Wczesne wykrywanie apoptozy może pomóc w identyfikacji populacji komórek wysokiego ryzyka w różnych jednostkach chorobowych. Prezentujemy tutaj metodę łączenia białka służącego do wczesnego wykrywania apoptozy (Aneksyna V) z nanocząsteczką tlenku żelaza wykrywalną w badaniu MRI (SPIO). Metoda ta może zostać rozszerzona na inne interesujące białka w celu tworzenia sond do obrazowania molekularnego wykrywalnych za pomocą MRI.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Synteza sondy do detekcji apoptozy w MRI in vivo
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Apoptoza komórkowa jest charakterystyczną cechą wielu chorób, a ta programowana śmierć komórki zazwyczaj następuje przed wystąpieniem klinicznych objawów choroby. Sposób wykrywania apoptozy w jej najwcześniejszych, odwracalnych stadiach zapewniłby przedkliniczne „okno”, podczas którego można byłoby podjąć środki zapobiegawcze lub terapeutyczne w celu ochrony serca przed trwałym uszkodzeniem. Przedstawiamy w niniejszej pracy prostą i niezawodną metodę sprzęgania ludzkiej Aneksyny V (ANX), która wykazuje silne powinowactwo do komórek w najwcześniejszych, odwracalnych stadiach apoptozy, z superparamagnetycznymi nanocząsteczkami tlenku żelaza (SPIO), które służą jako kontrast wykrywalny w MRI. Metoda sprzęgania rozpoczyna się od utlenienia nanocząsteczek SPIO, co powoduje utlenienie grup karboksylowych w powłoce polisacharydowej SPIO. Następnie dodaje się oczyszczone białko ANX w roztworze boranu sodu, aby ułatwić kowalencyjną interakcję ANX z SPIO w buforze redukującym. W celu całkowitego przeprowadzenia redukcji wykonuje się końcowy etap redukcji borowodorkiem sodu, a następnie reakcję wygasza się. Niesprzężoną ANX usuwa się z mieszaniny za pomocą filtracji w mikrocentryfudze. Rozmiar i czystość produktu ANX-SPIO weryfikuje się za pomocą dynamicznego rozpraszania światła (DLS). Metoda ta nie wymaga dodawania ani modyfikacji polisacharydowej powłoki SPIO, w przeciwieństwie do metod sprzęgania cząsteczek tlenku żelaza sieciowanych lub nanocząsteczek znakowanych biotyną. W rezultacie metoda ta stanowi proste i niezawodne podejście, które można rozszerzyć na sprzęganie innych interesujących białek.
Protokół
Zaadaptowano z wcześniejszej publikacji1.
1. Koniugacja Anneksyny V do SPIO
- Utlenić cząsteczki SPIO (Ocean Nanotech Inc., 5 mg/mL) przez 1 hr w temperaturze 20 °C w ciemności w roztworze 0,15 M nadjodynianu sodu (NaIO4) (stosunek masy do masy 4:1)2.
- Inkubować utlenione SPIO przez 12 hr z oczyszczonym białkiem ANX (stosunek masy do masy 1:1) w 0,15 M boranie sodu (Na2B4O7 10H2O) w temperaturze 20 °C.
- Dalej redukować mieszaninę przez 1 hr za pomocą borowodorku sodu (NaBH4) pod dygestorium, a następnie zatrzymać reakcję za pomocą 0,15 M Tris-HCl.
- Oddzielić wolne ANX od ANX-SPIO poprzez wirowanie przy 14 000 x g (filtr Microcon z porami 75 μm, Millipore, Billerica, MA).
- Dalej oczyszczać kompleks poprzez usunięcie niezwiązanych zanieczyszczeń za pomocą urządzenia Magnetic Separator (Ocean Nanotech, Inc.).
- Oznaczyć poziom białka w retentacie z filtra (ANX-SPIO) metodą oznaczenia białka Bradforda i przechowywać w temperaturze -80 °C w stężeniu 2 mg/mL w 0,1 M Tris-HCl z 1% albuminą surowiczą i inhibitorami proteaz (Halt Protease Inhibitor, Thermo Scientific, 1-50 mg/mg ANX).
2. Dynamiczne rozpraszanie światła
- SPIO oraz ANX-SPIO należy oddzielnie rozcieńczyć w PBS do gęstości optycznej 0,1 i przeanalizować za pomocą dynamicznego rozpraszania światła w urządzeniu Zetasizer Nano DLS (Malvern Inc., Worcestershire, UK)3.
- (Idealnie) należy uzyskać piki monomodalne dla związku, określając średnią wielkość cząstek Z-average oraz indeks polidyspersyjności (PDI). Wielkość tę należy porównać z wielkością samych nanocząstek tlenku żelaza zmierzoną metodą DLS. Wyniki DLS dla ANX-SPIO wykazały średnicę hydrodynamiczną cząstek koniugatu wynoszącą 78 nm przy PDI równym 0,131, co świadczy o homogeniczności gatunku ANX-SPIO3.
3. Hodowla komórek, indukcja apoptozy w hodowli i MRI hodowanych komórek
- Kulturować mezenchymalne komórki macierzyste szpiku kostnego dorosłych myszy (mMSCs) w pożywce DMEM uzupełnionej o 10% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny (Invitrogen, Inc.), najlepiej w pasażach 20-304.
- Indukować apoptozę w hodowlach komórkowych poprzez inkubację w temperaturze 37 °C przez różny czas z dodatkiem DOX (Sigma, 1 mM w 0,9% soli fizjologicznej, stężenie w pożywce 1 μM)12.
- Ilościowo określić poziom apoptozy w kulturze, wykorzystując MRI z ANX-SPIO (opisane w punkcie 3.4 poniżej) lub mikroskopię po barwieniu TUNEL (APO-BrdUTM TUNEL Assay Kit, Molecular Probes/Invitrogen, Eugene, OR) bądź barwieniu ANX-FITC (Roche, Szwajcaria).
- Znakować komórki ANX-SPIO (10 mg białka/mL pożywki, chyba że zaznaczono inaczej) lub równoważną masą wolnych SPIO (5 mg) przez 15 min w temperaturze 37 °C. Przemyć 4 razy PBS i przykryć 1 mL 1% agarozy, aby zapobiec dyfuzji nanocząstek SPIO. Wykonać MRI szalek (opisane poniżej). Alternatywnie, po znakowaniu DOX i ANX-SPIO, przemyć komórki i poddać je trypsynizacji, a następnie pozwolić komórkom sformować osad w probówkach Eppendorf.
4. MRI in vitro
- Do analizy MRI in vitro należy użyć skanera GE Signa EXCITE o indukcji 1,5 lub 3 Tesla ze standardową cewką odbiorczą do kolana.
- Szalki hodowlane lub probówki należy umieścić w fantomie agarowym i obrazować przy użyciu sekwencji gradient-echo ze zniszczonym gradientem: czas powtórzenia (TR) 550 ms, czas echa (TE) 10 ms, kąt odchylenia 15°, macierz 256 x 256, pole widzenia 3 cm x 3 cm, grubość warstwy 1,3 mm, liczba uśrednień (NEX) 2, odstęp 0 mm5. Obrazowanie należy przeprowadzić w płaszczyźnie osiowej przez warstwę komórek na płytce w celu oceny utraty sygnału T2*, wykorzystując obszary zainteresowania (ROI) o stałej powierzchni (na przykład 0,8 mm2). Tło należy skorygować, korzystając z sygnału ROI kontrolnego z fantomu agarowego. Szum tła należy zmierzyć na podstawie sygnału powietrza otaczającego fantom.
- Dla każdej szalki hodowlanej obliczono stosunek kontrastu do szumu MRI (CNR: [SI próbki ROI-SI kontroli ROI]/[SD SI szumu tła], gdzie SI to intensywność sygnału, a SD to odchylenie standardowe).
5. Reprezentatywne wyniki
Pomiar spadku sygnału T2* in vitro wymaga zastosowania homogenicznego fantoma agarowego oraz braku pęcherzyków powietrza, które powodują powstanie artefaktu pustki sygnałowej. Artefakt ten jest trudny do odróżnienia od rzeczywistego spadku sygnału T2* wywołanego przez SPIO, co ma kluczowe znaczenie dla interpretacji wyników. Przykład artefaktu powietrznego oraz rzeczywistego spadku sygnału T2* tlenku żelaza przedstawiono na Rysunku 1.
W przypadku obrazowania naczyń hodowlanych in vitro, należy nanieść do każdego naczynia odpowiednią objętość żelu agarowego, aby można było wykonać wystarczającą liczbę osiowych przekrojów MRI o grubości około 1 mm, co pozwoli na właściwe zobrazowanie całego naczynia. Rysunek 2 przedstawia oczekiwany sygnał MRI z poszczególnych płytek hodowlanych w agarze. Na krawędziach płytek zazwyczaj występuje pewna zmienność sygnału, dlatego podczas analizy obszarów zainteresowania należy unikać tych nierównomiernych stref.
Rysunek 1. ANX-SPIO wykrywa apoptozę w hodowlach kardiomiocytów noworodka szczura. Rysunek 1A przedstawia zdjęcie odwirowanych kardiomiocytów noworodka traktowanych roztworem kontrolnym (lewa probówka), ANX-SPIO (środkowa probówka) oraz DOX+ANX-SPIO (prawa probówka). Należy zwrócić uwagę na brązowy kolor komórek traktowanych DOX+ANX-SPIO, co odzwierciedla zwiększoną retencję związku ANX-SPIO w komórkach apoptotycznych. Rysunek 1B obrazy MRI in vitro wykazują intensywną utratę sygnału T2* w komórkach DOX+ANX-SPIO. Widoczny jest również pęcherzyk powietrza między 4th a 5th probówką Eppendorf (mały czarny ubytek sygnału), który jest podobny do ubytku sygnału ANX-SPIO i może wpływać na analizę CNR.
Rycina 2. Wiązanie ANX-SPIO jest specyficzne dla komórek apoptotycznych w hodowli. Rycina 2A przedstawia apoptotyczne kardiomiocyty noworodka szczura na szalkach hodowlanych, poddane barwieniu ANX-FLUOS lub barwieniu ANX-SPIO, z zastosowaniem niskich i wysokich stężeń (odpowiednio po lewej i prawej stronie) ANX-SPIO. Zwróć uwagę na różnice w utracie sygnału T2* (sygnał czarny) w komórkach apoptotycznych traktowanych fluorescencyjnym ANX (ANX-FLUOS) oraz niskimi i wysokimi stężeniami ANX-SPIO. Zwiększona utrata sygnału T2* po prawej stronie wiąże się z wyraźnie zredukowanym sygnałem ANX-FLUOS, który został wyparty przez wyższe stężenia ASX-SPIO. Rycina 2B ilustruje konkurencyjne wiązanie ANX-SPIO względem sygnału ANX-FLUOS oraz stałą dysocjacji, Ki. Oś X oznacza stężenie białka Aneksyny w skali logarytmicznej.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opisana metoda sprzęgania w celu połączenia SPIO z Aneksyną V wykorzystuje grupy aminowe łańcucha bocznego Aneksyny oraz grupy karboksylowe nanocząsteczek SPIO. Poprzez specyficzne etapy utleniania i redukcji można uzyskać kowalencyjne powiązanie tych związków, a następnie wyizolować powstałą funkcjonalizowaną nanocząsteczkę. Metodę tę można uogólnić na inne interesujące białka i nanocząsteczki.
Kluczowymi etapami są warunki utleniania i redukcji, przeprowadzane w odpowiednich temperaturach i ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.
Podziękowania
National Institutes of Health, NHLBI (RD, PY, PS).
Amerykańskie Towarzystwo Serca (JL).
Stanford University, grant VPUE (JL).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Superparamagnetyczny tlenek żelaza | Ocean Nanotech, Inc. | ICK-40-005 | |
| Doksorubicyna | Sigma | D1515-10MG | |
| Separator SuperMag | Ocean Nanotech, Inc. | N/A | |
| Urządzenie Zetasizer Nano DLS | Malvern, Inc | N/A |
Bibliografia
- Dash, R. A molecular MRI probe to detect treatment of cardiac apoptosis in vivo. Magn. Reson. Med. , (2011).
- Khym, J. X. The reaction of methylamine with periodate-oxidized adenosine 5'-phosphate. Biochemistry. 2, 344-350 (1963).
- Liu, Y. Y., Yu, Y., Zhang, G. B., Tang, M. F. Preparation, characterization, and controlled release of novel nanoparticles based on MMA/beta-CD copolymers. Macromol. Biosci. 7, 1250-1257 (2007).
- Seo, W. S. FeCo/graphitic-shell nanocrystals as advanced magnetic-resonance-imaging and near-infrared agents. Nat. Mater. 5, 971-976 (2006).
- Hsiao, J. K. Magnetic nanoparticle labeling of mesenchymal stem cells without transfection agent: cellular behavior and capability of detection with clinical 1.5 T magnetic resonance at the single cell level. Magn. Reson. Med. 58, 717-724 (2007).
- Zhao, M., Beauregard, D. A., Loizou, L., Davletov, B., Brindle, K. M. Non-invasive detection of apoptosis using magnetic resonance imaging and a targeted contrast agent. Nat. Med. 7, 1241-1244 (2001).
- van Tilborg, G. A. Internalization of annexin A5-functionalized iron oxide particles by apoptotic Jurkat cells. Contrast Media Mol. Imaging. 4, 24-32 (2009).
- Sosnovik, D. E. Magnetic resonance imaging of cardiomyocyte apoptosis with a novel magneto-optical nanoparticle. Magn. Reson. Med. 54, 718-724 (2005).
- Sosnovik, D. E. Molecular MRI detects low levels of cardiomyocyte apoptosis in a transgenic model of chronic heart failure. Circ. Cardiovasc. Imaging. 2, 468-475 (2009).
- Dumont, E. A. Cardiomyocyte death induced by myocardial ischemia and reperfusion: measurement with recombinant human annexin-V in a mouse model. Circulation. 102, 1564-1568 (2000).
- Blankenberg, F. G. In vivo detection and imaging of phosphatidylserine expression during programmed cell death. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 6349-6354 (1998).
- Schellenberger, E. A., Sosnovik, D., Weissleder, R., Josephson, L. Magneto/optical annexin V, a multimodal protein. Bioconjug. Chem. 15, 1062-1067 (2004).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
