Ogólnym celem tego filmu jest pokazanie, jak przeprowadzić celowaną iniekcję do siatkówki oraz elektroporację konstruktów DNA/RNA in ovo do siatkówki zarodka kurczaka w stadium 22-23 według skali Hamburgera i Hamiltona, co odpowiada około 4. dniu inkubacji (E4). Technika ta jest bardzo użyteczna w badaniu ekspresji genów, regulacji genów oraz zmian morfologicznych w rozwijającej się siatkówce kurczaka.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Elektroporacja in ovo siatkówki zarodka kurczaka
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Zarodek siatkówki kurczaka jest doskonałym narzędziem do badania rozwoju siatkówki u wyższych kręgowców. Ze względu na duże rozmiary i rozwój zewnętrzny, manipulacja zarodkową siatkówką kurczaka przy użyciu technologii rekombinowanego DNA/RNA jest stosunkowo łatwa. Elektroporacja konstruktów DNA/RNA do zarodkowej siatkówki daje ogromną przewagę w badaniu regulacji genów w komórkach macierzystych/progenitorowych siatkówki podczas jej rozwoju. Dzięki technice elektroporacji można przeprowadzać różne rodzaje testów, takie jak testy genów reporterowych, nadekspresja genów, wyciszanie genów (shRNA) itp. Niniejszy film prezentuje celowaną iniekcję do siatkówki oraz elektroporację in ovo zarodkowej siatkówki kurczaka w stadium 22-23 według skali Hamburgera i Hamiltona, co odpowiada około 4. dniu inkubacji (E4). Przedstawiamy tutaj szybką i wygodną technikę elektroporacji in ovo, w której plazmidowe DNA kodujące zielone białko fluorescencyjne (GFP) jako marker jest dostarczane bezpośrednio do podsiatkówkowej przestrzeni zarodka kurczaka, a następnie następują impulsy elektryczne ułatwiające pobieranie DNA przez komórki macierzyste/progenitorowe siatkówki. Nowa metoda iniekcji i elektroporacji siatkówki w dniu E4 umożliwia wizualizację wszystkich typów komórek siatkówki, w tym neuronów powstających w późniejszym etapie1, co było trudne przy zastosowaniu konwencjonalnej metody iniekcji i elektroporacji w dniu E1,52.
Protokół
Ponieważ niektóre części protokołu są wykonywane zgodnie z wcześniejszymi opisami w innych filmach JoVE2 oraz publikacjach3, z niewielkimi modyfikacjami, nie będziemy ich tutaj szczegółowo omawiać.
1. Obsługa jaj i przygotowanie igły
- Jaja można przechowywać w chłodziarce do wina w temperaturze około 13°C przez maksymalnie 1 tydzień. Jeśli temperatura będzie zbyt wysoka, zarodki zaczną rozwijać się anomalnie, natomiast niższa temperatura powoduje wysoką śmiertelność. Po przygotowaniu do inkubacji należy wyjąć jaja z chłodziarki i ustawić je pionowo, tępym końcem do góry. Przed umieszczeniem w inkubatorze o temperaturze 37,5°C należy pozostawić jaja w temperaturze pokojowej przez co najmniej 2 godziny.
- Inkubuj jaja przez 96-100 godzin, co odpowiada około 4. dobie embrionalnej, aby uzyskać zarodki w stadium 22 według skali Hamburgera i Hamiltona4-5.
- Przygotuj igły do mikropipety z wyciągniętych szklanych kapilar i odłam końcówkę za pomocą pęsety pod mikroskopem stereoskopowym, aby uzyskać otwór o średnicy około 0,1 μm i zwężeniu o długości 20 mm. Igły z większymi końcówkami mają trudności z przebiciem błony witelinowej, natomiast igły z mniejszymi końcówkami utrudniają pobieranie i podawanie roztworu DNA.
- Przymocuj igłę do strzykawki Hamilton Gastight o pojemności 0,1 ml zamontowanej na mikromanipulatorze. Do połączenia igły ze strzykawką użyj krótkiego odcinka silikonowej rurki Masterplex. Ze względu na szczelność połączeń nie ma potrzeby dodawania oleju mineralnego do uszczelnienia tego elementu.
- Wymieszaj na kawałku parafilmu 2 μl roztworu plazmidowego DNA reporterowego o stężeniu od 3-6 μg/μl oraz 0,2 μl barwnika fast green (0,025%). Barwnik fast green pomoże w wizualizacji iniekcji. Powoli pobierz mieszaninę do igły.
- Aby oddzielić błonę witelinową od błony wewnętrznej, delikatnie obróć jajo o około 180°, odczekaj kilka minut, a następnie obróć je z powrotem do pozycji wyjściowej i przygotuj do elektroporacji.
- Przetrzyj pęsetę i skorupkę jaja 70% etanolem, aby zapobiec infekcji zarodka.
- Za pomocą pęsety w rozmiarze AA wykonaj mały otwór w skorupce jaja bezpośrednio nad komorą powietrzną. Należy uważać, aby nie pęknęła skorupka. Usuwaj małe fragmenty jeden po drugim, aż powstanie małe okienko. Ostrożnie usuń błonę wewnętrzną za pomocą pęsety, nie dotykając błony witelinowej.
2. Iniekcja i elektroporacja
- Aby zapobiec uszkodzeniu mózgu lub serca, ustaw igłę po stronie przeciwległej do głównego pęczka naczyń krwionośnych wchodzących do oka, skierowaną w stronę dzioba.
- Przebij błonę witelinową, twardówkę, siatkówkę i ciało szkliste za pomocą gwałtownego, lekkiego pchnięcia igły. Jeśli igła przebije oko na wylot, nie powinno to stanowić problemu, chyba że dojdzie do uszkodzenia głównej żyły krwi.
- Powoli wycofaj igłę do krawędzi otworu i ustaw ją prawie stycznie do zewnętrznej ściany gałki ocznej.
- Wprowadź igłę do przestrzeni podsiatkówkowej między twardówką a siatkówką.
- Wstrzykuj DNA tak długo, aż zobaczysz zielony roztwór wypełniający bok gałki ocznej i wypychający siatkówkę do wewnątrz, tworząc wybrzuszenie.
- Jeśli umiejscowienie igły jest nieprawidłowe, roztwór DNA będzie rozprzestrzeniać się wewnątrz ciała szklistego, wypełniając środek gałki ocznej. Ponadto, w przypadku zbyt dużego uszkodzenia siatkówki, roztwór DNA będzie wypływać z gałki ocznej.
- Powoli wyjmij igłę i natychmiast umieść elektrody równolegle wewnątrz jaja po uprzednim namoczeniu ich w PBS. Wsuń elektrody tak, aby zanurzyły się w płynie owodniowym w taki sposób, by wstrzyknięte oko znajdowało się pomiędzy nimi. Podczas umieszczania elektrod unikaj dotykania głównych naczyń krwionośnych lub serca. Elektroda ujemna powinna znajdować się po stronie wstrzyknięcia, aby DNA mogło być transportowane z przestrzeni podsiatkówkowej do siatkówki w kierunku elektrody dodatniej. Przeprowadź elektroporację siatkówki, stosując 5 impulsów o napięciu 15V przez 50 ms w odstępach 950 ms.
- Ostrożnie wyjmij elektrody i uszczelnij okno w jaju za pomocą kawałków przezroczystej taśmy klejącej.
- Oznacz i datuj wstrzyknięte jajo przed umieszczeniem go z powrotem w inkubatorze. Zazwyczaj cały proces elektroporacji trwa od 3 do 5 minut.
- Ekspresja GFP może być widoczna już 8 godzin po elektroporacji. Można jednak poczekać, aż zarodek osiągnie pożądany stopień rozwoju przed pobraniem materiału.
3. Reprezentatywne wyniki
W naszym badaniu wykorzystujemy różne konstrukty plazmidowe do analizy regulacji ekspresji genów zaangażowanych w rozwój komórek siatkówki. W tym filmie użyto pCAG-GFP (kontrola transfekcji) w celu potwierdzenia prawidłowości wstrzyknięcia i elektroporacji. Można jednak zastosować dowolny konstrukt plazmidowy z genem reporterowym (GFP, RFP itp.). Pomimo że ekspresja GFP może być widoczna już 8 godzin po elektroporacji, zazwyczaj rozpoczynamy pobieranie zarodków w 6. dniu (E6) i później. Elektroporowane siatkówki wypreparowano z zarodka i przeanalizowano pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym przed zatopieniem i sekcjonowaniem. Po udanej elektroporacji ekspresja genu reporterowego jest zazwyczaj widoczna w co najmniej jednej czwartej siatkówki (Rys. 1). Transfekowane tkanki siatkówki poddano dalszej analizie poprzez sekcjonowanie w celu wyraźnej wizualizacji morfologii komórek. Immunohistochemia z zastosowaniem markerów specyficznych dla typów komórek (Brn3a, Pax6 itp.) pozwoliła na charakteryzację specyficznej dla komórek ekspresji GFP (Rys. 2).
Rysunek 1. Pomyślna elektroporacja plazmidu raportowego skutkuje pozytywną ekspresją GFP. Siatkówki embrionów kurzych zostały poddane iniekcji i elektroporacji w 4. dniu inkubacji, a następnie pobrano je w 6. dniu inkubacji. Pomyślnie przetransfekowano co najmniej 25% siatkówki (A=widok z góry, B=widok z dołu). Pasek skali = 1mm.
Rysunek 2. Charakterystyka komórek siatkówki wykazujących ekspresję GFP z wykorzystaniem immunohistochemii. Tkanki siatkówki wykazujące ekspresję GFP w stadium E7 zostały utrwalone i poddane sekcjonowaniu. Następnie przekroje te zabarwiono różnymi markerami swoistymi dla komórek. Do identyfikacji komórek zwojowych użyto Brn3a (A), natomiast do identyfikacji komórek poziomych, amakrynowych i zwojowych użyto Pax6 (B). Pasek skali = 50 μm.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Celowane wstrzyknięcie do siatkówki oraz elektroporacja in ovo w embrionalnej siatkówce w stadium E4 pozwalają na specyficzne ukierunkowanie na komórki progenitorowe siatkówki, co umożliwia wizualizację wszystkich sześciu głównych typów komórek siatkówki na poziomie pojedynczych komórek. Elektroporacja in ovo w stadium HH10 (~E1.5) ukierunkowana na pęcherzyk optyczny pozwala na transfekcję komórek, z których rozwija się oko. Jednakże komórki te charakteryzują się w tym czasie bardzo wysoką rotacją, a me...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Facilities Committee na Uniwersytecie Rutgers.
Podziękowania
Pragniemy podziękować panu Maazowi Enverowi za udostępnienie kamery HD (Cannon VIXIA HFS100). Praca ta była częściowo wspierana przez granty z NIH (EY018738), New Jersey Commission on Spinal Cord Research (08-3074-SCR-E-0 oraz 10-3091-SCR-E-0) oraz Busch Biomedical Research Award.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Zapłodnione jaja kurcząt rasy White Leghorn wolne od patogenów (SPF) | Sunrise Farms (Catskill, NY) | ||
| Inkubator do jaj kurzych | GQF Manufacturing | Model-1550 | Ustawiony na 60% wilgotności i 37,5°C. |
| Szklane kapilary | World Precision Instruments, Inc. | TW150F-4 | |
| Strzykawka 0,1 ml | Hamilton Co | Gastight 1710 | Alternatywnie można użyć strzykawki 1 ml |
| Silikonowy (nadtlenkowy) przewód Masterflex | Cole-Parmer | HV-96400-13 | Odciąć mały fragment (1 cm) do przymocowania szklanej igły do strzykawki |
| Pinceta | Dumont | AA | |
| Mikromanipulator | World Precision Instruments, Inc. | M3301-M3 | |
| Plazmidowe DNA | pCAG-GFP zostało udostępnione przez dr Connie Cepko | ||
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252 | Rozcieńczyć do 0,025% w PBS |
| Generator impulsów | Harvard Apparatus | BTX ECM 830 | Generator fali prostokątnej |
| Elektrody | Harvard Apparatus | BTX model 514 | Elektrody były rozmieszczone w odstępach 3-5 mm |
| Monochromatyczny aparat cyfrowy | Carl Zeiss, Inc. | Axiocam MRM | |
| Fluorescencyjny mikroskop sekcyjny | Leica Microsystems | Leica MZ16FA | |
| Pionowy mikroskop fluorescencyjny | Carl Zeiss, Inc. | Zeiss Axio Imager A1 |
Bibliografia
- Doh, S. T. Analysis of retinal cell development in chick embryo by immunohistochemistry and in ovo electroporation techniques. BMC. Dev. Biol. 10, (2010).
- Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos. J. Vis. Exp. (9), e408-e408 (2007).
- Nakamura, H., Funahashi, J. Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation. Methods. 24, 43-48 (2001).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Dev. Dyn.. 195, 231-272 (1992).
- Hamburger, V. The stage series of the chick embryo. Dev. Dyn. 195, 273-275 (1992).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
