Szkodliwość grzybów infekujących nasiona w uprawach zbóż skłoniła do licznych wysiłków badawczych mających na celu lepsze zrozumienie interakcji między rośliną a patogenem. Aby badać interakcje nasion z grzybami w warunkach laboratoryjnych, opracowaliśmy niezawodną metodę ilościowego określania reprodukcji grzybów, biomasy oraz skażenia mikotoksynami przy użyciu bioassayów na ziarnach.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Ilościowe określanie kolonizacji grzybowej, sporogenezy i produkcji mikotoksyn z wykorzystaniem biotestów na ziarnach kukurydzy
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Gnicie zbóż wywoływane przez grzyby infekujące nasiona stanowi jedno z największych wyzwań ekonomicznych dla produkcji zbożowej na całym świecie, nie wspominając o poważnym ryzyku dla zdrowia ludzi i zwierząt. Wśród upraw zbożowych kukurydza jest prawdopodobnie najbardziej dotkniętą rośliną, ze względu na straty w integralności ziaren oraz kontaminację nasion mikotoksynami indukowaną przez patogeny. Dwiema najpowszechniejszymi i najbardziej problematycznymi mikotoksynami dla producentów kukurydzy oraz przetwórców żywności i pasz są aflatoksyna i fumonizyna, produkowane odpowiednio przez Aspergillus flavus i Fusarium verticillioides.
Niedawne badania nad molekularnymi interakcjami między roślinami a patogenami wykazały potencjał w zrozumieniu specyficznych mechanizmów związanych z odpowiedziami roślin na infekcje grzybowe i skażenie mikotoksynami1,2,3,4,5,6. Ponieważ wiele laboratoriów wykorzystuje testy na ziarnach do badania interakcji roślina-patogen, istnieje potrzeba opracowania zestandaryzowanej metody ilościowego oznaczania różnych parametrów biologicznych, aby wyniki z różnych laboratoriów mogły być wzajemnie interpretowane. W celu zapewnienia solidnego i powtarzalnego sposobu przeprowadzania analiz ilościowych na nasionach, opracowaliśmy laboratoryjne testy na ziarnach oraz następujące po nich metody ilościowego oznaczania wzrostu grzybów, biomasy i skażenia mikotoksynami. Cztery sterylizowane ziarna kukurydzy są inokulowane w szklanych fiolkach zawiesiną grzybową (106) i inkubowane przez określony czas. Następnie wybierane są fiolki z próbkami w celu zliczenia konidiów za pomocą hemocytometru, analizy biomasy opartej na ergosterolu metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC), oznaczania ilości aflatoksyn metodą fluorometrii AflaTest oraz oznaczania ilości fumonizyn metodą HPLC.
Protokół
1. Bioassay z użyciem ziaren kukurydzy
- Na dwa tygodnie przed badaniem hoduj patogeny grzybowe na agarze ziemniaczano-dekstrozowym (PDA) w temperaturze 28 °C.
- Wybierz ziarna o podobnej wielkości i kształcie, najlepiej spłaszczone, aby leżały płasko na dnie fiolek do bioanalizy, i umieść je w probówkach typu falcon o pojemności 50 ml. Wybrane ziarna muszą zostać wyprodukowane jednocześnie w tym samym środowisku, aby zapewnić podobny wiek nasion i skład metabolitów.
- Zesterylizuj powierzchnię ziaren, wstrząsając probówkami w temperaturze pokojowej przez 5 minut z 70% etanolem, 1 minutę z wodą sterylną oraz 10 minut z 6% podchlorynem sodu. Trzykrotnie przepłucz ziarna wodą sterylną przez 5 minut podczas każdego płukania, kontynuując wstrząsanie. Osusz ziarna, odciskając je na autoklawowanych ręcznikach.
- Aby ułatwić infekcję Aspergillus flavus, wykonaj niewielką ranę po stronie zarodka za pomocą igły 18 G na głębokość 0,5 cm. Jednak w naszym doświadczeniu przy infekcji Fusarium verticillioides wymagana jest większa rana. W takim przypadku użyj żyletki, aby naciąć stronę zarodka na głębokość 0,5 mm.
- Przygotuj zawiesinę inokulum, zeskrobując zawartość płytek hodowlanych do około 5 ml autoklawowanego 0,01% roztworu Tween-20 w celu uwolnienia zarodników, a następnie usuń grzybnię poprzez filtrację grawitacyjną przez co najmniej 4 warstwy autoklawanej gazy. Oblicz stężenie zarodników za pomocą komory countingowej (hemocytometru) i dostosuj je do 106 spores /ml dla A. flavus lub F. verticillioides. W przypadku użycia innych gatunków patogenów lub gospodarzy ważne jest dobranie odpowiedniego stężenia inokulum dla właściwej infekcji.
- Utwórz komorę wilgotności w plastikowym pojemniku (29,2 cm X 18,7 cm X 8,3 cm) wyłożonym pięcioma arkuszami ręczników papierowych i 100 ml sterylnej wody. Komora nie jest wodoszczelna ani powietrzeszczelna, dlatego w trakcie eksperymentu należy dolewać wody, aby utrzymać ręczniki papierowe w stanie wilgotnym.
- Umieść cztery ziarna w autoklawowanej szklanej fiolce scyntylacyjnej o pojemności 20 ml i zmierz ich masę. Zaszczep za pomocą 200 μl zawiesiny zarodników, zakręć i wymieszaj w wortexie, aby równomiernie pokryć ziarna zawiesiną. Poluzuj nakrętki, aby umożliwić swobodną wymianę powietrza, i umieść fiolki w komorze wilgotności.
Uwaga: W przypadku nasion lub grzybów innych niż opisane w niniejszych metodach, wymagana ilość inokulum może być inna i powinna zostać ustalona doświadczalnie.
- Inkubować ziarna w fotoperiodzie 12 h światła/12 h ciemności w temperaturze 28 °C przez 7 dni lub do uzyskania pożądanego efektu.
2. Oliczanie konidiów
- Po okresie infekcji dodać 5 ml autoklawowanego 0,01% Tween-20 do fiolek scyntylacyjnych zawierających zainfekowane ziarna i mieszać intensywnie na wortexie przez 1 minutę.
- Używając końcówki do pipety o szerokim otworze, niezwłocznie rozcieńczyć zawiesinę, przenosząc dwie oddzielne aliquoty po 200 μl zawiesiny zarodników do probówek Eppendorfa o pojemności 2,0 ml zawierających 1,8 ml 0,01% Tween-20 (lub rozcieńczyć w razie potrzeby, w zależności od stopnia infekcji).
- Policzyć każdą aliquotę 200 μl dwukrotnie za pomocą hemocytometru4 i porównać liczbę konidiów pomiędzy próbami.
3. Oznaczanie ilości aflatoksyn
- Do kubka blendera o pojemności 50 ml dodać ziarna z 1 próbki, 20 ml 80% metanolu oraz 0,05 g NaCl, przykryć i blendować z wysoką prędkością przez 1 min.
- Umieścić plisowany papier filtracyjny nad czystym naczyniem zbiorczym i przelać ekstrakt przez filtr.
- Przenieść 10 ml filtratu do czystego naczynia, dodać 20 ml destylowanej H2O i dokładnie wymieszać.
- Przefiltrować próbkę przez szklany filtr z mikrowłókien o wielkości porów 1,5 μm do czystego kubka.
- Nanieść 1 ml przefiltrowanego ekstraktu na kolumnę Afla Test i za pomocą sprężonego powietrza przepchnąć ekstrakt przez kolumnę z prędkością 1-2 kropli/sekundę aż do całkowitego opróżnienia.
- Przemyć kolumnę dwukrotnie 1 ml destylowanej H2O, przepuszczając ciecz z prędkością 1-2 kropli/sekundę, aż do pojawienia się powietrza.
- Eluować kolumnę 1 ml 100% metanolu klasy HPLC z prędkością 1-2 kropli/sekundę, zbierając eluat do szklanej kuwety.
- Do eluatu dodać 1 ml odczynnika Afla Test Developer i dokładnie wymieszać. Umieścić kuwetę w skalibrowanym fluorometrze i odczytać wynik po 60 sek.
Uwaga: Podczas stosowania protokołu Aflatest FGIS pomiar z fluorometru jest obliczany na podstawie początkowych 50 gramów próbki ekstrahowanych w 100 ml. Uwzględniając rozcieńczenie próbki wodą, 1 ml naniesiony na kolumnę odpowiada 0,166 gramom próbki. Zatem przy modyfikacji protokołu należy wziąć pod uwagę różnice w wielkości próbki i początkowym roztworze ekstrakcyjnym. Na przykład 2 gramy ziaren są ekstrahowane w 20 ml 80% methanolu. Daje to 0,1 gramów/ml. Gdy 1 ml tej próbki zostanie zmieszany z 2 ml wody, proporcja próbki w cieczy wynosi teraz 0,033 gramów/ml. Jeśli ta próbka daje odczyt z fluorometru wynoszący 100 ppb, rzeczywiste stężenie opiera się na proporcji próbki do 0,166, czyli ppb = (0,166 gram X 100 ppb)/ 0,1 gram), czyli 166 ppb. Alternatywne metody ilościowego oznaczania aflatoksyn opisano w referencji 7.
4. Analiza fumonizyny B1 (FB1)
- W przypadku grzyba hodowanego na ziarnach kukurydzy, próbki ekstrahować przez noc z użyciem 10 ml acetonitrylu/wody (50/50, v/v) w temperaturze pokojowej bez mieszania. Następnie zmieszać ekstrakt (2 ml) z wodą dejonizowaną (6 ml) i taką mieszaninę (8 ml) nanieść bezpośrednio na kolumnę do ekstrakcji do fazy stałej C-18.
- Przed nałożeniem próbki przygotować kolumnę do ekstrakcji do fazy stałej C-18, płucząc ją 2 ml acetonitrylu, a następnie 2 ml wody.
- Po nałożeniu próbki kolumnę przemyć 2 ml wody, a następnie 2 ml acetonitrylu/wody (15/85, v/v). Próbkę do analizy HPLC (zawierającą FB1) eluować za pomocą 2 ml acetonitrylu/wody (70/30, v/v).
- Przeprowadzić derywatyzację FB1 za pomocą o-ftalaldehydu (OPA), przenosząc 0,1 ml eluatu z kolumny do fiolki zawierającej 0,1 ml buforu boranowego (0,05 M kwas borowy/0,05 M boran sodu [50/50, v/v], pH 8,5) oraz 0,1 ml OPA (0,1 mg/ml w acetonitrylu z 0,5% mercaptoetanolem).
- Przerwać reakcję po 10 min, dodając 0,5 ml acetonitrylu/0,01 M kwasu borowego (40/60, v/v).
- FB1 analizować na systemie Shimadzu HPLC LC-20AT wyposażonym w analityczną kolumnę Zorbax ODS (4,6 150 mm) oraz detektor fluorescencyjny Shimatzu RF-10Axl o zmiennej długości fali (pobudzenie 335 nm/emisja 440 nm).
- Zastosować gradient liniowy (rozpuszczalnik A: acetonitryl/0,1 M fosforan sodu (40/60), pH 3,3; rozpuszczalnik B: acetonitryl/ 0,1 M fosforan sodu (60/40), pH 3,3), a program gradientu ustawić następująco: od 100% A do 100% B w 10 min, 100% B przez 5 min.
- Standardy FB1 analizować metodą HPLC, a pomiary pól powierzchni pików wykorzystać do wykreślenia krzywej wzorcowej. Następnie oznaczyć stężenie FB1 w próbce, porównując pola powierzchni pików z krzywą wzorcową dla FB1.
5. Analiza ergosterolu
- Hodować grzyba na ziarnach kukurydzy przez 7-14 dni.
- Po okresie inkubacji do każdej fiolki dodać 10 ml mieszaniny chloroformu i metanolu (2:1, v/v). Po dodaniu dokładnie wstrząsnąć próbkami, a następnie inkubować fiolki w ciemności w temperaturze pokojowej przez 24 h.
- Po 24 h odwirować próbki, zebrać nadsącz i przefiltrować go przez membranę nylonową o rozmiarze porów 0.45 um.
- Próbkę wstrzyknąć bezpośrednio do systemu Shimadzu HPLC LC-20AT wyposażonego w kolumnę 4.6 U ODS-C18 (200 Å, 250 ± 4.6 mm) oraz detektor Shimadzu SPD-20A UV/VIS ustawiony na monitorowanie przy 282 nm.
- Jako fazę ruchomą zastosować metanol (100%) przy przepływie 1.5 mL/min. Wyznaczyć ilość ergosterolu w próbkach poprzez porównanie pól powierzchni pików próbek z krzywą wzorcową sporządzoną z ergosterolu klasy HPLC.
6. Reprezentatywne wyniki
Po inokulacji i inkubacji w komorze wilgotnościowej przez dwa do trzech dni, na ziarnach powinien zacząć pojawiać się wzrost grzyba. Siedem dni po zabiegu wzrost wegetatywny na roślinach traktowanych powinien być wyraźnie widoczny, podczas gdy kontrole pozorowane powinny pozostać niezinfekowane (Rysunek 1B, góra). Dłuższe okresy inkubacji sprzyjają bardziej obfitemu wzrostowi wegetatywnemu (Rysunek 1B, dół). W warunkach opisanych w niniejszym opracowaniu (Rysunek 2G), dziki typ A. flavus NRRL 3357 wykazał maksymalne wartości kolonizacji, akumulacji aflatoksyn i produkcji konidiów odpowiednio w 8, 6 i 8 dniu (Rysunek 2, A-C). Jednakże, gdy zanieczyszczenie mikotoksynami i konidiacja zostały porównane w przeliczeniu na jednostkę ergosterolu, najwyższe poziomy zaobserwowano odpowiednio w 4 i 6 dniu (Rysunek 2, D-E). Rysunek 2F podsumowuje te obserwacje dotyczące wartości maksymalnych zależnych od biomasy grzyba. Co ciekawe, między 4 a 6 dniem po inokulacji w ziarnach zachodzi degradacja kwasów nukleinowych, co widać na podstawie całkowitego RNA z próbek pobranych w trakcie badania czasowego (Rysunek 2H, dół).
Wiele badań, w tym nasze własne, analizowało infekcję F. verticilliodies w ziarnach kukurydzy2,8,9,10,11,12, wykazując, że okres od 7 do 13 dni jest odpowiednim punktem czasowym dla obserwacji. Stosując opisane w niniejszym opracowaniu metody, poziomy fumonizyn wynoszą od 3 500-8 000 ng/g ziarna4,13, a poziomy ergosterolu wynoszą od 5 000-10 000 ng/g ziarna14,13. Rysunek 3 przedstawia reprezentatywne piki dla fumonizyn (góra) i ergosterolu (dół) z chromatogramów HPLC. Pomiar ergosterolu można również przeprowadzić za pomocą widm absorbancji 15.
Rysunek 1. Schemat ilościowego oznaczania biomasy grzybowej, sporogenezy i produkcji mikotoksyn oraz reprezentatywne wyniki wzrostu wegetatywnego z bioanaliz na ziarnach. A) Schemat przedstawiający opisaną metodę ilościowego oznaczania podstawowych parametrów biologicznych wykorzystywanych do oceny patogenezy grzybów na ziarnach kukurydzy. B) Reprezentatywne wyniki bioanaliz na ziarnach. Góra, wzrost wegetatywny A. flavus (NRRL3357) na ziarnach kukurydzy w tle genetycznym B73. Nasiona zaszczepiono 200 μl zawiesiny o stężeniu 106 zarodników/mL, a zdjęcia wykonano 7 dni po inokulacji. Dół, zaszczepione ziarna F. verticillioides w tle B73 13 dni po zakażeniu. Ziarna zaszczepiono 200 μl zawiesiny o stężeniu 106 zarodników/mL.
Rysunek 2. Przebieg czasowy bioanalizy ziaren kukurydzy z Aspergillus flavus. Ziarna B73 zostały zainokulowane 200 μl zawiesiny konidiów Aspergillus flavus o stężeniu 106 spor/ml i inkubowane przez 2-8 dni (G). Wszystkie wartości wyznaczono na podstawie średniej masy suchej 4 ziaren (n = 3-4; średnia ± SE). A) Kolonizację (na podstawie ergosterolu), (B) aflatoksyny i (C) konidiację ilościowo określono za pomocą opisanych powyżej metod. E) Aflatoksyny i (F) konidiację przedstawiono jako funkcję biomasy grzyba mierzonej poprzez h ergosterol. F) Maksymalne wartości dla ergosterolu, akumulacji aflatoksyn i konidiacji jako funkcja biomasy grzyba – maksymalne zaobserwowane wartości dla każdej wielkości przyjęto jako 100%. (H) 1 μg na ścieżkę całkowitego RNA z przebiegu czasowego.
Rysunek 3. Reprezentatywne chromatogramy wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) dla fumonizyny B1 (góra) i ergosterolu (dół) wyizolowanych z ziaren zainfekowanych Fusarium verticillioides (M3125).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opisane tutaj metody zostały szeroko przetestowane i okazały się niezawodne w generowaniu mierzalnych wyników w zakresie kolonizacji grybiczej, sporogenezy oraz produkcji mikotoksyn. Co więcej, metody te powinny mieć zastosowanie do nasion innych gatunków roślin podatnych na zanieczyszczenie grzybami produkującymi mikotoksyny (np. araki-fistaszki, pszenicy, bawełny, pistacji itp.). Dla przeprowadzenia kompetentnych analiz interakcji między rośliną a patogenem niezbędne jest utrzymanie nasion przy życiu. Małe miejsce zra...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie mam nic do ujawnienia.
Podziękowania
Chcielibyśmy podziękować Brandonowi Hassettowi i Carlosowi Ortizowi za pomoc techniczną. Praca ta była finansowana z grantów NSF IOB-0544428, IOS-0951272 oraz IOS-0925561 przyznanych dr. Michaelowi Kolomietsowi, a także z funduszy USDA National Institute of Food and Agriculture (NIFA), AFRI Plant Breeding and Education Grant #2010-85117-20539 przyznanego dr. Sethowi Murrayowi, dr. Thomasowi Isakeitowi i dr. Michaelowi Kolomietsowi.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Agar z ekstraktem ziemniaczanym i glukozą (PDA) | Fisher Scientific | S71659A | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| Plastikowy pojemnik do inkubacji | Sterilite | 1713LAB06 | |
| Blender | Vicam | 20200 | |
| Karbowny papier filtracyjny 24 cm | Vicam | 31240 | |
| Szklane mikrowłókno 1,5 μm | Vicam | 31955 | |
| Kolumna Afla Test | Vicam | G1024 | |
| Developer Afla Test | Vicam | 32010 | |
| Metanol | Vicam | 35016 | |
| Acetonitryl | Fisher Scientific | AC14952-0025 | |
| Etanol | Fisher Scientific | AC39769-0025 | |
| Kolumna do ekstrakcji w fazie stałej C-18 (Prep SEP SPE C18 Column) | Fisher Scientific | 60108-304 | |
| O-ftalaldehyd (OPA) | Sigma-Aldrich | 79760-5g | |
| Kwas borowy | Fisher Scientific | BP168-500 | |
| Boran sodu | Fisher Scientific | RDCS0330500 | |
| Mercapto–etanol | Fisher Scientific | 45-000-231 | |
| Pompa Shimadzu HPLC LC-20AT | Shimadzu Corporation | LC-20AT | |
| Kolumna Zorbax ODS (4,6x150 mm) | Agilent Technologies | 443905-902 | |
| Detektor fluorescencyjny Shimadzu RF-10Axl | Shimadzu Corporation | RF-10AXL | |
| Fosforan sodu | Fisher Scientific | AC38987-0010 | |
| Standardy FB1 | Sigma-Aldrich | F1147-1mg | |
| Chloroform | VWR international | MK444410 | |
| Filtr strzykawkowy 13 mm z membraną nylonową 0,45 µm (HPLC) | Pall Corporation | 4426 | |
| Ergosterol | Sigma-Aldrich | 45480-50G-F | |
| Fiolki scyntylacyjne | VWR international | 66021-602 | |
| Chlorek sodu | Vicam | G1124 |
Bibliografia
- Tsitsigiannis, D. I., Keller, N. P. Oxylipins as developmental and host-fungal communication signals. Trends Microbiol. 15, 109-118 (2007).
- Gao, X., Shim, W. -B., Göbel, C., Kunze, S., Feussner, I., Meeley, R., Balint-Kurti, P., Kolomiets, M. Disruption of a maize 9-lipoxygenase results in increased resistance to fungal pathogens and reduced levels of contamination with mycotoxin fumonisin. Mol. Plant-Microbe Interact. 20, 922-933 (2007).
- Brodhagen, M., Tsitsigiannis, D. I., Hornung, E., Goebel, C., Feussner, I., Keller, N. P. Reciprocal oxylipin-mediated cross-talk in the Aspergillus - seed pathosystem. Mol. Microbiol. 67, 378-391 (2008).
- Gao, X., Brodhagen, M., Isakeit, T., Brown, S. H., Göbel, C., Betran, J., Feussner, I., Keller, N. P., Kolomiets, M. V. Inactivation of the lipoxygenase ZmLOX3 increases susceptibility of maize to Aspergillus spp. Mol. Plant-Microbe Interact. 22, 222-231 (2009).
- Gao, X. Q., Kolomiets, M. V. Host-derived lipids and oxylipins are crucial signals in modulating mycotoxin production by fungi. Toxin Rev. 28, 79-88 (2009).
- Mukherjee, M., Kim, J. -E., Park, Y. -S., Kolomiets, M. V., Shim, W. -B. Regulators of G protein signaling in F. verticillioides mediate differential host-pathogen responses on non-viable versus viable maize kernels. Mol. Plant Pathol. 12, 479-491 (2011).
- Zheng, M. Z., Richard, J. L., Binder, J. A review of rapid methods for the analysis of mycotoxins. Mycopathologia. 161, 261-273 (2006).
- Bacon, C. W., Bennett, R. M., Hinton, D. M., Voss, K. A. Scanning electron microscopy of Fusarium moniliforme within asymptomatic maize kernels and kernels associated with equine leukoencephalomalacia. Plant Dis. 76, 144-148 (1992).
- Munkvold, G. P., Hellmich, R. L., Rice, L. G. Comparison of fumonisin concentrations in kernels of transgenic Bt maize hybrids and nontransgenic hybrids. Plant Dis. 83, 130-138 (1999).
- Sagaram, U. S., Shaw, B. D., Shim, W. -B. Fusarium verticillioides GAP!, a gene encoding a putative glycolipid-anchored surface protein, participates in conidiation and cell wall structure but not virulence. Microbiol. 153, 2850-2861 (2007).
- Shim, W. -B., Flaherty, J. E., Woloshuk, C. P. Comparison of Fumonisin B1 biosynthesis in maize germ and degermed kernels by Fusarium verticillioides. J. Food Protect. 66, 2116-2122 (2003).
- Shim, W. -B., Woloshuk, C. P. Regulation of fumonisin B1 biosynthesis and conidiation in Fusarium verticillioides by a cyclin-like (C-type) gene, FCC1. Appl. Environ. Micrbiol. 67, 1607-1612 (2001).
- Conversation with: Won-Bo Shim. , (2011).
- Shin, J. -H., Shim, W. -B. Characterization of PPR1 and PPR2, genes encoding regulatory subunits of protein phosphatase 2A in Fusarium verticillioides. Phytopathol. 99, S119(2009).
- Breivik, O. N., Owades, J. L. Spectrophotometric Semimicrodetermination of Ergosterol in Yeast. Yeast. Agric. and Food Chem. 5, 360-363 (1957).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
