Artykuł metodologiczny

Izolacja komórek podstawnych i komórek przewodów gruczołów podśluzowych z tchawki myszy

14K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/3731

⸱

14 września 2012

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, David Geffen School of Medicine at UCLA

W tym artykule

Podsumowanie

W niniejszym materiale prezentujemy protokół izolacji komórek podstawnych oraz komórek przewodów gruczołów podśluzowych z tchawki myszy. Przedstawiamy również metodę wstrzykiwania komórek macierzystych do grzbietowej poduszki tłuszczowej myszy w celu stworzenia modelu in vivo regeneracji gruczołów podśluzowych.

Streszczenie

Duże drogi oddechowe są w bezpośrednim kontakcie ze środowiskiem, a zatem są podatne na uszkodzenia spowodowane toksynami i czynnikami zakaźnymi, które wdychamy 1. W związku z tym duże drogi oddechowe wymagają wydajnego mechanizmu naprawczego w celu ochrony organizmu. Proces ten odbywa się dzięki komórkom macierzystym dróg oddechowych, a izolacja tych komórek jest kluczowa dla zrozumienia mechanizmów naprawy i regeneracji. Jest to również istotne dla zrozumienia nieprawidłowych procesów naprawczych, które mogą prowadzić do chorób dróg oddechowych 2. Celem niniejszej metody jest wyizolowanie nowej populacji komórek macierzystych z przewodów gruczołów podśluzowych tchawicy myszy oraz umieszczenie tych komórek w modelach in vitro i in vivo w celu zidentyfikowania mechanizmów naprawy i regeneracji gruczołów podśluzowych 3. Niniejszy materiał prezentuje metody, które mogą być wykorzystane do izolacji i analizy komórek macierzystych przewodowych i podstawnych z dużych dróg oddechowych 3. Pozwoli to na badanie chorób dróg oddechowych, takich jak mukowiscydoza, astma i przewlekła obturacyjna choroba płuc. Obecnie nie istnieją metody izolacji komórek przewodowych gruczołów podśluzowych oraz nie opracowano modeli in vivo do badania regeneracji gruczołów podśluzowych.

Protokół

Krótki opis etapów

1. Disekcja tchawicy

2. Oczyszczanie i wycinanie tchawicy

3. Trawienie enzymatyczne i przygotowanie zawiesiny pojedynczych komórek

4. Barwienie do FACS i sortowanie

5. Przetwarzanie posortowanych komórek do modeli in vivo i in vitro

1. Disekcja tchawki

  1. Uśmierć mysz poprzez dostarczenie dootrzewnowe 0,1 mg/0,2 cc pentobarbitalu.
  2. Nacinij ścianę brzucha i odsuń jelita na bok, aby odsłonić aortę brzuszną, a następnie przeprowadź jej wycięcie.
  3. Otwórz klatkę piersiową, przecinając przeponę oraz przednią ścianę klatki piersiowej po obu stronach, aby odsłonić serce i płuca. Kontynuuj nacinanie w górę w stronę szyi, usuwając tłuszcz i ślinianki, aby odsłonić tchawicę.
  4. Usuń grasicę i odetnij płuca w miejscach ich połączeń poniżej i za nimi. Oddziel tchawicę od przełyku, wsuwając między nie pęsetę, a następnie przetnij tchawicę w jej najwyższej części, powyżej połączenia z krtanią. Następnie uchwyć tchawicę pęsetą, odseparuj ją od tkanek i kontynuuj preparację w dół, aby usunąć ją wraz z sercem i płucami w bloku. Odetnij serce i płuca w pobliżu wnęki, aby objąć większą część prawnego i lewego oskrzela głównego.
  5. Umieść tchawicę w małej szalce Petriego zawierającej medium do zbierania, na lodzie.

2. Oczyszczanie i wycinanie tchawicy

  1. Pod mikroskopem stereowym użyj pęsety o bardzo cienkich końcach (nr 5) oraz nożyczek Vannasa Tubingen (FST 15003-08 finescience.com), aby oczyścić tchawicę ze wszystkich przylegających do niej tkanek. Należą do nich: węzły chłonne, nerw krtaniowy wsteczny, tkanka tłuszczowa, tarczyca oraz pozostałe naczynia płucne. Górna część tchawicy wymaga szczególnej uwagi podczas usuwania dużych chrząstek krtani, aby nie uszkodzić największego skupiska SMG, które znajduje się między chrząstką pierścienowatą a pierwszym pierścieniem chrzęstnym tchawicy (C1)4.
  2. Przetnij tchawicę na część górną i dolną pomiędzy C4 a C5, a następnie rozetnij obie części wzdłuż światła tchawicy.

3. Trawienie enzymatyczne i przygotowanie jednokomórkowej zawiesiny (SCS)

  1. Inkubować dolną część tchawicy w 1 ml 16 U dyspazy w probówce Eppendorf w temperaturze pokojowej (RT) przez 30 min, zgodnie z wcześniejszym opisem 5. Następnie dodać 0,5 mg/ml DNazy I w DMEM i inkubować przez kolejne 20 min w RT.
  2. Przenieść trawioną tchawicę do świeżego medium zbierającego w sterylnej płytce Petriego i usunąć nabłonek powierzchniowy pod mikroskopem dissectingowym. Za pomocą pipety przenieść medium zawierające usunięty nabłonek do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
  3. Odwirować usunięty nabłonek przy 1 000 x g w temperaturze 4 °C. Usunąć nadsącz, dodać 0,1% trypsyny/EDTA i inkubować w inkubatorze wytrząsowym w temperaturze 37 °C (200 rpm) przez 30 min. Po inkubacji, używając końcówki 1 000 μl, pipetować zawiesinę w górę i w dół, aby rozbić grudki i utworzyć jednokomórkową zawiesinę.
  4. Umieścić górną część tchawicy w probówce stożkowej zawierającej 1 ml 0,15% pronazy. Następnie inkubować w temperaturze 4 °C przez 4 h.
  5. Delikatnie wymieszać probówkę w wortexie, a następnie przenieść tchawicę do świeżego medium zbierającego i potwierdzić pod mikroskopem dissectingowym całkowite oddzielenie nabłonka powierzchniowego (SE).
  6. Posiekać tchawicę drobnymi nożyczkami, aby otworzyć przedziały SMG, a następnie inkubować przez kolejną godzinę w pronazie w RT przy powolnym wstrząsaniu.
  7. Odwirować tkankę tchawicy, usunąć pronazę, dodać 0,1% trypsyny/EDTA i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 min z wstrząsaniem jak opisano wyżej.
  8. Przepuścić strawione komórki, grudki i pozostałe fragmenty gruczołów przez igły 20G, 23G i 26G, używając strzykawki 10 ml. Powtórzyć pasażowanie kilka razy dla każdego rozmiaru igły przed przejściem do mniejszej średnicy. Na tym etapie większość komórek powinna znajdować się w formie SCS.
  9. Przefiltrować zawiesinę przez sito 40 μM, następnie przemyć sito i odwirować komórki. Następnie resuspendować komórki w odpowiedniej objętości medium, policzyć komórki i bezzwłocznie przystąpić do barwienia i sortowania metodą FACS. Nie pozostawiać komórek w temperaturze 4 °C ani na lodzie przez kilka godzin, ponieważ stwierdzono, że wpływa to na żywotność i znacznie zmniejsza wydajność tworzenia sfer.

4. Barwienie do FACS i sortowanie

  1. Odłożyć odpowiednią liczbę komórek do przygotowania probówek kontrolnych (niebarwionych i barwionych pojedynczo) do kompensacji, a pozostałe komórki zabarwić przeciwciałami pierwotnymi (kozio Trop2 i szczur ITGA6) przez 15 min w temperaturze pokojowej. Następnie przemyć PBS-em lub medium zbierającym, bardzo ostrożnie usunąć nadsącz i rozbić osad komórkowy.
  2. Zabarwić odpowiednim przeciwciałem wtórnym, inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 10 min, przemyć, usunąć nadsącz, a następnie rozbić osad.
  3. W urządzeniu FACS ARIA, po dostrojeniu napięcia i kompensacji, wykluczyć (gate out) debris, bardzo małe komórki, dublety oraz martwe komórki. Większość komórek z SE powinna być TROP2-dodatnia, podczas gdy 20-50% komórek SMG będzie TROP2+ 6.
  4. Ustawić bramkę sortowania (sorting gate) dla komórek Trop2+ITGA6+ z SE (komórki podstawowe) oraz dla komórek Trop2+ (komórki +/-ITGA6 dodatnie) z SMG (komórki przewodowe).

5. Przetwarzanie posortowanych komórek do hodowli in vitro oraz modelu in vivo

5.1 Hodowla sfer In vitro 5-9

  1. Wymieszać 100 μl „Growth Factor reduced Matrigel” z 100 μl pełnej pożywki 10,11 (patrz Tabela 1) zawierającej do 50 000 posortowanych komórek, a następnie umieścić tę mieszaninę w górnej komorze wkładu trans-well w płytce 24-dołkowej. Następnie wlać 400 μl pełnej pożywki do dolnej komory i inkubować w temperaturze 37 °C. Wymieniać pożywkę w dolnej komorze co drugi dzień i dodawać dodatkowe 100 μl Matrigeluy co tydzień lub wcześniej, jeśli warstwa stanie się zbyt cienka.

5.2 Model in vivo

  1. Resuspender osad posortowanych komórek w pełnym medium zmieszanym w stosunku 1:1 z matrigelem, przy stężeniu 5 000-10 000 komórek na 50 μl.
  2. Zznieczylić myszy biorcy szczepu C57/BL6. Podać podskórnie karprofen (5 mg/kg) jako lek przeciwbólowy. Zsterylizować i ogolić grzbiet, a następnie wykonać centralne podłużne nacięcie skóry w górnej części grzbietu. Nacięcie powinno być wystarczająco duże, aby zidentyfikować miejsce wstrzyknięcia w tkance tłuszczowej oraz pęcherzyk powstający po iniekcji. Użyć tępego końca nożyczek, aby rozszerzyć przestrzenie między skórą a tylną ścianą klatki piersiowej po obu stronach, w celu maksymalizacji dostępu i widoczności.
  3. Zidentyfikować przyśrodkową krawędź łopatki, przesuwając przednią kończynę myszy do góry i do tyłu, aby zaobserwować ruch łopatki. Nabrać 50 μl zawiesiny komórkowej do strzykawki insulinowej BD o pojemności 300 μl i wstrzyknąć ją do tkanki tłuszczowej przyśrodkowo w stosunku do łopatki i bocznie w stosunku do kręgów. Powinien być widoczny pęcherzyk; w przeciwnym razie igła została wprowadzona zbyt głęboko. Powtórzyć tę samą procedurę po drugiej stronie, a następnie zapiąć lub zszyć nacięcie skóry. Monitorować myszy i podawać karprofen (5 mg/kg, SC) raz dziennie przez 48 h.
  4. Po 3 tygodniach uśpić myszy pentobarbitalem (0,1 mg/0,2 cc, IP), otworzyć skórę w opisany wcześniej sposób i wyciąć całą tkankę tłuszczową z obu stron z marginesem bezpieczeństwa, aby uniknąć pominięcia jakichkolwiek struktur tkankowych, które mogły powstać i rozprzestrzenić się w okolicy. Utrwalić w PFA i zalać do parafiny 12. Podczas przycinania i krojenia bloku należy zachować szczególną ostrożność, aby nie pominąć żadnej struktury. Najlepszą praktyką jest jednorazowe przycięcie 40 μm, a następnie wycięcie plastra o grubości 4 μm, umieszczenie go na szkiełku i zbadanie pod mikroskopem w celu potwierdzenia, czy w tej części bloku znajdują się „struktury nabłonkowe”. Jeśli nic nie zostanie zaobserwowane, należy ponownie przyciąć blok i powtórzyć ten krok.

6. Reprezentatywne wyniki

Usunięcie tkanek z tchawic mysich doprowadzi do uzyskania oczyszczonej tchawicy, widocznej w mikroskopii światła, co przedstawiono na Rysunku 1A. Rysunek 1B przedstawia obraz w jasnym polu tchawicy po usunięciu nabłonka, gdzie gruczoły podmukozowe zostały uwolnione z tkanek i przypominają grona winogron.

Pronaza usuwa epitop ITGA6, dlatego komórki przewodowe TROP2 nie mogą zostać rozdzielone na populacje ITGA6+ i -. Jednakże dispaza, która zachowuje epitop ITGA6, trawi cały nabłonek powierzchniowy oraz komórki przewodowe nawet przy bardzo krótkim czasie inkubacji, i dlatego nie może być używana do oddzielania komórek przewodowych od podstawnych3. Cytometria przepływowa zawiesin pojedynczych komórek powinna wykazać wykresy rozproszenia przedniego i bocznego przedstawione na Rysunku 2A. Dobra separacja komórek przewodowych od pozostałych komórek tchawicy powinna być widoczna przy użyciu przeciwciała Trop2 w cytometrii przepływowej do fluorescencyjnego sortowania komórek (FACS), co pokazano na Rysunku 2B. Sfery powinny być widoczne w matrigelu po około 1 tygodniu hodowli i mają gęsty wygląd, jak pokazano na Rysunku 3. Wydajność tego procesu wynosi około 1-2% i w matrigelu nadal będą obecne pojedyncze komórki, które prawdopodobnie reprezentują komórki z przewodów gruczołów podśluzowych niewykazujące zdolności do samoodnowy. Wstrzyknięcie macierzystych komórek przewodowych do tkanki tłuszczowej myszy skutkuje powstaniem struktur przypominających gruczoły podśluzowe, przedstawionych na Rysunku 4. Są one widoczne w blokach nawet bez barwienia H&E. Mają one kształt sferyczny i posiadają centralny światło. Należy wykonać wiele przekrojów przez tkankę tłuszczową, aby nie przeoczyć tych struktur nabłonkowych.

Histologia, porównanie traktowania enzymatycznego; dyspaza 30 min vs pronaza 4 godz.; trawienie tkanki.
Rysunek 1. Trawienie enzymatyczne nabłonka tchawki. Usuwanie powierzchniowych komórek nabłonka zaznaczono czarnymi strzałkami, a usuwanie komórek w przewodach gruczołów podśluzowych zielonymi strzałkami. Ogołocone tchawki widoczne w mikroskopii świetlnej przedstawiono po 30 min trawienia dyspazą oraz po 4 godz. trawienia pronazą.

Wykresy cytometrii przepływowej przedstawiające analizę danych SSC vs. FSC oraz rozkład TROP2; wykres z wynikami.
Rysunek 2A. i. Cytometria przepływowa zawiesin pojedynczych komórek przedstawiająca reprezentatywne wykresy rozprosiania przedniego (forward scatter) i bocznego (side scatter) z tchawic myszy po usunięciu nabłonka powierzchniowego. ii. Reprezentatywne wykresy FACS dla ekspresji TROP2 w komórkach przewodowych z tchawic myszy.

Schematy analizy cytometrii przepływowej; wykresy rozrzutu SSC vs FSC, TROP2, ITGA6; wyniki sortowania komórek.
Rysunek 2B. i. Cytometria przepływowa zawiesin pojedynczych komórek z oddzielonego nabłonka powierzchniowego dolnych dwóch trzecich tchawicy myszy, przedstawiająca reprezentatywne wykresy rozproszenia przedniego (forward scatter) i bocznego (side scatter). ii. Typowy wykres FACS ekspresji ITGA6 w nabłonku powierzchniowym. iii. Inny reprezentatywny wykres FACS rozproszenia przedniego i bocznego z nabłonka powierzchniowego, pokazujący wsteczne bramkowanie (back gating) populacji komórek podstawowych w kolorze zielonym. iv. Typowa populacja komórek wykazujących ekspresję ITGA6 i TROP2 w kolorze zielonym.

Schemat przebiegu czasowego wzrostu sfer przewodowych i podstawnych myszy w ciągu kolejnych dni, obrazy mikroskopowe.
Rysunek 3. Przebieg czasowy rozwoju sfer. A. Sfery przewodowe. Sfery powinny być widoczne w matrigelu po około 1 tygodniu hodowli i niemal wszystkie mają gęsty wygląd. Widoczne są również pojedyncze komórki, które nie tworzą sfer (pasek skali = 50 μm). B. Sfery podstawne są większe i mają wygląd luminalny. Widoczne są również pojedyncze komórki, które nie tworzą sfer (pasek skali = 50 μm).

Obrazy z mikroskopii histologicznej przedstawiające próbki tkanek w skali 100 µm; analiza morfologii komórek.
Rycina 4. Wstrzyknięcie komórek macierzystych przewodu do tkanki tłuszczowej myszy prowadzi do powstania struktur przypominających gruczoły podśluzowe. Reprezentatywne struktury pokazano w tkance tłuszczowej, a niektóre z nich wykazują produkcję mucyny (jasnoniebieski kolor) po zabarwieniu błękitem Alcian i Periodic Acid Schiff.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Niniejsza technika izolacji komórek przewodowych i podstawkowych z dróg oddechowych jest istotna dla pogłębienia wiedzy na temat naprawy i regeneracji dróg oddechowych oraz chorób tych dróg. Opisane tutaj metody obejmują kilka kluczowych etapów. Pierwszym z nich jest zoptymalizowany czas trawienia enzymatycznego. Drugim jest przygotowanie zawiesiny pojedynczych komórek poprzez seryjne pasażowanie z użyciem igieł o progresywnie mniejszej średnicy (wyższym numerze G), co zapobiega ścinaniu komórek, a jednocześnie pozwala n...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować Broad Stem Cell Research Center FACS, a w szczególności Jessice Scholes i Felicii Codrea za pomoc w sortowaniu komórek. Praca została sfinansowana przez CIRM RN2-00904-1, K08 HL074229, American Thoracic Society/COPD Foundation ATS-06-065, The Concern Foundation, UCLA Jonsson Comprehensive Cancer Center Thoracic Oncology Program/Lung Cancer SPORE, University of California Cancer Research Coordinating Committee oraz Gwynne Hazen Cherry Memorial Laboratories (BG).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Pożywka kompletna 10:
DMEM-F-12, 50/50, 1X) 		Mediatech15-090-CV
Hepes (15 mM)Invitrogen15630
Wodorowęglan sodu (3,6 mM lub 0,03%)Invitrogen25080
L-glutamina (4 mM)Mediatech25-005-Cl
Penicylina (100 J/ml)Mediatech30-001-CI
Streptomycyna (100 μg/m)Mediatech30-001-CI
Insulina (10 μg/ml)SigmaI6634
Transferryna (5 μg/ml)SigmaT1147
Toksyna cholery (0,1 μg/ml)SigmaC8052
czynnik wzrostu naskórka (25 ng/ml)BD354001
Ekstrakt z przysadki bydlęcej (30 μg/ml)Invitrogen13028-014
płodowa surowica bydlęca (5%)FisherSH3008803HI
Kwas retinowy (0,05 μM)SigmaR2625
Matrigel o zredukowanej zawartości czynników wzrostuBD354230

Tabela 1. Składniki pełnej pożywki.

PronazaRoche10165921001Stężenie użyte: 0,15%:
-o/n w temperaturze 4°C °Trawienie enzymatyczne w celu izolacji całkowitej populacji komórek tchawicy (do hodowli ALI)
- 4-godzinne trawienie 4 °Izolacja SMG
DyspazaBD Biosciences354235Zastosowano w ilości 16 jednostek: 30 min w temperaturze pokojowej
DNaza ISigmaDN25Stosowane w stężeniu 0,5 mg/ml:
20–30 min w temp. pokojowej

Tabela 2. Enzymy stosowane do trawienia enzymatycznego tchawicy.

Bibliografia

  1. Bartlett, J. A., Fischer, A. J., McCray, P. B. Innate immune functions of the airway epithelium. Contrib. Microbiol. 15, 147-163 (2008).
  2. Finkbeiner, W. E. Physiology and pathology of tracheobronchial glands. Respir. Physiol. 118, 77-83 (1999).
  3. Hegab, A. E. A Novel Stem/Progenitor Cell Population from Murine Tracheal Submucosal Gland Ducts with Multipotent Regenerative Potential. Stem Cells. , (2011).
  4. Jeffery, P. K. Morphologic features of airway surface epithelial cells and glands. Am. Rev. Respir. Dis. 128, S14-S20 (1983).
  5. Rock, J. R. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 12771-12775 (2009).
  6. Goldstein, A. S. Trop2 identifies a subpopulation of murine and human prostate basal cells with stem cell characteristics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20882-20887 (2008).
  7. Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
  8. McQualter, J. L., Yuen, K., Williams, B., Bertoncello, I. Evidence of an epithelial stem/progenitor cell hierarchy in the adult mouse lung. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 1414-1419 (2010).
  9. Inayama, Y. In vitro and in vivo growth and differentiation of clones of tracheal basal cells. Am. J. Pathol. 134, 539-549 (1989).
  10. You, Y., Richer, E. J., Huang, T., Brody, S. L. Growth and differentiation of mouse tracheal epithelial cells: selection of a proliferative population. Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 283, L1315-L1321 (2002).
  11. Wu, X., Peters-Hall, J. R., Bose, S., Pena, M. T., Rose, M. C. Human Bronchial Epithelial Cells Differentiate to 3D Glandular Acini on Basement Membrane Matrix. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. , (2010).
  12. Ooi, A. T. Presence of a putative tumor-initiating progenitor cell population predicts poor prognosis in smokers with non-small cell lung cancer. Cancer Res. 70, 6639-6648 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Disekcja tchawicystripping nab onkazawiesina pojedynczych kom reksortowanie kom rek aktywowane fluorescencjprzeciwcia o anty Trop2tworzenie sfer in vitromodel regeneracji in vivo

Powiązane artykuły