Artykuł metodologiczny

Profilowanie proteomu redoks grup tiolowych z wykorzystaniem spektrometrii mas z tagowaniem izotopowym

DOI:

10.3791/3766

⸱

24 marca 2012

 ,  ,  , 
1Plant Molecular and Cellular Biology Program, University of Florida , 2Department of Biology, University of Florida , 3Interdisciplinary Center for Biotechnology Research, University of Florida , 4Genetics Institute, University of Florida

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Poziom reaktywnych form tlenu wzrasta, gdy komórki znajdują się w warunkach stresowych. Przedstawiamy tutaj przykład barwienia 3',3'-diaminobenzydyną oraz znakowania cysTMT i spektrometrii mas w celu profilowania proteomu redoks w liściach pomidora traktowanych Pseudomonas syringae.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pseudomonas syringae pv. tomato szczep DC3000 wywołuje plamistość bakteryjną nie tylko u Solanum lycopersicum, ale także u gatunków Brassica oraz u Arabidopsis thaliana, która jest modelową rośliną gospodarza pod względem genetycznym1,2. Akumulacja reaktywnych form tlenu (ROS) w kotyledonach inokulowanych szczepem DC3000 wskazuje na rolę ROS w modulowaniu nekrotycznej śmierci komórek podczas plamistości bakteryjnej pomidora3. Nadtlenek wodoru, będący składnikiem ROS, jest wytwarzany po inokulacji roślin pomidora Pseudomonas3. Nadtlenek wodoru można wykryć za pomocą barwienia histochemicznego 3'-3' diaminobenzydyną (DAB)4. Barwienie DAB reaguje z nadtlenkiem wodoru, tworząc brązowy osad w tkance liścia4. ROS pełnią funkcję regulacyjną w środowisku redox komórki, co może zmieniać stan redoks niektórych białek5. Cysteina jest ważnym aminokwasem wrażliwym na zmiany redoks. W warunkach łagodnego utleniania odwracalne utlenianie grup sulfhydrylowych cysteiny służy jako sensory redoks i przetworniki sygnałów regulujące szereg procesów fizjologicznych6,7. Odczynniki TMT (tandem mass tag) umożliwiają jednoczesną identyfikację i multipleksową kwantyfikację białek w różnych próbkach przy użyciu tandemowej spektrometrii mas8,9. Odczynniki TMT reagujące z cysteiną (cysTMT) umożliwiają selektywne znakowanie i relatywną kwantyfikację peptydów zawierających cysteinę z maksymalnie sześciu próbek biologicznych. Każdy izobaryczny znacznik cysTMT posiada taką samą nominalną masę prekursorową i składa się z grupy reagującej z grupą sulfhydrylową, neutralnego w MS ramienia dystansowego oraz reportera MS/MS10. Po znakowaniu próbki poddano trawieniu proteolitycznemu. Peptydy znakowane cysteiną wzbogacono za pomocą żywicy zawierającej przeciwciało anty-TMT. Podczas analizy MS/MS w obszarze niskich mas pojawia się seria jonów reporterowych (tj. 126-131 Da), dostarczających informacji o relatywnej kwantyfikacji. Procedura ta jest skuteczna w redukcji złożoności próbek, poprawie zakresu dynamicznego oraz badaniu modyfikacji cysteiny. W niniejszej pracy przedstawiamy analizę proteomiczną redoks liści pomidora (Rio Grande) potraktowanych Pst DC3000 z wykorzystaniem technologii cysTMT. Ta wysokoprzepustowa metoda ma potencjał do zastosowania w badaniu innych regulowanych przez redoks procesów fizjologicznych.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hodowla siewek i przygotowanie bakterii

  1. Siewki są kiełkowane w mieszance glebowej MetroMix 500 (BWI Companies) w komorze wzrostu (160 μmol fotonów m-2s-1 przy fotoperiodzie: 8 godzin światła w temperaturze 22 °C i 16 godzin ciemności w temperaturze 20 °C) przez 1 tydzień. Wilgotność względna została ustawiona na 70%. Siewki podlewano wodą z kranu w razie potrzeby, aby zapobiec wyschnięciu gleby.
  2. Dwie siewki o podobnej wielkości są następnie przesadzane do doniczek o średnicy 4" zawierających glebę MetroMix 500 i hodowane przez dodatkowe 3 tygodnie w tych samych warunkach, co w punkcie 1.1.
  3. Pseudomonas syringae (Pst) jest początkowo wysiewana metodą smugową na płytki z pożywką Kings B Medium (KBM) (na litr: 20 g peptonu proteozowego, 0,1975 g MgSO4, 1% glicerolu, 1,5 g K2HPO4, 18 g agaru) i hodowana przez dwa dni w temperaturze 28 °C. Pojedynczą kolonię pobiera się, miesza z 300 μl płynnej pożywki Kings B Medium (20 g peptonu proteozowego, 0,1975 g MgSO4, 10 mL glicerolu, 10 mL 100-krotnego roztworu zapasowego K2HPO4 (1,5 g K2HPO4 w 10 mL H2O)) i wysiewa na płytkę z pożywką Kings B Medium. Następnie inkubuje się ją przez noc w temperaturze 28 °C.
  4. Inokulum bakteryjne przygotowuje się poprzez zebranie wyhodowanych bakterii z płytki KBM i zawieszenie ich w 20 mL H2O. Roztwór o OD600 wynoszącym 0,03 (~106 cfu/ml) przygotowuje się w 1 L buforu do inokulacji (10 mM MgCl2 + 400 μL Silwett-70). Jako roztwór kontrolny przygotowano bufor do inokulacji bez bakterii.

2. Inokulacja pomidorów Pst oraz histochemiczne barwienie na H2O2

  1. Czterotygodniowe rośliny inokulowano poprzez zanurzenie w powyższym roztworze inokulacyjnym na 30 sekund. Bezpośrednio po inokulacji rośliny przykryto przezroczystymi plastikowymi workami.
  2. Barwnik 3'-3' diaminobenzydyna (DAB)11 został przygotowany (1 mg/ml DAB w H2O, pH 3,8 (HCl)) na trzy dni przed użyciem w celu zapewnienia całkowitego rozpuszczenia. Roztwór mieszano na wytrząsarce w temperaturze pokojowej.
  3. Dwadzieścia cztery godziny po zabiegu usunięto w pełni rozwinięty liść, umieszczono go stroną epidermalną do góry w barwniku DAB i poddano infiltracji próżniowej przez 15 min. Następnie liście pozostawiono w ciemności w temperaturze pokojowej na noc w celu przeprowadzenia barwienia.
  4. Liście gotowano w 95% etanolu przez 10 min, a następnie przechowywano w 75% etanolu.

3. Ekstrakcja białek

  1. Po zbiorze liście pomidora utarto na drobny proszek w ciekłym azocie za pomocą moździerza i tłuczka.
  2. Do 0,5 g tkanki dodano 1,25 mL buforowanego fenolu w Tris pH 8.8 oraz 1,25 mL / 0,5 g buforu do ekstrakcji (0,1 M Tris-HCl pH 8.8, 10 mM EDTA, 0,9 M sacharozy), a następnie kontynuowano ucieranie przez kilka kolejnych minut w dygestorium.
  3. Ekstrakt przeniesiono do probówki wirówkowej Oakridge (Thermo Fisher Scientific Nalgene Company) i mieszano przez 2 h w temperaturze pokojowej.
  4. Wirówkowano przy 5,000x g i 15 °C przez 10 min. Górną fazę fenolową przeniesiono do nowej, czystej probówki.
  5. Przeprowadzono reeksstrakcję fazy wodnej równą objętością buforu fenolowego; mieszano na wytrząsarce przez 30 min. Wirówkowano i przeniesiono ekstrakt do nowej probówki Falcon.
  6. Powtórzono powyższy krok jeszcze raz i przeniesiono ekstrakt do nowej probówki Oakridge.
  7. Białka wyekstrahowane fenolem wytrącono poprzez dodanie 5 objętości 0,1 M octanu amonu w 100% metanolu (przechowywanego w -20 °C). Wymieszano w wortexie i inkubowano w -20 °C przez noc.
  8. Osad białkowy zebrano poprzez wirowanie przy 20,000x g i 4 °C przez 20 min.
  9. Osad przemyto 2 razy zimnym 0,1 M octanem amonu w metanolu oraz 2 razy zimnym 80% acetonem. Do osadu dodano 1,5 mL zimnego 70% etanolu i zawieszono. Przeniesiono do probówki do mikrowirówki 2 mL (USA Scientific) i wirowano przy 14,000 rpm i 4 °C przez 20 min. Usunięto etanol.
  10. Osad krótko wysuszono w koncentratorze SpeedVac i rozpuszczono w buforze do ekstrakcji białek, np. ReadyPrep Protein Extraction Kit Reagent 3 (8 M Urea, 4% CHAPS, 40 mM Tris-base, 2 M Thiourea) (Bio-Rad). Wirowano przy 14,000 rpm i 20 °C przez 30 min w celu uformowania osadu. Zebrano nadsącz.
  11. Stężenie białka zmierzono za pomocą testu białkowego CB-X zgodnie z instrukcją producenta (Geno Technology).

4. Przygotowanie próbki i znakowanie peptydów za pomocą cysTMT

  1. Przygotować próbkę białka o stężeniu 2-5 μg/μL. W niniejszym protokole zastosowano 100 μg białka dla każdego znacznika masy w próbkach o objętości 20 μL-50 μL. W tym doświadczeniu wykorzystano wszystkie 6 znaczników.
  2. Do próbki białka dodać równą objętość buforu do alkilacji (100 mM Tris-HCl pH7.5, 200 mM jodoacetamidu), aby zablokować wolne grupy tiolowe. Bufor należy przygotować bezpośrednio przed użyciem. Alkilację przeprowadza się w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
  3. Wytrącić białko, dodając 1 mL zimnego 80% acetonu i inkubując przez noc w temperaturze -20°C. Osadzić białko poprzez wirowanie przy 14 000 rpm w temperaturze 4 °C przez 20 min. Osad przemyć 3 razy 80% acetonem, za każdym razem mieszając na wortexie. Usunąć nadsącz i pozostawić do wysuszenia na powietrzu na lodzie.
  4. Resuspender osad w 50 μL buforu do lizy (6 M Urea, 50 mM Tris base, 1 mM EDTA). Następnie dodać 0,5 μL 100 mM Tris(2-karboksyetylu) fosfiny (TCEP), aby zredukować mostki dwusiarczkowe, inkubując przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej.
  5. Przygotować znaczniki, dodając 20 μL acetonitrylu do probówek z odczynnikami w celu ich rozpuszczenia. Wymieszać na wortexie i odwirować na dno.
  6. Usunąć nadmiar TCEP, używając wirówki z filtrem Microcon 3KD (Millipore). Do kolumny Microcon 3KD dodać 50 μL próbki oraz 50 μL buforu do lizy. Wirować przez 15 min przy 10 000x g i 4 °C. Powtórzyć ten krok łącznie trzy razy. Wyjąć kolumnę i odwrócić ją do czystej probówki. Wirować przez 5 min przy 1 000x g i 4 °C.
  7. Sprawdzić pH. W razie potrzeby skorygować pH do poziomu 7,0-8,0 za pomocą 1 M HCl.
  8. Do każdej próbki dodać 5 μL odczynnika cysTMT (zestaw odczynnika cysTMT zawiera znaczniki w objętości 20 μL dla maksymalnie 500 μg białka; w tej metodzie zastosowano 100 μg białka, zatem użyto jednej piątej objętości znacznika). Pozostawić do zajścia reakcji przez 2 h w temperaturze pokojowej.
  9. Próbki połączono z buforem do próbek Laemmli (Bio-Rad) w stosunku 1:1.

5. Usuwanie nieprzereagowanej frakcji tagu i frakcjonowanie próbki

  1. Próbki gotowano przez 5 min, a następnie rozdzielano na gotowym żelu poliakrylamidowym 12% (Bio-Rad). Żel płukano trzykrotnie w odstępach 5-minutowych przefiltrowaną wodą H2O i barwiono Coomassie Blue (Bio-Rad) przez 1 godzinę. Żel odbarwiano przez noc w H2O.
  2. Z każdej ścieżki żelu pobrano dwanaście frakcji. Frakcje wyznaczono na podstawie stężeń prążków białkowych. Frakcje pocięto na kawałki o długości 1 mm i umieszczono w probówkach o pojemności 1,5 mL.
  3. Fragmenty żelu odbarwiano przy użyciu 50% acetonitrylu i 0,1 M wodorowęglanu amonu w H2O. Krok ten należy powtarzać do czasu całkowitego usunięcia niebieskiego koloru z fragmentów żelu (~3-4 razy, po 15 min za każdym razem).
  4. Odbarwione fragmenty żelu suszono przy użyciu 100% acetonitrylu (przykrywając fragmenty żelu) przez 15 min, po czym usunięto naddestylat i wysuszono fragmenty za pomocą SpeedVac.
  5. Rozpuścić trypsynę (Promega) w stosunku 1:10 (trypsyna: białko) w objętości (równej objętości połączonej próbki znakowanej) 25 mM wodorowęglanu amonu. Na przykład: próbka 600 μg białka o objętości 500 μL wymaga 60 μg trypsyny rozpuszczonej w 500 μL 25 mM wodorowęglanu amonu.
  6. Dodać roztwór trypsyny do fragmentów żelu i pozostawić na lodzie w celu rehydratacji. Jeśli fragmenty nie są całkowicie przykryte, dodać bufor 50 mM wodorowęglanu amonu. Po rehydratacji inkubować w 37 °C przez 12-16 h.
  7. zebrać ciekły ekstrakt białkowy z inkubowanych próbek.
  8. Zatrzymać reakcję i usunąć pozostałe produkty trawienia białek, przykrywając fragmenty żelu 5% kwasem mrówkowym i 50% acetonitrylem. Wstrząsać fragmentami żelu przez 20 min w temperaturze pokojowej. Przenieść naddestylat do probówek z ekstraktem białkowym z punktu 5.7. Powtórzyć procedurę ekstrakcji dwukrotnie. Wysuszyć wyekstrahowane peptydy za pomocą SpeedVac.

6. Wzbogacanie próbek peptydów znakowanych cysTMT

  1. Do probówek o pojemności 0,5 mL dodać gradient żywicy anti-TMT w celu uzyskania 50% zawiesiny. (Gradient określono na podstawie stężenia prążków w żelu frakcjonującym. W przypadku frakcji zawierającej ciemny prążek wymagane jest użycie większej ilości żywicy. Frakcje z słabszymi prążkami wymagają mniejszej ilości żywicy ze względu na niższą zawartość białka.)
  2. Następnie żywicę przemyto trzykrotnie objętością kolumny 1x soli buforowanej trissolą (TBS) (25 mM Tris, 0,15 M NaCl, pH 7,2) (Thermo Scientific Pierce Protein Research Products).
  3. Do każdej próbki dodać 200 μL 1xTBS. Następnie próbki naniesiono na żywicę anti-TMT (Thermo Scientific Pierce Protein Research Products) i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 2 h, a następnie mieszano na kołysarce przez noc w 4 °C.
  4. Próbkę nanieść na kolumnę (Thermo Scientific Pierce Protein Research Products).
  5. Każdą kolumnę przemyć trzykrotnie 200 μL 1x TBS. Następnie przeprowadzić trzykrotne przemywanie 0,05% CHAPs (rozpuszczonych w 1x TBS).
  6. Kolumnę przemyto następnie trzykrotnie 4 M mocznikiem w 1x TBS. Do trzykrotnego przemycia kolumny wykorzystano następnie dwieście mikrolitrów H2O.
  7. Każdą próbkę eluoowano trzykrotnie 200 μL 50% buforu elucyjnego (50% acetonitrylu, 0,4% TFA).
  8. Próbki wysuszono następnie w koncentratorze próżniowym.

7. Analiza spektrometryczna

  1. Przesuspender próbki w 12 μL 3% acetonitrylu z 0,1% kwasem mrówkowym i wstrzyknąć 5 μL bezpośrednio do kolumny wysokosprawnej chromatografii cieczowej Eksigent NanoLC-1D (AB SCIEX, USA).
  2. Peptydy zostaną rozdzielone na kolumnie Proteopep II C18 75 μm ID x 20 cm (New Objective, USA) przy użyciu gradientu 4-60% (A: 3% acetonitrylu, 0,1% kwasu mrówkowego; B: 97% acetonitrylu, 0,1% kwasu mrówkowego) z przepływem 3 μL/min przez 60 min.
  3. Do detekcji peptydów wykorzystano spektrometr mas Thermo Scientific LTQ Orbitrap XL w trybie eksperymentu top 2 x 3, składającym się z jednowartościowego MS, a następnie akwizycji 3 widm MS/MS z fragmentacją HCD (higher-energy C-trap dissociation), po których nastąpiły 3 widma MS/MS z fragmentacją CID (collision induced dissociation) w celu identyfikacji białek. Parametry w tym trybie wynosiły: szerokość izolacji: 3,0 m/z; energia kolizyjna: 50% (10% w dwóch krokach). Do fragmentacji wybrano wyłącznie peptydy dwu- i trzykrotnie naładowane. Parametry dynamicznej ekskluzji ustawiono następująco: liczba powtórzeń (Repeat count) = 1; czas trwania powtórzenia (Repeat Duration) = 60; rozmiar listy ekskluzji (Exclusion list size) = 500; czas trwania ekskluzji (Exclusion duration) = 28. Wartości docelowe wyniosły: MS = 5 e5; MS/MS (HCD) = 1 e5. Czas transferu jonów ustawiono na 500 dla FTMS i 300 dla MS/MS (HCD). Do widm HCD wymagane były dwa mikroskany.

8. Przeszukiwanie bazy danych i kwantyfikacja

  1. Pozyskane dane CID i HCD przeanalizowano przy użyciu oprogramowania Thermo Scientific Proteome Discoverer 1.2 (Thermo Scientific Pierce Protein Research Products) w ramach rozgałęzionego przepływu pracy, który wykorzystywał moduł Reporter Ion Quantizer (tolerancja masy jonów fragmentacyjnych 20 ppm) w celu określenia stosunku ilościowego. Osobny segment przetwarzał widma MS2 poprzez węzły Spectrum Selector, Spectrum Normalizer oraz Spectrum Grouper.
  2. Następnie dane przeszukano za pomocą wyszukiwarki SEQUEST. Zastosowano tolerancję masy 20 ppm. Modyfikacje statyczne ustawiono dla odczynnika cysTMT (304,18 Da), a modyfikacje dynamiczne obejmowały fosforylację oraz utlenianie metioniny (15,99 Da). W obu przypadkach wykorzystano niestandardową bazę danych dla Solanum lycopersicum, opracowaną na podstawie danych RNA (około 350 000 wpisów z Harvard University)13.

9. Reprezentatywne wyniki

Reprezentatywny obraz liścia kontrolnego rośliny pomidorowej oraz liścia inokulowanego Pseudomonas przedstawiono na Rysunku 1. Widoczna jest różnica między liśćmi kontrolnymi a liśćmi traktowanymi Pseudomonas. Po usunięciu liści i ich zabarwieniu za pomocą DAB, proces odbarwiania pozwala na uwidocznienie barwienia histochemicznego wskazującego na obecność ROS w tkance liścia (Rysunek 2). Rysunek 2A przedstawia reprezentatywny liść kontrolny bez zabarwienia. Rysunek 2B przedstawia reprezentatywny liść traktowany Pseudomonas z pozytywnym zabarwieniem na produkcję H2O2. Przykład wyniku analizy danych z programu Proteome Discover dla białka podlegającego różnicowej regulacji redoks przedstawiono na Rysunku 3. Białkiem tym jest znane białko regulowane redoks, ferredoksyna-114, o której wykazano, że odgrywa ona rolę w obronie przed Pseudomonas syringae pv tomato15. Do uzyskania ilościowego określenia względnego wykorzystano intensywność piku pomiędzy próbką kontrolną a inokulowaną, co wykazało istotne zmiany w regulacji redoks ferredoksyny-1 (p< 0,05). Piki o wysokiej intensywności sugerują, że białko to ulega utlenieniu w odpowiedzi na obecność patogenu. Rysunek 4 jest przykładem wyniku analizy danych z programu Proteome Discover dla białka, którego regulacja redoks jest podobna w próbce kontrolnej i inokulowanej. Piki o podobnej intensywności sugerują obecność mostków disiarczkowych, które nie są regulowane zmianą traktowania. Metoda ta zrewolucjonizuje sposób, w jaki naukowcy wykrywają cysteiny i disiarczki reagujące na zmiany stanu redoks10.

Eksperyment porównawczy liści, schemat analizujący różnice w zdrowiu i wzroście roślin w próbkach A i B.
Rycina 1. Reprezentatywne zdjęcie liści pomidora inokulowanych roztworem kontrolnym (A) oraz Pseudomonas (B).

Porównanie wysuszonych liści, dwie próbki, A zielona, B brązowa, różnice fenotypowe, badanie biologiczne.
Rycina 2. Reprezentatywny obraz barwienia DAB zainokulowanych liści pomidora roztworem kontrolnym (A) oraz Pseudomonas (B). Liście zabarwiono przy użyciu 3',3'-diaminobenzydyny. Chlorofil usunięto z liści poprzez gotowanie w 95% etanolu. Ciemne barwienie wskazuje na obecność H2O2. Tylko liście zainokulowane kulturą bakterii wykazywały ciemne barwienie.

Wyniki spektrometrii mas, m/z vs intensywność; analiza próbek Pseudomonas i kontrolnych, wykres słupkowy.
Rycina 3. Przykład wyników analizy z programu Proteome Discover dla ferredoksyny-1, białka podlegającego różnicowej regulacji redoks14. Intensywność piku nad każdym pikiem jest wykorzystywana do kwantyfikacji absolutnej. Intensywność piku pomiędzy próbkami kontrolnymi a inokulowanymi jest wykorzystywana do przeprowadzenia kwantyfikacji względnej.

Wykres spektrometrii mas porównujący grupę kontrolną z Pseudomonas; analiza intensywności m/z z fragmentacją.
Rycina 4. Przykład danych wyjściowych z programu Proteome Discover dla białka, które wykazuje podobną intensywność piku w próbce kontrolnej i zaszczepionej. Piki o podobnej intensywności sugerują obecność mostków dwusiarczkowych, które nie są regulowane zmianą traktowania.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niniejszy protokół dostarcza informacji na temat wykonywania barwienia DAB oraz ilościowego oznaczania utlenionych cystein z użyciem znakowania cysTMT. Procedury te są przydatne w badaniu produkcji ROS oraz wpływu na regulację białek w przypadku inokulacji Solanum lycopersicum bakterią Pseudomonas syringae. Metody przedstawione w tym protokole umożliwiają badanie ROS w całych próbkach liści w sposób powodujący najmniejsze uszkodzenia tkanki liściowej. Procedura znakowania pozwala na badanie białek potencjalnie regulowanych przez procesy redox z wykorzystaniem metody znakowania cysteiny. Jest to szczególnie korzystne podczas badania wczesnego etapu odpowiedzi na stres.

Metody takie jak znacznik powinowactwa kodowany izotopowo (ICAT) oraz cysTMT mogą być wykorzystywane do badania potencjalnych białek regulowanych przez procesy redox w próbkach biologicznych. ICAT umożliwia znakowanie i porównywanie dwóch próbek12. Obie metody znakują wolne cysteiny i mogą być stosowane do kwantyfikacji białek10,12. Jednakże metoda cysTMT pozwala na zmniejszenie zmienności eksperymentalnej oraz na multipleksowanie10. Liczba dostępnych znaczników umożliwia badaczom uwzględnienie powtórzeń lub wielu próbek w projekcie eksperymentalnym. Większa liczba próbek daje potencjał do zidentyfikowania większej liczby białek. Główną wadą techniki cysTMT jest obniżenie ogólnej jakości identyfikacji białek ze względu na etapy selektywnego wzbogacania peptydów znakowanych cysTMT (6.5-6.6). Liczba peptydów służących do identyfikacji białka zależy w znacznym stopniu od liczby reszt cysteiny w sekwencji białka. Problem ten można rozwiązać, poddając część próbki trawionej trypsyną analizie spektrometrią mas w celu identyfikacji białek jeszcze przed etapem wzbogacania.

Ze względu na naturę projektu eksperymentalnego oraz mechanizm znakowania wykorzystywany w metodzie cysTMT, niektóre etapy są krytyczne. Podczas przeprowadzania precypitacji białek i przemywania osadu (3.9) ważne jest utrzymywanie próbek w niskiej temperaturze na lodzie, aby ograniczyć degradację białek. Podczas znakowania cysTMT kluczowe jest usunięcie odczynnika redukującego (4.6), ponieważ próbki mogą ulec odwróconemu znakowaniu. Odwrócone znakowanie jest możliwe, jeśli w próbce pozostanie odczynnik redukujący. Jeśli próbki zostaną zredukowane po znakowaniu, znacznik cysTMT może zostać usunięty. Po dodaniu znaczników do próbek należy sprawdzić poziom pH (4.7), aby zapewnić optymalną wydajność znakowania. Ponadto analiza danych zależy od wymagań badacza oraz ostatecznego celu zastosowania protokołu. Zależy ona również od wykorzystywanego oprogramowania, ponieważ każdy program posiada inne algorytmy.

W tym doświadczeniu wykorzystano patogen jako elicytor w celu zwiększenia produkcji reaktywnych form tlenu u pomidora; można jednak w odpowiedni sposób zmierzyć inne odpowiedzi regulowane przez procesy redoks. Projekt tego doświadczenia można dostosować do innych układów roślinnych i zwierzęcych.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować dr. Gregowi Martinowi (Cornell University) oraz jego zespołowi za udostępnienie szczepu DC3000, nasion pomidora oraz za udzielone porady. Dziękują również dr. Zhonglinowi Mou za pomoc w opracowaniu protokołu DAB oraz Wydziałowi Proteomiki w Międzydyscyplinarnym Centrum Badań nad Biotechnologią na UF za pomoc w opracowaniu metody. Protokół ekstrakcji białek został zmodyfikowany na podstawie pracy Hurkmana i Tanaki16. Protokół znakowania cysTMT, kroki od 4 do 6, został dostosowany na podstawie oryginalnej instrukcji produktu Thermo Pierce Fisher Scientific17. Praca była finansowana przez National Science Foundation (MCB 0818051 dla S. Chen).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
MetroMix 500BWI CompaniesTX-500
3,3'-DiaminobenzydynaSigma-AldrichD8001
Zestaw do sekwencyjnej ekstrakcji ReadyPrep, Odczynnik 3Bio-Rad163-2104
Analiza białka CB-XGeno Technology786-12x
odczynniki cysTMTProdukty do badań nad białkami Thermo Scientific Pierce90071
Bufor do próbek LaemmliegoBio-Rad161-0737
Bio-Safe Coomassie (barwnik G-250)Bio-Rad161-0786
Kolumna Microcon 3KDEMD Millipore42403
Żywica z unieruchomionym przeciwciałem anty-TMTProdukty Thermo Scientific Pierce do badań nad białkami90076
Kolumna wirnikowaProdukty Thermo Scientific Pierce do badań nad białkami89896
kolumna Proteopep II C18Nowy celPFC7515-PP2-10
NanoLC-1D HPLCAB Sciex90389
LTQ Orbitrap XLThermo Fisher Scientific, Inc.0020137580
SpeedVacLabconco Corp.7812013
oprogramowanie Proteome Discoverer 1.2Produkty do badań nad białkami Thermo Scientific Pierce
TrypsynaPromega Corp.V5111
Probówka wirówkowa OakridgeThermo Scientific Nalgene Company3139-0050
Probówka do mikrocentryfugi (2 ml)USA Scientific, Inc.1620-2700
gotowy żel 12% Mini-PROTEAN TGXBio-Rad456-1043
Góra formularza >Barwienie Coomassie Bio-Safe Bio-Rad161-0786
Zestaw do wzbogacania TMTProdukty do badań nad białkami Thermo Scientific Pierce90077

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Almeida, N. F. A draft genome sequence of Pseudomonas syringae pv. tomato T1 reveals a type III effector repertoire significantly divergent from that of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000. Mol. Plant Microbe Interact. 22, 52-62 (2009).
  2. Preiter, K. Novel virulence gene of Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000. J. Bacteriol. 187, 7805-7814 (2005).
  3. Apostol, I., Heinstein, P. F., Low, P. S. Rapid stimulation of an oxidative burst during elicitation of cultured plant cells: role in defense and signal transduction. Plant Physiol. 90, 109-116 (1989).
  4. Orozco-Cardenas, M., Ryan, C. A. Hydrogen peroxide is generated systemically in plant leaves by wounding and systemin via the octadecanoid pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 6553-6557 (1999).
  5. Tonks, N. K. Redox redux: revisiting PTPs and the control of cell signaling. Cell. 121, 667-670 (2005).
  6. Alvarez, S., Wilson, G. H., Chen, S. Determination of in vivo disulfide-bonded proteins in Arabidopsis. J. Chromatogr. B. 877, 101-104 (2009).
  7. Apel, K., Hirt, H. Reactive oxygen species: metabolism, oxidative stress, and signal transduction. Annu. Rev. Plant Biol. 55, 373-399 (2004).
  8. Dayon, L. Relative quantification of proteins in human cerebrospinal fluids by MS/MS using 6- plex isobaric tags. Anal. Chem. 80, 2921-2931 (2008).
  9. Thompson, A. Tandem mass tags: a novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS. Anal. Chem. 75, 1895-1904 (2003).
  10. A novel cysteine-reactive tandem mass tag reagent for subproteome labeling, enrichment and quantitation. Rosenblatt, M. The 58th ASMS Conference on Mass Spectrometry, , Thermo Fisher Scientific. TP169(2010).
  11. Clark, J. Phenotypic analysis of Arabidopsis mutants: diaminobenzidine stain for hydrogen peroxide. Cold Spring Harb. Protoc. , (2009).
  12. Sethuraman, M. Isotope-Coded affinity tag (ICAT) approach to redox proteomics: identification and quantification of oxidant-sensitive cysteine thiols in complex protein mixtures. J. Proteome Res. 3, 1228-1233 (2004).
  13. DFCI - Tomato Gene Index. , Harvard University: Computational Biology and Functional Genomics Laboratory. Boston, MA. Available from: http://compbio.dfci.harvard.edu/cgi-bin/tgi/gimain.pl?gudb=tomato (2010).
  14. Asso, M. EPR and redox characterization of ferredoxins I and II from Desulfovibrio vulgaris Miyazaki. Biochem. Biophys. Res. Commun. 211, 198-204 (1995).
  15. Huang, H. e Disease resistance to bacterial pathogens affected by the amount of ferredoxin-I proteins in plants. Mol. Plant Pathol. 8, 129-137 (2007).
  16. Hurkman, W., Tanaka, C. Solubilization of plant membrane proteins for analysis by two-dimensional gel electrophoresis. Plant Physiol. 81, 802-806 (1986).
  17. Cysteine-Reactive Tandem Mass Tag®(cysTMT®) Reagents. , Thermo Scientific Pierce Biotechnolgy. Rockford, IL. Available from: http://www.piercenet.com/instructions/2162220.pdf (2011).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Analiza modyfikacji cysteinyTandem Mass TagTMT reaktywne wobec cysteinytrawienie proteazwzbogacanie za pomoc ywicy anty TMTrozdzia HPLCanaliza MS MSkwantyfikacja jon w reporterowych

Powiązane artykuły