Izolacja pierwotnych mikroglejów z mieszanych kultur komórek glejowych tkanki mózgu noworodka szczura

Podsumowanie

Izolowanie pierwotnych mikroglejów z heterogenicznej populacji komórek mózgu jest niezbędne do zbadania ich roli w warunkach fizjologicznych i patologicznych. Niniejszy protokół opisuje technikę mechanicznej izolacji i mieszanej hodowli komórkowej, która zapewnia wysoką wydajność oraz wysoką czystość żywych, pierwotnych komórek mikrogleju do badań in vitro i dalszych zastosowań.

Streszczenie

Mikrogleja stanowi około 12% całkowitej populacji komórkowej w mózgu ssaków. Podczas gdy neurony i astrocyty są uważane za główne typy komórek układu nerwowego, mikroglej odgrywa istotną rolę w prawidłowej fizjologii mózgu, monitorując tkankę pod kątem obecności debris i patogenów oraz utrzymując homeostazę w miąższu poprzez aktywność fagocytarną ^1,2. Mikroglej ulega aktywacji w wielu stanach urazowych i chorobowych, w tym w chorobach neurodegeneracyjnych, urazach czaszkowo-mózgowych oraz infekcjach układu nerwowego ³. W warunkach aktywacji komórki mikrogleju zwiększają swoją aktywność fagocytarną, przechodzą zmiany morfologiczne i proliferacyjne oraz aktywnie wydzielają reaktywne formy tlenu i azotu, prozapalne chemokiny i cytokiny, często uruchamiając pętlę parakrynną lub autokrynną ^4-6. Ponieważ odpowiedzi te przyczyniają się do patogenezy schorzeń neurologicznych, uzasadnione są badania skoncentrowane na mikrogleju.

Ze względu na heterogeniczność komórkową mózgu, uzyskanie wystarczającej ilości materiału mikrogleju o wysokiej czystości podczas eksperymentów in vivo jest technicznie trudne. Obecne badania nad funkcjami neuroprotekcyjnymi i neurotoksycznymi mikrogleju wymagają rutynowej metody technicznej, która pozwalałaby na spójne generowanie czystego i zdrowego mikrogleju z wydajnością wystarczającą do prowadzenia badań. Przedstawiamy w tekście i wideo protokół izolacji czystego pierwotnego mikrogleju z mieszanych kultur glejowych do różnorodnych zastosowań analitycznych. W skrócie, technika ta wykorzystuje zdysocjowaną tkankę mózgową noworodków szczura do wytworzenia mieszanych kultur komórek glejowych. Po osiągnięciu przez mieszane kultury glejowe pełnej konfluencji, pierwotny mikroglej jest izolowany mechanicznie z kultury poprzez krótkotrwałe wytrząsanie. Następnie mikroglej o wysokiej czystości jest wysiewany do dalszych badań eksperymentalnych.

Zasada i protokół tej metodologii zostały opisane w literaturze ^7,8. Ponadto w literaturze dobrze opisano alternatywne metodologie izolacji pierwotnej mikroglei ^9-12. Homogenizowaną tkankę mózgową można rozdzielić za pomocą wirowania w gradiencie gęstości w celu uzyskania pierwotnej mikroglei ¹². Jednakże wirowanie to trwa umiarkowany czas (45 min) i może powodować uszkodzenia oraz aktywację komórkową, a także prowadzić do wzbogacenia populacji mikroglei i innych typów komórek. Inny protokół wykorzystywany do izolacji pierwotnej mikroglei u różnych organizmów opiera się na przedłużonym (16 hr) wstrząsaniu w hodowli ^9-11. Po wstrząsaniu supernatant pożywki jest wirowany w celu wyizolowania mikroglei. Ta dłuższa, dwuetapowa metoda izolacji może również zaburzać funkcje i stan aktywacji mikroglei. W naszym laboratorium stosujemy głównie następujący protokół izolacji mikroglei z kilku powodów: (1) pierwotna mikrogleja wierniej odwzorowuje biologię in vivo niż unieśmiertelnione linie komórkowe mikroglei gryzoni, (2) minimalna destrukcja mechaniczna ogranicza potencjalne dysfunkcje lub aktywację komórkową oraz (3) można uzyskać wystarczającą wydajność bez konieczności pasażowania mieszanych kultur komórek glejowych.

Należy zauważyć, że niniejszy protokół wykorzystuje tkankę mózgową noworodków szczurów do izolacji mikrogleju i że użycie starszych szczurów do izolacji mikrogleju może znacząco wpłynąć na wydajność, stan aktywacji oraz właściwości funkcjonalne wyizolowanych komórek. Istnieją dowody na to, że starzenie wiąże się z dysfunkcją mikrogleju, zwiększonym stanem neurozapalnym i patologiami neurodegeneracyjnymi, dlatego w poprzednich badaniach wykorzystywano mikroglej dorosłych osobników ex vivo, aby lepiej zrozumieć rolę mikrogleju w chorobach neurodegeneracyjnych, w których starzenie jest istotnym parametrem. Jednakże mikroglej ex vivo nie może być utrzymywany w kulturze przez dłuższy czas. Zatem, choć niniejszy protokół przedłuża żywotność pierwotnych kultur mikrogleju, należy pamiętać, że komórki te zachowują się inaczej niż mikroglej dorosłych osobników, a wyniki badań in vitro powinny być ostrożnie interpretowane przy przenoszeniu ich na warunki in vivo.

Protokół

1. Disekcja tkanki mózgu noworodka szczura

1. Schłodzić warunkowane medium Leibovitz'a L-15 (Leibowitz L-15 + 0,1% BSA + 1% Pen/Strep) do 4 °C. Podgrzać medium hodowlane (DMEM + 10% FBS + 1% penicylina/streptomycyna) do 37 °C. Przygotować 4 szalki Petriego o wymiarach 60x15 mm z 4-5 ml warunkowanego medium L-15 na lodzie. Wszystkie narzędzia chirurgiczne wysterylizować 100% etanolem.
2. Opłukać noworodki szczurów w wieku P2 70% etanolem. (W niniejszym protokole można stosować noworodki szczurów w wieku od P1 do P5).
3. Szybko odciąć głowę noworodka szczura za pomocą sterylnych, ostrych nożyczek i niezwłocznie zanurzyć ją w 70% etanolu. Powtórzyć czynność dla łącznie 5 noworodków szczurów, a następnie przenieść głowy do roztworu soli fizjologicznej.
4. Wyjąć całe mózgi z głów i umieścić je w szalce Petriego z 4-5 ml roztworu L-15 (Leibowitz L-15 + 0,1% BSA + 1% Pen/Strep) na lodzie.
5. Powtórzyć procedury 1.2 - 1.4 dla pozostałych noworodków z miotu.
6. Usunąć oponami mózgowymi i przenieść pożądaną tkankę mózgową (np. korę, móżdżek, cały mózg itp.) do nowej szalki Petriego z 4-5 ml roztworu L-15 (Leibowitz L-15 + 0,1% BSA + 1% Pen/Strep) na lodzie.

2. Przygotowanie mieszanej populacji komórek glejowych

1. Przenieś tkankę za pomocą pipety 10 ml do sterylnej probówki stożkowej 50 ml, uważając, aby nie uszkodzić tkanki mózgowej nożyczkami ani ostrzem.
2. Wiruj probówkę stożkową przy 2,500 RCF przez 5 min w temperaturze 4 °C.
3. Odssij supernatant. Dodaj 4-5 ml świeżej pożywki L-15 (Leibowitz L-15 + 0,1% BSA + 1% Pen/Strep).
4. Przenieś tkankę w górę i w dół pipetą 10 razy, używając sterylnej pipety 10 ml.
5. Umieść sitko do komórek (oczka 100 μm) na świeżej probówce stożkowej 50 ml. Przenieś tkankę w górę i w dół raz za pomocą sterylnej pipety 5 ml, a następnie, trzymając pipetę równolegle do sitka, przelej materiał przez sitko do probówki stożkowej.
6. Przepłucz sitko do komórek 4-5 ml świeżej pożywki L-15 (Leibowitz L-15 + 0,1% BSA + 1% Pen/Strep).
7. Wiruj probówkę stożkową z przesianymi komórkami przy 2,500 RCF przez 5 min w temperaturze 4 °C.

3. Wysiewanie i utrzymywanie mieszanych kultur komórek glejowych

1. Dla każdego przetworzonego mózgu młodego szczura przygotuj jedną sterylną kolbę T-75, wlewając do każdej z nich 12 ml pożywki hodowlanej (DMEM + 10% FBS + 1% penicyliny/streptomycyny).
2. Odsaj pożywkę znad osadu komórkowego i dodaj do pelletu komórkowego 5-6 ml pożywki hodowlanej. Przenieś zawiesinę w górę i w dół 10 razy za pomocą pipety 10 ml.
3. Przenieś równą objętość zawiesiny komórkowej do każdej kolby T-75.
4. Inkubuj kolby w inkubatorze z 5% CO₂ w temperaturze 37 °C przez łącznie od 1 do 3 tygodni.
5. Kolby należy inkubować najpierw przez 5 dni, a w piątym dniu wymienić pożywkę w każdej kolbie na 12 ml świeżej pożywki i ponownie umieścić je w inkubatorze. Następnie, co 3 dni, wymieniaj pożywkę kondycjonowaną w każdej kolbie na 12 ml świeżej pożywki, aż do uzyskania konfluencji. Należy to robić bardzo ostrożnie, aby nie dotknąć dna kolb, do którego przytwierdzone są komórki.

4. Izolacja i wysiew pierwotnych mikroglejów

1. Po całkowitym zrośnięciu mieszanych kultur glejowych, wyjmij kolby z inkubatora i owiń ich zakrętki parafilmem, aby zapobiec wymianie gazowej z powietrzem otoczenia.
2. Wstrząsaj kolby z częstotliwością 100 rps (Lab Companion SI-600, Jeio Tech) przez 1 hr w temperaturze 37 °C.
3. Zbierz pożywkę ze wszystkich kolb za pomocą pipety 10 ml, nie naruszając warstwy astrocytów na powierzchni kolby. Przenieś pożywkę do probówek stożkowych o pojemności 50 ml. Dolej świeżą pożywkę do kolb i wprowadź je z powrotem do inkubatora.
4. Wiruj probówki stożkowe przy 2,500 RCF przez 5 min w temperaturze 4 °C.
5. Odsuń nadmiar cieczy znad osadu we wszystkich probówkach stożkowych. Osady komórkowe stanowią wysokiej czystości komórki mikrogleju. Resuspenduj osady w 1 ml pożywki do wysiewu mikrogleju (DMEM + 10% FES + 1% Penicillin/Streptomycin).
6. Oznacz gęstość komórek w resuspendowanej pożywce za pomocą hemocytometru.
7. Dodaj odpowiednią objętość pożywki do wysiewu mikrogleju, aby uzyskać gęstość 2 x 10e5 cells per ml. Wysiej zgodnie z wymogami analizy eksperymentalnej.
8. Pozostaw mikroglej do przytwierdzenia przez noc.

5. Reprezentatywne wyniki

Opisany powyżej protokół pozwala na uzyskanie pierwotnych kultur mikrogleju o wysokiej czystości. Jak ustalono w badaniu immunohistochemicznym z użyciem markera specyficznego dla makrofagów/mikrogleju (Iba1), wysiane kultury mikrogleju są czyste w > 90% (Rysunek 2). Ponadto barwienie markerami specyficznymi dla astrocytów, oligodendrocytów i neuronów wykazuje minimalne zanieczyszczenie (Rysunek 2). Po ustaleniu mieszanych kultur komórek glejowych mikroglej można wyizolować poprzez wstrząsanie do 4 razy pod rząd. Pierwsza izolacja mikrogleju dostarczy około 2,2 x 10ˆ6 komórek/ml lub około 9 milionów komórek z 10 kolb, a spodziewana wydajność zmniejsza się z każdym kolejnym wstrząsaniem. Mikroglej izolowany tą metodą był z powodzeniem wykorzystywany do badania zdolności fagocytarnych, funkcji takich jak produkcja tlenku azotu oraz toksyczności neuronalnej (Rysunek 3) ^13-14.

Rysunek 1. Przegląd protokołu przygotowania mieszanych hodowli komórek glejowych i izolacji pierwotnego mikrogleju.

Rycina 2. Izolacja mikrogleju o wysokiej czystości potwierdzona analizą immunohistochemiczną z użyciem markerów specyficznych dla mikrogleju (Iba-1, czerwony), astrocytów (GFAP, zielony), neuronów (NeuN, czerwony) i oligodendrocytów (CC1, czerwony). Przedstawiono również barwienie DNA komórek w hodowli za pomocą DAPI (niebieski).

Rysunek 3. Mikroglej wyizolowany opisaną metodą został wykorzystany w szeregu testów, w tym, między innymi, w testach fagocytozy, testach funkcji oraz badaniach neurotoksyczności. W badaniach tych stwierdzono, że mikroglej (Iba-1 dodatni, zielony), po ekspozycji na pożywkę kontrolną (A) lub traktowaną LPS (B), zwiększa fagocytozę znakowanych fluorescencyjnie kulek lateksowych (czerwone), co można ilościowo określić (C). Ponadto traktowanie LPS (1ng/ml) może zwiększyć produkcję tlenku azotu w mikrogleju (D). Wreszcie, w hodowlach mikrogleju i neuronów, zarówno rozdzielonych wkładkami transwell, jak i w kokulturach bezpośrednich, wykazano, że mikroglej inkubowany z LPS może indukować śmierć komórek neuronalnych, co zmierzono za pomocą uwalniania dehydrogenazy mleczanowej (LDH) (E, F).

Dyskusja

Choć protokół ten jest rutynowo wykorzystywany do pozyskiwania czystych i zdrowych mikroglejów na potrzeby eksperymentów badawczych, staranne uwzględnienie aspektów technicznych podczas krytycznych etapów procedury pozwoli zminimalizować zmienność w wyizolowanych komórkach mikrogleju. Po pierwsze, podczas preparowania tkanki mózgowej z noworodków szczura, konieczna jest sprawna i szybka praca, aby zminimalizować uszkodzenia tkanki wynikające z niedotlenienia i niedokrwienia. Niezwykle ważne jest jednak również całkowite ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Szalki Petriego 60 mm x 15 mm	Fisher brand	0875713A
Ostre nożyczki do dyssekcji	Fine Science Tools	14094-11
Pinceta Dumont #7b – końcówki standardowe, zakrzywione, 11 cm	Fine Science Tools	11270-20
Pinceta Dumont #5 – końcówki standardowe, proste, 11 cm	Fine Science Tools	11251-10
Stożkowe probówki wirówkowe 50 ml	VWR	89039-656
Pipety serologiczne 5 ml	Grenier Bio One	606180
Pipety serologiczne 10 ml	Grenier Bio One	607180
Sterylne nylonowe sitko do komórek 100 μm	Falcon	35-2360
Flaski do hodowli tkankowej 75 cm2	Corning	430641
Podłoże DMEM (Dulbecco's minimal essential medium)	Gibco (Invitrogen)	31053-028
Podłoże L-15 Leibovitza	Gibco (Invitrogen)	11415064
Płodowa surowica bydlęca	Gibco(Invitrogen)	16000-036
Płodowa surowica końska	Fisher	SH3007402
Penicylina-Streptomycyna	Gibco (Invitrogen)	15140163
Etanol 100%	The Warner Graham Company	64-17-5
Roztwór soli fosforanowo-buforowanej (PBS), 10X, pH 7.4	Quality Biological, inc.	119-069-131	1X w sterylnej wodzie destylowanej
Worki na odpady biologiczne	VWR	14220-028
Hemocytometr	Hausser Scientific	1492
6-dołkowe płytki do hodowli komórek z powierzchnią cellBIND	Corning	3335