Artykuł metodologiczny

Zakażanie zarodków danio pręgowanego wewnątrzkomórkowymi patogenami bakteryjnymi

48.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/3781

⸱

15 marca 2012

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Cell Biology, Institute of Biology, Leiden University, 2Department of Medical Microbiology and Infection Control, VU University Medical Center, 3Australian Regenerative Medicine Institute, Monash University

W tym artykule

Podsumowanie

Przezroczyste zarodki rybek danio-ostrolepisnych okazały się użytecznymi modelami gospodarzy do wizualizacji i funkcjonalnego badania oddziaływań między komórkami odporności wrodzonej a wewnątrzkomórkowymi patogenami bakteryjnymi, takimi jak Salmonella typhimurium oraz Mycobacterium marinum. Mikrowstrzykiwanie bakterii oraz wielobarwne obrazowanie fluorescencyjne to kluczowe techniki stosowane w modelach infekcji zarodków rybek danio-ostrolepisnych.

Streszczenie

Zarodki danio pręgowanego (Danio rerio) są coraz częściej wykorzystywane jako model do badania funkcji wrodzonego układu odpornościowego kręgowców w interakcjach gospodarz-patogen 1. Główne typy komórek wrodzonego układu odpornościowego, makrofagi i neutrofile, rozwijają się podczas pierwszych dni embriogenezy, przed dojrzewaniem limfocytów niezbędnych do odpowiedzi odpornościowej adaptacyjnej. Łatwość pozyskiwania dużych liczb zarodków, ich dostępność dzięki rozwojowi zewnętrznemu, przeźroczystość optyczna stadiów embrionalnych i larwalnych, szeroka gama narzędzi genetycznych, obszerne zasoby mutantów oraz kolekcje transgenicznych linii reporterowych – wszystko to zwiększa wszechstronność modelu danio pręgowanego. Salmonella enterica serowar Typhimurium (S. typhimurium) oraz Mycobacterium marinum mogą bytować wewnątrzkomórkowo w makrofagach i są często używane do badania interakcji gospodarz-patogen w zarodkach danio pręgowanego. Procesy infekcji tych dwóch patogenów bakteryjnych są interesujące do porównania, ponieważ infekcja S. typhimurium jest ostra i śmiertelna w ciągu jednego dnia, podczas gdy infekcja M. marinum ma charakter przewlekły i może być obrazowana aż do stadium larwalnego 2, 3. Miejsce mikroiniekcji bakterii do zarodka (Rysunek 1) determinuje, czy infekcja szybko stanie się systemiczna, czy początkowo pozostanie zlokalizowana. Szybką infekcję systemiczną można wywołać poprzez mikroiniekcję bakterii bezpośrednio do krwiobiegu poprzez żyłę ogonową w tylnej wyspie krwi lub poprzez kanał Cuviera, szeroki kanał krążenia w worku żółtkowym łączący serce z naczyniami tułowia. W 1 dpf, kiedy zarodki na tym etapie posiadają fagocytycznie aktywne makrofagi, ale neutrofile nie dojrzały jeszcze, preferowana jest iniekcja do wyspy krwi. Dla iniekcji w 2-3 dpf, gdy zarodki posiadają również rozwinięte funkcjonalne (produkujące mieloperoksydazę) neutrofile, jako miejsce iniekcji preferowany jest kanał Cuviera. Aby badać ukierunkowaną migrację komórek mieloidalnych w kierunku lokalnych infekcji, bakterie można wstrzyknąć do mięśnia ogonowego, pęcherzyka słuchowego lub komory tylnomózgowia 4-6. Ponadto notochorda, struktura, która wydaje się być normalnie niedostępna dla komórek mieloidalnych, jest wysoce podatna na lokalną infekcję 7. Użyteczną alternatywą dla zastosowań wysokoprzepustowych jest iniekcja bakterii do żółtka zarodków w ciągu pierwszych godzin po zapłodnieniu 8. Połączenie fluorescencyjnych bakterii i transgenicznych linii danio pręgowanego z fluorescencyjnymi makrofagami lub neutrofilami tworzy idealne warunki do wielokolorowego obrazowania interakcji gospodarz-patogen. Niniejszy artykuł wideo opisze szczegółowe protokoły dożylnej i lokalnej infekcji zarodków danio pręgowanego bakteriami S. typhimurium lub M. marinum oraz późniejszego obrazowania fluorescencyjnego interakcji z komórkami wrodzonego układu odpornościowego.

Protokół

1. Przygotowanie igieł do iniekcji

  1. Przygotować szklane mikrokapilary borokrzemianowe do iniekcji (Harvard Apparatus, 300038, 1 mm O.D. × 0.78 mm I.D.) za pomocą wyciągarki do mikropipet (Sutter Instruments Inc., Flaming/Brown p-97), stosując następujące ustawienia dla dłuższej końcówki: ciśnienie powietrza 400; ciepło 610; wyciąganie 40; prędkość 50; czas 30 oraz następujące ustawienia dla krótszej końcówki: ciśnienie powietrza 500; ciepło 510; wyciąganie 100; prędkość 200; czas 60).
  2. Odłamać końcówkę igły za pomocą precyzyjnej pęsety, aby uzyskać średnicę otworu końcówki wynoszącą 5-10 μm. Zaleca się ścięcie otworu końcówki igły pod kątem 45 stopni za pomocą mikro szlifierki (Narishige Inc., EG-400) w celu uzyskania ostrzejszej końcówki. Ułatwi to przebicie warstwy naskórka, co pozwoli na bardziej powtarzalne iniekcje przy mniejszym uszkodzeniu tkanek niż w przypadku igieł tępych. Igły z dłuższą końcówką są preferowane do iniekcji do żyły ogonowej (krok 5) i przewodu Cuviera (krok 6.1), natomiast igły z krótszą końcówką są preferowane w pozostałych protokołach iniekcji (kroki 6.2-6.6).

2. Przygotowanie inokulum S. typhimurium

  1. Wysiać S. typhimurium z zapasu glicerolowego przechowywanego w -80 °C na płytki z agarem LB (z odpowiednimi antybiotykami w celu selekcji wektorów ekspresji fluorescencji) i inkubować przez noc w 37 °C.
  2. Wybrać pojedyncze kolonie wykazujące fluorescencję i resuspendować je do pożądanego stężenia (patrz protokoły 5 i 6) w sterylnym soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS), opcjonalnie zawierającym 0,085% (v/v) czerwieni fenolowej (Sigma-Aldrich) w celu ułatwienia wizualizacji procesu iniekcji. Świeżą zawiesinę można wykorzystać bezpośrednio do iniekcji lub przygotować zapasy glicerolowe. Aby przygotować zapasy glicerolowe, odwirupować świeżo przygotowany zapas do iniekcji o pożądanym stężeniu bakterii i zagęścić go poprzez resuspendowanie osadu w połowie objętości początkowej w sterylnym 20% (v/v) glicerolu (Sigma-Aldrich) w PBS. Zapasy glicerolowe przechowywać w -80 °C. Przed iniekcją rozcieńczyć zapas glicerolowy 1:1 (v/v) w sterylnym PBS, opcjonalnie zawierającym 0,17% czerwieni fenolowej.
  3. Dokładnie wymieszać zawiesinę bakteryjną w wortexie, aby uniknąć tworzenia się grudek.
  4. Napełnić igłę mikrokapilarną za pomocą końcówki mikroloadera (Eppendorf, 5242956.003).
  5. Ze względu na stosunkowo duży rozmiar bakterii S. typhimurium oraz ich silną fluorescencję Ds-RED przy użyciu wektora ekspresyjnego pGMDs3 3 (szczep dostępny na zapytanie), pojedyncze komórki bakteryjne można łatwo policzyć za pomocą stereomikroskopu fluorescencyjnego w celu ustalenia dawki iniekcyjnej. W tym celu wstrzyknąć 1 nL do kropli PBS na płytce z agarem, policzyć fluorescencyjne bakterie i obliczyć objętość iniekcji niezbędną do uzyskania pożądanej dawki bakterii (zaleca się utrzymanie objętości iniekcji w przedziale 1-2 nL). Wstrzyknąć S. typhimurium do embrionów wybraną drogą (patrz protokoły 5 i 6).

3. Przygotowanie inokulum M. marinum

  1. Utrzymuj szczep M. marinum w hodowli na agarze Difco Middlebrook 7H10 (BD and company) uzupełnionym o 10% kwasu oleinowego, albuminy, dekstrozy i katalazy (OADC, BD and company), 0,5% glicerolu oraz odpowiednie antybiotyki w celu selekcji wektorów ekspresji fluorescencyjnej (szczepy dostępne na żądanie 9), aby zawsze dysponować świeżym zapasem.
  2. Pobierz kolonię M. marinum i resuspenduj ją w bulionie Difco Middlebrook 7H9 (BD and company) uzupełnionym o 10% albuminy, dekstrozy i katalazy (ADC, BD and company), 0,05% Tween 80 (Sigma-Aldrich) oraz odpowiednie antybiotyki. Sprawdź, czy gęstość optyczna (OD) przy 600 nm wynosi 0,2 - 0,3 i pozostaw do wzrostu statycznego przez noc w temperaturze 28,5 °C. Czas generacji M. marinum wynosi około 4-6 h, w zależności od szczepu.
  3. W dniu iniekcji ponownie zmierz OD przy 600 nm. Wartość OD600 równa 1 odpowiada około 108 M. marinum/mL (wartość ta może się różnić w zależności od użytego szczepu bakteryjnego, dlatego powinna być oparta na krzywej wzrostu dla konkretnego szczepu).
  4. Zbierz bakterie w fazie logarytmicznej (nie dopuść do przekroczenia OD600 wartości 1,00) poprzez wirowanie i trzykrotne przemycie w sterylnym PBS.
  5. Ponownie zmierz OD600 zawiesiny bakteryjnej w PBS, odwiruj i resuspenduj bakterie do pożądanego stężenia (patrz protokoły 5 i 6) w PBS lub w 2% poliwinylopirolidonie (PVP40) w PBS (w/v), co poprawia homogenność zawiesiny bakteryjnej. W celu ułatwienia wizualizacji procesu iniekcji można dodać czerwień fenolową (Sigma-Aldrich) do stężenia 0,085%. Świeżą zawiesinę wykorzystaj bezpośrednio do iniekcji lub przygotuj zapasy w glicerolu. Aby przygotować zapasy w glicerolu, odwiruj świeżo przygotowaną zawiesinę do iniekcji o pożądanym stężeniu bakterii i zagęść ją, resuspendując osad w połowie objętości początkowej w sterylnym 20% glicerolu w PBS. Zapasy w glicerolu przechowuj w temperaturze -80 °C. Rozcieńcz zapas w glicerolu w stosunku 1:1 (v/v) w sterylnym PBS, opcjonalnie zawierającym 4% PVP40 i/lub 0,17% czerwieni fenolowej.

4. Przygotowanie zarodków danio pręgowanego do iniekcji

  1. Przygotować pary hodowlane danio pręgowanego i zebrać zarodki zgodnie z instrukcją przedstawioną w innym artykule wideo10. Zarodki przechowywać w szalce Petri wypełnionej wodą do jaj (60 μg/mL soli morskich; ok. 60 zarodków na szalkę) i inkubować w temperaturze 28.5 °C.
  2. W razie potrzeby, gdy zarodki osiągną wiek około 12 hpf, dodać do wody do jaj 0.003% N-fenylotiomocznika (PTU, Sigma-Aldrich), aby zapobiec melanizacji.
  3. Około 24 godzin po zapłodnieniu (hpf) usunąć chorion z zarodków za pomocą precyzyjnej pęsety (Fine Science Tools Inc., Dumont #5 Forceps - Inox Biology).
  4. Zarodki przechowywać w szalce Petri wypełnionej wodą do jaj, z warstwą 1% agarozy na dnie, aby zapobiec przywieraniu zarodków do plastikowej powierzchni.
  5. Zanestezjować zarodki za pomocą 200 μg/mL buforowanego kwasu 3-aminobenzoowego (Tricaine, Sigma-Aldrich) około 10 min przed wykonaniem iniekcji.

5. Dożylne wstrzykiwanie bakterii do jednodniowych zarodków

  1. Wyznacz stadium rozwoju embrionów na 28 hpf 11, sprawdzając obecność stabilnego krążenia krwi, początek pigmentacji oka, prosty ogon oraz położenie serca bezpośrednio brzusznie względem oka.
  2. Zanurz embriony w środku znieczulającym, patrz krok 4.5.
  3. Napełnij igłę inokulum bakteryjnym za pomocą końcówki do mikroladowania.
  4. Zamocuj napełnioną igłę w mikromanipulatorze (Sutter Instrument, MM-33) połączonym ze statywem (World precision Instruments, M10L magnetic stand) i ustaw go pod stereomikroskopem (Leica M50, achromat 1x objective 0,15 NA, transmitted light base TL ST). Ustaw czas wtrysku na 0,2 s, a ciśnienie kompensacyjne na 15 hPa (Eppendorf, Femtojet). Dostosuj ciśnienie wtrysku w zakresie od 700 do 900 hPa, aby uzyskać właściwą objętość wtrysku dla zastosowanej igły. Dostosuj wielkość kropli do pożątej średnicy, korzystając z podziałki na szkiełku przedmiotowym lub w okularze. W celu określenia wielkości kroplę można wstrzyknąć do oleju mineralnego na szkiełku przedmiotowym lub oszacować jej rozmiar, wstrzykując ją w powietrze, co pozostawi kroplę zwisającą z końcówki igły. Promień kropli o objętości 1 nL wynosi 0,062 mm (V = 4/3 π r3).
  5. Ustaw mikromanipulator z napełnioną igłą w odpowiedniej pozycji przed wtryskiem (tzn. pod kątem około 45° względem powierzchni płytki do iniekcji) i przesuwaj go jedynie w przód i w tył podczas wykonywania wtrysku.
  6. Znieczulone embriony przenosi się pipetą na płaską płytkę do iniekcji z 1% agarozy i usuwa nadmiar wody z jaj, co pozwala napięciu powierzchniowemu utrzymać embriony na miejscu podczas wtryskiwania. Do wyrównania embrionów należy użyć pętelki z włosa (Rysunek 2). Podczas wtrysków orientuj płytkę do iniekcji ręcznie, aby ustawić embriony w preferowanej pozycji do wprowadzenia igły, tzn. tak, aby ich ogony były skierowane w stronę końcówki igły.
  7. Umieść końcówkę igły bezpośrednio nad żyłą ogonową w pobliżu otworu urogenitalnego (Rysunek 1A), przebij peryderm końcówką igły i wstrzyknij pożądaną dawkę bakterii; stosujemy ok. 250 cfu szczepu dzikiego (wt) S. typhimurium SL1027, zawierającego wektor ekspresyjny Ds-RED pGMDs3, oraz ok. 120 cfu szczepu M. marinum Mma20. Wstrzyknięta zawiesina bakteryjna przemieści się wraz z przepływem krwi przez żyłę ogonową w kierunku serca. Monitoruj, czy wtrysk został wykonany prawidłowo, sprawdzając, czy bezpośrednio po impulsie następuje zwiększenie objętości układu naczyniowego 2. W eksperymentach z krzywą dawka-odpowiedź można wykonać 2-3 kolejne wtryski bez wyciągania igły.
  8. Często sprawdzaj, czy objętość wtrysku pozostaje stała podczas eksperymentu. Aby zapewnić kontrolę spójności wtrysków w trakcie całego doświadczenia, po wstrzyknięciu bakterii do około każdego 30tego embrionu wstrzyknij kroplę bakterii bezpośrednio do sterylnej kropli PBS na podłożu wzrostowym dla bakterii. Wysiej tę kroplę na płytkę i po inkubacji policz kolonie bakteryjne, aby określić jednostki tworzące kolonie (cfu) w objętości wtrysku.
  9. Użyj stereomikroskopu fluorescencyjnego (protokół 7), aby zaobserwować pojedyncze fluorescencyjne komórki S. typhimurium krążące w krwiobiegu bezpośrednio po wtrysku i odrzuć embriony, w które wtrysk nie został wykonany prawidłowo. Pojedynczych fluorescencyjnych bakterii M. marinum nie można zaobserwować za pomocą stereomikroskopii fluorescencyjnej bezpośrednio po wtryskach, jednak fluorescencyjne agregaty zakażonych komórek powinny być widoczne do 2 dni po infekcji (dpi) i z czasem powiększać się.

6. Alternatywne drogi zakażenia

  1. Iniekcja do przewodu Cuviera: ustaw znieczulone zarodki (2-3 dpf) na płaskiej płytce do iniekcji z 1% agarozy, analogicznie jak w przypadku iniekcji do żyły ogonowej (patrz 5.6). Podczas iniekcji orientuj płytkę ręcznie, aby ustawić zarodki w pozycji preferowanej do wprowadzenia igły, tj. ukośnie pod kątem 45°, tak aby do przewodu Cuviera można było dotrzeć końcówką igły od strony grzbietowej zarodka (Rysunek 1B). Wprowadź igłę w punkt początkowy przewodu Cuviera, tuż grzbietowo od miejsca, w którym przewód zaczyna rozszerzać się nad workiem żółtkowym, i wstrzyknij 100-200 bakterii (1-3 nL). Iniekcja jest prawidłowa, jeśli objętość wewnątrz przewodu zwiększa się bezpośrednio po impulsie, a worek żółtkowy nie uległ przerwaniu. Podobnie jak w przypadku iniekcji do żyły ogonowej (patrz 5.7), można wykonać kilka następujących po sobie iniekcji bez wyciągania igły.
  2. Iniekcja do komory rombu mózgu: ustaw znieczulone zarodki (32 hpf) na płaskiej płytce do iniekcji z 1% agarozy w taki sposób, aby strona grzbietowa zarodków była skierowana ku końcówce igły. Wprowadź igłę do komory rombu mózgu od strony przedniej, nie dotykając neuroepithelium (Rysunek 1C), i wstrzyknij 20-100 bakterii (0.5-1 nL). Aby przećwiczyć procedurę, użyj barwnika fluorescencyjnego (takiego jak Texas-Red Dextran), zgodnie z instrukcją w innym artykule wideo13.
  3. Iniekcja do mięśni ogona: ustaw znieczulone zarodki (1-2 dpf) analogicznie jak w przypadku iniekcji do żyły ogonowej (patrz 5.6). Ustaw mikromanipulator z załadowaną igłą pod kątem około 65° względem powierzchni płytki do iniekcji. Wstrzyknij zawiesinę bakteryjną (0.5-1 nL) zawierającą 20-50 cfu do mięśnia nad otworem urogenitalnym (Rysunek 1D), nie powodując uszkodzenia struny grzbietowej ani naczyń krwionośnych.
  4. Iniekcja do pęcherzyka słuchowego: ustaw znieczulone zarodki (2-3 dpf) analogicznie jak w przypadku iniekcji do żyły ogonowej (patrz 5.6). Ustaw mikromanipulator z załadowaną igłą pod kątem około 65° względem powierzchni płytki do iniekcji. Wstrzyknij około 20 bakterii (0.5 nL) do pęcherzyka słuchowego (Rysunek 1E) z niskim ciśnieniem, aby uniknąć miejscowego rozerwania tkanek.
  5. Iniekcja do struny grzbietowej: ustaw znieczulone zarodki (1-2 dpf) na płaskiej płytce do iniekcji z 1% agarozy w taki sposób, aby ogony zarodków były skierowane w stronę przeciwną do końcówki igły. Wprowadź igłę przez tkankę mięśniową ogona do struny grzbietowej (Rysunek 1F) i wstrzyknij około 20-50 bakterii (maksymalnie 0.5 nL). Należy uważać, aby nie wstrzyknąć zbyt dużej objętości, co zapobiegnie przerwaniu struny grzbietowej.
  6. Iniekcja do żółtka: ustaw jaja zawierające zarodki w stadium od 16 do 1000 komórek na płytce do iniekcji z 1% agarozy z kanałami prostokątnymi lub w kształcie litery V, wykonanymi za pomocą formy do kanałów 12 lub zgodnie z instrukcją dostępną online pod adresem http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt5/5.1.html. Przebij igłą chorion i wprowadź ją do centrum żółtka (Rysunek 1G), a następnie wstrzyknij 20-40 bakterii (1-2 nL). Użycie 2% roztworu nośnika PVP40 dla zawiesiny bakteryjnej (patrz krok 3.5) jest istotne, aby zapobiec przedwczesnemu rozprzestrzenianiu się bakterii w zarodku.

7. Obrazowanie stereoskopowe infekcji

  1. Zanurz zakażone embriony w warstwie 1% agarozy w szalce Petri wypełnionej wodą do jaj zawierającą Tricaine w celu ich znieczulenia (patrz 4.5).
  2. Używając pętelki z włosa, ustaw embriony w odpowiedniej pozycji do obrazowania pod stereomikroskopem fluorescencyjnym (Rysunek 2). Przed napompowaniem pęcherza pławnego (1-5 dpf) embriony będą leżeć płasko na bokach, co umożliwi obrazowanie w widoku bocznym.
  3. Jeśli wymagana jest inna pozycja niż widok boczny, zamocuj embriony w 1,5% metylocelulozie. Używając pętelki z włosa, ustaw embrion w wymaganej pozycji (Rysunek 2).
  4. Po zakończeniu obrazowania przenieś embriony z powrotem do wody do jaj.

8. Obrazowanie konfokalne infekcji

  1. Nanieś kroplę nisko topiącej się agarozy (Lonza Inc., 1,5% (w/v) w wodzie do jaj) na szklane dno szalki WillCo (WillCo Wells, GWSt-5040) w przypadku użycia odwróconego mikroskopu konfokalnego lub na szkiełko z pojedynczym wgłębieniem (Agar Scientific, L4090) w przypadku użycia mikroskopu konfokalnego w układzie prostym.
  2. Umieść znieczulony embrion w kropli agarozy z niewielką ilością wody do jaj i ustaw go w odpowiedniej pozycji za pomocą pętelki z włosa (Rysunek 2). Przy użyciu mikroskopu odwróconego ważne jest, aby obszar zainteresowania embrionu przylegał płasko do szklanego dna naczynia obrazującego. Mikroskop w układzie prostym można stosować w połączeniu z obiektywami imersyjnymi wodnymi lub suchymi o długiej ogniskowej; embrion należy ustawić tak, aby obszar zainteresowania znajdował się jak najbliżej obiektywu.
  3. Pozostaw agarozę do stężenia i zanurz kroplę agarozy w wodzie do jaj zawierającej Tricaine (patrz 4.5). W przypadku użycia mikroskopu w układzie prostym, nałóż szklaną lamellkę na wgłębienie (należy dopilnować, aby nie powstały pęcherzyki powietrza).
  4. Sekwencyjnie wykonaj obrazy fluorescencyjne i transmisyjne.
  5. Ostrożnie usuń agarozę z embrionu za pomocą precyzyjnej pęsety i przenieś embrion z powrotem do wody do jaj, jeśli jest to wymagane do dalszych eksperymentów.

9. Reprezentatywne wyniki

Wstrzyknięcie bakterii Salmonella typhimurium lub Mycobacterium marinum do wyspy krwi zarodków w 1 dpf skutkuje ich szybką fagocytozą przez makrofagi. Gen mpeg1 został niedawno zidentyfikowany jako wiarygodny marker makrofagów zarodkowych, kolokalizujący z uznanym markerem makrofagów csf1r (fms) i nie nakładający się na markery neutrofili, takie jak mpx (mpo) i lyz 4, 14. Do obrazowania na żywo fagocytozy bakteryjnej wykorzystano linie transgeniczne, w których promotor mpeg1 steruje ekspresją białka fluorescencyjnego w makrofagach 14. Linie transgeniczne te posiadają albo promotor mpeg1 bezpośrednio połączony z genem gfp, albo wykorzystują system dwuskładnikowy, w którym promotor mpeg1 steruje ekspresją drożdżowego czynnika transkrypcyjnego Gal4, który aktywuje drugi transgen z sekwencją rozpoznawczą Gal4 (UAS, upstream activating sequence) połączoną z genem kaede. Jeśli wstrzyknięcie do wyspy krwi (protokół 5; Rysunek 1A) zostanie wykonane prawidłowo, bakterie natychmiast popłyną wraz z krążeniem krwi i rozprzestrzenią się po całym zarodku. Rozprzestrzenianie się stosunkowo dużych i silnie fluorescencyjnych bakterii S. typhimurium znakowanych Ds-RED można obrazować bezpośrednio za pomocą stereomikroskopu fluorescencyjnego (Rysunek 3A), a obrazowanie konfokalne w 2 hpi pokazuje, że wiele bakterii jest fagocytowanych przez fluorescencyjne makrofagi (Rysunek 3B-C). Wstrzyknięcie nawet 25 cfu bakterii S. typhimurium typu dzikiego doprowadzi do śmiertelnej infekcji, podczas gdy podobna dawka bakterii szczepu awirulentnego, np. Ra, może zostać usunięta przez embrionalny układ odpornościowy 3. Dawkę wstrzykniętą w ilości 250 cfu wykorzystano do określenia odpowiedzi transkrypcyjnej na zakażenie S. typhimurium w zarodku danio pręgowanego, co wykazało indukcję silnej pro zapalnej odpowiedzi ekspresji genów 15. W przeciwieństwie do tego, dożylne wstrzyknięcie bakterii M. marinum nie wywołuje silnej odpowiedzi pro zapalnej, lecz prowadzi do przetrwałej infekcji, w której zainfekowane makrofagi tworzą gęste agregaty uznawane za wczesne stadia ziarniniaków, będących znakiem rozpoznawczym gruźlicy 2. Obrazowanie konfokalne takiego agregatu przypominającego ziarniniak w linii Tg(mpeg1:EGFP)gl2214 w 5 dpi pokazuje wewnątrzkomórkowy wzrost bakterii M. marinum znakowanych mCherry wewnątrz zielonych fluorescencyjnych makrofagów (Rysunek 3D-E).

Inne drogi zakażenia są przydatne w różnych celach. Bakterie można wstrzyknąć do komory tylnego mózgu w 32 hpf (Rysunek 1C), która jest przedziałem pozbawionym makrofagów. Wstrzyknięcie 20-100 bakterii M. marinum znakowanych mCherry do tego przedziału prowadzi do szybkiej infiltracji przez makrofagi, które fagocytują bakterie (Rysunek 4A). Inną metodą badania ukierunkowanej migracji komórek odporności wrodzonej jest wstrzyknięcie bakterii do mięśnia ogona (Rysunek 1D). Jednakże wstrzyknięcia do mięśnia ogona powodują również uszkodzenie tkanek, co samo w sobie wywołuje pewne przyciąganie leukocytów. Takiej odpowiedzi na zranienie można uniknąć, ostrożnie wstrzykując niewielką objętość (0,5-1 nL) do pęcherzyka słuchowego (Rysunek 1E). Jak pokazano tutaj z użyciem linii Tg(mpx:EGFP)i11416, wstrzyknięcie około 20 cfu S. typhimurium do pęcherzyka słuchowego prowadzi do przyciągnięcia neutrofili w 3 hpi (Rysunek 4D), podczas gdy odpowiedź ta nie jest obserwowana przy wstrzyknięciach kontrolnych PBS (Rysunek 4E). Ciotrzew, który wydaje się być odporny na infiltrację przez leukocyty, jest przedziałem dopuszczalnym dla wzrostu mutantów M. marinum, które są silnie osłabione po wstrzyknięciu do innych tkanek 7; (Rysunek 4F). Wreszcie, wczesne wstrzyknięcie M. marinum do żółtka embrionów stanowi alternatywną metodę wywołania zakażenia systemowego. Zazwyczaj wykonujemy te wstrzyknięcia około stadium 16 komórek (Rysunek 1G), ale wstrzyknięcia bakterii do żółtka mogą być wykonywane również w późniejszych stadiach (do stadium 1000 komórek) lub wcześniej (stadium od 1 do 8 komórek) w przypadku współwstrzykiwania z morfolinami 8. Po wstrzyknięciu do żółtka dawki 20-40 cfu, bakterie M. marinum rozprzestrzeniają się w ciągu kilku dni do tkanek embrionalnych i tworzą agregaty przypominające ziarniniaki, podobnie jak te obserwowane przy konwencjonalnej metodzie wstrzykiwania dożylnego 8; (Rysunek 4G). Metoda wstrzykiwania do żółtka nie nadaje się do zakażeń S. typhimurium, ponieważ ich szybki wzrost w żółtku powoduje wczesną śmiertelność. Metoda zakażania żółtka dla infekcji M. marinum będzie użyteczna w zastosowaniach wysokoprzepustowych, ponieważ może zostać zautomatyzowana przy użyciu robota do mikroiniekcji 8.

Schemat etapów rozwoju zarodka danio pręgowanego; obraz mikroskopowy przedstawiający fazy wzrostu i struktury.
Rysunek 1. Przegląd metod iniekcji stosowanych w celu wywołania infekcji systemowych lub lokalnych u zarodków danio pręgowanego. (A-B) Iniekcje dożylne w celu wywołania szybkiej infekcji systemowej wykonuje się do żyły ogonowej w tylnej wyspie krwi w 1 dpf (A) lub do przewodu Cuviera w 2-3 dpf (B). (C-E) Iniekcje lokalne w celu badania chemotaksji makrofagów i neutrofili wykonuje się do komory tylnomózgowia w 1 dpf (C), mięśnia ogonowego w 1-2 dpf (D) lub pęcherzyka słuchowego w 2-3 dpf (E). (F) Iniekcje w celu wywołania infekcji pozornie niedostępnej dla fagocytów wykonuje się do struny grzbietowej w 1-2 dpf. (G) Iniekcje w celu wywołania wczesnej infekcji systemowej wolno rosnącymi bakteriami, takimi jak M. marinum, można wykonać do żółtka w stadium 16-1000 komórek. Wszystkie obrazy zostały wykonane przy użyciu Leica M165C, PLANAPO 1.0x połączonego z kamerą Leica DFC420 (Leica 10446307 0.8x).

Układ igły do elektroprzędzenia; produkcja włókien polimerowych, metoda syntezy nanowłókien, schemat urządzenia.
Rysunek 2. Narzędzie z pętli z włosa. Pasmo ludzkiego włosa zostaje wprowadzone w formie pętli do otworu pipety Pasteura i utrwalone w tym miejscu za pomocą superglue lub korektora Tipp-Ex. Stanowi to wygodne narzędzie do delikatnego manipulowania kruchymi embrionami danio pręgowanego.

Mikroskopia embrionów danio pręgowanego, barwienie fluorescencyjne, biologia rozwoju, rozkład komórkowy, obrazy.
Rycina 3. Dożylne wstrzyknięcia czerwonych fluorescencyjnych Salmonella typhimurium i Mycobacterium marinum. Bakterie S. typhimurium SL1027 znakowane Ds-RED (A-C) oraz bakterie M. marinum Mma20 znakowane mCherry (D-E) zostały wstrzyknięte do wyspy krwi embrionów danio pręgowanego linii Tg(mpeg1:Gal4-VP16)gl24;Tg(UAS-E1b:Kaede)s1999t (A-C) lub Tg(mpeg1:EGFP)gl22 (D-E) w 28 hpf. (A) Nałożony obraz stereo-fluorescencyjny i w polu jasnym ukazujący rozsianie S. typhimurium w krwiobiegu w 2 hpi (mikroskop Leica MZ16FA z kamerą Leica DFC420C). (B-C) Projekcje z-stack z mikroskopu konfokalnego ukazujące czerwone bakterie S. typhimurium fagocytowane przez zielone makrofagi w 2 hpi (Leica TCS SPE, obiektyw HCX APO 40x 0.8 NA). Można również zaobserwować bakterie, które wciąż znajdują się poza komórkami. (D) Projekcja z-stack z mikroskopu konfokalnego ukazująca agregat przypominający ziarniniak, zawierający zakażone i niezakażone makrofagi M. marinum Mma20 w 5 dpi (Leica TCS SPE, HCX APO 40x 0.8 NA). Makrofagi w kolorze zielonym, a bakterie w czerwonym. (E) Projekcja z-stack z mikroskopu konfokalnego pojedynczego makrofaga (zielony) z wewnątrzkomórkowymi bakteriami M. marinum (czerwone). Obszar zaznaczony w D białym prostokątem został zobrazowany przy użyciu obiektywu o większym powiększeniu (Leica TCS SPE, HCX PL APO 63x 1.2 NA). Paski skali: 20 μm.

Mikroskopia zarodków danio pręgowanego; mikroskopia fluorescencyjna, analiza ekspresji białek, obrazowanie komórkowe.
Rycina 4. Alternatywne drogi zakażania zarodków danio pręgowanego. (A) Bakterie M. marinum Mma20 znakowane mCherry zostały wstrzyknięte do komory tylnej części mózgu w 32 hpf. Nałożony obraz fluorescencyjny i transmisyjny przedstawia znakowane mCherry bakterie fagocytowane przez makrofagi w 5 hpi (Leica TCS SPE, HCX PL FLUO TAR 40.0x 0.7 NA). (B) S. typhimurium wstrzyknięto do mięśnia ogonowego w 1 dpf. Przyciąganie komórek mieloidalnych do miejsca wstrzyknięcia (białe koło) pokazano w 3 hpi za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ 4, (C) podczas gdy w niewstrzykniętych zarodkach w tym miejscu morfologicznym zazwyczaj nie występują komórki mieloidalne. Chociaż zarodki na tym etapie nie zawierają dojrzałych neutrofili, można wyróżnić dwie populacje komórek mieloidalnych: jedną wykazującą ekspresję markera makrofagów mfap4 (czerwony) i drugą wykazującą ekspresję markera neutrofili mpx (zielony) (Leica TCS SPE, HC PL FLUOTAR 10.0x 0.3 NA). Fluorescencja bakterii zanika po procedurze hybrydyzacji in situ. (D) Bakterie S. typhimurium znakowane Ds-RED zostały wstrzyknięte do pęcherzyka słuchowego danio pręgowanego linii Tg(mpx:EGFP)i114 w 2 dpf. Nałożone obrazy stereofluorescencyjne i w świetle przechodzącym pokazują, że neutrofile znakowane mpx:EGFP są przyciągane do zakażonego pęcherzyka słuchowego (przerywana elipsa) w 3 hpi, (E) podczas gdy kontrolne wstrzyknięcie PBS do pęcherzyka słuchowego danio pręgowanego Tg(mpx:EGFP)i114 nie wykazuje przyciągania neutrofili do niezakażonego pęcherzyka słuchowego (przerywana elipsa) (Leica MZ16FA z kamerą Leica DFC420C). (F) Bakterie M. marinum znakowane mCherry z atenuowanego szczepu mutanta E11 eccCb1::tn 17 zostały wstrzyknięte do notochordu w 1 dpf. Proliferację wewnątrz notochordu obrazowano w 5 dpi (mikroskop Leica MZ16FA z kamerą DC500). (G) Bakterie M. marinum E11 znakowane mCherry wstrzyknięto do żółtka zarodków danio pręgowanego w stadium 16 komórek linii Tg(fli1a:EGFP), która wykazuje ekspresję gfp w komórkach śródbłonka naczyń krwionośnych i limfatycznych. Powstawanie agregatów przypominających ziarniniaki z zakażonych komórek w okolicy ogona obserwuje się w 5 dpi (mikroskop Leica MZ16FA z kamerą Leica DFC420C; obraz z 8).

Dyskusja

Metody infekcji opisane w tym artykule są często stosowane do badania funkcji genów odporności wrodzonej gospodarza lub genów wirulencji bakterii1. Metody mikroiniekcji dożylnej (protokoły 5 i 6.1) są najczęściej wykorzystywane w tego typu badaniach. Żyła ogonowa w tylnej wyspie krwi jest najwygodniejszym miejscem do iniekcji dożylnej w przypadku 1-dniowych embrionów. Ponieważ w późniejszych etapach żyła ogonowa staje się trudniejsza do nakłucia, w przypadku embrionów w wieku 2-3 dpf preferujemy przewód Cuviera jako miejsce iniekcji dożylnej. W każdym przypadku kluczowe jest wstrzykiwanie embrionom spójnej liczby bakterii, co powinno być weryfikowane poprzez wysiewanie inokulum iniekcyjnego w celu obliczenia cfu. Aby uzyskać powtarzalne iniekcje, należy wziąć pod uwagę następujące aspekty. Po pierwsze, niezbędne jest zastosowanie wysokiej jakości szklanych mikrokapilarnych igieł iniekcyjnych. Jeśli końcówka igły jest zbyt duża, iniekcja spowoduje powstanie otworu wystarczająco dużego, by doszło do krwawienia, a wstrzyknięte bakterie wypłyną z krwiobiegu. Po drugie, bakterie muszą być wstrzykiwane bezpośrednio do krwiobiegu. Jeśli końcówka igły nie znajduje się wewnątrz żyły lub jeśli płyn iniekcyjny rozprzestrzeni się do rozszerzenia pęcherzyka żółtkowego, embrion musi zostać wykluczony z eksperymentu. Po trzecie, zastosowanie PVP40 jako nośnika do iniekcji M. marinum pomoże zapobiec opadaniu bakterii w szklanej igle. PVP40 poprawia homogeniczność zawiesiny, co skutkuje bardziej powtarzalnymi inokulami przez cały czas trwania iniekcji. PVP40 może być również stosowane do iniekcji S. typhimurium, jednak w tym przypadku jest to mniej istotne, ponieważ większy rozmiar i silna fluorescencja bakterii pozwalają na wizualną kontrolę inokulum iniekcyjnego podczas eksperymentów. Do ćwiczenia iniekcji zalecamy stosowanie barwnika czerwieni fenolowej (1% v/v) lub 1 μm fluorescencyjnych kulek dostępnych w różnych kolorach (Invitrogen). Po opanowaniu techniki iniekcja 50-100 embrionów zajmuje około 30 minut, wliczając w to czas potrzebny na ustawienie embrionów na płytkach agarozy i dostosowanie objętości iniekcji bakteryjnej.

Choć najczęściej stosuje się iniekcje dożylne do wyspy krwi (protokół 5) lub do przewodu Cuviera (protokół 6.1), alternatywne drogi zakażenia opisane w tym artykule wideo okazały się przydatne w badaniu chemotaksji makrofagów i neutrofili (protokoły 6.2, 6.3 i 6.4), badaniu wzrostu atenuowanych szczepów bakteryjnych (protokół 6.5) oraz w adaptacji modelu zakażeń zebrafish do zastosowań wysokoprzepustowych (protokół 6.6) 4-8. Opisane metody mikroiniekcji można również zastosować do iniekcji wirusów 18, 19, zarodników grzybów 14, 20 lub pierwotniaków (Maria Forlenza, komunikacja osobista). Przydatnym uzupełnieniem procedur iniekcyjnych opisanych w tym artykule wideo jest niedawno opisana procedura podskórnego wstrzykiwania bakterii do embrionów zebrafish 21. Procedurę tę zastosowano do badania fagocytozy bakterii przez neutrofile, które, jak stwierdzono, efektywnie pochłaniają bakterie na powierzchni tkanek, ale w przeciwieństwie do makrofagów są praktycznie niezdolne do fagocytozy bakterii po wstrzyknięciu ich do krwi lub do wypełnionych płynem jam ciała. W przypadku iniekcji podskórnych embriony ustawia się podobnie jak przy iniekcjach do mięśni ogonowych opisanych w tym artykule wideo, jednak igłę wprowadza się tuż pod skórę, aby wstrzyknąć bakterie nad somitem.

Należy wziąć pod uwagę, że mikroiniekcja jest w istocie sztuczną drogą zakażenia. Jednakże wczesne embriony są wysoce odporne na zewnętrzną ekspozycję na patogeny bakteryjne. W rzeczywistości testy immersyjne, w których embriony są kąpane w zawiesinie bakteryjnej, nie są w naszych warunkach powtarzalne 22. Chociaż niektóre embriony mogą ulec zakażeniu podczas immersji, zaobserwowaliśmy w takich testach duże zróżnicowanie w stopniu śmiertelności oraz w ekspresji genów markerów zapalnych między poszczególnymi embrionami. Metody mikroiniekcji opisane w niniejszym artykule pozwalają na uzyskanie powtarzalnych zakażeń i są szczególnie użyteczne w badaniu interakcji bakterii z komórkami wrodzonej odpowiedzi immunologicznej gospodarza. Efektywnym podejściem do ilościowego określenia zakażenia bakteryjnego w poszczególnych embrionach jest analiza obrazów fluorescencyjnych zakażonych embrionów przy użyciu dedykowanego, specjalistycznego oprogramowania do kwantyfikacji pikseli 17, 23. Wykazano, że podejście to dobrze koreluje z wynikami liczenia cfu po wysianiu zakażonych embrionów. Podobnie, względne zmiany w liczbie leukocytów na embrion zostały określone ilościowo poprzez cyfrową analizę obrazu w transgenicznych liniach reporterowych fluoroforów leukocytów; podejście to byłoby możliwe do zastosowania w celu ilościowego określenia leukopoetycznej odpowiedzi gospodarza na zakażenie24.

Funkcję genów odporności wrodzonej gospodarza można efektywnie badać in vivo, łącząc opisane modele infekcji z wyciszaniem za pomocą morfolino. Morfolino są syntetycznymi oligonukleotydami antysensownymi, które celują w specyficzne RNA i redukują ekspresję produktów genów po wstrzyknięciu do zarodków danio pręgowanego w stadium jednego komórki, co pokazano w innych artykułach wideo w tym czasopiśmie 10, 25. W badaniach nad wyciszaniem za pomocą morfolino niezwykle ważne jest, aby wszystkie porównywane grupy zarodków były prawidłowo stadiowane przed wstrzyknięciem bakterii. Jest to szczególnie istotne, ponieważ zarodki posiadają rozwijający się układ odpornościowy, który z czasem staje się coraz bardziej kompetentny.

Obecnie dostępnych jest kilka transgenicznych linii reporterowych pozwalających na rozróżnienie głównych podzbiorów odporności wrodzonej — makrofagów i neutrofili — w embrionach rybek zebrafish. Promotory mpx i lyz zostały wykorzystane do wytworzenia linii reporterowych dla neutrofili 16, 26, 27, natomiast promotory csf1r (fms) i mpeg1 posłużyły do stworzenia reporterów dla makrofagów 14, 28 . Podczas gdy csf1r (fms) jest dodatkowo ekspresowany w ksantoforach, ekspresja mpeg1 występuje wyłącznie w makrofagach. Jak pokazano w niniejszym artykule wideo, niedawno opracowane linie reporterowe mpeg1 są niezwykle użyteczne do obrazowania fagocytozy bakterii przez makrofagi.

Oświadczenia

Autorzy nie wykazali żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować Chao Cui, Floor de Kort, Esther Stoop i Ralphowi Carvalho za obrazy zamieszczone na Rysunku 4, Ulrike Nehrdich i Davy’emu de Wittowi za opiekę nad rybami, a pozostałym członkom zespołu laboratoryjnego za pomocne dyskusje. Praca ta była wspierana przez program Smart Mix holenderskiego Ministerstwa Gospodarki oraz Ministerstwa Edukacji, Kultury i Nauki, projekt ZF-HEALTH (HEALTH-F4-2010-242048) w ramach 7. programu ramowego Komisji Europejskiej, europejską sieć szkoleniową Marie-Curie FishForPharma (PITN-GA-2011-289209) oraz przez australijski NHMRC (637394). Australian Regenerative Medicine Institute jest wspierany przez granty rządu stanu Wiktoria oraz rządu Australii.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Czerwony fenolSigma-AldrichP0290
GlicerolSigma-Aldrich228210
agar Difco Middlebrook 7H10BD Biosciences262710
Wzbogacenie BBL Middlebrook OADCBD Biosciences211886
Bulion Difco Middlebrook 7H9BD Biosciences271310
Wzbogacanie na podłożu BBL Middlebrook ADCBD Biosciences211887
Tween 80Sigma-AldrichP1754
Poliwinylo 원하는 pyrrolidon (PVP40)Calbiochem529504
Nfenylotiomocznik (PTU)Sigma-AldrichP7629
Metanosulfonian etylu 3-aminobenzoesanu (trykaina)Sigma-AldrichA5040
MetylocelulozaSigma-AldrichM0387
Agaroza SeaPlaque (agaroza o niskiej temperaturze topnienia)Lonza Inc.50100
FluoSpheres (1,0 μm, czerwona fluorescencja (580/605))InvitrogenF8821
FluoSpheres (1,0 μm, żółto-zielony fluorescencyjny (505/515))InvitrogenF8823

Bibliografia

  1. Meijer, A. H., Spaink, H. P. Host-pathogen interactions made transparent with the zebrafish model. Curr. Drug Targets. 12, 1000-1017 (2011).
  2. Davis, J. M. Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17, 693-702 (2002).
  3. vander Sar, A. M. Zebrafish embryos as a model host for the real time analysis of Salmonella typhimurium infections. Cell Microbiol. 5, 601-611 (2003).
  4. Zakrzewska, A. Macrophage-specific gene functions in Spi1-directed innate immunity. Blood. 116, 1-11 (2010).
  5. Le Guyader, D. Origins and unconventional behavior of neutrophils in developing zebrafish. Blood. 111, 132-141 (2008).
  6. Herbomel, P., Thisse, B., Thisse, C. Ontogeny and behaviour of early macrophages in the zebrafish embryo. Development. 126, 3735-3745 (1999).
  7. Alibaud, L. A Mycobacterium marinum TesA mutant defective for major cell wall-associated lipids is highly attenuated in Dictyostelium discoideum and zebrafish embryos. Mol. Microbiol. 80, 919-934 (2011).
  8. Carvalho, R. A high-throughput screen for tuberculosis progression. PLoS One. 6, 16779-16779 (2011).
  9. van der Sar, A. M., Spaink, H. P., Zakrzewska, A., Bitter, W., Meijer, A. H. Specificity of the zebrafish host transcriptome response to acute and chronic mycobacterial infection and the role of innate and adaptive immune components. Mol. Immunol. 46, 2317-2332 (2009).
  10. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. J. Vis. Exp. (25), e1115-e1115 (2009).
  11. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
  12. Westerfield, M. The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Brachydanio rerio). , The University of Oregon Press. Eugene. (1993).
  13. Gutzman, J. H., Sive, H. Zebrafish Brain Ventricle Injection. J. Vis. Exp. (26), e1218-e1218 (2009).
  14. Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117, 49-56 (2011).
  15. Stockhammer, O. W., Zakrzewska, A., Hegedus, Z., Spaink, H. P., Meijer, A. H. Transcriptome profiling and functional analyses of the zebrafish embryonic innate immune response to Salmonella infection. J. Immunol. 182, 5641-5653 (2009).
  16. Renshaw, S. A. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108, 3976-3978 (2006).
  17. Stoop, E. J. Zebrafish embryo screen for mycobacterial genes involved in the initiation of granuloma formation reveals a newly identified ESX-1 component. Dis. Model Mech. 4, 526-536 (2011).
  18. Levraud, J. P. Identification of the zebrafish IFN receptor: implications for the origin of the vertebrate IFN system. Journal of Immunology. 178, 4385-4394 (2007).
  19. Levraud, J. P., Colucci-Guyon, E., Redd, M. J., Lutfalla, G., Herbomel, P. In vivo analysis of zebrafish innate immunity. Methods Mol. Biol. 415, 337-363 (2008).
  20. Brothers, K. M., Newman, Z. R., Wheeler, R. T. Live imaging of disseminated candidiasis in zebrafish reveals role of phagocyte oxidase in limiting filamentous growth. Eukaryot. Cell. 10, 932-944 (2011).
  21. Colucci-Guyon, E., Tinevez, J. Y., Renshaw, S. A., Herbomel, P. Strategies of professional phagocytes in vivo: unlike macrophages, neutrophils engulf only surface-associated microbes. J. Cell Sci. 124, 3053-3059 (2011).
  22. van Soest, J. J. Comparison of static immersion and intravenous injection systems for exposure of zebrafish embryos to the natural pathogen Edwardsiella tarda. BMC Immunology. 12, 58-58 (2011).
  23. Adams, K. N. Drug tolerance in replicating mycobacteria mediated by a macrophage-induced efflux mechanism. Cell. 145, 39-53 (2011).
  24. Ellett, F. L., Lieschke, G. J. Computational quantification of fluorescent leukocyte numbers in zebrafish embryos. Methods in Enzymology. , (2011).
  25. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (27), e1113-e1113 (2009).
  26. Mathias, J. R. Resolution of inflammation by retrograde chemotaxis of neutrophils in transgenic zebrafish. J. Leukoc. Biol. 80, 1281-1288 (2006).
  27. Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Dev. Biol. 7, 42-42 (2007).
  28. Gray, C. Simultaneous intravital imaging of macrophage and neutrophil behaviour during inflammation using a novel transgenic zebrafish. Thromb. Haemost. 105, 811-819 (2011).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Zakażenie bakteryjnetechnika mikroiniekcjibakterie fluorescencyjnemikroskopia konfokalnaodporność wrodzonainterakcja gospodarz-patogenSalmonella TyphimuriumMycobacterium marinumlokalizacja wewnątrzkomórkowa
Zakażanie zarodków danio pręgowanego wewnątrzkomórkowymi patogenami bakteryjnymi
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.