliśmy nieprawidłowy rozwój tkanek osiowych, w tym notochordu (dane nie pokazane¹⁴). Opóźnienie rozwojowe wywołane przez etanol najwyraźniej prowadzi do zaburzenia prawidłowego wydłużania się notochordu, co skutkuje jego skróceniem, a sporadycznie również przerwaniem jego ciągłości (dane nie pokazane¹⁴). To wczesne opóźnienie i wada notochordu prawdopodobnie przyczyniają się częściowo do późniejszych nieprawidłowości w somytach (Rysunek 2), które utraciły swój wyraźny kształt w literę V (chevron), widoczny w nieleczonych kontrolach, i bardziej przypominają somyty w kształcie litery U, charakterystyczne dla fenotypów obserwowanych przy zredukowanym sygnale sonic¹⁴. Kąt somytów można zmierzyć za pomocą standardowego oprogramowania; kąt ten zwiększa się z 92,1 ± 4,6° w nieleczonych kontrolach do 122,6 ± 6,6° w zarodkach traktowanych etanolem (p < 0,001).

Kolejnym następstwem ekspozycji na etanol, które może wynikać z wczesnego opóźnienia rozwojowego i późniejszych wad notochordu, jest skrócona długość zarodka (Rysunek 3). Nawet przy pomiarach zarodków uwzględniających zakrzywienie wywołane ekspozycją na etanol, działanie to prowadzi do skrócenia tułowia, co jest zależne od dawki etanolu, na którą wystawiono zarodek (Rysunek 3E¹⁴). Wynik ten jest podobny do utrzymującego się niskiego wzrostu przed okresem dojrzewania u dzieci narażonych na etanol podczas rozwoju^{16, 17}, co sugeruje, że model danio pręgowanego jest istotny dla zrozumienia tej ludzkiej wady wrodzonej.

Jedną z klasycznych cech FAS jest charakterystyczny wygląd twarzy, obejmujący niedorozwój żuchwy, małe szczeliny eyelids oraz wygładzone wgłębienie nadustne. Wiele z tych cech wiąże się z redukcją tkanek linii pośrodkowej. Wykazano na modelach zwierzęcych, że silna ekspozycja na etanol prowadzi do jeszcze bardziej wyraźnych fenotypów, w tym synoftalmii i cyklopii. Podczas narażania embrionów rybek danio na zwiększone dawki etanolu, odległość międzygałkowa (IOD) zmniejsza się w sposób zależny od dawki (Rysunek 4), co jest zgodne z charakterem ludzkiej wady wrodzonej. Cyklopia występuje jedynie przy bardzo wysokich dawkach, jednak niższe dawki powodują znaczną redukcję IOD (Rysunek 4), co sugeruje, że ten model zwierzęcy wykazuje podobną wadę w rozwoju linii pośrodkowej twarzy¹⁰.

Aby zrozumieć mechanizm leżący u podstaw wad ciała i twarzy wywołanych ekspozycją na etanol, dążyliśmy do ustalenia zmian w ekspresji genów, które występują wcześnie w rozwoju i które mogą racjonalnie przyczyniać się do późniejszych wad rozwojowych. Robimy to na dwa sposoby: ekstrakcja mRNA z embrionów pozwala na ilościową ocenę poziomów ekspresji genów w embrionach traktowanych etanolem w porównaniu z grupą kontrolną (Rysunek 1A). Dodatkowo możemy przeprowadzić hybrydyzację in situ, aby zbadać wzorzec ekspresji genów, niezależnie od tego, czy sygnał jest osłabiony, czy nie (Rysunek 1B-G¹⁸). W tym przykładzie pokazano dwa geny, których ekspresja ulega zmniejszeniu po ekspozycji na etanol: gli1 oraz six3b. Analizując wzorzec in situ dla six3b, stwierdziliśmy zmniejszenie przestrzennego zakresu ekspresji tego genu (Rysunek 1 E-G) w embrionach narażonych na etanol. Podobne zmniejszenie odnotowano w przypadku genu gsc (Rysunek B-D). Zarówno six3b, jak i gsc są eksprimowane w tkankach, które w przyszłości będą tworzyć tkanki linii środkowej twarzoczaszki. Zatem redukcja tych genów w 8 hpf jest zgodna z późniejszym zmniejszeniem IOD, co pokazano na Rysunku 4.

Po zidentyfikowaniu genów pod wpływem etanolu istnieją mechanizmy, dzięki którym ich ekspresję można zwiększyć lub zmniejszyć. W tym konkretnym przykładzie za pomocą qPCR wykazaliśmy dwa geny, których ekspresja uległa zmniejszeniu (gli1 i six3b). Postanowiliśmy wstrzyknąć mRNA, aby sprawdzić, czy odwrócenie tych zmian genetycznych może poprawić wyniki. W tym doświadczeniu zamiast wstrzykiwać gli1, zdecydowaliśmy się na wstrzyknięcie shh, liganda zwiększającego poziom gli1. W przypadku six3b mogliśmy wstrzyknąć sam six3b. Nie odnotowaliśmy żadnych zmian po wstrzyknięciu six3b (dane nie zostały przedstawione), lecz zdołaliśmy zasadniczo zniwelować wady morfologiczne w embrionach rybek danio pręgowany poprzez dodatkowe wstrzyknięcia shh (Rysunek 5).

Rysunek 1. Ekspozycja na etanol zmienia wczesny wzorzec oraz poziomy ekspresji wybranych genów rozwojowych. A) Wyniki qPCR dla zarodków w 8 hpf. Przedstawiono wyniki dla dwóch genów: six3b oraz gli1. Wyniki przedstawiono jako średnią z trzech oddzielnych eksperymentów, a zastosowana dawka etanolu wynosi 2.5%. Ekspresja obu genów jest obniżona w sposób istotny w porównaniu z kontrolą (test t, p < 0.05). B-G) Hybrydyzacja in situ zarodków danio pręgowanego w 8 hpf. W tym punkcie czasowym wzorce obu genów, gsc oraz six3b, są zmienione w porównaniu z kontrolą. (Opracowano za zgodą Loucks et al. 2007).

Rycina 2. Rozwój somytów jest zaburzony w zarodkach poddanych działaniu preparatu. Strukturę i kąty somytów badano w 48 hpf. W zarodkach kontrolnych (A) somyty mają kształt litery V i ostry kąt. Rybki danio eksponowane na etanol wykazują częściej somyty w kształcie litery I lub U oraz mniej ostre kąty. (Zmodyfikowano za zgodą Loucks i Ahlgren 2009).

Rysunek 3. Traktowanie etanolem znacząco zmniejsza długość ciała u danio-osteoma. Długość zarodków nietraktowanych oraz narażonych na etanol mierzono w 5. dobie po zapłodnieniu. Znaczący spadek długości zaobserwowano u wszystkich traktowanych zarodków (ANOVA, p < 0.001). B-D. Odnotowano niewielki, ale istotny spadek całkowitej długości zarodków traktowanych 1,0% i 1,5% etanolem, natomiast większy spadek zaobserwowano u zarodków otrzymujących dawki 2,0% i 2,5% etanolu. E. Aby skontrolować różnice w wielkości w obrębie każdego cyklu, zarodki kontrolne dla każdego eksperymentu znormalizowano do wartości 100, a traktowane zarodki z tego samego cyklu wyrażono jako procent wartości 100. (Zmodyfikowano za zgodą Loucks i Ahlgren 2009).

Rycina 4. Ekspozycja na etanol prowadzi do zmniejszenia odległości międzygałkowej (iod) u zarodków ryby danio. A) Widoki frontalne zarodków przedstawiają prawidłowy fenotyp oraz fenotyp z zrośniętymi oczami. B) Różne dawki etanolu podane przez 3 godziny podczas gastrulacji skutkują zmniejszeniem iod w badaniu ryb po 24 godzinach. Zrośnięte oczy i cyklopia występują jedynie przy najwyższej badanej dawce (2,4%). * oznacza istotne zmniejszenie iod w porównaniu z grupą kontrolną. (zmodyfikowano za zgodą Ahlgren, 2004).

Rycina 5. shh-NmRNA wstrzyknięte w celu zniwelowania ogólnych wad powstałych w wyniku ekspozycji zarodków danio pręgowanego na etanol. Do zarodków w stadium jednej lub dwóch komórek wstrzyknięto 100 pg/nl shh-NmRNA, a połowę wstrzykniętych zarodków poddano działaniu standardowych dawek etanolu od 4,3 do 24 hpf. Zarodki analizowano w 5 dpf. Zarodki traktowane 2,0% etanolu wykazują zakrzywione grzbietowo krótsze ogony, somity w kształcie litery I oraz wady oczu, w tym cyklopię. Odzyskanie prawidłowego fenotypu zaobserwowano u 71/76 wstrzykniętych zarodków (93%). W tych zarodkach ciało jest proste, somity mają kształt grotu strzały, a oczy są całkowicie rozdzielone.

Dyskusja

Metody opisane w niniejszym materiale oraz przedstawione wyniki stanowią jedynie zarys możliwości wykorzystania danio pręgowanych do badania wad rozwojowych. Ze względu na łatwy dostęp do zarodka, dużą liczbę jaj w każdym cyklu tarła oraz wysoką powtarzalność wyników, kręgowce te są idealne do badań teratogennych. Ryby można również modyfikować tak, aby zawierały cząsteczki fluorescencyjne, służące jako wizualny reporter dla konkretnego genu lub interesującej badacza ścieżki sygnałowej¹⁹. W badaniach nad etanolem zastosowane dawki wydają się dość wysokie w porównaniu z poziomem alkoholu we krwi ssaków. Poziomy te odzwierciedlają jednak stężenie w wodzie, a nie cały etanol nie dociera do zarodka.

Podsumowując, opisane i szczegółowo omówione powyżej metody sugerują, że embriony danio pręgowanego są niezwykle użyteczne w modelowaniu ludzkich wad wrodzonych związanych z ekspozycją na etanol. Ponadto zmiany w ekspresji genów zaobserwowane u danio pręgowanego zostały potwierdzone przez innych badaczy w modelach ssaków²⁰, co sugeruje, że wpływ etanolu na rozwój jest zachowany u wszystkich kręgowców. Wiele z zaprezentowanych powyżej technik można zastosować w przypadku innych czynników środowiskowych lub farmakologicznych, aby szybko i łatwo wykrywać potencjalne teratogeny oraz określać mechanizmy leżące u podstaw teratogenezy wywoływanej przez konkretną substancję.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zestaw do izolacji RNA z tkanek: 5-Prime PerfectPure	Fisher Scientific	FP2302410
Platinum SYBR green qPCR SuperMix-UDG	Invitrogen	11733038
Zestaw do wysokowydajnej transkrypcji RNA z cappingiem mMessage mMachine	Applied Biosystems	Zależnie od polimerazy RNA w plazmidzie