Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Metody oceny zachowania Drosophila

45K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/3795

⸱

7 marca 2012

 ,  , 
1Department of Pharmacology and Experimental Therapeutics, Louisiana State University Health Sciences Center, 2Department of Genetics, Louisiana State University Health Sciences Center

W tym artykule

Podsumowanie

Drosophila melanogaster to genetycznie i behawioralnie podatny system modelowy, który od ponad wieku jest wykorzystywany do zrozumienia molekularnych i komórkowych podstaw wielu ważnych procesów biologicznych 1. Drosophila została szeroko wykorzystana w celu uzyskania wglądu w genetyczne podstawy zachowania much.

Streszczenie

Drosophila melanogaster, muszka owocowa, jest wykorzystywana do badania mechanizmów molekularnych szerokiej gamy ludzkich schorzeń, takich jak nowotwory, choroby układu sercowo-naczyniowego oraz różne choroby neurologiczne1. Zoptymalizowaliśmy proste i niezawodne testy behawioralne służące do określania lokomocji larw, zdolności wspinania się osobników dorosłych (test RING) oraz zachowań godowych Drosophila. Testy behawioralne te znajdują szerokie zastosowanie w badaniu wpływu czynników genetycznych i środowiskowych na zachowanie much. Zdolność pełzania larw może być wiarygodnie wykorzystana do określania wczesnych zmian w sprawności ruchowej larw Drosophila, a także do badania wpływu leków lub genów chorób ludzkich (u much transgenicznych) na ich lokomocję. Test pełzania larw staje się szczególnie przydatny, gdy ekspresja lub usunięcie genu powoduje letalność w stadium poczwarki lub osobnika dorosłego, ponieważ muchy te nie dożywają wieku dorosłego, w którym mogłyby zostać poddane ocenie. Ten podstawowy test może być również stosowany w połączeniu z silnym światłem lub stresem, aby zbadać dodatkowe reakcje behawioralne larw Drosophila. Zachowania godowe są szeroko wykorzystywane do badania genetycznych podstaw zachowań seksualnych, a mogą być również stosowane do badania aktywności i koordynacji, a także uczenia się i pamięci. Zachowania godowe Drosophila obejmują wymianę różnorodnych bodźców sensorycznych, w tym sygnałów wizualnych, słuchowych i chemosensorycznych między samcami a samicami, co prowadzi do złożonej serii dobrze scharakteryzowanych zachowań motorycznych kulminujących w udanej kopulacji. Tradycyjne testy wspinania się osobników dorosłych (geotaksja ujemna) są żmudne, pracochłonne i czasochłonne, wykazując znaczną zmienność między poszczególnymi próbami2-4. Szybki iteracyjny test geotaksji ujemnej (RING)5 posiada wiele zalet w porównaniu do powszechniej stosowanych protokołów, zapewniając powtarzalne, czułe i wysokoprzepustowe podejście do ilościowego określania lokomocji osobników dorosłych oraz zachowań geotaksji ujemnej. W teście RING można jednocześnie badać kilka genotypów lub terapii lekowych z wykorzystaniem dużej liczby zwierząt, a podejście wysokoprzepustowe sprawia, że jest on bardziej odpowiedni do eksperymentów przesiewowych.

Protokół

1. Test pełzania larw

1. Zbieranie larw

  1. Przygotuj butelkę o pojemności 8 uncji z muchami (10-15 samców + 10-15 samic).
  2. Pozostaw muchy do składania jaj przez 24 godziny, a następnie usuń dorosłe osobniki z butelki. (Przenieś dorosłe muchy do nowej butelki i powtórz czynność w razie potrzeby).
  3. Inkubuj butelkę przez 3-4 dni lub do momentu pojawienia się larw w trzecim stadium rozwojowym.
  4. Do butelki z larwami dodaj 50 - 100 ml 20% sacharozy i odstaw na 20 minut. Larwy wypłyną na powierzchnię.
  5. Zbierz larwy za pomocą pipety serologicznej o pojemności 25 ml z odciętym końcem i umieść je w koszyku z siatki.
  6. Przemyj larwy w koszyku dwukrotnie dejonizowaną wodą H2O. Larwy są teraz gotowe do eksperymentów.

2. W celu podania leku larwom

  1. Za pomocą pędzla przenieś odpowiednią liczbę larw do zlewki o pojemności 5 ml zawierającej roztwór 5% sacharozy z dodatkiem leku.
  2. Pozostaw larwy do żerowania przez co najmniej 15 minut.
  3. Przelej larwy poddane działaniu leku do koszyka z siatki i przepłucz. Są one teraz gotowe do użycia.

3. Test lokomocyjny (pomiar całkowitego przebytego dystansu lub skurczów ścian ciała)

  1. Za pomocą pędzla przenieś poszczególne larwy do:
    1. 15 cm szalki Petriego zawierającej 2% agarozę (wcześniej wlanej i zestalonej) umieszczonej na papierze milimetrowym z siatką 0,2 cm2.
      1. Policz liczbę przekroczonych linii siatki w ciągu 1 minuty.
    2. dołka szklanej korytka sekcyjnego zawierającego rozcieńczony roztwór pasty drożdżowej.
      1. Policz skurcze perystaltyczne (pełny ruch z przedniej do tylnej części ciała = 1 skurcz) w ciągu jednej minuty, obserwując larwę pod stereomikroskopem.
  2. Powtarzaj procedurę, aż zostanie policzona pożądana liczba larw.

2. Protokół szybkiego iteracyjnego negatywnego geotaksji (RING)

Analiza ta została pierwotnie opisana przez Gargano et al5.

  1. Zebrać nowo wylęgłe dorosłe męskie muchy pod lekką anestezją CO2 i umieścić je w standardowej fiolce zawierającej pożywkę (lub pożywkę + lek).
  2. Utrzymywać muchy w temperaturze pokojowej (na blacie, ~22 °C) przez 2-3 dni, aby umożliwić regenerację po CO2 (oraz osiągnięcie stanu stacjonarnego stężenia leku, jeśli dotyczy).
  3. Przenieść około 25 much bez podawania anestezji do przygotowanych fiolek polistyrenowych.
  4. Zamocować fiolki z muchami w aparaturze RING (Rysunek 1).
  5. Pozostawić muchy w spokoju na 15-20 minut, aby zaadaptowały się do środowiska.
  6. W tym czasie umieścić aparat cyfrowy w odległości ~1 m przed aparaturą (na platformie, jeśli jest to konieczne, aby wyrównać środek obiektywu z połową wysokości fiolek), ustawić ostrość i zoom aparatu na aparaturę oraz ustawić czasomierz na 3,0 sekundy.
  7. Ostrożnie chwycić aparaturę RING lewą ręką, tak aby nie płoszyć much, a w prawej ręce trzymać czasomierz.
  8. Trzykrotnie energicznie uderzyć aparaturą o powierzchnię blatu, upewniając się, że uderzenie jest wystarczająco silne, aby wszystkie muchy spadły na dno fiolek.
  9. Jednocześnie z zakończeniem trzeciego uderzenia uruchomić 3-sekundowe odliczanie czasomierza.
  10. Po trzech sekundach wykonać zdjęcie.
  11. Zresetować czasomierz na 1 minutę i uruchomić. W tym czasie zresetować aparat, ustawić ostrość na aparaturze oraz ustawić kolejny kanał czasomierza na trzy sekundy.
  12. Po 1 minucie powtórzyć kroki 1.7-1.10.
  13. Po wykonaniu łącznie 5-6 prób przesłać obrazy na komputer i za pomocą preferowanej przeglądarki obrazów otworzyć je oraz ocenić średnią wysokość wspinaczki dla każdej fiolki.
  14. Przeprowadzić analizę statystyczną dla różnych grup, porównując średnią wysokość wspinaczki.

3. Test zalotów i kopulacji

  1. Pierwszą czynnością rano jest przygotowanie butelek z rozwiniętymi muchami, które będą wykorzystane w doświadczeniu.
  2. W ciągu dnia (co 3-4 godziny) należy zbierać nowo wyklute, naiwne seksualnie samce i samice:
    1. Samce należy umieszczać pojedynczo w probówkach z podłożem.
    2. Samice należy umieszczać po 5-6 osobników w jednej probówce.
    3. Zebrane muchy należy izolować w temperaturze 25 °C przy cyklu światła i ciemności 12 hr przez 5 dni.
    4. Przenieść jedną samicę do komory koła kopulacyjnego.
    5. Przenieść jednego samca do komory koła kopulacyjnego.
    6. Obserwować parę pod mikroskopem stereoskopowym pod kątem następujących zachowań:
      1. Orientacja (samiec orientuje się w stronę samicy)
      2. Stukanie (samiec stuka w samicę)
      3. Pieśń skrzydłowa (samiec rozpościera i wibruje jednym skrzydłem)
      4. Lizanie (samiec liże genitalia samicy)
      5. Podwijanie (samiec podwija odwłok pod siebie)
      6. Próba kopulacji (aktywność podwijania podczas próby wejścia na samicę)
  3. Obserwację prowadzić przez 10 minut lub do momentu udanej kopulacji, odnotowując czas wystąpienia każdego zachowania (latencja), całkowity czas poświęcony na zachowania godowe do momentu kopulacji (w celu obliczenia indeksu zalotów) oraz liczbę par, które z sukcesem wykonały dane zachowanie (częstotliwość). 100% par typu dzikiego zazwyczaj kopuluje w ciągu 5 minut.
  4. Obliczyć indeks zalotów (CI), dzieląc czas spędzony na zalotach przez całkowity czas do momentu kopulacji. Dla par typu dzikiego wartość ta zazwyczaj mieści się w przedziale 0,6-0,8.

4. Reprezentatywne wyniki

Test pełzania

Normalne larwy typu dzikiego poruszają się z prędkością ~3 cm/minutę i wykazują ~40-50 skurczów ściany ciała w ciągu jednej minuty. Opracowaliśmy niedawno model Drosophila dla stwardnienia zanikowego bocznego związanego z FUS/TLS, który wykazuje defekt pełzania larw, skróconą długość życia oraz upośledzenie zdolności wspinania się osobników dorosłych6. Skierowaliśmy ekspresję form dzikich i zmutowanych FUS/TLS do neuronów ruchowych (driver OK-371-gal4) i przeprowadziliśmy test pełzania larw. Jak pokazano poniżej, larwy typu dzikiego pełzają do 12 cm, podczas gdy ekspresja dzikiego typu FUS zmniejszyła zdolność pełzania larw do około 6 cm. Zwierzęta wykazujące mutację R521C w FUS/TLS, powodującą ALS, wykazują bardzo silne upośledzenie ruchu pełzania (Rysunek 1), pełzając z prędkością zaledwie około 1 cm/minutę.

Test RING oceniający negatywny geotaksyz

Młode dorosłe muchy typu dzikiego powinny osiągać średnią wysokość wspinania wynoszącą ~4-5 cm w czasie 3 sekund (czas ten można zmodyfikować z 3 sekund, aby dostosować go do różnych szczepów lub poziomów aktywności, w celu zdefiniowania średniej wysokości dla danego szczepu/obróbki). Muchom, które pozostają na dnie, przypisuje się wartość 0. Nie zaleca się używania więcej niż 25 much na probówkę, ponieważ utrudnia to określenie położenia każdej poszczególnej muchy w celu pomiaru wysokości. Nie zaobserwowano desensytyzacji przy zastosowaniu do 6 kolejnych prób w odstępach 1 minuty. Kluczowe jest, aby NIE używać ponownie polistyrenowych probówek testowych w tym teście po zebraniu pierwszych zestawów danych, ponieważ nowe muchy umieszczone w używanych probówkach nie będą wspinać się w takim stopniu, jak w świeżych probówkach.

Schemat i zdjęcie układu do wirowania z probówkami, skalą i kamerą do sedymentacji cząstek.
Rysunek 1. Układ do analizy RING. Aparat cyfrowy umieszczono w odległości ~1 m przed aparaturą zawierającą muchy w probówkach polistyrenowych; należy ustawić ostrość i zoom aparatu na aparaturę oraz ustawić czas naświetlania na 3,0 sekundy.

Wykres słupkowy porównujący aktywność lokomocyjną; Driver Alone vs. UAS-FUS WT/R521C; wynik eksperymentalny.

Rysunek 2. Reprezentatywne dane z testu pełzania larw much ektopowo eksponujących UAS-FUS WT oraz UAS-FUS R521C pod kontrolą promotora neuronów ruchowych (OK371-gal4).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Drosophila zachowanie jest ściśle regulowane przez czynniki genetyczne i środowiskowe. My oraz inni badacze wykorzystaliśmy wcześniej opisane tutaj testy do gromadzenia danych w celu zbadania genów związanych z zachowaniem muszek oraz chorób neurodegeneracyjnych człowieka modelowanych u Drosophila5-19. W przypadku testu pełzania krytycznym krokiem jest staranny dobór larw w 3rd stadium rozwojowym. Jeśli stosowany jest lek, osiągnięcie maksymalnego efektu przy dobrej rozpuszczalnośc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie mamy nic do ujawnienia.

Podziękowania

Pragniemy podziękować Astha Maltare za zgromadzenie danych dotyczących pełzania larw. Dziękujemy dr. Nicholasowi Lansonowi Jr. za uwagi do manuskryptu. Praca ta była wspierana przez Robert Packard Center for ALS at Johns Hopkins (dla UBP) oraz Amyotrophic Lateral Sclerosis Association (UBP); a także przez grant R01MH083689 z National Institutes of Mental Health (CDN).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
SacharozaFisher ScientificS5-500
AgarozaInvitrogen16500-500
Butelka do Drosophila 6 ozGenesee Scientific32-130
Pędzel malarski (#1)Ted Pella, Inc.11859
Mączka kukurydzianaFisher ScientificNC9109741
AgarGenesee Scientific66-104
MelasaFisher ScientificNC9349176
Kwas propionowyAcros Organics14930-0010
TegoseptApex20-258
EtanolFisher ScientificBP2818-4
DrożdżeGenesee Scientific62-107

Bibliografia

  1. Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacol. Rev. 63 (2), 411-436 (2011).
  2. Feany, M. B., Bender, W. W. A Drosophila model of Parkinson's disease. Nature Mar. 23 (6776), 394-398 (2000).
  3. Auluck, P. K., Bonini, N. M. Pharmacological prevention of Parkinson disease in Drosophila. Nat. Med. 8 (11), 1185-1186 (2000).
  4. Whitworth, A. J., Theodore, D. A., Greene, J. C., Benes, H., Wes, P. D., Pallanck, L. J. Increased glutathione Stransferase activity rescues dopaminergic neuron loss in a Drosophila model of Parkinson's disease. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (22), 8024-8029 (2005).
  5. Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Exp. Gerontol. 40 (5), 386-395 (2005).
  6. Lanson, N. A., Maltare, A., King, H., Smith, R., Kim, J. H., Taylor, J. P., Lloyd, T. E., Pandey, U. B. A Drosophila model of FUS-related neurodegeneration reveals genetic interaction between FUS and TDP-43. Hum. Mol. Genet. 20 (13), 2510-2523 (2011).
  7. Batlevi, Y., Martin, D. N., Pandey, U. B., Simon, C. R., Powers, C. M., Taylor, J. P., Baehrecke, E. H. Dynein light chain 1 is required for autophagy, protein clearance, and cell death in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (2), 742-747 (2010).
  8. Sang, T. K., Chang, H. Y., Lawless, G. M., Ratnaparkhi, A., Mee, L., Ackerson, L. C., Maidment, N. T., Krantz, D. E., Jackson, G. R. A Drosophila model of mutant human parkin-induced toxicity demonstrates selective loss of dopaminergic neurons and dependence on cellular dopamine. J. Neurosci. 27 (5), 981-992 (2007).
  9. Stacey, S. M., Muraro, N. I., Peco, E., Labbé, A., Thomas, G. B., Baines, R. A., van Meyel, D. J. Drosophila glial glutamate transporter Eaat1 is regulated by fringe-mediated notch signaling and is essential for larval locomotion. J. Neurosci. 30 (43), 14446-14457 (2010).
  10. Repnikova, E., Koles, K., Nakamura, M., Pitts, J., Li, H., Ambavane, A., Zoran, M. J., Panin, V. M. Sialyltransferase regulates nervous system function in Drosophila. J. Neurosci. 30 (18), 6466-6476 (2010).
  11. Repnikova, E., Koles, K., Nakamura, M., Pitts, J., Li, H., Ambavane, A., Zoran, M. J., Panin, V. M. Sialyltransferase regulates nervous system function in Drosophila. J. Neurosci. 30 (18), 6466-6476 (2010).
  12. Nedelsky, N. B., Pennuto, M., Smith, R. B., Palazzolo, I., Moore, J., Nie, Z., Neale, G., Taylor, J. P. Native functions of the androgen receptor are essential to pathogenesis in a Drosophila model of spinobulbar muscular atrophy. Neuron. 67 (6), 936-952 (2010).
  13. Lorenzo, D. N., Li, M. G., Mische, S. E., Armbrust, K. R., Ranum, L. P., Hays, T. S. Spectrin mutations that cause spinocerebellar ataxia type 5 impair axonal transport and induce neurodegeneration in Drosophila. J. Cell Biol. 189 (1), 143-158 (2010).
  14. Wang, J. W., Brent, J. R., Tomlinson, A., Shneider, N. A., McCabe, B. D. The ALS-associated proteins FUS and TDP-43 function together to affect Drosophila locomotion and life span. J. Clin. Invest. , (2011).
  15. Choi, J. K., Jeon, Y. C., Lee, D. W., Oh, J. M., Lee, H. P., Jeong, B. H., Carp, R. I., Koh, Y. H., Kim, Y. S. A Drosophila model of GSS syndrome suggests defects in active zones are responsible for pathogenesis of GSS syndrome. Hum. Mol. Genet. 19 (22), 4474-4489 (2010).
  16. Ruan, H., Wu, C. F. Social interaction-mediated lifespan extension of Drosophila Cu/Zn superoxide dismutase mutants. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (21), (2008).
  17. Slawson, J. B., Kim, E. Z., Griffith, L. C. High-resolution video tracking of locomotion in adult Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (24), (2009).
  18. Becnel, J., Johnson, O., Luo, J., Nässel, D. R., Nichols, C. D. The serotonin 5-HT7 Dro receptor is expressed in the brain of Drosophila, and is essential for normal courtship and mating. PLoS One. 6 (6), e20800(2011).
  19. Johnson, O., Becnel, J., Nichols, C. D. Serotonin 5-HT(2) and 5-HT(1A)-like receptors differentially modulate aggressive behaviors in Drosophila melanoga- ster. Neuroscience. 158 (2), 1292-1300 (2009).
  20. Bastock, M., Manning, A. The Courtship of Drosophila Melanogaster. Behaviour. , 85-111 (1955).
  21. Greenspan, R. J., Ferveur, J. F. Courtship in Drosophila. Annu. Rev. Genet. 34, 205-232 (2000).
  22. Villella, A., Hall, J. C. Neurogenetics of courtship and mating in Drosophila. Adv. Genet. 62, 67-184 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Test pe zania larwTest RINGTest zalot wNegatywna geotaksjaAnaliza funkcji motorycznychCzynniki genetyczneCzynniki rodowiskoweEfekty leczenia farmakologicznegoLokomocja much
Metody oceny zachowania Drosophila
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.