Artykuł metodologiczny

Metody oceny zachowania Drosophila

DOI:

10.3791/3795

⸱

7 marca 2012

 ,  , 
1Department of Pharmacology and Experimental Therapeutics, Louisiana State University Health Sciences Center, 2Department of Genetics, Louisiana State University Health Sciences Center

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Drosophila melanogaster to genetycznie i behawioralnie zarządzalny system modelowy, który od ponad stu lat służy do zrozumienia molekularnych i komórkowych podstaw wielu ważnych procesów biologicznych 1. Drosophila została dobrze wykorzystana do uzyskania wglądu w genetyczne podstawy zachowania much.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Drosophila melanogaster, muszka owocowa, była używana do badania mechanizmów molekularnych szerokiego zakresu chorób ludzkich, takich jak rak, choroby układu krążenia i różne choroby neurologiczne1. Zoptymalizowaliśmy proste i solidne testy behawioralne do określania lokomocji larw, zdolności wspinania się dorosłych osobników (test RING) i zachowań godowych Drosophila. Te testy behawioralne mają szerokie zastosowanie w badaniu roli czynników genetycznych i środowiskowych w zachowaniu much. Zdolność raczkowania larw może być niezawodnie wykorzystana do określenia wczesnych zmian w zdolnościach raczkowania larw Drosophila, a także do badania wpływu leków lub genów chorób ludzkich (u muszek transgenicznych) na ich lokomocję. Test pełzania larw staje się bardziej odpowiedni, jeśli ekspresja lub zniesienie genu powoduje śmiertelność w stadium poczwarkowym lub dorosłym, ponieważ muchy te nie przeżywają do dorosłości, gdzie w przeciwnym razie można by je ocenić. Ten podstawowy test może być również stosowany w połączeniu z jasnym światłem lub stresem w celu zbadania dodatkowych reakcji behawioralnych u larw Drosophila. Zachowania związane z zalotami są szeroko stosowane do badania genetycznych podstaw zachowań seksualnych, a także mogą być wykorzystywane do badania aktywności i koordynacji, a także uczenia się i pamięci. Zachowanie godowe Drosophila obejmuje wymianę różnych bodźców sensorycznych, w tym sygnałów wzrokowych, słuchowych i chemosensorycznych między samcami i samicami, które prowadzą do złożonej serii dobrze scharakteryzowanych zachowań motorycznych, których kulminacją jest udana kopulacja. Tradycyjne testy wspinaczkowe dla dorosłych (geotaksja ujemna) są żmudne, pracochłonne i czasochłonne, ze znacznymi różnicami między różnymi próbami2-4. Test szybkiej iteracyjnej geotaksji ujemnej (RING)5 ma wiele zalet w porównaniu z szerzej stosowanymi protokołami, zapewniając powtarzalne, czułe i wysokoprzepustowe podejście do ilościowego określania zachowań lokomotorycznych i negatywnych geotaksji dorosłych. W teście RING można jednocześnie testować kilka genotypów lub terapii lekowych na dużej liczbie zwierząt, przy czym podejście wysokoprzepustowe sprawia, że jest ono bardziej podatne na eksperymenty przesiewowe.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Test pełzania larw

1. Kolekcja larw

  1. Ustaw 8-uncjową butelkę much (10-15 samców + 10-15 samic).
  2. Pozwól muchom złożyć jaja przez 24 godziny, a następnie wyczyść butelkę much. (Przenieś dorosłe osobniki do nowej butelki i powtórz w razie potrzeby).
  3. Inkubuj butelkę przez 3-4 dni lub do momentu, gdy pojawią się larwy trzeciego stadium rozwojowego.
  4. Dodaj 50 - 100 ml 20% sacharozy do butelki z larwami i odstaw na 20 minut. Larwy będą unosić się na górze.
  5. Zebrać larwy za pomocą pipety serologicznej o pojemności 25 ml z odciętą końcówką i umieścić w siatkowym koszu.
  6. Umyj larwy w siatkowym koszu dwa razy dejonizowanymH2O. Larwy są teraz gotowe do eksperymentów.

2. Leczenie larw za pomocą leku

  1. Za pomocą pędzla przetransportuj żądaną liczbę larw do zlewki o pojemności 5 ml zawierającej roztwór 5% sacharozy + lek.
  2. Pozwól larwom żerować przez co najmniej 15 minut.
  3. Wlej larwy leczone lekiem do siatkowego kosza i spłucz. Są teraz gotowe do użycia.

3. Test lokomotoryczny (mierzący całkowitą przebytą odległość lub skurcze ścian ciała)

  1. Użyj pędzla, aby przetransportować pojedynczą larwę do:
    1. 15 cm szalka Petriego zawierająca 2% agarozy (uprzednio wylana i pozostawiona do stwardnienia) na papierze milimetrowym z siatką 0,2cm2.
      1. Policz liczbę linii siatki przekroczonych w ciągu 1 minuty.
    2. Studzienka szklanego naczynia rozwarstwiającego zawierającego rozcieńczony roztwór pasty drożdżowej.
      1. Policz skurcze perystaltyki jelit (pełny ruch od przodu do tyłu = 1 skurcz) w ciągu jednej minuty podczas obserwacji pod mikroskopem preparacyjnym.
  2. Powtarzaj, aż pożądana liczba larw zostanie policzona.

2. Protokół szybkiej iteracyjnej negatywnej geotaksji (RING)

Ten test został pierwotnie opisany przez Gargano et al5.

  1. Zebrać nowo pojawiające się dorosłe samce much pod lekkim znieczuleniem CO2 i umieścić w standardowej fiolce zawierającej pokarm (lub pokarm + lek).
  2. Utrzymuj muchy w temperaturze pokojowej (na blacie ławki. ~22 °C) przez 2-3 dni, aby umożliwić regenerację z CO2 (i akumulację poziomów leku w stanie ustalonym, jeśli to konieczne).
  3. Przenieś około 25 much bez znieczulenia do przygotowanych fiolek z polistyrenu.
  4. Złożyć fiolki z muchami w aparacie RING (Rysunek 1).
  5. Pozwól muchom zaaklimatyzować się w środowisku w spokoju przez 15-20 minut.
  6. W tym czasie umieść kamerę cyfrową ~1 m przed aparatem (na platformie, jeśli to konieczne, aby wyrównać środek obiektywu w połowie wysokości fiolek), ustaw ostrość i przybliż kamerę na aparacie, a następnie ustaw timer na 3.0 sekundy.
  7. Ostrożnie chwyć aparat RING lewą ręką, aby nie przeszkadzać muchom, a prawą ręką trzymaj timer.
  8. Ostro postukaj aparatem o powierzchnię stołu trzy razy, upewniając się, że kran jest wystarczająco twardy, aby strącić wszystkie muchy na dno fiolek.
  9. Równocześnie z zakończeniem trzeciego stuknięcia, uruchom 3-sekundowy stoper odliczający.
  10. Za trzy sekundy zrób zdjęcie.
  11. Zresetuj timer na 1 minutę i uruchom. W tym czasie zresetuj aparat i skup się na aparacie, a następnie ustaw inny kanał timera na trzy sekundy.
  12. Po 1 minucie powtórz kroki 1.7-1.10
  13. Po sumie 5-6 prób prześlij obrazy na komputer i użyj swojej ulubionej przeglądarki obrazów, aby otworzyć i ocenić średnią wysokość, jaką pokonano dla każdej fiolki.
  14. Przeprowadź analizę statystyczną na różnych grupach, porównując średnią pokonaną wysokość.

3. Zaloty i próba krycia

  1. Pierwszą rzeczą z samego rana są czyste, dobrze produkujące butelki much, które należy użyć.
  2. W ciągu dnia (co 3-4 godziny) zbieraj nowo powstałe niedojrzałe seksualnie samce i samice:
    1. Umieścić samce pojedynczo w fiolkach lub probówkach z podłożem.
    2. Umieścić 5-6 samic razem w fiolce/probówce.
    3. Izolować zebrane muchy w temperaturze 25 °C w świetle / ciemności przez 12 godzin przez 5 dni.
    4. Przenieś jedną samicę do komory koła współpracującego.
    5. Przenieś jednego samca do komory koła współpracującego.
    6. Obserwuj parę pod mikroskopem preparacyjnym pod kątem następujących zachowań:
      1. Orientacja (samiec orientuje się w kierunku samicy)
      2. Stukanie (samiec stuka samicę)
      3. Pieśń skrzydeł (samiec wysuwa i wibruje jedno skrzydło)
      4. Lizanie (samiec liże żeńskie genitalia)
      5. Curling (samiec zwija brzuch pod sobą)
      6. Próba kopulacji (aktywność curlingu podczas próby dosiadania samicy)
  3. Obserwuj przez 10 minut lub do udanej kopulacji, odnotowując czas, w którym występuje każde zachowanie (opóźnienie), całkowity czas trwania zalotów do kopulacji (w celu obliczenia wskaźnika zalotów), a także liczbę par, które z powodzeniem wykonują dane zachowanie (częstotliwość). 100% par typu dzikiego na ogół łączy się w pary w ciągu 5 minut.
  4. Oblicz wskaźnik zalotów (CI), dzieląc czas spędzony w zalotach podzielony przez całkowity czas do kopulacji. W przypadku par typu wild zwykle waha się to między 0,6-0,8.

4. Reprezentatywne wyniki

Test pełzania

Normalna larwa typu dzikiego będzie wędrować ~3 cm/minutę i wykazywać ~40-50 skurczów ścian ciała w ciągu jednej minuty. Niedawno opracowaliśmy model Drosophila stwardnienia zanikowego bocznego związanego z FUS/TLS, który wykazuje wadę pełzania larw, skrócenie długości życia i upośledzenie wspinaczki w wieku dorosłym6. Ukierunkowaliśmy ekspresję typu dzikiego i zmutowanych form FUS / TLS na neurony ruchowe (sterownik OK-371-gal4) i przeprowadziliśmy test pełzania larw. Jak pokazano poniżej, larwy typu dzikiego pełzają do 12 cm, podczas gdy ekspresja dzikiego typu FUS zmniejszyła zdolność raczkowania larw do około 6 cm. Zwierzęta wykazujące ekspresję mutacji R521C powodującej ALS w FUS / TLS wykazują bardzo poważne upośledzenie w poruszaniu się pełzania (ryc. 1), pełzając tylko około 1 cm / minutę.

Negatywny test geotaksji RING

Młode dorosłe muchy dzikiego typu powinny mieć średnią wysokość wspinania się ~4-5 cm w ciągu 3 sekund (czas można dostosować od 3 sekund, aby dostosować się do różnych szczepów lub poziomów aktywności, aby określić daną średnią wysokość dla danego szczepu/zabiegu). Muchy, które pozostają na dole, mają przypisaną wartość 0. Nie zaleca się używania więcej niż 25 much na fiolkę, ponieważ wtedy trudno jest określić lokalizację każdej pojedynczej muchy w celu zmierzenia wysokości. Nie zaobserwowano odczulania w maksymalnie 6 kolejnych badaniach w odstępie 1 minuty, które zastosowaliśmy. Bardzo ważne jest, aby NIE używać ponownie fiolek testowych z polistyrenu w tym teście po zebraniu początkowych zestawów danych, ponieważ nowe muchy umieszczone w zużytych fiolkach nie będą wspinać się w takim samym stopniu, jak w świeżych fiolkach.

figure-protocol-1
Rysunek 1. Konfiguracja do testu RING. Aparat cyfrowy umieszcza się w odległości ~1 m przed aparatem zawierającym muchy w fiolkach z polistyrenu; ustawić ostrość i przybliżyć kamerę na urządzeniu; i ustaw timer na 3,0 sekundy.

figure-protocol-2

Rysunek 2. Reprezentatywne dane z testu pełzania larw przy użyciu much ekstopowo eksprymujących UAS-FUS WT i UAS-FUS R521C pod kontrolą sterownika neuronu ruchowego (OK371-gal4).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zachowanie Drosophila jest ściśle regulowane przez czynniki genetyczne i środowiskowe. My i inni wcześniej używaliśmy opisanych tutaj testów do zbierania danych do zbadania genów związanych z zachowaniem much i ludzkimi chorobami neurodegeneracyjnymi modelowanymi u Drosophila5-19. W przypadku testu pełzania kluczowym krokiem jest staranna selekcja larw w 3. stadium rozwojowym. W przypadku leczenia lekiem zajmie to 10-15 minut (lub więcej w zależności od rodzaju i charakteru leku), ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie mamy nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować Astha Maltare za wygenerowanie danych o pełzaniu larw. Chcielibyśmy podziękować dr Nicholasowi Lansonowi Jr. za udzielenie uwag na temat manuskryptu. Praca ta była wspierana przez Robert Packard Center for ALS w Johns Hopkins (do UBP) i Stowarzyszenie Stwardnienia Zanikowego Bocznego (UBP); oraz R01MH083689 z Narodowych Instytutów Zdrowia Psychicznego (CDN).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
SacharozaFisher ScientificS5-500
AgarozaInvitrogen16500-500
6 uncji butelka DrosophilaGenesee Scientific32-130
PędzelTed Pella, Inc.11859
Mąka kukurydzianaFisher ScientificNC9109741
AgarGenesee Scientific66-104
MelasaFisher ScientificNC9349176
Kwas propionowyAcros Organics14930-0010
TegoseptApex20-258
EtanolFisher ScientificBP2818-4
DrożdżeGenesee Scientific62-107

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacol. Rev. 63 (2), 411-436 (2011).
  2. Feany, M. B., Bender, W. W. A Drosophila model of Parkinson's disease. Nature Mar. 23 (6776), 394-398 (2000).
  3. Auluck, P. K., Bonini, N. M. Pharmacological prevention of Parkinson disease in Drosophila. Nat. Med. 8 (11), 1185-1186 (2000).
  4. Whitworth, A. J., Theodore, D. A., Greene, J. C., Benes, H., Wes, P. D., Pallanck, L. J. Increased glutathione Stransferase activity rescues dopaminergic neuron loss in a Drosophila model of Parkinson's disease. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (22), 8024-8029 (2005).
  5. Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Exp. Gerontol. 40 (5), 386-395 (2005).
  6. Lanson, N. A., Maltare, A., King, H., Smith, R., Kim, J. H., Taylor, J. P., Lloyd, T. E., Pandey, U. B. A Drosophila model of FUS-related neurodegeneration reveals genetic interaction between FUS and TDP-43. Hum. Mol. Genet. 20 (13), 2510-2523 (2011).
  7. Batlevi, Y., Martin, D. N., Pandey, U. B., Simon, C. R., Powers, C. M., Taylor, J. P., Baehrecke, E. H. Dynein light chain 1 is required for autophagy, protein clearance, and cell death in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (2), 742-747 (2010).
  8. Sang, T. K., Chang, H. Y., Lawless, G. M., Ratnaparkhi, A., Mee, L., Ackerson, L. C., Maidment, N. T., Krantz, D. E., Jackson, G. R. A Drosophila model of mutant human parkin-induced toxicity demonstrates selective loss of dopaminergic neurons and dependence on cellular dopamine. J. Neurosci. 27 (5), 981-992 (2007).
  9. Stacey, S. M., Muraro, N. I., Peco, E., Labbé, A., Thomas, G. B., Baines, R. A., van Meyel, D. J. Drosophila glial glutamate transporter Eaat1 is regulated by fringe-mediated notch signaling and is essential for larval locomotion. J. Neurosci. 30 (43), 14446-14457 (2010).
  10. Repnikova, E., Koles, K., Nakamura, M., Pitts, J., Li, H., Ambavane, A., Zoran, M. J., Panin, V. M. Sialyltransferase regulates nervous system function in Drosophila. J. Neurosci. 30 (18), 6466-6476 (2010).
  11. Repnikova, E., Koles, K., Nakamura, M., Pitts, J., Li, H., Ambavane, A., Zoran, M. J., Panin, V. M. Sialyltransferase regulates nervous system function in Drosophila. J. Neurosci. 30 (18), 6466-6476 (2010).
  12. Nedelsky, N. B., Pennuto, M., Smith, R. B., Palazzolo, I., Moore, J., Nie, Z., Neale, G., Taylor, J. P. Native functions of the androgen receptor are essential to pathogenesis in a Drosophila model of spinobulbar muscular atrophy. Neuron. 67 (6), 936-952 (2010).
  13. Lorenzo, D. N., Li, M. G., Mische, S. E., Armbrust, K. R., Ranum, L. P., Hays, T. S. Spectrin mutations that cause spinocerebellar ataxia type 5 impair axonal transport and induce neurodegeneration in Drosophila. J. Cell Biol. 189 (1), 143-158 (2010).
  14. Wang, J. W., Brent, J. R., Tomlinson, A., Shneider, N. A., McCabe, B. D. The ALS-associated proteins FUS and TDP-43 function together to affect Drosophila locomotion and life span. J. Clin. Invest. , (2011).
  15. Choi, J. K., Jeon, Y. C., Lee, D. W., Oh, J. M., Lee, H. P., Jeong, B. H., Carp, R. I., Koh, Y. H., Kim, Y. S. A Drosophila model of GSS syndrome suggests defects in active zones are responsible for pathogenesis of GSS syndrome. Hum. Mol. Genet. 19 (22), 4474-4489 (2010).
  16. Ruan, H., Wu, C. F. Social interaction-mediated lifespan extension of Drosophila Cu/Zn superoxide dismutase mutants. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (21), (2008).
  17. Slawson, J. B., Kim, E. Z., Griffith, L. C. High-resolution video tracking of locomotion in adult Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (24), (2009).
  18. Becnel, J., Johnson, O., Luo, J., Nässel, D. R., Nichols, C. D. The serotonin 5-HT7 Dro receptor is expressed in the brain of Drosophila, and is essential for normal courtship and mating. PLoS One. 6 (6), e20800(2011).
  19. Johnson, O., Becnel, J., Nichols, C. D. Serotonin 5-HT(2) and 5-HT(1A)-like receptors differentially modulate aggressive behaviors in Drosophila melanoga- ster. Neuroscience. 158 (2), 1292-1300 (2009).
  20. Bastock, M., Manning, A. The Courtship of Drosophila Melanogaster. Behaviour. , 85-111 (1955).
  21. Greenspan, R. J., Ferveur, J. F. Courtship in Drosophila. Annu. Rev. Genet. 34, 205-232 (2000).
  22. Villella, A., Hall, J. C. Neurogenetics of courtship and mating in Drosophila. Adv. Genet. 62, 67-184 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Drosophila BehaviorLarval Crawling AssayRING AssayCourtship AssayNegative GeotaxisMotor Function AnalysisGenetic FactorsEnvironmental FactorsDrug Treatment EffectsFly Locomotion

Powiązane artykuły