Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) z wykorzystaniem tkanek Drosophila

Podsumowanie

W ostatnim czasie technologia sekwencjonowania wysokoprzepustowego znacznie zwiększyła czułość eksperymentów immunoprecypitacji chromatyny (ChIP), co przyczyniło się do ich zastosowania z użyciem oczyszczonych komórek lub wyselekcjonowanych tkanek. W niniejszym opracowaniu przedstawiamy metodę wykorzystania techniki ChIP w tkankach Drosophila, która pozwala na badanie endogennego stanu chromatyny w dobrze scharakteryzowanym systemie biologicznym.

Streszczenie

Epigenetyka pozostaje dynamicznie rozwijającą się dziedziną, która bada, w jaki sposób stan chromatyny wpływa na zróżnicowaną ekspresję genów w różnych typach komórek na różnych etapach rozwoju. Regulacja epigenetyczna przyczynia się do szerokiego spektrum procesów biologicznych, w tym do różnicowania komórkowego podczas rozwoju embrionalnego oraz do homeostazy w wieku dorosłym. Krytyczną strategią w badaniach epigenetycznych jest analiza tego, jak poszczególne modyfikacje histonów i czynniki chromatynowe regulują ekspresję genów. W tym celu powszechnie stosuje się immunoprecypitację chromatyny (ChIP), aby uzyskać obraz powiązań konkretnych czynników z DNA w badanych komórkach.

Technika ChIP zazwyczaj wykorzystuje hodowlane komórki jako materiał wyjściowy, które można uzyskać w dużej ilości i stopniu jednorodności, aby wygenerować powtarzalne dane. Istnieje jednak kilka zastrzeżeń: po pierwsze, środowisko hodowli komórek w szalce Petriego różni się od warunków in vivo, w związku z czym może nie odzwierciedlać endogennego stanu chromatyny komórek w żywym organizmie. Po drugie, nie wszystkie typy komórek można hodować ex vivo. Liczba linii komórkowych, z których można uzyskać materiał wystarczający do przeprowadzenia analizy ChIP, jest ograniczona.

W niniejszym opracowaniu opisujemy metodę przeprowadzania eksperymentu ChIP z wykorzystaniem tkanek Drosophila. Materiałem wyjściowym jest wypreparowana tkanka z żywego organizmu, co pozwala na dokładne odzwierciedlenie endogennego stanu chromatyny. Adaptacyjność tej metody do wielu różnych typów tkanek umożliwi badaczom odpowiedzi na znacznie więcej istotnych biologicznie pytań dotyczących regulacji epigenetycznej in vivo^{1, 2}. Połączenie tej metody z sekwencjonowaniem wysokoprzepustowym (ChIP-seq) pozwoli badaczom na dodatkowe uzyskanie obrazu krajobrazu epigenomicznego.

Protokół

(Cała procedura ChIP trwa około dwóch dni. Przygotowanie bibliotek ChIP do sekwencjonowania wysokoprzepustowego zajmuje kolejne 2-3 dni.)

1. Disekcja i przygotowanie tkanki do eksperymentu ChIP (~1 milion komórek)

1. Wypreparować interesującą tkankę (np. 200 par jąder Drosophila) w zimnym roztworze PBS + 1x inhibitor proteaz (rozpuścić 1 pellet koktajlu inhibitorów proteaz w 1,5 mL 1x PBS, aby otrzymać 7x roztwór zapasowy) + PMSF (stężenie końcowe 100 μg/mL). Przepłukać tkankę dwukrotnie i zawiesić ją ponownie w 200 μL tego samego roztworu PBS z inhibitorami.
2. Aby utrwalić próbkę, dodać 5,5 μL 37% formaldehydu (formaldehyd podgrzać w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C przez 1 min przed użyciem). Inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut, mieszając na vortexie co 5 minut.
3. Umieścić próbkę na lodzie na 2 minuty, aby tkanka osiadła. Przepłukać 2x za pomocą 450 μL PBS (z inhibitorami proteaz i PMSF). Próbkę można teraz przechowywać w temperaturze -20 °C. Powtórzyć procedurę preparacji kilka razy, aby uzyskać wystarczającą ilość materiału do analizy ChIP.

2. Przygotowanie supernatantu z koniugacją białko-DNA do analizy ChIP

1. Przenieść odpowiednią ilość próbki z kroku 1.3 do probówki Eppendorf o pojemności 1,75 mL.
2. Usunąć PBS z próbki tkanki. Dodać 200 μL buforu do lizy (50 mM Tris-HCl, pH 7,6, 1 mM CaCl2, 0,2% Triton X-100 lub NP-40, 5 mM maślanu oraz 1x koktajlu inhibitorów proteaz). Do buforu do lizy dodać świeży roztwór stokowy PMSF (końcowe stężenie PMSF 0,5 mM). Homogenizować za pomocą homogenizatora niebieskiego (Fisher Cat# 749521-1590) aż do całkowitego rozpadu tkanek bez tworzenia agregatów, a następnie inkubować w RT (temperaturze pokojowej) przez 10 minut.
3. Sonikacja: użyć sonikatora z mikrokońcówką (Misonix HS-XL200) przy mocy 20. Sonikować przez 10 s, a następnie chłodzić na lodzie przez 50 s. Powtórzyć 4–5 razy (optymalny czas sonikacji należy dobrać empirycznie, ponieważ dłuższa sonikacja prowadzi do powstania mniejszych fragmentów. W przypadku ChIP z użyciem przeciwciał przeciwko modyfikacjom histonów zwykle sonikujemy chromatynę do wielkości około 200–300 bp; w przypadku czynników transkrypcyjnych lub regulatorów chromatyny (np. białek Polycomb) zwykle sonikujemy chromatynę do 200–1000 bp. Niemniej jednak optymalną wielkość fragmentów należy przetestować empirycznie. Uwaga: PROBÓWKĘ NALEŻY PRZEZ CAŁY CZAS TRZYMAĆ NA LODZIE, TAKŻE PODCZAS SONIKACJI, ABY zapobiec nagrzaniu próbki!).
4. Rozcieńczyć próbkę, dodając 1,8 mL buforu RIPA (10 mM Tris-HCl, pH 7,6, 1 mM EDTA, 0,1% SDS, 0,1% deoksycholan sodu, 1% Triton X-100, z inhibitorami proteaz i PMSF w stężeniach opisanych wcześniej). Odstawić 40 μL jako kontrolę wejściową (input), dodając 2 μL 5M NaCl i inkubować w 65 °C przez noc (O/N) w celu odwrócenia sieciowania.
5. Aby skoniugować przeciwciało z kuleczkami, dodać 40 μL kuleczek Protein A do probówki Eppendorf o pojemności 1,5 ml, następnie dodać 600 μL PBS i mieszać na rotatorze w 4 °C przez 2 minuty, oddzielić kuleczki magnesem i usunąć nadsącz. Dodać 100 μL PBS oraz przeciwciało docelowe (ilość przeciwciała należy dobrać empirycznie). Inkubować w RT przez 1 godzinę lub w 4 °C przez 4 godziny.
6. Usunąć nadsącz z kuleczek za pomocą magnesu i dodać do kuleczek 1 mL ekstraktu z chromatyny z kroku 2.4. Rotować w 4 °C przez noc (O/N).
7. Przenieść próbkę ChIP na magnes i usunąć nadsącz. Przemyć kuleczki następującymi buforami w 4 °C przez 10 minut każdy:
   2x 1 mL buforu RIPA [1,89 mL „buforu RIPA” + 315 μL 7x inhibitorów proteaz + 20 μL PMSF];
   2x 1 mL buforu RIPA + 0,3 M NaCl [1,89 mL buforu RIPA + 220 μL 3 M NaCl];
   2x 1 mL buforu LiCl (0,25 M LiCl, 0,5% NP40, 0,5% NaDOC);
   1x 1 mL 1x TE + 0,2% Triton X-100;
   1x 1 mL 1x TE.
   
8. W celu odwrócenia sieciowania resuspendować kuleczki w 100 μL buforu TE + 3 μL 10% SDS + 5 μL proteinazy K (20 mg/mL). Inkubować w 65 °C przez noc (O/N).
9. Oddzielić kuleczki magnesem i przenieść nadsącz do nowej probówki. NADSĄCZ ZAWIERA PRÓBKĘ DNA. Przemyć kuleczki 100 μL TE + 0,5 M NaCl i połączyć oba nadsącze.
10. Przeprowadzić ekstrakcję próbki DNA fenolowo-chloroformową. Dodać 200 μL mieszaniny fenol:chloroform:IAA (25:24:1) i wymieszać w wirówce typu vortex. Wirować przy 14k przez 5 minut w RT. Alternatywnie DNA można wyekstrahować za pomocą zestawu do oczyszczania PCR firmy Qiagen.
11. Przenieść nadsącz/fazę wodną do nowej probówki i dodać akrylamid liniowy do końcowego stężenia 20 μg/mL (alternatywnie można użyć 1 μL glikogenu w stężeniu 20 mg/mL na każdy 1 mL nadsączu. Glikogen stosuje się do późniejszych analiz qPCR lub PCR, natomiast akrylamid liniowy do analiz sekwencyjnych). Dodać 20 μL 3M NaOAc i 500 μL 100% EtOH. Dobrze wymieszać i inkubować w 80 °C przez 10 minut. Wirować z maksymalną prędkością przez 20 minut w 4 °C.
12. Usunąć nadsącz i przemyć 300 μL 70% EtOH. Osuszyć na powietrzu i resuspendować próbkę w 50 μL buforu TE. Próbkę można teraz przechowywać w -20 °C. Próbka może być wykorzystana do analizy ilościwym PCR (qPCR) (Rycina 1).

3. Analiza DNA poddanego immunoprecypitacji chromatyny (ChIP)

3a. Analiza DNA z ChIP przy użyciu qPCR

1. Rozcieńczć DNA genomowe w następujących stężeniach w celu przygotowania krzywej wzorcowej: nie programmerskie, 1/10, 1/100, 1/1000, 1/5000.
2. Dla każdej pary starterów przygotować qPCR w duplikacie na płytce 96-dołkowej z DNA genomowym z kroku 3a.1, kontrolą input oraz DNA po ChIP:
   10 μL 2x SYBR PCR mix (Fermentas, K0222);
   1 μL 10 μM startera forward;
   1 μL 10 μM startera reverse;
   x μL DNA po ChIP (kontrola input lub DNA genomowe);
   y μL wody wolnej od nukleaz H₂O w celu dostosowania objętości reakcji do 20 μL.
   
3. Odwirować płytkę 96-dołkową za pomocą Mini plate spinner (Labnet).
4. Przeprowadzić qPCR w systemie ABI 7300 real time PCR (lub innym systemie PCR w czasie rzeczywistym) stosując następujące warunki:
   Etap 1: 50 °C przez 2 min, 1 cykl;
   Etap 2: 95 °C przez 10 min, 1 cykl;
   Etap 3: 95 °C przez 15 s, 60 °C przez 1 min, 40 cykli;
   Etap 4 (etap dysocjacji): 95 °C przez 15 s, 60 °C przez 1 min, 95 °C przez 15 s.
   
5. Sprawdzić krzywą dysocjacji: Jeden pik na wykresie dysocjacji termicznej sugeruje obecność pojedynczego amplikonu z reakcji PCR. Więcej niż jeden pik wskazuje na produkt niespecyficzny dla danej pary starterów; takich danych z qPCR nie należy używać.
6. Wyznaczyć fazę liniową amplifikacji wykładniczej reakcji PCR dla każdego zestawu starterów, obliczając wzór określający ilość DNA na podstawie wartości Ct (cycle threshold), w oparciu o krzywą wzorcową z serii rozcieńczeń DNA genomowego z kroku 3a.1.
7. Jeśli wartości Ct dla DNA po ChIP oraz kontroli input mieszczą się w zakresie liniowym wartości Ct, obliczyć wzbogacenie DNA po ChIP względem input, uwzględniając czynnik rozcieńczenia DNA po ChIP oraz kontroli input z kroku 2.4.

3b. Przeprowadź amplifikację DNA z ChIP w celu sekwencjonowania wysokoprzepustowego.

1. Naprawa końców mieszaniny DNA po ChIP (należy użyć zestawu Epicentre DNA END-Repair), przygotować na lodzie:
   1-34 μl genomiczne DNA z kroku 2.12 (od 0,1 do 5 μg)
   5 μl 10x bufor do naprawy końców
   5 μl mieszanina dNTP o stężeniu 2,5 mM
   5 μl 10 mM ATP
   Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. μl H₂Aby dostosować objętość reakcji do 49 μl
   1 μl Mieszanina enzymów do naprawy końców (polimeraza DNA T4 + polinukleotydowa kinaza T4)
   Inkubować przez 45 minut w temperaturze pokojowej. Produkt reakcji oczyścić za pomocą zestawu Qiagen MinElute Reaction.
   Zestaw do oczyszczania. Eluuj w 30 μl Bufor elucyjny (EB).
   
2. Dodanie nadwieszeń A na końcach 3':
   30 μl eluat produktu DNA z kroku 3b.1
   5 μl 10x bufor NEB nr 2
   10 μl 1 mM dATP
   2 μl dH₂O
   3 μl 5 j./ μl Fragment Klenowa (3'→5' exo-)
   Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °COczyścić produkt reakcji za pomocą zestawu MinElute ReactionCleanup. Eluować do 10 μl EB.
   
3. Ligacja linkerów Solexa:
   10 μl eluowanego DNA z kroku 3b.2
   10 μl ddH2O₂O
   2.5 μl 10x bufor do ligazy T4 DNA
   1 μl Mieszanina oligonukleotydów adaptorowych od Illumina (rozcieńczona 1:10 ze stoku)
   2.5 μl T4 DNA ligaza (400 jednostek/μl)
   Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Produkt reakcji oczyścić za pomocą zestawu MinElute ReactionCleanup. Eluować do 20 μl EB. Próbkę można teraz przechowywać w temperaturze -20 °C.
4. Próbkę elowanego DNA z kroku 3b.3 poddaj elektroforezie z wykorzystaniem aparatu E-gel. Wyizoluj z żelu prążek o wielkości 300–500 bp i oczyść go za pomocą zestawu Qiagen Gel Extraction (krok ten pozwala na usunięcie samoligowanych linkerów o wielkości ~125 bp powstałych w wyniku ligacji oligonukleotydów adaptorowych). Eluuj w 12 μl EB.
   
5. Amplifikuj bibliotekę, używając starterów paired-end (PE) firmy Illumina:
   10.5 μl eluowanego DNA z kroku 3b.4
   12.5 μl mieszaniny master mix (2X Phusion HF, Finnzymes)
   1 μl startera PCR PE1 primer 1
   1 μl startera PCR PE2 primer 2
   Warunki PCR:
   98 °C przez 30 s
   (98 °C 10 s, 65 °C 30 s 72 °C 30 s), powtórzyć 20 cykli
   72°C przez 5 minut.
   
6. Próbki z kroku 3b.5 można wykorzystać do analizy ChIP-seq po wybraniu fragmentów DNA o odpowiedniej wielkości (300–500 bp) przy użyciu standardowego 2% żelu agarozowego. Próbkę można teraz przechowywać w temperaturze -20 °CNajlepiej jest izolować każdą próbkę ChIP na oddzielnym żelu, aby zapobiec kontaminacji. Próbki można przekazać do sekwencjonowania wysokoprzepustowego.

3c. Analiza rurociągiem Solexa

1. Odczyty sekwencjonowania o długości 25 bp uzyskano z potoku analitycznego Illumina Genome Analyzer (GA).
2. Wszystkie odczyty dopasowano do genomu Drosophila (dm3) przy użyciu oprogramowania ELAND (Efficient Local Alignment of Nucleotide Data), dopuszczając do dwóch niedopasowań w stosunku do sekwencji referencyjnej.
3. Do dalszych analiz zachowano odczyty zmapowane jednoznacznie. W przypadku wielu identycznych odczytów zachowano do trzech kopii, aby zmniejszyć ryzyko wystąpienia błędów wynikających z amplifikacji PCR.
4. Wyniki z potoku GA przekonwertowano do plików BED (browser extensible data).
5. W celu wygenerowania plików wig do przesłania do przeglądarki UCSC w celu wizualizacji, wykorzystano skrypt w języku python opisany w poprzedniej publikacji³, przyjmując rozmiar okna 4 bp oraz rozmiar fragmentu DNA 160 bp.
6. Do klasyfikacji genów Drosophila na geny wyciszone i ekspresjonowane wykorzystano wartość cyfrową RPKM (reads/per kilobase merged exonic region/per million mapped reads). Geny z RPKM = 0 zaklasyfikowano do grupy wyciszonych, a geny z RPKM ≥ 1 do grup ekspresjonowanych, które można podzielić na trzy podgrupy: geny o niskim, umiarkowanym i wysokim poziomie ekspresji, przy czym każda grupa zawiera zbliżoną liczbę genów.
7. Do porównania poziomu modyfikacji histonów i ekspresji genów wykorzystano skrypt w języku python opisany w poprzedniej publikacji³.

4. Reprezentatywne wyniki

Przykłady wyników ChIP-qPCR z wykorzystaniem jąder mutantów bam (bag of marbles) przedstawiono na Rysunku 1⁴. W jądrach mutantów bam dochodzi do zaburzenia przejścia z proliferujących spermatogoniów do różnicujących się spermatocytów^{5, 6}. Jądra bam wykorzystujemy jako źródło niedróżnicowanych komórek linii płciowej, które są wzbogacone w tym typie tkanki. Geny różnicowania niezbędne do różnicowania plemników, takie jak male-specific transcription factor 87 (mst87F), don juan (dj) i fuzzy onion (fzo), nie są ekspresowane w jądrach bam. Geny te wykazują wysoki stopień wzbogacenia w represyjną modyfikację histonów H3K27me3⁷ (Rysunek 1A), lecz są pozbawione aktywnej modyfikacji histonów H3K4me3⁸ (Rysunek 1B), co stanowi sygnaturę chromatyny, którą określiliśmy jako „monowalentną”⁷. Wzbogacenie w H3K27me3 lub H3K4me3 jest określane poprzez normalizację względem konstytutywnie ekspresowanego genu Cykliny A (CycA)⁴.

Analiza ChIP-seq z wykorzystaniem tego samego zestawu przeciwciał (tj. represyjnego H3K27me3 i aktywnego H3K4me3) w jądrach mutantów bam (Rysunek 2) potwierdziła wyniki qPCR przedstawione na Rysunku 1. W przypadku trzech badanych genów różnicowania końcowego mst87F, dj i fzo, ich regiony genomiczne są silnie wzbogacone w H3K27me3, ale nie w H3K4me3 (Rysunek 2A-2C). Z kolei konstytutywnie ekspresowany gen CycA wykazuje znaczące wiązanie H3K4me3, lecz niewielkie wiązanie H3K27me3 w pobliżu miejsca rozpoczęcia transkrypcji (TSS) (Rysunek 2D).

Ponadto profile ChIP dla H3K27me3 oraz H3K4me3 w pobliżu TSS czterech klas genów o różnym poziomie ekspresji są zgodne z funkcją każdej z tych modyfikacji histonowych. Jak pokazano na Rysunku 3A, wzbogacenie H3K27me3 poniżej TSS jest odwrotnie skorelowane z poziomem ekspresji genów. Geny wyciszone wykazują najwyższy poziom H3K27me3, podczas gdy geny silnie eksprimowane nie wykazują wiązania H3K27me3. Dane te są zgodne z represyjną rolą H3K27me3 w ekspresji genów. W przeciwieństwie do tego, wzbogacenie H3K4me3 wokół TSS wykazało odwrotną korelację z poziomem ekspresji genów (Rysunek 3B), co jest zgodne z aktywną rolą H3K4me3 w ekspresji genów.

Rysunek 1. Analiza qPCR DNA poddanego immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) z użyciem przeciwciał przeciwko represyjnej modyfikacji histonowej H3K27me3 (A) lub aktywnej modyfikacji histonowej H3K4me3 (B) w jądrach mutantów bam wzbogaconych w komórki niedróżnicowane. (A) W jądrach mutantów bam geny różnicowania (Mst87F, dj, fzo) są wzbogacone w represyjną modyfikację histonową H3K27me3. (B) Geny różnicowania wykazują deficyt aktywnej marki H3K4me3. Poziom DNA z ChIP (ChIP DNA/input) w genie docelowym (Mst87F, dj lub fzo) został najpierw znormalizowany do poziomu DNA z ChIP w kontrolnym genie CycA. Słupki błędów oznaczają odchylenie standardowe z trzech niezależnych powtórzeń biologicznych.

Rycina 2. Zrzuty ekranu z przeglądarki genomu UCSC przedstawiające wzbogacenie H3K27me3 i H3K4me3 w całych regionach genomicznych (A) Mst87F, (B) dj, (C) fzo oraz (D) genów CycA. Zakreślony region wzbogacony w H3K27me3 w części (D) odzwierciedla stan chromatyny nakładającego się genu CG7264, który wykazuje niską ekspresję w jądrach bam (RPKM=1), ale wysoką ekspresję w jądrach typu dzikiego wild-type (RPKM=130)⁸ (dane ChIP-seq z⁷). Sondy użyte w analizie ilościowej PCR wyników ChIP na Rycinie 1 są oznaczone na dole każdego wykresu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą rycinę.

Rycina 3. Profile ChIP-seq z wykorzystaniem H3K27me3 i H3K4me3 w jądrach bam⁷. Cztery grupy genów (7 509 genów) zostały sklasyfikowane zgodnie z poziomami ich ekspresji na podstawie wyników RNA-seq⁸. Reprezentatywne klasy genów przedstawiono pod kątem wzbogacenia w konkretną modyfikację histonów, stosując sekwencje od 3kb powyżej do 3kb poniżej ich miejsc startu transkrypcji (TSS). Pozwala to na wygenerowanie profilu wzbogacenia w analizach ChIP-seq dla (A) H3K27me3 (K27) oraz (B) H3K4me3 (K4) w każdej grupie. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinę.

Dyskusja

Wszechstronność analiz ChIP opisanych w niniejszym protokole pozwala na ich zastosowanie w różnych tkankach, co stwarza możliwość badania stanu chromatyny w biologicznie istotnym systemie. Eksperymenty ChIP z wykorzystaniem komórek z hodowli są wygodne w wykonaniu, ponieważ można łatwo uzyskać ich dużą ilość. Jednakże komórki hodowlane niekoniecznie odzwierciedlają stan komórek w środowisku wielokomórkowym. Dzięki opracowaniu tej techniki z wykorzystaniem wypreparowanej tkanki z żywych zwierząt możemy odpowiedzieć na wie...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kompletny Mini koktajl inhibitorów proteaz	Roche Group	11836153001
Formaldehyd (37%)	Supelco, Sigma-Aldrich	47083-U
PMSF	Sigma-Aldrich	78830
Moździerz i tłuczek Kontes	Fisher Scientific	K749521-1590
Zestaw do oczyszczania PCR	Qiagen	28104
Liniowa poliakrylamid	Sigma-Aldrich	56575-1ML
Glikogen	Qiagen	158930
SYBR green/ROX qPCR Master Mix	Fermentas	K0223
Mini wirówka do płytek	Labnet International	Z723533
System PCR w czasie rzeczywistym	Applied Biosystems	4351101
Ultradźwiękowy procesor do małych objętości	Misonix	HS-XL2000	Model wycofany z produkcji
Dynabeads, Protein A	Invitrogen	100-01D
Magnes Dynamag	Invitrogen	123-21D
Fenol:Chloroform:IAA	Invitrogen	15593-049
Zestaw Epicentre DNA END-Repair	Epicentre Biotechnologies	ER0720
Zestaw MinElute Reaction Cleanup	Qiagen	28204
Fragment Klenowa (3’→5’ exo-)	New England Biolabs	M0212S
Ligaza T4 DNA	Promega Corp.	M1794
Oligonukleotydy adaptorowe	Illumina	PE-400-1001
Primery Paired-End 1.0 i 2.0	Illumina	1001783 1001 784
System elektroforezy E-Gel	Invitrogen	G6512ST
2X Phusion HF Mastermix	Finnzymes	F-531