Analiza pojedynczych komórek biofilmu Bacillus subtilis przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej i cytometrii przepływowej

Podsumowanie

Biofilmy mikrobiologiczne są zazwyczaj tworzone przez odrębne subpopulacje wyspecjalizowanych komórek. Analiza pojedynczych komórek w tych subpopulacjach wymaga zastosowania reporterów fluorescencyjnych. W niniejszym protokole opisujemy metodę wizualizacji i monitorowania kilku subpopulacji w biofilmach B. subtilis przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej oraz cytometrii przepływowej.

Streszczenie

Tworzenie biofilmu jest cechą charakterystyczną dla niemal wszystkich bakterii ^1-6. Podczas tworzenia biofilmu komórki bakterii zostają zamknięte w macierzy zewnątrzkomórkowej, która składa się głównie z białek i egzo-polisacharydów, pomiędzy innymi czynnikami ^7-10. Społeczność drobnoustrojów zamknięta w biofilmie często wykazuje różnicowanie na odrębne subpopulacje wyspecjalizowanych komórek ^11-17. Subpopulacje te współistnieją i często wykazują organizację przestrzenną oraz czasową w obrębie biofilmu ^18-21.

Tworzenie biofilmu u organizmu modelowego Bacillus subtilis wymaga dyferencjacji odrębnych subpopulacji wyspecjalizowanych komórek. Wśród nich subpopulacja producentów macierzy, odpowiedzialna za wytwarzanie i wydzielanie macierzy zewnątrzkomórkowej biofilmu, jest niezbędna do jego powstania ^11,19. Zatem dyferencjacja producentów macierzy jest cechą charakterystyczną dla tworzenia biofilmu u B. subtilis.

Wykorzystaliśmy reportery fluorescencyjne do wizualizacji i kwantyfikacji subpopulacji producentów macierzy w biofilmach B. subtilis ^15,19,22-24. Konkretnie zaobserwowaliśmy, że subpopulacja producentów macierzy różnicuje się w odpowiedzi na obecność produkowanego przez te komórki zewnątrzkomórkowego sygnału – surfaktyny ²⁵. Co ciekawe, surfaktyna jest produkowana przez subpopulację wyspecjalizowanych komórek, która różni się od subpopulacji producentów macierzy ¹⁵.

W niniejszym raporcie szczegółowo opisaliśmy podejście techniczne niezbędne do wizualizacji i kwantyfikacji subpopulacji producentów macierzy oraz producentów surfaktyny w obrębie biofilmu B. subtilis. W tym celu do chromosomu B. subtilis wprowadzono fluorescencyjne reportery genów odpowiedzialnych za produkcję macierzy oraz produkcję surfaktyny. Reportery te są ekspresowane tylko w subpopulacji wyspecjalizowanych komórek. Następnie subpopulacje te mogą być monitorowane przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej i cytometrii przepływowej (patrz Ryc. 1).

Fakt, że różne subpopulacje wyspecjalizowanych komórek współistnieją w obrębie wielokomórkowych społeczności bakterii, dostarcza nam nowej perspektywy na regulację ekspresji genów u prokariontów. Niniejszy protokół podejmuje to zjawisko w sposób eksperymentalny i może zostać łatwo dostosowany do dowolnego innego modelu badawczego w celu wyjaśnienia molekularnych mechanizmów leżących u podstaw heterogeniczności fenotypowej w obrębie społeczności drobnoustrojów.

Protokół

1. Znakowanie B. subtilis i test tworzenia biofilmu

1. Przeprowadź amplifikację regionu promotorowego genu docelowego za pomocą metody PCR. Jako przykład przedstawiamy klonowanie P_tapA, promotor genów odpowiedzialnych za produkcję białka macierzy TasA ²⁶Klon P_tapA do wektora pkm008 (stworzonego w laboratorium Rudnera, Harvard Medical School, Boston, USA) (Rys. 2).
2. Zlinearyzuj plazmidy poprzez trawienie enzymatyczne (zalecany enzym: XhoI).
3. Indukcja naturalnej kompetencji u B. subtilis szczep 168, postępując zgodnie z jednokrokowym protokołem opisanym wcześniej przez Harwooda i Cuttinga ²⁷.
4. Należy dodać zlinearyzowane plazmidy do hodowli komórek kompetentnych, a następnie po dwóch godzinach inkubacji przeprowadzić selekcję w kierunku oporności na spektynomycynę.
5. W uzyskanych szczepach konstrukt został wstawiony w miejsce neutralne amyE locus z B. subtilis poprzez podwójną rekombinację (Ryc. 4). Aby stworzyć szczep z podwójnym znakowaniem, należy zintegrować drugi reporter w locus neutralnym lacA używając plazmidu pDR183 przedstawionego na rysunku 3. Wprowadź ten reporter, stosując tę samą technikę, którą opisaliśmy powyżej w przypadku wprowadzania reporterów sklonowanych w pKM008.
6. Przenieś reporter z szczepu 168 do szczepu NCIB3610, który wykazuje zdolność do tworzenia biofilmu. Zastosuj protokół transdukcji fagiem SPP1. ^28,29Hodować szczep donorowy w medium TY (LB+10mM MgSO4).₄+10μM MnSO₄₄). Wymieszać 200 μl kultury za pomocą 100 μl roztworu macierzystego faga. Po 30 min inkubacji dodać 3 ml miękkiego agaru i poczekać do momentu powstania halo fagowych w 37 °C.
7. Zebrać miękki agar. Odwirować go, a następnie przepuścić nadsącz przez strzykawkę. 0.22 μm przefiltrować. Powstały nadsącz wykorzystać do zakażenia hodowli szczepu biorcy wyhodowanej w medium TY. Dodać 30 μl do 10 ml kultury rozcieńczonej 1:10. Inkubować przez 30 min, a następnie wyselekcjonować szczepy oporne na antybiotyk po 24 h inkubacji.
8. Wybrać kolonię i hodować ją przez noc na podłożu LB w temperaturze 37 °C.
9. Plama 3 μL hodowli nocnej na stałym medium indukującym biofilm MSgg z 1,5% agaru ³⁰Pozostawić komórki do wzrostu przez 72 godziny w temperaturze 30 °C (Rysunek 3). Po trzech dniach wzrostu biofilmy powstałe na powierzchni agaru MSgg wykształciły złożoną architekturę morfologiczną na powierzchni agaru.

2. Dyspersja biofilmu i fiksacja komórek

1. Usuń biofilm z powierzchni agaru MSgg za pomocą wykałaczki lub pęsety. Konsystencja biofilmu powinna pozwalać na odklejenie go od powierzchni agaru w całości.
2. Umieść biofilm w 3 ml buforu PBS i rozprosz go poprzez wielokrotne pipetowanie lub przepuszczanie przez igłę. Alternatywnie, dyspersję biofilmu można przeprowadzić za pomocą łagodnej sonikacji. Łagodna sonikacja wymaga 12 impulsów przy mocy wyjściowej 3 i amplitudzie 0,7 sekundy.
3. Utrwal próbki przed analizą pojedynczych komórek. Przenieś 300 μL zawiesiny komórkowej do 1 ml 4% roztworu paraformaldehydu i inkubuj w temperaturze pokojowej przez dokładnie siedem minut.
   Skład 4% roztworu paraformaldehydu:
   2 g paraformaldehydu
   50 ml buforu PBS
   4 μl 10 N NaOH
   Przefiltruj roztwór przez filtr 0,22 um i podziel na alikwoty
4. Po utrwaleniu przemyj komórki buforem PBS trzy razy i ponownie zawieś w 300 μL buforu PBS.

3. Mikroskopia fluorescencyjna

1. Nalać 200 μL 0,8% agarozy na szkiełko przedmiotowe i ostrożnie przykryć je drugim szkiełkiem. Po 2 minutach delikatnie zdjąć górne szkiełko, aby uzyskać warstwę agarozy przylegającą do szkiełka dolnego.
2. Nanieść 2 μL utrwalonych komórek na powierzchnię warstwy agarozy i przykryć szkiełkiem podstawowym.
3. Umieścić próbkę w mikroskopie fluorescencyjnym. W tej procedurze wykorzystano mikroskop fluorescencyjny Leica DMI6000B wyposażony w system oświetlenia Leica CRT6000 iIlumination. Filtry dla YFP to Ex: BP500/20, Em: BP535/30, a dla CFP to Ex: BP426/20, Em: 480/40
4. Naświetlać próbkę fluorescencją wzbudzającą przez okres od 50-200 ms. Czas wzbudzenia należy dobrać na podstawie kontroli negatywnej, która nie wykazuje fluorescencji w warunkach wybranych do eksperymentu.
5. Odnieść obraz fluorescencyjny do obrazu uzyskanego w świetle przechodzącym. Połączyć oba obrazy w jeden plik. Wyniki uzyskane z mikroskopii fluorescencyjnej przepływowej z użyciem szczepu z pojedynczym znacznikiem zawierającym reporter P_tapA-YFP przedstawiono na rysunku 6.

4. Ilościowe oznaczanie pojedynczych komórek przy użyciu cytometrii przepływowej

1. Rozproszyć próbkę utrwalonych komórek za pomocą łagodnej sonikacji. Sonicować próbkę, wykonując 2 serie po 12 impulsów przy mocy 5 i amplitudzie 0,7 sekundy, aby rozbić skupiska do pojedynczych komórek bez powodowania lizy komórek. Efektywność rozproszenia komórek potwierdzić za pomocą mikroskopii świetlnej.
2. Próbkę rozcieńczyć 1:100 w buforze PBS przed analizą cytometryczną. Używamy cytometru przepływowego BD FACS Canto II. Dla fluorescencji YFP należy zastosować wzbudzenie laserowe przy 488 nm sprzężone z filtrem 530/30. Dla fluorescencji CFP należy zastosować wzbudzenie laserowe przy 405 nm sprzężone z filtrem 408/40.
3. Zkalibrować cytometr przepływowy za pomocą dwóch kontroli negatywnych. Próbka buforu PBS bez zawieszonych komórek powinna służyć jako kontrola negatywna dla wielkości cząstek wykrywanych przez cytometr. Próbka nieznakowana reporterem fluorescencyjnym powinna służyć jako kontrola negatywna dla czułości fluorescencyjnej cytometru.
4. Umieścić próbkę znakowaną reporterem fluorescencyjnym w cytometrze przepływowym. Dla każdej próbki przeanalizować co najmniej 50,000 zdarzeń przy przepływie od 300 do 3000 zdarzeń na sekundę.
5. Dane zarejestrować za pomocą oprogramowania FACS Diva (BD Biosciences) i przeanalizować przy użyciu oprogramowania FlowJo 8.5.2. Sygnały fluorescencji odnieść do kontroli nie wykazującej fluorescencji.
6. Przedstawić dane dotyczące sygnału fluorescencji szczepu znakowanego pojedynczo na wykresie dwuosiowym. Na osi X nanieść wykryty sygnał fluorescencji, a na osi Y liczbę komórek wykazujących różne poziomy fluorescencji. Wyniki otrzymane z analizy cytometrycznej szczepu znakowanego pojedynczo, zawierającego reporter P_tapA-YFP, przedstawiono na rysunku 8.
7. Przedstawić dane dotyczące sygnału fluorescencji szczepu znakowanego podwójnie na wykresie trójosiowym. Na osiach X i Y nanieść sygnał fluorescencji każdego z monitorowanych kanałów (na przykład GFP mierzone na osi X, a CFP na osi Y). Na osi Z nanieść liczbę komórek wykazujących każdy reporter i przedstawić je w formie izolinii konturowych prostopadłych do płaszczyzny papieru (Rys. 9 i 10).

4. Reprezentatywne wyniki

Kiedy B. subtilis rośnie na płytce z podłożem indukującym biofilm MSgg, tworzenie biofilmu obserwuje się po trzech dniach inkubacji w 30 °C ³⁰. Biofilm wykazuje silną konsystencję i można go odczepić od powierzchni agaru w jednym kawałku. Co więcej, biofilm wykazuje złożoną architekturę morfologiczną, która wskazuje na udział odrębnych subpopulacji komórek (Ryc. 5). Na przykład produkcja macierzy zewnątrzkomórkowej w biofilmach prowadzi do powstania zmarszczek na powierzchni kolonii. Cecha ta może być skorelowana z różnicowaniem subpopulacji producentów macierzy ¹⁹. Podobnie, powstawanie struktur powietrznych na powierzchni biofilmu wskazuje na obecność subpopulacji komórek sporulujących, ponieważ przetrwalniki lokalizują się w obszarze wierzchołkowym tych struktur ³⁰.

Przykłady wizualizacji różnicowania komórek w szczepie z pojedynczym i podwójnym znakowaniem z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej przedstawiono odpowiednio na rysunku 6 i 7. Szczep z pojedynczym znakowaniem posiada fluorescencyjny reporter P_tapA-CFP, który jest ekspresowany w subpopulacji komórek wytwarzających macierz. Ta subpopulacja odpowiada za produkcję i sekrecję macierzy zewnątrzkomórkowej, która tworzy biofilm (Rys. 6). Szczep z podwójnym znakowaniem posiada reporter P_tapA-CFP ²⁶ oraz dodatkowy reporter P_srfAA-YFP ³¹. Ten drugi reporter pozwala na monitorowanie subpopulacji komórek odpowiedzialnych za sekrecję cząsteczki sygnałowej – surfaktyny, która uruchamia kaskadę sygnałową prowadzącą do różnicowania producentów macierzy (Rys. 7). Subpopulacja producentów macierzy została zabarwiona sztucznie na niebiesko, natomiast subpopulacja producentów surfaktyny na żółto.

Analiza cytometrii przepływowej z wykorzystaniem szczepu z pojedynczym znacznikiem zawierającego reporter P_tapA-YFP została przedstawiona na rysunku 8. Nieleczony szczep kontrolny, nieposiadający genów białek fluorescencyjnych, wykazał pojedynczą populację o niskiej względnej fluorescencji. Komórki zawierające P_tapA-YFP w warunkach nieindukujących tworzenia biofilmu nie różnicowały subpopulacji producentów macierzy, a cała populacja wykazywała niską względną fluorescencję. W warunkach indukujących tworzenie biofilmu pojawiła się subpopulacja komórek o wysokiej względnej fluorescencji, zaobserwowana jako ramię po prawej stronie piku niskiej względnej fluorescencji ²³.

Wyniki uzyskane z analizy cytometrii przepływowej z użyciem szczepu podwójnie znakowanego przedstawiono na rysunkach 9 i 10. Na rysunku 9 monitorowano subpopulacje producentów macierzy oraz producentów surfaktyny przy użyciu podwójnie znakowanego szczepu P_tapA-CFP, P_srfAA-YFP. Jako kontrolę fluorescencji tła zastosowano szczep nieposiadający genów białek fluorescencyjnych. Następnie wykryto każdą subpopulację producentów macierzy i producentów surfaktyny w każdym kanale fluorescencji, wykorzystując jako kontrole szczepy pojedynczo znakowane. Szczep podwójnie znakowany P_tapA-CFP, P_srfAA-YFP wykazał dwie subpopulacje komórek wykazujących wysoki poziom ekspresji reporterów fluorescencyjnych. Każda populacja jest obramowana, co wskazuje na brak nakładania się ekspresji reporterów pomiędzy dwiema subpopulacjami wyspecjalizowanych komórek ¹⁵. Analogicznie, analiza cytometrii przepływowej z użyciem podwójnie znakowanego szczepu P_skf-YFP, P_tapA-YFP przedstawiona jest na rysunku 10. Reporter genu skf monitoruje różnicowanie subpopulacji kanibali ³², o której opisano, że różnicuje się koordynacyjnie z subpopulacją producentów macierzy ²⁴. W tym przypadku szczep podwójnie znakowany wykazał pojedynczą subpopulację komórek fluorescencyjnych wykazujących ekspresję zarówno YFP, jak i CFP. Wskazuje to, że obie ścieżki różnicowania komórek są koordynacyjnie aktywowane w tej samej subpopulacji.

Rysunek 1. Ogólny schemat eksperymentu. Protokół podzielono na trzy główne etapy. Pierwszy etap wymaga znakowania szczepu B. subtilis fuzją reporterową monitorującą interesującą subpopulację. Po drugie, należy hodować znakowane szczepy w warunkach indukujących tworzenie biofilmu. Po trzecie, należy rozproszyć biofilm i przeprowadzić analizę pojedynczych komórek populacji przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego oraz cytometrii przepływowej.

Rycina 2. Schematyczne przedstawienie wektora integracyjnego pKM008. Wektor ten integruje interesującą fuzję reporterową w neutralnym locus amyE poprzez podwójną rekombinację. Interesujący promotor (P_tapA) jest klonowany do wektora z wykorzystaniem miejsc restrykcyjnych EcoRI oraz HindIII. W ten sposób ekspresja genu cfp znajduje się pod kontrolą promotora P_tapA. Orientacja genów w plazmidzie jest przedstawiona w postaci strzałki.

Rycina 3. Schematyczna reprezentacja wektora integracyjnego pDR183. Wektor ten integruje interesującą fuzję reporterową w neutralnym locus lacA poprzez podwójną rekombinację. Interesująca fuzja (P_tapA-cfp) jest klonowana do wektora przy użyciu miejsc restrykcyjnych EcoRI oraz BamHI. Orientacja genów w plazmidzie jest przedstawiona w formie strzałki.

Rycina 4. Schemat integracji reporterów do chromosomu B. subtilis poprzez podwójną rekombinację. (A) Chromosom B. subtilis posiada dwa loci neutralne, amyE oraz lacA, umożliwiające integrację fuzji reporterowych bez wpływu na rozwój biofilmu. (B) Proces podwójnej rekombinacji pKM008. Zlinearyzowany plazmid integruje się z genomem B. subtilis poprzez podwójną rekombinację. Fuzja reporterowa integruje się z locusem neutralnym w sposób stabilny.

Rycina 5. Tworzenie biofilmu przez B. subtilis NCIB3610. Proces tworzenia biofilmu przez szczep B. subtilis NCIB 3610 podczas wzrostu na medium indukującym biofilm MSgg przez trzy dni w temperaturze 30 °C. Kolejne zdjęcia rozwoju biofilmu wykonywano co 12 h.

Rycina 6. Wizualizacja subpopulacji producentów macierzy pod mikroskopem fluorescencyjnym. Próbkę z biofilmu B. subtilis P_tapA-cfp utrwalono i zbadano pod mikroskopem fluorescencyjnym. Wzbudzenie fluorescencji przez 200 ms wykazało subpopulację komórek emitujących silniejszą fluorescencję niż pozostałe komórki. Subpopulację tę uznano za subpopulację komórek produkujących macierz. Pasek skali wynosi 3 μm.

Rycina 7. Wizualizacja subpopulacji producentów macierzy i producentów surfaktyny pod mikroskopem fluorescencyjnym. Próbka z biofilmu podwójnie znakowanego szczepu B. subtilis P _tapA-cfp, P_srfAA-yfp została utrwalona i zbadana pod mikroskopem fluorescencyjnym. Czas ekspozycji 250 ms wykazał dwie subpopulacje komórek emitujących silniejszą fluorescencję niż pozostałe komórki. Jedna subpopulacja wykazywała ekspresję YFP i została wykryta wyłącznie w kanale YFP (fałszywie kolorowana na żółto). Jest to subpopulacja producentów surfaktyny. Druga subpopulacja wykazywała ekspresję CFP i została wykryta wyłącznie w kanale CFP. Jest to subpopulacja producentów macierzy. Pasek skali wynosi 3 μm.

Rysunek 8. Ilościowe oznaczenie subpopulacji producentów macierzy przy użyciu 2-D cytometrii przepływowej. Monitorowano rozproszone komórki z biofilmu B. subtilis P_tapA-yfp za pomocą cytometrii przepływowej. Cytometr przepływowy zliczył 50.000 zdarzeń i monitorowano sygnał fluorescencji dla każdego z nich. Liczbę zliczonych komórek naniesiono na oś Y, a intensywność sygnału YFP na oś X. Komórki hodowano w pożywce LB w celu uzyskania warunków nieindukujących tworzenia biofilmu. Komórki hodowano w pożywce MSgg w celu uzyskania warunków indukujących tworzenie biofilmu. Subpopulacja producentów macierzy różnicuje się wyłącznie w warunkach indukujących tworzenie biofilmu. Rysunek zaadaptowano z pracy López et al., PNAS (2009) 106:280-285.

Rycina 9. Ilościowe oznaczenie subpopulacji producentów macierzy i producentów surfaktyny przy użyciu 3D cytometrii przepływowej. Sygnały fluorescencji monitorowanych kanałów przedstawiono na osi X (dla YFP) oraz osi Y (dla CFP). Oś Z mierzy liczbę komórek wykazujących ekspresję każdego reportera i jest ona określona jako linie izokonturowe prostopadłe do płaszczyzny papieru. Liczba zdarzeń monitorowanych w tym eksperymencie wynosiła 50.000 zdarzeń. Górny lewy panel przedstawia kontrolę fluorescencji tła w szczepie pozbawionym genów białek fluorescencyjnych. Górny prawy panel wykrywa subpopulację producentów surfaktyny w kanale fluorescencji YFP (obramowana na żółto) przy użyciu szczepu z pojedynczym znacznikiem P_srfAA-YFP. Dolny lewy panel wykrywa subpopulację producentów macierzy w kanale fluorescencji CFP (obramowana na niebiesko) przy użyciu szczepu z pojedynczym znacznikiem P_tapA-CFP. Szczep z podwójnym znacznikiem P_tapA-CFP, P_srfAA-YFP jest monitorowany w dolnym prawym panelu. Wykazano w nim dwie subpopulacje obramowane na żółto i niebiesko. Rycina została zaadaptowana z López et al., Genes and Development (2009) 23:1631-1638.

Rysunek 10. Ilościowe określenie subpopulacji producentów macierzy i kanibali przy użyciu 3-D cytometrii przepływowej. Sygnał fluorescencji monitorowanych kanałów przedstawiono na osi X (dla YFP) i osi Y (dla CFP). Liczba zdarzeń monitorowanych w tym eksperymencie wynosiła 50 000. Górny prawy panel wykrywa subpopulację kanibali w kanale fluorescencji YFP (obramowana na żółto) w szczepie znakowanym pojedynczo P_skf-YFP. Dolny lewy panel wykrywa subpopulację producentów macierzy w kanale fluorescencji CFP (obramowana na niebiesko) w szczepie znakowanym pojedynczo P_tapA-CFP. Szczep znakowany podwójnie P_tapA-CFP, P_skf-YFP wykazał tylko jedną subpopulację komórek na przekątnej osi X i Y (obramowana na zielono). Subpopulacja ta jest wykrywana w kanale YFP i CFP, ponieważ jednocześnie wykazuje ekspresję obu reporterów. López et al., Genes and Development (2009) 23:1631-1638.

Dyskusja

Fakt, że społeczności bakteryjne wykazują subpopulacje komórek wykazujących ekspresję określonego zestawu genów, świadczy o złożoności społeczności drobnoustrojów ^33,34. Niniejszy protokół powinien pomóc ustalić, czy ekspresja dowolnego interesującego genu jest ograniczona do konkretnej subpopulacji wyspecjalizowanych komórek w obrębie społeczności mikrobiologicznej. Wizualizacja tych subpopulacji wymaga opracowania nowych technik, ponieważ tradycyjne metody monitorowania ekspresji genów lub analiza mikromacie...