Mysi model astmy indukowanej alergenem

Podsumowanie

Eksperymentalne modele mysie astmy alergicznej oferują nowe możliwości badania patogenezy choroby oraz opracowywania nowych terapii. Modele te są odpowiednie do pomiaru czynników kontrolujących alergiczną odpowiedź immunologiczną, zapalenie dróg oddechowych i patofizjologię płuc.

Streszczenie

Astma jest główną przyczyną zachorowalności i śmiertelności, dotykając około 300 milionów ludzi na całym świecie.¹ Ponad 8% populacji USA cierpi na astmę, a jej rozpowszechnienie rośnie.² Podobnie jak w przypadku innych chorób, modele zwierzęce alergicznej choroby dróg oddechowych znacznie ułatwiają zrozumienie leżącej u podstaw patofizjologii, pomagają w identyfikacji potencjalnych celów terapeutycznych i umożliwiają badania przedkliniczne możliwych nowych terapii. Modele alergicznej choroby dróg oddechowych opracowano u kilku gatunków zwierząt, jednak modele mysie są szczególnie atrakcyjne ze względu na niski koszt, łatwą dostępność oraz dobrze scharakteryzowany układ odpornościowy tych zwierząt.³ Dostępność różnych szczepów transgenicznych dodatkowo zwiększa atrakcyjność tych modeli.⁴ W niniejszej pracy opisujemy dwa mysie modele alergicznej choroby dróg oddechowych, w których jako antygen wykorzystuje się owalbuminę. Po wstępnej sensytyzacji poprzez wstrzyknięcie doszpikowe, w jednym modelu wyzwanie antygenowe podaje się za pomocą nebulizacji, a w drugim drogą wewnątrztrachealną. Te dwa modele oferują komplementarne zalety, a każdy z nich naśladuje główne cechy ludzkiej astmy.⁵

Główne cechy ostrej astmy obejmują nadmierną reakcję dróg oddechowych na bodźce, takie jak metacholina (nadreaktywność dróg oddechowych; AHR), oraz bogatą w eozynofile zapalną zmianę w drogach oddechowych. Są to również wyraźne efekty wywołania reakcji na alergen w naszych modelach mysich,^5,6 w związku z czym opisujemy techniki służące do ich pomiaru, a tym samym do oceny skutków manipulacji eksperymentalnych. W szczególności opisujemy zarówno inwazyjne⁷, jak i nieinwazyjne⁸ techniki pomiaru nadreaktywności dróg oddechowych, a także metody oceny nacieku komórek zapalnych do dróg oddechowych i płuc. Komórki zapalne dróg oddechowych pobiera się za pomocą lavage bronchoalveolarnego (płukania pęcherzykowego), natomiast histopatologia płuc służy do oceny markerów stanu zapalnego w całym narządzie. Techniki te stanowią potężne narzędzia do badania astmy w sposób, który nie byłby możliwy do zastosowania u ludzi.

Protokół

I. Sensybilizacja i ekspozycja na alergen (patrz Rysunek 1)

A. Do wyzwania wewnątrztachealnego

1. W celu wstępnej sensytyzacji, myszom samcom lub samicom szczepów C57BL/6 lub BALB/c (w wieku 6-8 tygodni) wstrzyknąć dootrzewnowo w dniu 0 oraz ponownie w dniu 7 20 μg owalbuminy (OVA; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) zemulgowanej w 0,2 ml sterylnego roztworu fosforanowego buforu solnego (PBS) zawierającego 2 mg wodorotlenku glinu (Sigma-Aldrich) lub 2 mg wodorotlenku glinu w 0,2 ml sterylnego PBS jako kontrolę.
2. Przeprowadzić prowokację antygenem w odpowiednich dniach (np. w dniach 14, 16, 18 i 20). Procedura prowokacji znajduje się poniżej.
3. Zanestetyzować mysz poprzez dootrzewnowy (i.p.) zastrzyk mieszaniny ketaminy (90 mg/kg) i ksylazyny (10 mg/kg). Upewnić się, że mysz pozostaje w pełnej anestezji przez co najmniej 10 min.
4. Ustawić powierzchnię operacyjną pod kątem 45 stopni lub większym. Umieścić mysz na tej powierzchni stroną brzuszną do góry, z głową u góry.
5. Zaczepić nitkę pod przednimi siekaczami, aby odciągnąć głowę do tyłu. Wyrównać położenie łap, aby upewnić się, że tchawica jest prosta, i przymocować nogi taśmą etykietową. Namoczyć miejsce operacyjne 70% EtOH i przetrzeć.
6. Zastosować bupiwakainę (0,1 do 0,2 ml 0,25% roztworu) miejscowo w miejscu nacięcia.
7. Uchwycić skórę w okolicy gardła pęsetą i delikatnie odciągnąć na zewnątrz. Wykonać niewielkie pionowe nacięcie nożyczkami chirurgicznymi. Zminimalizować wielkość nacięcia.
8. Przygotować strzykawkę 1 ml z 50 μl PBS lub 0,1% OVA w PBS i włożyć ją do pipety repetytoryjnej (Tridak Stepper, Torrington, CT). Trzymać pipetę w jednej ręce, a drugą odciągać tkanki pęsetą, aby odsłonić tchawicę.
9. Trzymając strzykawkę jak najbardziej równolegle do tchawicy, wprowadzić igłę przez ścianę tchawicy i wstrzyknąć roztwór.
10. Po wstrzyknięciu utrzymać mysz w pozycji pionowej, aby umożliwić roztworowi osadzenie się w płucach.
11. Delikatnie i w sposób sterylny zbliżyć brzegi rany pęsetą i zamknąć szwem.
12. Umieścić mysz na podgrzewaczce w pozycji na grzbiecie i pozostawić do wybudzenia, aż odzyska pełną sprawność ruchową. Po wybudzeniu zwrócić mysz do pomieszczenia dla zwierząt i codziennie monitorować pod kątem objawów seromy, stanu zapalnego, infekcji oraz rozstępów rany, aż do jej całkowitego zagojenia.

B. W przypadku wyzwania poprzez nebulizację

1. Umyszy należy uodpornić w dniu 0. przez wstrzyknięcie dootrzewnowe 20 μg OVA (Sigma-Aldrich) zemulgowanej w 0,2 ml sterylnego PBS zawierającego 2 mg wodorotlenku glinu (Sigma-Aldrich) lub 2 mg wodorotlenku glinu w 0,2 ml sterylnego PBS jako kontroli.
2. W 14. dniu wykonaj dawkę przypominającą sensytyzacji poprzez wstrzyknięcie dootrzewnowe zgodnie z powyższym opisem.
3. W dniu 21.^{Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.}, 22^nd, 23^rd, 24^th oraz 25^th dzień po wstępnej sensytyzacji poddano myszy ekspozycji na nebulizowaną 1% owalbuminę (OVA) lub sam PBS przez 30 min, z wykorzystaniem nebulizatora ultradźwiękowego (Buxco Research Systems, Wilmington, NC).
4. Umieść myszy w komorze głównej WBP; poddaj je aklimatyzacji w komorze pletyzmograficznej przez co najmniej 10 min.
5. Za pomocą kubka nebulizatora podać 1 ml 0,1% OVA w sterylnym PBS lub sam sterylny PBS, zgodnie z opisem w krokach 4–6 poniżej. Nebulizować przez 30 min.
6. Zdejmij pojemnik nebulizatora i wylej pozostały roztwór.
7. Nebulizację można przeprowadzić u wszystkich myszy jednocześnie, wykorzystując komorę do nebulizacji.

II. Oznaczanie nadreaktywności dróg oddechowych na metacholinę

A. Nieinwazyjny pomiar nadreaktywności dróg oddechowych za pomocą pletyzmografii całego ciała (WBP; Buxco Research Systems, Wilmington, NC)

1. Przed otwarciem butelki z metacholną w proszku należy pozwolić jej ogrzać się do temperatury pokojowej (metacholina jest bardzo higroskopijna i w przypadku pochłonięcia wody tworzą się bezużyteczne grudki). Przygotować roztwór zapasowy o stężeniu 200 mg/ml w sterylnym PBS, a następnie wykonać seryjne rozcieńczenia dwukrotne (np. 100, 50, 25, 12,5 i 6,25 mg/ml). Przechowywać roztwory w niskiej temperaturze.
2. Przygotować sprzęt w następujący sposób: połączyć główny wlot WBP z nebulizatorem, wlot przepływu bocznego z pompą powietrzną, a wylot WBP z pułapką gazową za pomocą szczelnych gumowych rurek. Przymocować przetwornik ciśnienia, aby połączył wyloty głównej i referencyjnej komory WBP. Połączyć przetwornik ciśnienia z przedwzmacniaczem za pomocą dostarczonych kabli, a przedwzmacniacz z komputerem PC za pomocą odpowiedniej karty akwizycji danych.
3. Zkalibrować przedwzmacniacz za pomocą oprogramowania zgodnie z zaleceniami producenta.
4. Umieścić myszy w głównej komorze WBP; poddać je aklimatyzacji w komorze pletyzmograficznej przez co najmniej 10 min, a następnie rejestrować odczyty bazowe (Penhbase) przez 3 min.
5. Wlać 1 ml sterylnego PBS do naczynia nebulizatora. Prowadzić nebulizację przez 2 min, a następnie monitorować zmienne oddechowe przez kolejne 6 min podczas fazy osuszania. Wyjąć naczynie nebulizatora i usunąć pozostały PBS.
6. Wlać 1 ml metacholiny o stężeniu 6,25 mg/ml do naczynia nebulizatora i powtórzyć nebulizację przez 2 min oraz 6-minutowy cykl monitorowania.
7. Powtórzyć pomiar z metacholiną o stężeniach 12,5, 25, 50 i 100 mg/ml, stosując ten sam 2-minutowy okres nebulizacji i 6-minutowy cykl monitorowania.
8. Wyjąć myszy z komór i przenieść je z powrotem do klatek.
9. Ponownie napełnić naczynie nebulizatora 1 ml sterylnego PBS i przeprowadzić kolejną sekwencję w celu przepłukania rurek.
10. Wyłączyć przepływy powietrza, rozłożyć urządzenie i wytrzeć do czysta wszystkie komory przed badaniem drugiej grupy zwierząt.

B. Inwazyjny pomiar reaktywności dróg oddechowych za pomocą wentylatora sterowanego komputerowo (flexiVent; SCIREQ Inc., Montreal, Canada)

1. Zważ mysz i podaj znieczulenie poprzez dożylne (i.p.) wstrzyknięcie pentobarbitalu sodu w dawce 60 mg na kg masy ciała.
2. Po uzyskaniu odpowiedniego stopnia znieczulenia ustaw myszy w pozycji brzuszno-grzbietowej w celu wykonania tracheotomii.
3. Zdezynfekuj skórę szyi 70% etanolem. Na miejsce nacięcia nałóż miejscowo bupiwakainę (0,1 do 0,2 ml 0,25% roztworu). Natnij i rozchyl skórę szyi. Rozsuń mięśnie szyi i odsłoń tchawicę.
4. Za pomocą precyzyjnych nożyczek wykonaj w tchawicy nacięcie o długości 1 do 2 mm (należy uważać, aby nie przeciąć tchawicy całkowicie) i ostrożnie wprowadź rurkę intubacyjną. Obwiąż tchawicę szwem, aby zapobiec wyciekowi powietrza.
5. Umieść mysz w komorze pletyzmografu całego ciała i podłącz wprowadzoną rurkę tchawiczą do respiratora.
6. Uruchom wentylację mechaniczną. Ustaw odpowiednią częstotliwość oddechów oraz objętość oddechową (odpowiednio 150 oddechów/min oraz 200 μl dla myszy o masie 20 g). Upewnij się, że klatka piersiowa porusza się synchronicznie z respiratorem. Jeśli mysz "walczy" z respiratorem (samodzielnie oddycha), wstrzyknij więcej środka znieczulającego i poczekaj na synchronizację.
7. Po pomiarach wyjściowych utrzymuj myszy w stanie wentylacji bazowej przez kolejne 3 min, a następnie wykonaj 2^gi zestaw pomiarów impedancji. Ten 2^gi zestaw pomiarów wyjściowych służy do obliczenia średnich wartości bazowych.
8. Podaj PBS lub wyzwania metacholiną (MCh) (6,25, 12,5, 25, 50 i 100 mg/ml), kierując przepływ inspiracyjny z respiratora przez nebulizator ultradźwiękowy.
9. Po każdym wyzwaniu MCh (6,25, 12,5, 25, 50 i 100 mg/ml) przywróć tłok do podawania Vt 10 ml/kg przy 120 oddechach/min i wykonaj pomiary impedancji.

III. Pomiar infiltracji komórkowej do przestrzeni powietrznej

A. Wykonaj płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe (BAL)

1. Po pomiarze AHR uśmiercić myszy za pomocą CO₂ i ułożyć każdą mysz na plecach na podkładce chirurgicznej.
2. Namoczyć dany obszar 70% EtOH.
3. Zaczynając od dolnej części brzucha, rozciąć jamę brzuszną i usunąć skórę oraz górną warstwę mięśni, przesuwając się w górę w stronę żeber.
4. Po odsłonięciu żeber za pomocą nożyczek ostrożnie przebić przeponę. Płuca powinny zapaść się, oddalając od przepony. Należy zachować szczególną ostrożność, aby nie uszkodzić płuc ani serca.
5. Odciąć klatkę piersiową, aby w pełni odsłonić płuca i serce (należy unikać przecinania dużych naczyń krwionośnych, aby zapobiec wypełnieniu pola operacyjnego krwią).
6. Używając strzykawki 1 ml z igłą 27G (strzykawki BD, Franklin Lakes, NJ), nakłuć komory serca i powoli oraz ostrożnie odciągnąć tłok strzykawki, aby pobrać krew. Należy uważać, aby nie doprowadzić do zapadnięcia się serca.
7. Wyizolować surowicę z pobranej krwi zgodnie ze standardowym protokołem. Przechowywać w temperaturze -70 °C do czasu użycia.
8. Odciąć skórę i tkanki z okolic gardła, aż do odsłonięcia tchawicy. Usunąć wystarczającą ilość tkanek, aby swobodnie pracować w polu operacyjnym (ponownie: unikać przecinania dużych naczyń krwionośnych).
9. Za pomocą zakrzywionych nożyczek rozciąć tkanki pod tchawicą, aby udrożnić dostęp.
10. Przesunąć końcówkę zakrzywionej pęsety pod tchawicę i chwycić koniec nici chirurgicznej. Przeciągnąć nić pod tchawicą.
11. Związać luźny półwęzeł wokół tchawicy w dolnej części gardła.
12. Ostrożnie wyciąć nacięcie o wielkości odpowiedniej dla kaniuli, powyżej nici chirurgicznej.
13. Ostrożnie wprowadzić kaniulę do otworu i w głąb tchawicy, poza miejsce zawiązania nici. Delikatnie naciskać do przodu, aż kaniula pojawi się tuż przy wejściu do płuc (zbyt głębokie wprowadzenie: przebicie płuc; zbyt płytkie: zapadnięcie się tchawicy podczas próby odzyskania BAL).
14. Zaciągnąć nić i zawiązać pełny węzeł, aby uszczelnić tchawicę wokół kaniuli.
15. Przymocować strzykawkę (zawierającą 1 ml PBS) do kaniuli i delikatnie wtłoczyć płyn do płuc. Poszczególne płaty płuc powinny powoli się rozszerzać. Nie przepełniać. Dla dorosłej myszy 0.9-1.0 ml to absolutne maksimum; 0.8 ml może być bezpieczniejszą objętością. Strzykawkę należy przymocować do kaniuli luźno, w przeciwnym razie istnieje ryzyko uszkodzenia przy próbie odłączenia.
16. Odssać płyn z płuc. W przypadku napotkania oporu (zassanie tkanki do kaniuli), powoli przesunąć kaniulę głębiej w płuca i kontynuować odsysanie. Można również spróbować obracać kaniulę w miejscu. W ostateczności wycofać kaniulę częściowo; w takim przypadku istnieje jednak znacznie większe ryzyko zapadnięcia się tchawicy.
17. Odłączyć strzykawkę od kaniuli, przelać płyn BAL do pojemnika i powtórzyć czynność 2 razy, używając świeżego roztworu PBS.
18. Przechowywać roztwór BAL w lodzie do czasu wirowania.
19. Wykorzystać płyn BAL oraz surowicę do pomiaru poziomu specyficznych dla OVA przeciwciał IgE, używając dostępnych komercyjnie zestawów ELISA do oznaczania IgE u myszy (MD Bioproducts, St. Paul, MN).

B. Policz komórki i określ różnicowanie

1. Odwiruj płyn z BAL przez 5 min przy ~600 × g, 4 °C.
2. Delikatnie resuspenduj osad komórkowy w PBS i przechowuj na lodzie.
3. Napełnij standardową komorę Neubauera rozcieńczoną zawiesiną komórkową i policz komórki.
4. Pobierz alikwoty zawierające 2 × 10⁴ komórek w objętości od 10 do 40 μl do cytospinowania. W razie potrzeby rozcieńcz komórki.
5. Do cytospinowania wymieszaj 2 × 10⁴ komórek, 130 μl PBS oraz 10 μl FBS. Przenieś całą mieszaninę komórkową do podwójnego lejka do cytospinowania i wiruj przez 10 min przy 700 rpm, używając podwójnych szkiełek do próbek powtórzonych.
6. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez 1 h przed barwieniem.
7. Zbarw szkiełka, używając barwnika Diff-Quick (Siemens, Newark, DE).

IV. Reprezentatywne wyniki

Nadmierny skurcz dróg oddechowych po bodźcach prowokacyjnych jest charakterystyczną cechą kliniczną astmy. Opisujemy dwie metody pomiaru takiej nadreaktywności dróg oddechowych na metacholinę u myszy uczulonych i eksponowanych na OVA: pletyzmografię całego ciała (Rysunek 2) oraz pomiar wymuszonych oscylacji przy użyciu systemu flexiVent (Rysunek 3). Obie metody wykazują, że uczulenie i ekspozycja na OVA wywołują nadreaktywność dróg oddechowych u myszy.

Zapalenie dróg oddechowych z przewagą eozynofilów jest kolejną charakterystyczną cechą zarówno klinycznej astmy, jak i alergicznej choroby dróg oddechowych u myszy. Jak pokazano na Rysunku 4, uczulenie i ekspozycja na OVA znacznie zwiększają całkowitą liczbę komórek, które można odzyskać z dróg oddechowych za pomocą BAL. Szczególnie wzrasta liczba eozynofilów, a w mniejszym stopniu neutrofili.

Dowody wskazują, że alergiczna choroba dróg oddechowych wynika z nadprodukcji przeciwciał IgE przeciwko antygenom uczulającym. Uczulenie i ekspozycja na OVA z wykorzystaniem opisanych przez nas protokołów zwiększa poziomy IgE zarówno w surowicy, jak i w płynie BAL u leczonych myszy (Rysunek 5).

Rycina 1. Schemat eksperymentalny dla indukowanego OVA alergicznego astmy. Myszy poddano dwukrotnej sensybilizacji drogą i.p. przy użyciu 20 μg OVA zemulgowanego w 2 mg wodorotlenku glinu w 0,2 ml sterylnego PBS lub 2 mg wodorotlenku glinu w 0,2 ml samego sterylnego PBS, a następnie w określonych punktach czasowych przeprowadzono prowokację drogą i.t. roztworem 0,1% OVA lub sterylnym PBS lub zastosowano codzienną 30-minutową ekspozycję na nebulizowany 1% OVA w PBS lub sam PBS dostarczany za pomocą nebulizatora ultradźwiękowego (Buxco). Dwadzieścia cztery godziny po ostatniej ekspozycji na OVA określono reaktywność dróg oddechowych. Następnie pobrano płyn z BAL, próbki krwi, komórki płuc i tkanki do dalszej analizy.

Rysunek 2. Ocena indukowanej alergenem nadreaktywności dróg oddechowych metodą nieinwazyjną. Myszy (n=4/grupa) poddano uczuleniu i prowokacji OVA. Dwadzieścia cztery godziny po ostatniej prowokacji określono nadreaktywność dróg oddechowych na wziewaną metacholinę przy użyciu pletyzmografii całego ciała zgodnie z opisem w protokole. Wyznaczono parametr Penh i przedstawiono go jako stosunek Penh (średni Penh w 8-minutowym odstępie czasu z metacholiną podzielony przez średni Penh w 8-minutowym odstępie czasu z PBS). *, P < 0.05 względem PBS.

Rycina 3. Ocena nadreaktywności dróg oddechowych indukowanej alergenem metodą inwazyjną (wymuszonych oscylacji). Myszy (n=4/grupa) poddano sensytyzacji i ekspozycji na OVA. Dwadzieścia cztery godziny po ostatniej ekspozycji oznaczono nadreaktywność dróg oddechowych na zwiększające się stężenia wziewnej metacholiny metodą wymuszonych oscylacji (flexiVent) zgodnie z opisem w protokole. A, B) Opór dróg oddechowych; C) Elastancja płuc. *, P < 0.05 względem PBS.

Rycina 4. Liczenie komórek w płynie BAL. Myszy (n=4/grupa) poddano sensybilizacji i ekspozycji na OVA. Dwadzieścia cztery godziny po ostatniej ekspozycji (Góra) pobrano komórki BAL i policzono całkowitą liczbę komórek zgodnie z opisem w protokole. (Dół) Przygotowano preparaty metodą cytospin i zabarwiono je barwnikiem Diff-Quick. Tot = całkowita liczba komórek; Eos = eozynofile; Neu = neutrofile; Mac = makrofagi; Lym = limfocyty. *, P < 0.05 względem PBS.

Rycina 5. Swoiste przeciwciała IgE przeciw OVA. Myszy (n=4/grupa) poddano sensytyzacji i wyzwoleniu za pomocą OVA. Dwadzieścia cztery godziny po ostatnim wyzwoleniu zmierzono poziom IgE w płynie z BAL oraz w surowicy krwi pobranej poprzez punkcję serca, zgodnie z opisem w protokole. *, P < 0.05 względem PBS.

Dyskusja

Modele zwierzęce alergicznej choroby dróg oddechowych stanowią istotne narzędzia w badaniach istotnych z punktu widzenia klinicznego obrazu astmy. Opracowano szereg różnych modeli, wykorzystujących różne gatunki i antygeny. Mysz, jako atrakcyjny i często stosowany gatunek laboratoryjny, oferuje również szereg zalet w modelowaniu alergicznej choroby dróg oddechowych.^9,10 Chociaż modele te nie odwzorowują astmy pod każdym względem,¹¹ a aspekty choroby przewlekłej są szczególnie trudne do odtworzenia,<...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Ovalbumina	Sigma-Aldrich	A5503
Wodorotlenek glinu	Sigma-Aldrich	239186
Chlorek acetylo-β-metylocholiny	Sigma-Aldrich	A2251
Sól sodowa pentobarbitalu	Sigma-Aldrich	P3761
System do pletyzmografii całego ciała (WBP)	Buxco Research Systems		http://www.buxco.com
FlexiVent	SCIREQ, Inc.		http://www.scireq.com
Mikroskop świetlny	Leica Microsystems
Cytospin 4	Thermo Fisher Scientific, Inc.
Barwnik Diff-Quick	Siemens AG	B4132-1A
Pipeta repetycyjna	Tridak	STP4001-0025