Kriokonserwacja i odzyskiwanie plemników myszy przy użyciu zestawu I·Cryo

Podsumowanie

W niniejszej pracy prezentujemy nowo opracowany zestaw I•Cryo do krio konserwacji plemników myszy. Dzięki zastosowaniu tego zestawu konsekwentnie poprawiono rozwój embrionów w stadium dwóchkomórkowym po rozmrożeniu plemników w 5 szczepach myszy. W okresie 1,5 roku zarchiwizowano 49 genetycznie zmodyfikowanych linii myszy poprzez krio konserwację plemników za pomocą zestawu I•Cryo, a następnie pomyślnie odzyskano je metodą IVF.

Streszczenie

Od czasu wprowadzenia technologii transgenezy i nokautu stworzono tysiące nowych genetycznie zmodyfikowanych (GM) szczepów myszy. Wiele z tych cennych zwierząt istnieje jedynie w formie żywych osobników, bez planu awaryjnego na wypadek sytuacji kryzysowej. Kriokonserwacja zarodków może zapewnić takie zabezpieczenie, jednak jest kosztowna, może być procedurą długotrwałą i zazwyczaj wymaga użycia licznej grupy zwierząt, aby odnieść sukces. Od czasu odkrycia, że plemniki myszy można skutecznie kriokonserwować za pomocą podstawowego środka krioprotekcyjnego (CPA) składającego się z 18% rafinozy i 3% mleka odtłuszczonego, kriokonserwacja plemników stała się akceptowalną i ekonomicznie opłacalną procedurą archiwizowania, dystrybucji i odzyskiwania tych cennych szczepów.

W niniejszym materiale prezentujemy nowo opracowany zestaw I•Cryo do krio konserwacji plemników myszy. Plemniki z pięciu powszechnie stosowanych szczepów myszy inbredowych zostały zamrożone przy użyciu tego zestawu, a następnie rozmrożone. W pięciu szczepach myszy inbredowych zaobserwowano wyższe wskaźniki ochrony ruchliwości plemników (> 60%) oraz ruchliwości progresywnej szybkiej (> 45%) w porównaniu z grupą kontrolną (podstawowy CPA) dla plemników zamrożonych za pomocą tego zestawu. Rozwój embrionów do stadium dwóch blastomerów po IVF z użyciem odzyskanych plemników uległ konsekwentnej poprawie we wszystkich 5 badanych szczepach myszy. W okresie 1,5 roku zarchiwizowano 49 linii myszy GM poprzez krio konserwację plemników za pomocą zestawu I•Cryo, a następnie odzyskano je w procesie IVF.

Protokół

1. Kriokonserwacja plemników myszy

1. Dla każdej linii przeznaczonej do krio konserwacji, przed rozpoczęciem przygotuj następujące elementy:
   1. 1 dołek płytki 4-dołkowej zawierający 240 l zestawowego CPA
   2. 15 słomek do krio konserwacji plemników w następujący sposób:
      1. Połącz słomki 0,25 ml ze strzykawkami 1 ml tak, aby bawełniany czop znajdował się najbliżej strzykawki. Do każdej słomki naciągnij 8 cm (około 160 μl) medium IVF, a następnie 1 cm powietrza. Oznacz słomki nazwą linii przeznaczonej do konserwacji.
2. LN₂ powinien znajdować się na głębokości 15 cm w pudełku styropianowym. Zamknij pokrywę.
3. Uśmierć 2 samce myszy z każdej linii przeznaczonej do krio konserwacji. Myszy powinny być w wieku od 10 do 60 tygodni. Usuń oba najogonowe najaąd라 (epididymides) wraz z przewodami nasiennymi od każdej myszy.
4. Umieść najaąd라 w uprzednio przygotowanym dołku płytki 4-dołkowej zawierającym CPA (krok 1.1).
5. Wykonaj 5-7 nacięć wzdłużnych w każdym najaądle i delikatnie uciśnij każdy przewód nasienny, aby wypchnąć plemniki.
6. Delikatnie wstrząśnij ręcznie mieszaniną CPA i najaądla w temperaturze pokojowej przez 3-5 minut. Pozwoli to plemnikom wypłynąć.
7. Używając wcześniej przygotowanej słomki, odessij 5 mm (około 10 μl) zawiesiny plemników, a następnie 1 cm powietrza.
8. Powtórz ten proces, aż do zapełnienia maksymalnie 15 słomek. W celu zapewnienia najlepszej przeżywalności plemników, napełnij i zapieczętuj słomki w ciągu 10 minut.
9. Ostrożnie zapieczętuj termicznie oba końce słomki. Umieść słomki w kanistrze do mrożenia, zaczynając od słupa plemników.
10. Do kanistra przymocuj dołączoną do zestawu pipetę 1 ml, aby przedłużyć uchwyt. Umieść kanister w LN₂ w pudełku styropianowym przez otwór w pokrywie. Pozostaw kanister w pozycji pionowej, aby dryfował w LN₂ przez 10 minut.
11. Zanurz kanister w LN2. Plemniki zostały poddane krio konserwacji i mogą zostać przeniesione do długoterminowego przechowywania w LN₂.
12. Kanistra nie należy używać do następnej linii, dopóki nie ogrzeje się do temperatury pokojowej.

2. Superowulacja u myszy

1. Zazwyczaj należy używać młodych samic myszy o tym samym tle genetycznym co dawcy plemników.
2. Myszki powinny ważyć ok. 12 g (wiek 3-4 tygodnie).
3. Wykonuje się wstrzyknięcie dosytronialne 5-10 IU gonadotropiny surowiczej klaczy ciężarnej (PMSG).
4. Należy odczekać 46-48 godzin.
5. Wykonuje się wstrzyknięcie dosytronialne 5-10 IU ludzkiej gonadotropiny kosmórki płodowej (hCG).
6. Oocyty należy pobrać 14-16 h po wstrzyknięciu hCG zgodnie z poniższym opisem.

3. Pozyskiwanie plemników myszych i IVF

1. Przed IVF, dla każdej słomki przeznaczonej do rozmrożenia, przygotować następujące elementy i inkubować przez co najmniej jedną godzinę w inkubatorze CO₂ w temperaturze 37°C.
   1. Szalka do inkubacji plemników: jedna szalka Petriego 35 mm z kroplą 90 μl medium do traktowania plemników (STM) przykrytą olejem.
   2. Szalka do wycinania: do pobrania oocytów od maksymalnie 10 superowulowanych samic, jedna szalka Petriego 35 mm z 3 ml medium do IVF.
   3. Dołek do IVF: dla każdej grupy 5 superowulowanych samic do IVF, jeden dołek w płytce 4-dołkowej z 500 μl medium do IVF (na przykład przy użyciu 10 superowulowanych samic będą potrzebne 2 dołki...)
   4. Szalka do płukania: jedna szalka Petriego 35 mm z 3 ml zoptymalizowanego medium potasowego simplex (KSOM) do płukania każdego użytego dołka płytki do IVF
   5. Szalka do hodowli: jedna szalka Petriego 35 mm z kroplami 50 μl medium KSOM przykrytymi olejem do hodowli embrionów z każdego dołka płytki do IVF.
2. Wyjąć słomkę z LN₂ i umieścić w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C na 2-3 minuty.
3. Wyjąć słomkę z kąpieli wodnej i wytrzeć, aby usunąć nadmiar wody. Wykonać pierwsze cięcie blisko pierwszej kolumny powietrza znajdującej się najbliżej zatyczki bawełnianej. Przeciąć słomkę w medium do IVF; przed kolumną plemników wciąż powinna być widoczna kolumna powietrza.
4. Następnie przeciąć koniec słomki w drugiej kolumnie powietrza, uważając, aby nie przeciąć kolumny plemników. Cięcie wykonać pod kątem 45° – znacznie ułatwi to aspirację plemników.
5. Aspirować zawiesinę plemników z dystalnego końca słomki za pomocą pipety 200 μl.
6. Umieścić zawiesinę plemników w centrum kropli STM i inkubować szalkę przez 45-60 minut w inkubatorze 37°C z 5% CO₂.
7. Podczas inkubacji plemników wypreparować jajowody superowulowanych samic do szalki do wycinania. Użyć igły 30 g lub pęsety, aby przerwać każdy jajowód, uwalniając kompleksy cumulus-oocyt (COC). Należy unikać przedostawania się tłuszczu i krwi do medium do IVF, ponieważ zanieczyszczone medium wymaga dodatkowych etapów płukania.
8. Po przerwaniu wszystkich jajowodów przenieść kompleksy COC od 5 samic do każdego z dołków do IVF. Liczba kompleksów COC uzyskanych w wyniku superowulacji jest silnie zależna od szczepu.
9. Pobrać 10-15 μl plemników z obwodu kropli STM i przeprowadzić zapłodnienie w jednym dołku IVF około 14-16 godzin po iniekcji hCG. Powtórzyć zapłodnienie dla każdego użytego dołka. Końcowe stężenie plemników wyniesie około 1 milion/ml.
10. Kulturować wspólnie plemniki i oocyty przez 4-6 godzin w inkubatorze 37°C z 5% CO₂.
11. Przepłukać embriony medium KSOM minimum 2 razy i hodować w kroplach KSOM w celu rozwoju w inkubatorze 37°C z 5% CO₂.
12. Wskaźnik IVF obliczono jako liczbę embrionów w stadium dwóchkomórkowym w stosunku do całkowitej liczby użytych oocytów po nocnej hodowli.

4. Reprezentatywne wyniki

Zamrożono plemniki pochodzące z 5 inbredowych szczepów myszy Charles River. Współczynniki ochrony obliczono poprzez podzielenie wartości oceny zamrożonych plemników przez wartości oceny plemników świeżych. Współczynniki ochrony ruchliwości plemników wynosiły odpowiednio 60,2%, 81,3%, 78,6%, 66,5% oraz 61,0% dla C57BL/6NCrl, 129S2/SvPasCrl, FVB/NCrl, DBA/2NCrl i BALB/cAnNCrl. Współczynniki ochrony dla szybkiej ruchliwości progresywnej wynosiły odpowiednio 47,3%, 69,4%, 57,0%, 52,8% oraz 54,1% w przypadku C57BL/6NCrl, 129S2/SvPasCrl, FVB/NCrl, DBA/2NCrl i BALB/cAnNCrl (Rys. 1).

Wskaźniki IVF z użyciem rozmrożonych plemników wyniosły odpowiednio 55,7%, 26,4%, 87,3%, 87,8% oraz 26,2% dla szczepów C57BL/6NCrl, 129S2/SvPasCrl, FVB/NCrl, DBA/2NCrl i BALB/cAnNCrl (Ryc. 2).

W okresie 1,5 roku 49 linii myszy GM zarchiwizowano poprzez kriokonserwację plemników. Linie te zostały później pomyślnie odzyskane (definiowane jako urodzenie żywych szczeniąt) za pomocą IVF u 4 szczepów samic (C57BL/6, BALB/c, DBA/1 oraz 129Sv) (Rys. 3).

Rycina 1. Współczynniki ochrony ruchliwości oraz szybkiej ruchliwości progresywnej plemników u myszy

Rysunek 2. In vitro zapłodnienie zamrożonymi i rozmrożonymi plemnikami u myszy

Rysunek 3. In vitro zapłodnienie zamrożonym i rozmrożonym nasieniem u myszy GM

Dyskusja

Od 1990 roku podstawowy protokół mrożenia plemników z wykorzystaniem 18% rafinozy i 3% mleka odtłuszczonego okazał się niezawodny u wielu szczepów myszy, a kriokonserwacji poddano liczne linie myszy ^{1,2,3,4,5,6,7}. Główne przyczyny uszkodzeń komórek plemników podczas procesu mrożenia i rozmrażania wiązano z tworzeniem się kryształków lodu ^8,9 oraz reaktywnymi formami tlenu ¹⁰. Badano wpływ suplementacji medium do mrożenia wymiataczami wolnych rodników, takimi jak aminokwasy, oraz reduktorami, takimi jak monotioglicerol, co okazało się znacząco zwiększać odsetek IVF z użyciem plemników rozmrożonych u szczepów inbredalnych, w tym C57BL/6 ^11,6.

W niniejszym protokole opracowaliśmy nowy zestaw I•Cryo do krio konserwacji plemników myszy poprzez optymalizację podstawowego CPA przy użyciu komercyjnie dostępnych przeciwutleniaczy i blokerów lodu oraz poprzez modyfikację procedury mrożenia plemników i IVF. W przypadku plemników z pięciu inbredowych szczepów myszy mrożonych za pomocą zestawu I•Cryo zaobserwowano wskaźniki ochrony ruchliwości plemników (>60%) oraz ruchliwości progresywnej szybkiej (>45%). Wskaźnik rozwoju embrionów do stadium 2 komórek przy użyciu plemników rozmrożonych w 5 inbredowych szczepach myszy uległ znacznej poprawie w porównaniu z wynikami uzyskanymi przy zastosowaniu podstawowego CPA ^11,6.

Podczas korzystania z zestawu użytkownik przygotowuje skoncentrowaną zawiesinę plemników poprzez zamrożenie nasienia od 2 samców dla każdej linii. Dzięki zamrożeniu tylko 15 słomek proces ten jest szybki, łatwy i zajmuje mniej miejsca w magazynie podczas przechowywania krótkoterminowego lub długoterminowego. W większości przypadków linie myszy można odzyskać, rozmrażając tylko 1 lub 2 słomki.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
CPA	Charles River Laboratories		Dostarczony w zestawie
STM	Charles River Laboratories		Dostarczony w zestawie
Pożywka do IVF	Charles River Laboratories		Dostarczona w zestawie
Plastikowa słomka 0,25 ml	Charles River Laboratories		Dostarczona w zestawie
Kapsułka do mrożenia nasienia	Charles River Laboratories		Dostarczona w zestawie
Trzpień i kielich	Charles River Laboratories		Dostarczone w zestawie
Olej mineralny	Sigma-Aldrich	M5310	Należy sprawdzić pod kątem wpływu na embriony
Pożywka KSOM	EMD Millipore	MR-106-D
Szalka Petriego 35 mm	Falcon BD	351008
Zgrzewarka termiczna	ABTEC	TISH-200
Wielodobojka 4-dołkowa	Nalge Nunc international	73521-424
Pipet automatyczna	Gilson, Inc.
Kondensatory do pipet	Różne
Inkubator 37°C + 5% CO2	Różne
System przechowywania w LN2	Różne
Kąpiel wodna 37°C	VWR international	89032-196
Stereomikroskop	Nikon Instruments	SMZ800
hCG	Intervet Inc.
PMSG	EMD Millipore	367222
Strzykawka 1cc z igłą 26G 3/8	BD Biosciences	BD309625
Mikro-nożyczki do dyssekcji	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5602
Igła 30 gauge ½	BD Biosciences	305106
Nożyczki	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-6802
Pęsety	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5135, RS-5110, RS-5005