Identyfikacja i charakterystyka glikozylacji białek przy użyciu specyficznych endo- i egzoglikozydaz

Summary

Użycie określonych glikozydaz do usuwania cukrów z glikoprotein, a następnie SDS-PAGE jest cenną metodą wykrywania modyfikacji glikanów na próbkach białek i jest dobrym wyborem do wstępnych badań glikobiologicznych. Zmiany po deglikozylacji można wykryć jako zmiany w ruchliwości żelu lub przez barwienie odczynnikami wrażliwymi na glikany.

Abstract

Glikozylacja, czyli dodawanie kowalencyjnie połączonych cukrów, jest główną potranslacyjną modyfikacją białek, która może znacząco wpływać na procesy takie jak adhezja komórek, transport molekularny, klirens i transdukcja sygnału^1-4. U eukariontów najczęstszymi modyfikacjami glikozylacji w szlaku wydzielniczym są addycje do konsensusowych reszt asparaginy (sprzężonych z N); lub na resztach seryny lub treoniny (sprzężonych z O) (ryc. 1). Inicjacja syntezy N-glikanów jest wysoce konserwatywna u eukariontów, podczas gdy produkty końcowe mogą się znacznie różnić w zależności od gatunku, tkanki lub białka. Niektóre glikany pozostają niezmodyfikowane ("N-glikany o wysokiej zawartości mannozy") lub są dalej przetwarzane w Golgiego ("złożone N-glikany"). Większą różnorodność stwierdzono w przypadku O-glikanów, które zaczynają się od wspólnej reszty N-acetylogalaktozaminy (GalNAc) w komórkach zwierzęcych, ale różnią się w organizmach niższych¹.

Szczegółowa analiza glikozylacji białek jest dziedziną samą w sobie i wymaga rozległych zasobów i wiedzy specjalistycznej, aby przeprowadzić ją poprawnie. Jednak różnorodność dostępnych enzymów, które usuwają cukry (glikozydazy), pozwala uzyskać ogólne wyobrażenie o stanie glikozylacji białka w standardowych warunkach laboratoryjnych. W tym miejscu ilustrujemy zastosowanie glikozydaz do analizy modelowej glikoproteiny: rekombinowanej ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej beta (hCGβ), która zawiera dwa N-glikany i cztery O-glikany ⁵. Technika ta wymaga jedynie prostego oprzyrządowania i typowych materiałów eksploatacyjnych i może być łatwo dostosowana do analizy wielu próbek glikoprotein.

Kilka enzymów może być używanych równolegle do badania glikoproteiny. PNGaza F jest w stanie usunąć prawie wszystkie typy glikanów związanych z N ^6,7. W przypadku O-glikanów nie ma dostępnego enzymu, który mógłby rozszczepić nienaruszony oligosacharyd ze szkieletu białkowego. Zamiast tego O-glikany są przycinane przez egzoglikozydazy do krótkiego rdzenia, który jest następnie łatwo usuwany przez O-glikozydazę. Mieszanka deglikozylacji białek zawiera PNGazę F, O-glikozydazę, neuraminidazę (sialidazę), β1-4 galaktozydazę i β-N-acetyloglukozaminidazę. Służy do jednoczesnego usuwania N-glikanów i niektórych O-glikanów⁸ . Wreszcie, mieszanina deglikozylacji została uzupełniona mieszaniną innych egzoglikozydaz (α-N-acetylogalaktosaminidaza, α1-2 fukozydaza, α1-3,6 Galaktozydaza i β1-3 Galaktozydaza ), które pomagają usunąć oporne w inny sposób monosacharydy, które mogą być obecne w niektórych O-glikanach.

SDS-PAGE/Coomasie niebieski służy do wizualizacji różnic w migracji białek przed i po leczeniu glikozydazą. Ponadto metoda barwienia specyficzna dla cukru, ProQ Emerald-300, wykazuje zmniejszony sygnał, ponieważ glikany są sukcesywnie usuwane. Protokół ten jest przeznaczony do analizy niewielkich ilości glikoproteiny (0,5 do 2 μg), chociaż deglikozylację enzymatyczną można zwiększyć w celu uwzględnienia większych ilości białka w razie potrzeby.

Protocol

1. Deglikozylacja enzymatyczna

1. Użyj probówek PCR, aby zminimalizować utratę wody w wyniku parowania. Oznacz jeden zestaw probówek od 1 do 7.
2. Rozmrozić bufor 10X G7, 10X bufor denaturujący glikoproteinę i 10% NP-40 i delikatnie postukać w probówki, aby wymieszać zawartość. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
3. Umieścić fiolki zawierające enzymy na lodzie. Staraj się zminimalizować cykle rozmrażania/zamrażania.
4. Rozpuścić zawartość fiolki hCGβ (150 μg) w 600 μl dH₂O i przechowywać na lodzie.
5. Przygotować 1 ml 1X buforu G7, rozcieńczając 10X bulion w dH₂O.
6. Rozcieńczyć 0,5 μl PNGazy F w 25 μl buforu 1X G7 i przechowywać na lodzie.
7. Przygotuj mieszaninę egzoglikozydazy (mieszankę EG), łącząc po 2 μl α-N-acetylogalaktosaminidazy, α1-2 fukozydazy, β1-3 galaktozydazy i α1-3,6 galaktozydazy.
8. Ustaw probówki do PCR zgodnie ze wskazaniami:

Rurka/próbka# 1 cyfra arabska 3 4 5 6 7 hCGβ (0,25 mg / ml) 9μl 9μl 9μl 9μl -- -- -- 10X Bufor do denaturacji glikoproteiny   1μl 1μl 1μl 1μl 1μl 1μl 1μl dH₂O -- -- -- -- 9μl 9μl 9μl

9. Zakryj probówki, delikatnie wymieszaj i umieść w termocyklerze, zamknij pokrywę i denaturuj białka poprzez inkubację przez 10 minut w temperaturze 94°C, a następnie utrzymanie w temperaturze 4°C (użycie probówek do PCR w termocyklerze znacznie zapobiega parowaniu w próbkach o małej objętości).
10. Wyjmij probówki z termocyklera i odwiruj, aby usunąć widoczną kondensację.
11. Dodać następujące odczynniki, jak wskazano:

Próbka# 1 cyfra arabska 3 4 5 6 7 10% NP-40 2,5 μl 2,5 μl 2,5 μl 2,5 μl 2,5 μl 2,5 μl 2,5 μl 10X bufor G7 2,5 μl 2,5 μl 2,5 μl 2,5 μl 2,5 μl 2,5 μl 2,5 μl PNGaza F 1:50 dil. -- 2μl -- -- 2μl -- -- Mieszanka deglikozylacji -- -- 2μl 2μl -- 2μl 2μl Mieszanka EG -- -- -- 2μl -- -- 2μl dH₂O 10μl 8μl 8μl 6μl 8μl 8μl 6μl Całkowita reakcja, obj. 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl

12. Zamknąć probówki PCR za pomocą nowych nakrętek (wyrzucić zużyte, ponieważ nie pasują prawidłowo po jednym cyklu inkubacji).
13. Wymieszaj probówki, delikatnie stukając 4 razy, a następnie odkręć zawartość.
14. Umieścić probówki w termocyklerze i inkubować w temperaturze 37 °C przez 4 godziny, a następnie schłodzić próbki do temperatury 4 °C.

2. SDS-PAGE próbek deglikozylowanych

1. Przygotuj 130 μl świeżego bufora ładującego SDS 3X, dodając 4 μl 1,25M naziemnej telewizji cyfrowej.
2. Do każdej próbki dodać 12,5 μl przygotowanego buforu ładującego 3X redukującego SDS.
3. Zamknij probówki nowymi nakrętkami i delikatnie postukaj w tubki, aby wymieszać.
4. Inkubować probówki w termocyklerze w temperaturze 94°C przez 5 minut, a następnie schłodzić do temperatury 4°C.
5. Załaduj 30 μl każdej próbki i 10 μl markera białkowego na 10-20% żel Tris-Glycine. Pozostałą część próbki należy zachować w części 3.1. Załaduj 10 μl wstępnie wybarwionego markera białkowego ColorPlus.
6. Elektroforezę żelu pod napięciem 130 woltów w temperaturze pokojowej, aż przód barwnika znajdzie się w pobliżu dna żelu.
7. Kiedy żel skończy działać, usuń żel z odlewu i umieść go w małym plastikowym pudełku z wystarczającą ilością niebieskiej plamy Coomasie, aby pokryć żel.
8. Plamić żel przez 1 godzinę delikatnym mieszaniem.
9. Umyj żel trzy razy przez 30 minut w 50 ml roztworu odplamiającego.
10. Rejestruj obrazy za pomocą transiluminatora światła białego lub skanera. Alternatywnie żel można wysuszyć między arkuszami celofanu w ramce.

3. Pro-Q Emerald 300 do wykrywania glikozylowanych białek w żelach SDS-PAGE

1. Równolegle z żelem w 2.1) załadować pozostałe próbki na 10-20% żel Tris-Glycine. Załaduj 10 μl wstępnie wybarwionego markera białkowego ColorPlus.
2. Podczas pracy żelu rozpuść odczynnik Pro-Q Emerald za pomocą DMF i przygotuj roztwory utrwalające, myjące i utleniające dla bejcy Pro-Q Emerald 300, postępując zgodnie z instrukcją produktu dołączoną do zestawu.
3. Po zakończeniu elektroforezy usuń żel z odlewu i umieść go w plastikowym pudełku.
4. Utrwal żel, dodając 100 ml roztworu Fix i pozostawiając go na noc w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem.
5. Przemyć żel 100 ml roztworu do przemywania przez 10 do 20 minut w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem. Powtórz pranie ze świeżym roztworem do mycia.
6. Utlenić węglowodany poprzez inkubację żelu z delikatnym mieszaniem przez 30 minut w 25 ml roztworu utleniającego.
7. Umyj żel zgodnie z opisem w kroku 3.5.
8. Podczas mycia żelu przygotuj świeżą plamę Pro-Q Emerald 300, dodając 500 μl roztworu odczynnika Pro-Q Emerald 300 rozpuszczonego w kroku 3.2 do 25 ml buforu barwiącego znajdującego się w zestawie.
9. Wybarwić żel, dodając 25 ml barwnika przygotowanego w kroku 3.8 i inkubując w ciemności z delikatnym mieszaniem przez 90 do 120 minut.
10. Powtórz dwa kroki prania opisane w kroku 3.5.
11. Rejestruj obrazy za pomocą transiluminatora UV o długości fali 300 nm. Użyj markera o mocy 80 kDa, który jest oznaczony kolorem Pro-Q Emerald Green, aby nałożyć obraz UV na obraz żelu w świetle białym, pokazujący wstępnie zabarwioną drabinę.
12. Porównaj zdjęcia barwionego żelu Coomasie w kroku 2.10 z barwionym żelem Pro-Q Emerald z kroku 3.11.

4. Reprezentatywne wyniki

Zmiany w migracji białek po enzymatycznej deglikozylacji są pokazane na rysunku 2. Porównaj próbkę kontrolną (panel A, tor 1) z traktowaniem PNGazy F (usunięcie N-glikanów, tor 2) i mieszanką deglikozylacyjną (PNGaza F; plus endo- i egzoglikozydazy w celu usunięcia O-glikanów, tor 3). Nie obserwuje się dalszego zmniejszenia wielkości po trawieniu z dodatkowymi glikozydazami (ścieżka 4). Oprócz zmiany masy, pasma stają się ostrzejsze, gdy glikany są usuwane. Pasma biegnąca pod markerem 17 kDa (gwiazdka) reprezentuje w pełni zdeglikozylowany polipeptyd hCGβ (MW: 16 kDa). Inne prążki mogą pochodzić z niepełnej deglikozylacji lub z wielu niezidentyfikowanych białek obecnych w próbce hCGβ (patrz tor 1). Pasy od 5 do 7 (kontrole) pokazują prążki odpowiadające glikozydazom.

Barwienie glikoproteiną przez Emerald Green jest pokazane w panelu B. Odczynnik ten utlenia i barwi wszystkie glikany obecne w cząsteczce białka. W związku z tym intensywność sygnału maleje, gdy hCGβ jest enzymatycznie deglikozylowany (pas 1 do toru 4). Sygnał szczątkowy na torach 3 i 4 wskazuje na obecność motywów glikanowych, które są odporne na zastosowane enzymy. Dodatkowe glikozydazy użyte na torze 4 usuwają kilka dodatkowych pozostałości cukru: migracja białek jest taka sama, ale można zauważyć niewielkie zmniejszenie intensywności barwienia. Oporne grupy cukrowe nie były obecne we wszystkich gatunkach białek: niektóre prążki nie zostały wykryte przez Emerald Green (brak na obrazie UV, w nawiasach), co wskazuje, że były one w znacznym stopniu deglikozylowane. Dodatkowe dane potwierdzają wniosek, że hCGβ jest niejednorodnie glikozylowany. Dolne pasmo na pasie 2 (strzałka) jest słabe na obrazie Emerald Green, podczas gdy górne pasmo na pasie 2 jest jasne, co wskazuje, że wiele grup glikanów jest nadal obecnych. Dane te potwierdzają wniosek, że rekombinowany hCGβ ulegający ekspresji w komórkach myszy zawiera wiele glikoform^{9 .} Te różne glikoformy wynikają z nieodłącznej niejednorodności glikozylacji, w której niektóre polipeptydy nie otrzymują glikanu w każdym miejscu konsensusu i / lub niektóre glikany są wydłużone, podczas gdy inne, nawet na tym samym białku, nie są.

Rysunek 1. Typowe wzorce glikozylacji dla wydzielanych lub powierzchniowych glikoprotein.

Rysunek 2. Żele SDS-PAGE wykazujące enzymatyczną deglikozylację hCGβ. Panel A pokazuje niebieskie barwienie Coomasie, podczas gdy panel B pokazuje wyniki Pro-Q Emerald 300 do wizualizacji glikozylowanych białek. Numer próbki: 1, kontrola hCGβ; 2, trawienie PNGazy F; 3, trawienie mieszanką deglikozylacyjną; 4, Mieszanka deglikozylacji plus trawienie egzoglikozydazów, próbki od 5 do 7 to kontrole odczynników (O-Glyc, O-Glycosidase; GNA, β-N-acetyloglukozaminidaza; Gal/Fuc, β1-3 Galaktozydaza, α1-3,6 Galaktozydaza i α1-2 Fukozydaza; GalNA, α-N-acetyloglalaktosaminidaza; Neu, Neuraminidaza; Format PNGaza; PNGase F)

Discussion

Opisana tutaj metoda wykorzystująca deglikozylację enzymatyczną i SDS-PAGE może dostarczyć cennych informacji na temat stanu glikozylacji białka będącego przedmiotem zainteresowania, podczas gdy odczynniki specyficzne dla glikanów ułatwiają interpretację danych. Protokół ten jest przeznaczony do wstępnych badań glikozylacji białek i jest szczególnie odpowiedni dla glikoprotein wydzielniczych i błonowych z komórek ssaków: wybrane w tym przypadku enzymy specyficznie usuną wszystkie N-glikany i/lub N-glikany plus i najpowszechniejsze cukry rozciągające się i tworzące rdzeń O-glikany. Glikozydazy mają tę dodatkową zaletę, że są łagodne w porównaniu z chemicznymi metodami deglikozylacji, zachowując integralność zarówno cukrów, jak i szkieletu białkowego.

Aby wyjaśnić stopień zajmowania (które aminokwasy są glikozylowane), zakres glikozylacji lub określić drobną strukturę glikanów, wymagane są bardziej wyrafinowane techniki, takie jak spektrometria mas, chromatografia cieczowa lub NMR.

Ze względu na jego prostotę, kilka kroków w tym protokole można dostosować, zastąpić i/lub połączyć w celu zaspokojenia różnych potrzeb eksperymentalnych. Jednak, aby uzyskać wyniki, które można jednoznacznie zinterpretować, ważne jest zrozumienie jego mocnych stron i ograniczeń. Po pierwsze, kluczowe znaczenie ma specyficzność i czystość glikozydaz: należy stosować tylko dobrze scharakteryzowane enzymy, które są testowane jako wolne od proteaz i innych substancji zanieczyszczających. Niestety, nie ma standardowej definicji jednostki enzymatycznej dla glikozydaz; Użytkownik powinien ustalić odpowiedni zamiennik zgodnie ze specyfikacją producenta. Po drugie, konieczny jest staranny wybór detekcji: a) Odczynniki do barwienia białek są przydatne tylko wtedy, gdy deglikozylacja powoduje znaczne przesunięcie masy cząsteczkowej. Tak wyraźny wynik, jak pokazany tutaj, nie zawsze jest uzyskiwany. W innych przypadkach zaobserwowaliśmy nieprawidłową migrację po deglikozylacji (daleką od przewidywanej masy cząsteczkowej, a nawet wolniejszą migrację). Zjawisko to nie jest dobrze poznane, ale można powiedzieć, że każda zmiana w migracji jest dowodem na to, że białko zostało zdeglikozylowane. b) Wykrywanie cukru za pomocą przeciwciał wiąże się z wyjątkowymi wyzwaniami ograniczającymi ich zastosowanie. Bardzo trudno było wytworzyć ogólne przeciwciała antyglikańskie; Zwykle są one hodowane przeciwko złożonemu celowi glikanów, co ogranicza ich stosowanie. Ponadto kilka monoklonalnych przeciwciał antyglikanowych wykazuje niepożądaną reaktywność krzyżową¹⁰. c) Lektyny (białka o wewnętrznym powinowactwie do cukrów) dobrze nadają się do wykrywania cukrów, a ponadto dają wgląd w strukturę glikanów. Jednak nie wszystkie z nich mają wąską specyfikę; a wiele z nich jest tylko częściowo scharakteryzowanych (co oznacza, że mogą mieć nieznane pokrewieństwo). W konsekwencji dodatnie barwienie lektyną stanowi wskazówkę, a nie dowód na obecność danego cukru. d) Zestawy do znakowania chemicznego (oparte na periodycznym utlenianiu cukrów) są metodą z wyboru do barwienia wszystkich glikoprotein, a zatem dobrze nadają się do deglikozylacji.

Podczas przetwarzania nieznanej próbki dobrą praktyką jest uwzględnienie kontroli glikoproteiny. Fetuina jest łatwo dostępną N- i O-glikoproteiną; Gonadotropina kosmówkowa (obie podjednostki) jest również dobrym wyborem. Albumina surowicy bydlęcej (BSA) może być stosowana jako kontrola ujemna. Należy jednak zauważyć, że niektóre nieglikozylowane białka nieznacznie reagują z Pro-Q Emerald 300, szczególnie gdy są stosowane w wysokich stężeniach. Nieglikozylowane wzorce masy cząsteczkowej, takie jak wstępnie wybarwiony marker białkowy stosowany w tym protokole, mają tę zaletę, że wyświetlają ostre pasma. Tylko przypadek sprawia, że jedno z tych białek (80 kDa) reaguje na Pro-Q Emerald 300. Dlatego użytkownik może zamiast tego chcieć uruchomić standardową drabinę glikoproteinową, taką jak Candy-Cane firmy Invitrogen.

Wreszcie, proste wykrywanie glikoprotein nukleocytozolowych w żelu (które są modyfikowane pojedynczym O-GlcNAc) jest możliwe przy użyciu przeciwciała monoklonalnego wraz z β-N-acetyloglukozaminidazą w celu kontroli swoistości ¹¹. Opis tej techniki wykracza poza zakres tego artykułu, ale należy o niej wspomnieć, ponieważ glikozydazy są przydatnymi narzędziami do badania wielu innych glikoprotein i glikokoniugatów obecnych w komórkach. Kompleksowe omówienie wszystkich znanych form glikozylacji można znaleźć w drugim wydaniu "Podstaw glikobiologii"; dostępne bezpłatnie online na półce NCBI (identyfikator półki na książki: NBK1908; PMID: 20301239)¹².

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ludzka gonadotropina kosmówkowa β	Probówki do PCR Sigma-Aldrich	C6572
	VWR international	20170-004
Termocykler do PCR	Applied Biosystems	4359659
PNGase F	New England Biolabs	P0704	Dostarczane z
Mieszanka deglikozylacji białek	New England Biolabs	P6039	Dostarczane z
i alfa N-acetylglalaktosaminidaza	New England Biolabs	P0734	Dostarczany z buforem
i alfa; 1-2 Fukozydaza	New England Biolabs	P0724	Dostarczany z buforem
i alfa; 1-3,6 Galaktozydaza	New England Biolabs	P0731	Dostarczany z buforem
β 1-3 Galaktozydaza	New England Biolabs	P0726	Dostarczany z buforem
10X Buffer G7 (500 mM Sodium Phosphate)	New England Biolabs	---	Dostarczany z PNGaseF lub Degl Mix
10X Glikoprotein Denatura Buffer (5% SDS, 400 mM DTT)	New England Biolabs	---	Dostarczany z PNGaseF lub Degl Mix
10% NP-40	New England Biolabs	---	Dostarczany z PNGaseF lub Degl Mix
3X bufor ładujący SDS (187,5 mM Tris-HCl pH 6,8, 6% SDS, 30% glicerol, 0,03% błękitu bromofenolowego)	New England Biolabs	B7703	Dostarczany z 1,25 m wstępnie
wybarwionym markerem białkowym	ColorPlus New England Biolabs	P7709
10-20% Tris-Glycine Multigel	Cosmo Bio Co.	DCB-414893
Jednostka do elektroforezy kasetowej	Cosmo Bio Co.	DCB-303111
Zasilacz do elektroforezy EPS 301	GE Healthcare	18-1130-01
Pro-Q Emerald 300 Zestaw barwników glikoproteinowych	Invitrogen	P-21857
Brilliant Blue R	Sigma-Aldrich	B0149
AlphaImager HP System	Cell Biosciences	92-13823-00