Prezentujemy zjawisko FRET pomiędzy sprzężonym polimerem polidiacetylenem (PDA) a fluorophorem przyczepionym do powierzchni liposomów PDA w celu detekcji biomolekuł. Liposomy PDA zawierały na swojej powierzchni cząsteczki receptorowe dla biomolekuł, które służyły jako sondy. Oddziaływania ligand-receptor prowadzą do zmian w efektywności FRET pomiędzy fluorophorem a PDA, co stanowi podstawę mechanizmu detekcji.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Monitorowanie w czasie rzeczywistym oddziaływań ligand-receptor z wykorzystaniem transferu energii rezonansowej fluorescencji
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
FRET jest procesem, w którym energia jest przekazywana w sposób nieradiacyjny z wzbudzonej cząsteczki donora do cząsteczki akceptora w stanie podstawowym poprzez dalekosiężne oddziaływania dipol-dipol1. W niniejszym teście analitycznym wykorzystujemy interesującą właściwość PDA: przesunięcie w stronę niebieską w widmie absorpcji elektronicznej UV-Vis PDA (Figure 1) po wejściu analitytu w interakcję z receptorami przyłączonymi do PDA2,3,4,7. To przesunięcie w widmie absorpcji PDA powoduje zmiany w nakładaniu się widm (J) między PDA (akceptorem) a rodamidą (donorem), co prowadzi do zmian w wydajności FRET. Zatem oddziaływania między analitytem (ligandem) a receptorami są wykrywane poprzez FRET między fluoroforami donora a PDA. W szczególności pokazujemy detekcję modelowej cząsteczki białka – streptawidyny. Demonstrujemy również kowalencyjne wiązanie albuminy surowicy bydlęcej (BSA) z powierzchnią liposomu za pomocą mechanizmu FRET. Oddziaływania te między dwuwarstwowymi liposomami a cząsteczkami białek mogą być monitorowane w czasie rzeczywistym. Zaproponowana metoda jest ogólną metodą detekcji małych cząsteczek chemicznych i dużych cząsteczek biochemicznych. Ponieważ fluorescencja jest z natury czulsza niż kolorymetria, granica detekcji testu może znajdować się w zakresie subnanomolarnym lub niższym8. Co więcej, PDA może działać jako uniwersalny akceptor w FRET, co oznacza, że można opracować wiele czujników z PDA (akceptorem) funkcjonalizowanym donorami i różnymi receptorami przyłączonymi do powierzchni liposomów PDA.
Protokół
A. Synteza i charakterystyka liposomów PDA4,5,6
Uwaga 1: Należy chronić roztwór PDA przed światłem, owijając każdy pojemnik folią aluminiową na wszystkich etapach eksperymentu.
Uwaga 2: Dwa różne zestawy roztworu liposomów (B i C) przygotowano zgodnie z procedurą A (Synteza i charakterystyka liposomów PDA).
1. Synteza N-hydroksysukcynimidowego diacetylenu (NHS-PCDA)
- Do przygotowania liposomów niezbędny jest składnik PCDA-NHS. Zsyntetyzowaliśmy PCDA-NHS zgodnie z poniższą procedurą:
- Do suchego CH2Cl2 (20 ml) dodano kwas 10,12-pentakosadiynowy (PCDA) (0,267 g, 0,713 mmol), N-hydroksysuccynimid (0,0914 g, 0,786 mmol) oraz węglowodan 1-(3-(dimetylamino)propyl)-3-etylowy (EDC) w postaci chlorowodorku (0,144 g, 0,713 mmol).
- Roztwór mieszano w temperaturze pokojowej przez 2 h.
- Rozpuszczalnik ostrożnie usunięto za pomocą ewaporatora obrotowego, otrzymując suchy cienki film.
- Pozostałość ekstrahowano za pomocą rozdzielacza eterem dietylowym (25 ml) oraz wodą (25 ml) trzykrotnie.
- Warstwę organiczną suszono MgSO4 (1,0 g) przez pół godziny. Po przefiltrowaniu usunięto rozpuszczalnik za pomocą ewaporatora obrotowego, aby otrzymać biały proszek stały (0,24 g, >90%).
- Końcowy związek poddano analizie za pomocą spektroskopii jądra magnetycznego (NMR).
- 1H NMR (300 MHz, DMSO), δ (ppm): 0,893 (t, 3H), 1,268 (m, 26H), 1,512 (m, 4H), 1,754 (m, 2H), 2,252 (t, 4H), 2,365 (m, 1H), 2,610 (m, 1H), 2,842 (s, 2H).
2. Przygotowanie liposomów5,6,7
- Rozpuścić PCDA: PCDA-NHS: 1,2-dimyristylo-sn-glycero-3-fosfocholinę (DMPC) w stosunku 8 : 1: 1 w 20 ml dichlorometanu.
- Przefiltrować roztwór przez papier filtracyjny w celu usunięcia agregatów.
- Całkowicie odparować rozpuszczalnik, aby uzyskać cienką warstwę monomerów.
- Suszyć cienką warstwę przez noc w próżni.
- Nawodnić warstwę wodą dejonizowaną (50 ml), aby przygotować roztwór liposomów o pożądanej stężeniu (0,65-1 mM).
- Poddać otrzymaną zawiesinę działaniu sonikatora sondowego w temperaturze 76 °C przez ok. 18 min.
- Ostrożnie przepuścić roztwór przez filtr papierowy, aby usunąć agregaty lipidowe.
- Chłodzić roztwór w temperaturze 4 °C przez noc, aby wspomóc samoorganizację monomerów. Końcowy roztwór powinien być optycznie przejrzysty.
- Polimeryzować samoorganizujące się monomery diacetylenowe (liposomy) poprzez naświetlanie promieniowaniem UV o długości fali 254 nm przez ok. 2 min, używając źródła UV Pen Ray (4,5 mW/cm2) w powietrzu.
- Roztwór liposomów był stabilny w temperaturze pokojowej przez co najmniej dwa tygodnie. Roztwór był bardziej stabilny w warunkach chłodniczych.
B. Przygotowanie liposomów PCDA modyfikowanych rodaminową albuminą surowicy bydlęcej (BSA-Rh)
1. Wiązanie BSA-Rh do powierzchni liposomów
- Rozpuścić BSA-Rh w buforze PBS (stężenie jonowe 0,01 M, pH 7,2), aby przygotować roztwór BSA-Rhodamine o końcowym stężeniu 1,2 μM.
- Dodać 2 ml (1,2 μM) BSA-Rhodamine do 10 ml roztworu liposomów przygotowanego w kroku A.2. (patrz wyżej) w temperaturze pokojowej.
- Zastosowano klasyczną reakcję wiązania grup aminowych z reszt lysyny białek z grupą kwasu karboksylowego aktywowaną przez grupę NHS (schemat reakcji na Rysunku 2). NHS-PCDA został zaprojektowany (Rysunek 2, krok 1) w celu kowalencyjnego wiązania cząsteczek białek z liposomami za pomocą reakcji NHS-amina (Rysunek 2, krok 2). NHS jest doskonałą grupą odchodzącą, która przesuwa reakcję aminy z kwasem karboksylowym w kierunku produktów. Wydajność tej reakcji w odpowiednich warunkach powinna być ilościowa.
- Usuwanie wolnego BSA-Rh: Namoczyć membranę estrową celulozy (CE) Spectra/Por Biotech (MWCO: 100 000) w wodzie dejonizowanej przez 15 min. Membrana ta służy do dializy nieprzereagowanego BSA-Rhodamine (masa cząsteczkowa ~66000 Da) w wodzie dejonizowanej.
- Ostrożnie przelać roztwór do membrany dializacyjnej.
- Wymieniać wodę po 2 h, 8 h, 14 h, 24 h i 36 h podczas dializy.
- Zebrać końcowy roztwór do fiolki owiniętej folią aluminiową.
C. Przygotowanie liposomów z SR-diaminą i znakowanych biotyną
1. Zamiast stosowania DMPC w kroku 2.1, użyjemy biotynylionowanego (1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolaminy-N-(biotynylowej) (biotin-DOPE).
- Wykonaj wszystkie kroki od 2.2 do 2.9.
- Zamiast BSA-Rh w kroku B, użyj sulforodaminy znakowanej diaminą (SR-diamine).
- Wykonaj wszystkie kolejne kroki w sekcji B.
- Liposomy w tym preparacie zawierały na swoich powierzchniach biotynę i SR-diamine. Kolejne kroki były analogiczne do procedur A i B (patrz wyżej), z jednym wyjątkiem: do roztworu dodano streptawidynę, aby zbadać oddziaływania biotyna-streptawidyna poprzez zmiany w wydajności FRET.
D. Reprezentatywne wyniki
Rycina tytułowa. Schemat wyjaśniający reakcję i proces FRET zachodzący na powierzchni liposomu (przygotowanego zgodnie z krokiem B).
A. Monitorowanie przyłączania białek do liposomów za pomocą FRET1
Monitorowanie FRET między rodamina a liposomami PDA przygotowanymi w kroku B.
Wykonano pomiary widm wzbudzenia i emisji BSA-Rh oraz widma absorpcyjnego PDA (Rycina 3A). Wyraźnie widać, że widmo emisji BSA-Rh nakłada się na widmo absorpcyjne PDA. Spełnia to warunek rezonansu niezbędny dla mechanizmu FRET. Liposomy znakowane BSA-Rodaminą przed i po polimeryzacji przeanalizowano za pomocą spektroskopii UV-Vis oraz fluorescencyjnej. W przypadku odizolowanego donora i akceptora wydajność FRET jest silnie zależna od odległości donor-akceptor (r) oraz od J1 (wartości j). Obserwuje się wygaszanie emisji (Rycina 3B) w wyniku FRET pomiędzy rodaminą a PDA, co wynika z pojawienia się widma absorpcji elektronicznej niebieskiego PDA po fotopolimeryzacji. W naszym przypadku wydajność FRET dla niepolimeryzowanych liposomów i rodaminy wynosi zero, ponieważ dla niepolimeryzowanych liposomów w obszarze widzialnym J=0.
Przeprowadziliśmy analogiczne eksperymenty z wykorzystaniem wyłącznie liposomów PDA, które nie posiadały NHS na powierzchni. W tych przypadkach BSA-Rh nie został przyłączony do powierzchni liposomów. W związku z tym średnia odległość między rodaminą a PDA (raverage) była znacznie większa od promienia Förstera (R0 = 2.8 nm). W efekcie nie zaobserwowano znacznego spadku intensywności fluorescencji. Ta obserwacja sugeruje również, że wygaszanie fluorescencji dominuje, gdy r < 2.8 nm.
Wartości J oraz R0 obliczono przy użyciu następujących wzorów:[1]
J(λ)=∫FD(λ)εA(λ)λ4dλ
R0=0,211[k2n-4QDJ(λ)]1/6
Współczynnik ekstynkcji (ε) dla niebieskiego PDA mieści się w zakresie ~ 2000-10000 M-1 cm-1 przed dodaniem streptawidyny. Współczynnik ekstynkcji niebieskiego PDA zależy od warunków fotopolimeryzacji. [2] Na przykład wartości ε będą większe dla roztworu, który był polimeryzowany przez dłuższy czas. Ponadto na wartości ε może wpływać samoorganizacja monomerów diacetylenowych. Obliczenia J uwzględniają te zmiany i odzwierciedlają zmiany współczynników ekstynkcji PDA wynikające z oddziaływań molekularnych biotyna-streptawidyna. Wartości J oblicza się na podstawie eksperymentalnych danych dotyczących absorpcji PDA oraz emisji SR-101. Zmiany w wartościach J wynikają z przesunięcia w widmie absorpcji elektronowej PDA po dodaniu streptawidyny do roztworu (Rycyna 4C). Jednostką wartości J jest M-1cm-1nm4.
B. Monitorowanie FRET po dodaniu streptawidyny do roztworu liposomów znakowanych biotyną
Uwaga 1: Monitorowanie FRET pomiędzy rodaminą a liposomami PDA przygotowanymi w powyższym kroku C.
Wyznaczono widma wzbudzenia i emisji diaminy znakowanej sulforodaminą (SR-diamine) oraz widmo absorpcji PDA (Rysunek 4A). Liposomy znakowane biotyną, niepolimeryzowane i polimeryzowane, przeanalizowano za pomocą spektroskopii UV-Vis i fluorescencyjnej. Emisja rodaminy (SR-101) zmniejszyła się o około 45% po polimeryzacji (Rysunek 4B), co sugeruje gaszenie emisji w wyniku FRET. Do 2 ml roztworu liposomów dodano aliquoty 40 μl (1 μM) roztworu streptawidyny. Po dodaniu streptawidyny do roztworu zaobserwowano zmiany wartości J (Rysunek 4C). Wraz z wiązaniem biotyny do streptawidyny natężenie niebieskiego piku liposomów PDA (wycentrowanego przy ~645 nm na Rysunku 1) spadło, natomiast zaobserwowano wzrost piku absorpcji przy 540 nm (Rysunek 1S). Rysunek 4D przedstawia zmiany wydajności FRET. Spadek wydajności FRET wraz ze wzrostem stężenia streptawidyny jest zgodny z naszymi przewidywaniami.
Rejestruj emisję SR po każdym dodaniu 40 μl aliquotu streptawidyny. Zaobserwowano stały wzrost emisji rodaminy po dodaniu streptawidyny (Rysunek 5). Wzrost emisji rodaminy wynika ze spadku wartości J dla widma emisji sulforodaminy i widma absorbancji PDA następującego po oddziaływaniach biotyna-streptawidyna. Na poziomie molekularnym oddziaływania biotyna-streptawidyna prowadzą do subtelnych zmian w efektywnej długości sprzężenia PDA, co skutkuje przekształceniem niebieskiej formy PDA w bardziej stabilną termodynamicznie czerwoną formę PDA2. Stanowi to podstawę zmian wartości J. Co ciekawe, subtelne różnice w oddziaływaniach molekularnych dla biotyny związanej kowalencyjnie lub niekowalencyjnie z liposomem PDA mogą być badane przy użyciu naszego testu sensorycznego4.
Przeprowadzono również doświadczenia kontrolne, monitorując emisję próbek kontrolnych w tych samych warunkach doświadczalnych, co w przypadku układu streptawidyna-biotyna. Doświadczenia kontrolne obejmowały: (1) do roztworów liposomów z biotyną na powierzchni dodano roztwór buforowy o tej samej objętości i stężeniu; oraz (2) do roztworu liposomów bez receptorów biotyny na powierzchni dodano streptawidynę o tej samej objętości i stężeniu. Intensywność roztworu liposomów znakowanych biotyną po dodaniu streptawidyny wzrosła, natomiast intensywność roztworów liposomów w doświadczeniach kontrolnych (patrz np. Rycina 2S) wykazała spadek natężenia emisji. Zjawisko to przypisuje się rozcieńczeniu roztworu. Doświadczenia te jednoznacznie wykazały, że zwiększona emisja roztworu wynikała ze specyficznych oddziaływań molekularnych.
Promień Förstera (R0) dla pary rodamina-PDA został obliczony (rów. 2) na ~2.80 nm. Oznacza to, że dla izolowanych par PDA-rodamina 50% cząsteczek rodaminy w stanie wzbudzonym przekaże swoją energię do PDA, gdy r wynosi 2.80 nm.
Zaobserwowaliśmy, że gdy biotyna jest kowalencyjnie przyłączona do szkieletu PDA, wzrost emisji był 2-3 razy większy niż w przypadku biotyny nieprzyłączonej kowalencyjnie do liposomów.4 Wyniki te silnie sugerują, że zaproponowany przez nas system jest w stanie odróżnić subtelne różnice w oddziaływaniach na poziomie przetwornika (łącznika między biotyną a dwuwarstwą liposomów) wynikające z kowalencyjnego i niekowalencyjnego wiązania receptorów przyłączonych do liposomów. W zależności od możliwości skanowania i akwizycji danych spektrofotometru, system pomiarowy ten umożliwia monitorowanie w czasie rzeczywistym (w skali czasowej od milisekund do sekund) oddziaływań białkowych (w spektroskopii UV-Vis).
Rysunek 1. Widma absorpcyjne niebieskich i czerwonych roztworów PDA. (Wstawka) mikrofotografie optyczne wykonane cyfrowym aparatem fotograficznym.
Rysunek 2. Schemat reakcji dla syntezy PCDA-NHS (krok 1). Reakcja PCDA-NHS z podstawnikiem aminowym białek (krok 2). Krok 2 stanowi podstawę wiązania reszty lizyny białek z kwasem karboksylowym monomeru PCDA. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek.
Figura 3A. Zmiana obserwowanej wydajności FRET wynika ze zmian w widmie absorpcji PDA. Przed polimeryzacją nie występuje nakładanie się emisji BSA-Rh i absorpcji PDA, natomiast po polimeryzacji absorpcja PDA nakłada się na emisję BSA-Rh, co jest warunkiem koniecznym dla FRET. Rodamina jest donorem (kolor czerwony), a polimeryzowane liposomy PDA pełnią rolę akceptora (kolor niebieski).
Rycina 3B. Widma fluorescencji liposomów znakowanych BSA-Rh przed (niebieski) i po polimeryzacji PCDA (czerwony). Zaobserwowano znaczny spadek emisji rodaminy ze względu na zjawisko FRET między rodaminą a PDA.
Rysunek 4A. Zmiana nakładania się widm (J) dla widma absorpcyjnego PDA (niebieskiego lub czerwonego) i widma emisji sulphorhodaminy (pomarańczowego). Rysunek 4A przedstawia reprezentatywne widmo dla warunków ekstremalnych, tj. po dodaniu do roztworu nadmiaru streptawidyny. Rysunek 4A pokazuje niemal całkowitą transformację PDA z niebieskiego na czerwony po dodaniu nadmiaru streptawidyny. Wyraźnie widać, że J (nakładanie się widm) zwiększa się wraz z przesunięciem widma absorpcyjnego PDA w stronę krótszych fal (blue-shift).
Rysunek 4B. Widma fluorescencji przed (niebieskie) i po (czerwone) polimeryzacji liposomów.
Rysunek 4C. Warunek dla FRET: zmiana J pomiędzy donorem (sulforodamina) a akceptorem (PDA) po dodaniu streptawidyny do roztworu liposomów.
Rycina 4D. Zmiana wydajności FRET pomiędzy donorem (sulforodamina) a akceptorem (PDA) po dodaniu streptawidyny do roztworu liposomów.
Rycina 5. Widmo emisji rhodaminy po dodaniu alikwotów streptawidyny do roztworu liposomów PDA. Wstawka przedstawia powiększony widok zmian emisji w widmach SR-101.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Przeprowadziliśmy selektywne wiązanie reszty lizyny białka na powierzchni liposomów z wykorzystaniem reakcji NHS-amina. Ta metoda oparta na FRET umożliwia monitorowanie w czasie rzeczywistym wiązania biotyna-streptawidyna oraz wiązania białka (BSA) z powierzchnią liposomów. Podobną procedurę można zastosować do badania dynamiki wiązania różnych interakcji białkowych z ich selektywnymi receptorami. Istnieje elastyczność w doborze fluoroforów, co pozwala na uzyskanie zmian wartości J w zależności od charakterystyk...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Wsparcie finansowe dla niniejszej pracy zostało zapewnione przez National Science Foundation, National Institute of Health (NIH), Materials Technology Center (MTC) oraz ORDA na SIUC. Dziękujemy NSF za grant (CHE-0959568) na zakup FE-SEM. Chcielibyśmy podziękować prof. Matthew McCarrollowi za pomocne dyskusje. Julia Reyes pragnie podziękować COLCIENCIAS, agencji kolumbijskiej oraz Universidad Pedagogica y Tecnologica de Colombia za stypendium i wsparcie finansowe.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| kwas 10,12-pentakosadiynowy (PCDA) | odczynniki GFS chemicals | 3261 | Wrażliwy na światło |
| N-hydroksysukcynimid (NHS) | Acros Organics | 157270250 | Wrażliwy na wilgoć |
| chlorowodorek 1-(3-(dimetylamino)propyl)-3-etyloimmobilokarbodiimidu (EDC) | Chem-impex International | 00050 | |
| 1,2-dimyristylo-sn-glicero-3-fosfocholina (DMPC) | Avanti Polar lipids | 850345P | |
| Albuminy surowicy bydlęcej znakowana rodamyną (BSA-Rh) | Sigma Aldrich | A4537 | |
| (1,2-dioleoil-sn-glycero-3-fosfo-–etanolamina-N-(biotynyl)(biotin-DOPE) | Avanti Polar lipids | 870282 |
Bibliografia
- Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy. , 3rd ed, Kluwer Academic/Plenum Publishers. (1999).
- Charych, D. H., Nagy, J. O., Spevak, W., Bednarski, M. D. Direct Colorimetric Detection of a Receptor-Ligand Interaction by a Polymerized Bilayer Assembly. Science. 261, 585-588 (1993).
- Yoon, B., Lee, S., Kim, J. -M. Recent Conceptual and Technological Advances in Polydiacetylene-based Supramolecular Chemosensors. Chem. Soc. Rev. 38, 1958-1968 (2009).
- Xuelian, L. i, Kohli, P. unit Investigating Molecular Interactions in Biosensors Based on Fluorescence Resonance Energy Transfer. J. Phys. Chem. C. 114, 6255-6264 (2010).
- Li, X., Matthews, S., Kohli, P. Fluorescence Resonance Energy Transfer in Polydiacetylene Liposomes. J. Phys. Chem. B. 112, 13263-13272 (2008).
- Li, X., McCarroll, M., Kohli, P. Modulating Fluorescence Resonance Energy Transfer in Conjugated Liposomes. Langmuir. 22, (2006).
- New, R. R. C. Liposomes: A Practical Approach. New, R. R. C. , Oxford University Press. Oxford. 33-104 (1990).
- Chen, X., Lee, J., Jou, M. J., Kim, J. -M., Yoon, J. Colorimetric and Fluorometric Detection of Cationic Surfactants Based on Conjugated Polydiacetylene Supramolecules. Chem. Commun. , 3434-3436 (2009).
- Yarimaga, O., Im, M., Choi, Y. -K., Kim, T. W., Jung, Y. K., Park, H. G., Lee, S., Kim, J. -M. A Color Display System Based on Thermochromic Conjugated Polydiacetylene. Macromolecular Research. 18, 404-407 (2010).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
