Analiza pojedynczych komórek biofilmów Bacillus subtilis przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej i cytometrii przepływowej

Summary

Biofilmy mikrobiologiczne zazwyczaj składają się z odrębnych subpopulacji wyspecjalizowanych komórek. Analiza pojedynczych komórek tych subpopulacji wymaga użycia reporterów fluorescencyjnych. W tym miejscu opisujemy protokół wizualizacji i monitorowania kilku subpopulacji w obrębie biofilmów B. subtilis za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i cytometrii przepływowej.

Abstract

Tworzenie biofilmu jest ogólną cechą prawie wszystkich bakterii ^1-6. Kiedy bakterie tworzą biofilmy, komórki są otoczone macierzą zewnątrzkomórkową, która składa się głównie z białek i egzopolisacharydów, między innymi ^7-10. Społeczność drobnoustrojów zamknięta w biofilmie często wykazuje zróżnicowanie odrębnej subpopulacji wyspecjalizowanych komórek ^11-17. Te subpopulacje współistnieją i często wykazują organizację przestrzenną i czasową w obrębie biofilmu ^18-21.

Tworzenie biofilmu w organizmie modelowym Bacillus subtilis wymaga zróżnicowania odrębnych subpopulacji wyspecjalizowanych komórek. Wśród nich subpopulacja producentów macierzy, odpowiedzialnych za wytwarzanie i wydzielanie macierzy zewnątrzkomórkowej biofilmu, jest niezbędna do tworzenia biofilmu ^11,19. W związku z tym zróżnicowanie producentów matryc jest cechą charakterystyczną tworzenia biofilmu u B. subtilis.

Użyliśmy fluorescencyjnych reporterów do wizualizacji i ilościowego określenia subpopulacji producentów matryc w biofilmach B. subtilis ^15,19,22-24. Konkretnie zaobserwowaliśmy, że subpopulacja producentów matryc różnicuje się w odpowiedzi na obecność samodzielnie wytwarzanej zewnątrzkomórkowej surfaktyny ^{sygnałowej 25}. Co ciekawe, surfaktyna jest wytwarzana przez subpopulację wyspecjalizowanych komórek inną niż subpopulacja producentów matrycy ¹⁵.

W tym raporcie szczegółowo opisaliśmy techniczne podejście niezbędne do wizualizacji i ilościowego określenia subpopulacji producentów matryc i surfaktyn w biofilmach B. subtilis. W tym celu do chromosomu B. subtilis wprowadza się fluorescencyjne reportery genów wymaganych do produkcji macierzy i surfaktyny. Reportery ulegają ekspresji tylko w subpopulacji wyspecjalizowanych komórek. Następnie subpopulacje można monitorować za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i cytometrii przepływowej (patrz ryc. 1).

Fakt, że różne subpopulacje wyspecjalizowanych komórek współistnieją w wielokomórkowych społecznościach bakterii, daje nam inną perspektywę na regulację ekspresji genów u prokariontów. Protokół ten odnosi się do tego zjawiska eksperymentalnie i można go łatwo dostosować do dowolnego innego modelu roboczego, aby wyjaśnić mechanizmy molekularne leżące u podstaw niejednorodności fenotypowej w społeczności drobnoustrojów.

Protocol

1. Etykietowanie B. subtilis i test tworzenia biofilmu

1. Amplifikować metodą PCR region promotorowy genu będącego przedmiotem zainteresowania. Jako przykład pokazujemy klonowanie P_tapA, promotora genów odpowiedzialnych za produkcję białka macierzy TasA ²⁶. Sklonuj_{P tapA} do wektora pkm008 (utworzonego przez laboratorium Rudnera, Harvard Medical School. Boston, Stany Zjednoczone) (rys. 2).
2. Linearyzuj plazmidy przez trawienie enzymatyczne (zalecany enzym, XhoI).
3. Indukuj naturalną kompetencję u szczepu B. subtilis 168, postępując zgodnie z jednoetapowym protokołem opisanym w....

Discussion

Fakt, że społeczności bakteryjne wykazują subpopulacje komórek wyrażających określony zestaw genów, świadczy o złożoności społeczności drobnoustrojów ^33,34. Protokół ten powinien pomóc w ustaleniu, czy ekspresja któregokolwiek z genów będących przedmiotem zainteresowania jest ograniczona do określonej subpopulacji wyspecjalizowanych komórek w społeczności drobnoustrojów. Wizualizacja tych subpopulacji wymaga opracowania nowych technik, ponieważ tradycyjne metody monitorowania ekspresji genów lub analizy mikrom.......