W niniejszym materiale prezentujemy protokół izolacji komórek podstawnych oraz komórek przewodów gruczołów podśluzowych z tchawki myszy. Przedstawiamy również metodę wstrzykiwania komórek macierzystych do grzbietowej poduszki tłuszczowej myszy w celu stworzenia modelu in vivo regeneracji gruczołów podśluzowych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Izolacja komórek podstawnych i komórek przewodów gruczołów podśluzowych z tchawki myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Duże drogi oddechowe są w bezpośrednim kontakcie ze środowiskiem, a zatem są podatne na uszkodzenia spowodowane toksynami i czynnikami zakaźnymi, które wdychamy 1. W związku z tym duże drogi oddechowe wymagają wydajnego mechanizmu naprawczego w celu ochrony organizmu. Proces ten odbywa się dzięki komórkom macierzystym dróg oddechowych, a izolacja tych komórek jest kluczowa dla zrozumienia mechanizmów naprawy i regeneracji. Jest to również istotne dla zrozumienia nieprawidłowych procesów naprawczych, które mogą prowadzić do chorób dróg oddechowych 2. Celem niniejszej metody jest wyizolowanie nowej populacji komórek macierzystych z przewodów gruczołów podśluzowych tchawicy myszy oraz umieszczenie tych komórek w modelach in vitro i in vivo w celu zidentyfikowania mechanizmów naprawy i regeneracji gruczołów podśluzowych 3. Niniejszy materiał prezentuje metody, które mogą być wykorzystane do izolacji i analizy komórek macierzystych przewodowych i podstawnych z dużych dróg oddechowych 3. Pozwoli to na badanie chorób dróg oddechowych, takich jak mukowiscydoza, astma i przewlekła obturacyjna choroba płuc. Obecnie nie istnieją metody izolacji komórek przewodowych gruczołów podśluzowych oraz nie opracowano modeli in vivo do badania regeneracji gruczołów podśluzowych.
Protokół
Krótki opis etapów
1. Disekcja tchawicy
2. Oczyszczanie i wycinanie tchawicy
3. Trawienie enzymatyczne i przygotowanie zawiesiny pojedynczych komórek
4. Barwienie do FACS i sortowanie
5. Przetwarzanie posortowanych komórek do modeli in vivo i in vitro
1. Disekcja tchawki
- Uśmierć mysz poprzez dostarczenie dootrzewnowe 0,1 mg/0,2 cc pentobarbitalu.
- Nacinij ścianę brzucha i odsuń jelita na bok, aby odsłonić aortę brzuszną, a następnie przeprowadź jej wycięcie.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Niniejsza technika izolacji komórek przewodowych i podstawkowych z dróg oddechowych jest istotna dla pogłębienia wiedzy na temat naprawy i regeneracji dróg oddechowych oraz chorób tych dróg. Opisane tutaj metody obejmują kilka kluczowych etapów. Pierwszym z nich jest zoptymalizowany czas trawienia enzymatycznego. Drugim jest przygotowanie zawiesiny pojedynczych komórek poprzez seryjne pasażowanie z użyciem igieł o progresywnie mniejszej średnicy (wyższym numerze G), co zapobiega ścinaniu komórek, a jednocześnie pozwala n.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Chcielibyśmy podziękować Broad Stem Cell Research Center FACS, a w szczególności Jessice Scholes i Felicii Codrea za pomoc w sortowaniu komórek. Praca została sfinansowana przez CIRM RN2-00904-1, K08 HL074229, American Thoracic Society/COPD Foundation ATS-06-065, The Concern Foundation, UCLA Jonsson Comprehensive Cancer Center Thoracic Oncology Program/Lung Cancer SPORE, University of California Cancer Research Coordinating Committee oraz Gwynne Hazen Cherry Memorial Laboratories (BG).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Pożywka kompletna 10: DMEM-F-12, 50/50, 1X) | Mediatech | 15-090-CV | |
| Hepes (15 mM) | Invitrogen | 15630 | |
| Wodorowęglan sodu (3,6 mM lub 0,03%) | Invitrogen | 25080 | |
| L-glutamina (4 mM) | Mediatech | 25-005-Cl | |
| Penicylina (100 J/ml) | Mediatech | 30-001-CI | |
| Streptomycyna (100 μg/m) | Mediatech | 30-001-CI | |
| Insulina (10 μg/ml) | Sigma | I6634 | |
| Transferryna (5 μg/ml) | Sigma | T1147 | |
| Toksyna cholery (0,1 μg/ml) | Sigma | C8052 | |
| czynnik wzrostu naskórka (25 ng/ml) | BD | 354001 | |
| Ekstrakt z przysadki bydlęcej (30 μg/ml) | Invitrogen | 13028-014 | |
| płodowa surowica bydlęca (5%) | Fisher | SH3008803HI | |
| Kwas retinowy (0,05 μM) | Sigma | R2625 | |
| Matrigel o zredukowanej zawartości czynników wzrostu | BD | 354230 | |
Tabela 1. Składniki pełnej pożywki. | |||
| Pronaza | Roche | 10165921001 | Stężenie użyte: 0,15%: -o/n w temperaturze 4°C °Trawienie enzymatyczne w celu izolacji całkowitej populacji komórek tchawicy (do hodowli ALI) - 4-godzinne trawienie 4 °Izolacja SMG |
| Dyspaza | BD Biosciences | 354235 | Zastosowano w ilości 16 jednostek: 30 min w temperaturze pokojowej |
| DNaza I | Sigma | DN25 | Stosowane w stężeniu 0,5 mg/ml: 20–30 min w temp. pokojowej |
Tabela 2. Enzymy stosowane do trawienia enzymatycznego tchawicy. |
Bibliografia
- Bartlett, J. A., Fischer, A. J., McCray, P. B. Innate immune functions of the airway epithelium. Contrib. Microbiol. 15, 147-163 (2008).
- Finkbeiner, W. E. Physiology and pathology of tracheobronchial glands. Respir. Physiol. 118, 77-83 (1999).
- Hegab, A. E.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
