Inżynieria i ewolucja syntetycznych wektorów terapii genowej opartych na wirusach adeno-zależnych (AAV) za pomocą tasowania rodzin DNA

Podsumowanie

Prezentujemy podstawową technikę inżynierii molekularnej i ewolucji syntetycznych wektorów do terapii genowej opartych na wirusach towarzyszących adenowirusom (AAV) za pomocą tasowania rodzin DNA (DNA family shuffling). Ponadto przedstawiamy ogólne wytyczne oraz reprezentatywne przykłady selekcji i analizy poszczególnych chimerycznych kapsydów o ulepszonych właściwościach w odniesieniu do komórek docelowych w hodowli lub u myszy.

Streszczenie

Wektory oparte na wirusach towarzyszących adenowirusom (AAV) stanowią jedne z najskuteczniejszych i najbardziej obiecujących nośników dla terapeutycznego transferu genów u ludzi dzięki unikalnemu połączeniu korzystnych właściwości¹. Należą do nich apatogenność wirusów dzikich oraz wysoce zaawansowane metodologie produkcji rekombinowanych wektorów o wysokim mianie, wysokiej czystości i jakości klinicznej². Kolejną szczególną zaletą systemu AAV w porównaniu z innymi wirusami jest dostępność bogatego zbioru naturalnie występujących serotypów, które różnią się kluczowymi właściwościami, a jednocześnie mogą być łatwo przekształcane w wektory przy użyciu wspólnego protokołu^1,2. Co więcej, szereg grup, w tym nasza, opracowało ostatnio strategie wykorzystania tych naturalnych wirusów jako matryc do tworzenia wektorów syntetycznych, które albo łączą cechy wielu serotypów wyjściowych, albo ulepszają właściwości pojedynczego izolatu. Odpowiednie technologie służące do osiągnięcia tych celów to albo przetasowanie rodzin DNA (DNA family shuffling)³, t.j. fragmentacja różnych genów kapsydu AAV, a następnie ich ponowne złożenie w oparciu o częściowe homologie (zazwyczaj >80% dla większości serotypów AAV), albo prezentacja peptydów (peptide display)^4,5, t.j. insercja zazwyczaj siedmiu aminokwasów do eksponowanej pętli kapsydu wirusowego, gdzie peptyd w idealnym przypadku pośredniczy w ponownym kierowaniu (re-targeting) do pożądanego typu komórek. Aby osiągnąć maksymalny sukces, obie metody są stosowane w sposób wysokoprzepustowy, w którym protokoły są skalowane w górę w celu uzyskania bibliotek obejmujących około miliona odrębnych wariantów kapsydu. Każdy klon składa się następnie z unikalnej kombinacji licznych wirusów rodzicielskich (podejście przetasowania DNA) lub zawiera charakterystyczny peptyd w tym samym szkielecie wirusowym (podejście prezentacji peptydów). Następnym, końcowym krokiem jest iteracyjna selekcja takiej biblioteki na komórkach docelowych w celu wzbogacenia populacji o poszczególne kapsydy spełniające większość lub idealnie wszystkie wymogi procesu selekcji. Ta ostatnia najlepiej łączy presję pozytywną, taką jak wzrost na określonym, interesującym nas typie komórek, z selekcją negatywną, na przykład eliminacją wszystkich kapsydów reagujących z przeciwciałami anty-AAV. Takie połączenie zwiększa szansę, że syntetyczne kapsydy, które przetrwają selekcję, będą odpowiadać potrzebom danego zastosowania w sposób, który prawdopodobnie nie zostałby znaleziony w żadnym naturalnie występującym izolacie AAV. Tutaj skupiamy się na metodzie przetasowania rodzin DNA jako teoretycznie i eksperymentalnie bardziej wymagającej z tych dwóch technologii. Opisujemy i demonstrujemy wszystkie kluczowe kroki generowania i selekcji przetasowanych bibliotek AAV (Rys. 1), a następnie omawiamy pułapki i krytyczne aspekty protokołów, o których należy wiedzieć, aby odnieść sukces w molekularnej ewolucji AAV.

Protokół

1. Przygotowanie zestawów plazmidów kodujących geny kapsydu AAV

1. Aby ułatwić rutynowe przygotowanie wystarczających ilości różnych genów kapsydu (cap) AAV do późniejszego tasowania DNA (DNA shuffling), należy początkowo subklonować te geny do wspólnego szkieletu plazmidowego. Ważne jest uwzględnienie identycznych sekwencji flankujących o długości >20 nukleotydów, które posłużą później jako miejsca wiązania starterów dla zagnieżdżonej reakcji PCR oraz do klonowania (Rys. 2).
2. Przy użyciu odpowiednich starterów (patrz tabela z przykładowymi starterami dla AAV5) należy przeprowadzić amplifikację PCR wybranych genów cap z powszechnie dostępnych plazmidów AAV, które zazwyczaj zawierają gen rep AAV2 obok wybranego genu cap. Ponieważ produkt PCR zostanie wykorzystany do standardowego klonowania, wystarczająca jest ilość ~1 μg oczyszczonego produktu, w związku z czym można zastosować dowolny konwencjonalny protokół PCR.
3. Należy przeprowadzić trawienie oczyszczonego produktu PCR (np. stosując oczyszczanie w żelu agarozowym lub standardowy zestaw do oczyszczania produktów PCR) oraz plazmidu biorcy za pomocą enzymów restrykcyjnych, których miejsca rozpoznawania znajdują się w starterach użytych do amplifikacji cap (1.1), a także w plazmidzie biorcy. W naszym laboratorium stosujemy miejsca Pac I i Asc I (Rys. 2), ponieważ nie występują one w większości wirusów AAV.

2. Fragmentacja genu Cap z wykorzystaniem DNazy

1. Przeprowadź amplifikację PCR wybranych genów cap z plazmidów otrzymanych w krokach 1.1-1.3. Jedna reakcja, opisana poniżej, pozwoli uzyskać ok. 3 μg produktu PCR. W zależności od liczby genów cap, które mają zostać włączone do biblioteki, ilość ta jest wystarczająca dla maksymalnie sześciu reakcji tasowania.
2. W celu przeprowadzenia PCR przygotuj 50 μl mieszaniny reakcyjnej zawierającej 200 ng plazmidu cap, każdą z pary starterów w końcowym stężeniu 2 μM, 10 μl buforu 5x Hifi oraz 1 μl polimerazy Hifi. Rozpocznij od 5 min w 95 °C, a następnie przeprowadź 40 cykli: 15 s w 94 °C, 30 s w 57 °C oraz 3 min w 68 °C, kończąc etapem końcowym przez 10 min w 72 °C. Oczyść produkty PCR za pomocą żelu lub zestawu do oczyszczania, a następnie przeprowadź kontrolowane trawienie DNazą, aby utworzyć fragmenty genów cap do ponownego złożenia w chimery.
3. W tym celu wymieszaj w równych częściach poszczególne produkty PCR genów cap do całkowitej ilości 4 μg w 54 μl H₂O. Do reakcji dodaj 6 μl buforu do reakcji z DNazą i 0,5 μl DNazy I, ostrożnie uderz trzy razy dnem probówki o dłoń, krótko wiruj i natychmiast umieść na bloku grzewczym w 25 °C. Inkubuj od 1 do 2 min (przygotuj kilka równoległych reakcji i przerywaj je w odstępach 15 s), a następnie zatrzymaj reakcję, dodając 6 μl 25 mM EDTA, krótko mieszając w wirówce typu vortex i inkubując przez 10 min w 75 °C.
4. Oczyść fragmenty cap na standardowym 1% żelu agarozowym. W idealnym przypadku między 100 a 500 parami zasad powinien być widoczny rozmaz. Ponieważ DNaza I jest enzymem o bardzo wysokiej aktywności, właściwa obsługa i czas trwania są w tym kroku krytyczne, a dla uzyskania optymalnych wyników może być konieczne zastosowanie wielu wariantów czasu inkubacji w kroku 2.3 (Ryc. 3). Oczyść eluowane DNA za pomocą standardowego zestawu i określ jego stężenie.

3. Przetasowanie rodzin DNA (DNA Family Shuffling)

1. W pierwszej kolejności zrekonstruuj fragmenty genu cap w pełnowymiarowe sekwencje za pomocą PCR, w którym ulegają one samopremowaniu w oparciu o częściowe homologie. W tym celu przygotuj reakcję o objętości 50 μl zawierającą 500 ng oczyszczonych fragmentów (krok 2.4), 10 μl 10x buforu Phusion, 1 μl 10 mM dNTPs, 1,5 μl DMSO oraz 0,5 μl polimerazy Phusion II. Inkubuj przez 30 sec w 98 °C, a następnie przeprowadź 40 cykli: 10 sec w 98 °C, 30 sec w 42 °C i 45 sec w 72 °C, kończąc etapem finalnym: 10 min w 72 °C.
2. W kolejnej, drugiej reakcji PCR, namnóż zrekonstruowane geny cap do późniejszego klonowania, używając starterów wiążących się z konserwatywnymi sekwencjami flankującymi (Rys. 2). W tym celu przygotuj reakcję o objętości 50 μl zawierającą 2 μl produktu z pierwszej reakcji PCR (krok 3.1), każdy starter w końcowym stężeniu 2 μM, 0,5 μl MgCl2, 10 μl 5x buforu Hifi oraz 1 μl polimerazy Hifi. Zaleca się przeprowadzenie od 16 do 24 reakcji PCR, aby zapewnić wystarczająco wysoką wydajność do późniejszego klonowania. Połącz produkty PCR i oczyść pełnowymiarowy prążek cap (za pomocą żelu lub zestawu do oczyszczania).
3. Przetraw oczyszczoną pulę genów cap enzymami Pac I oraz Asc I w celu klonowania do kompetentnego replikacyjnie plazmidu AAV zawierającego ITR AAV (odwrócone powtórzenia końcowe; sygnały replikacji i pakowania) oraz gen rep AAV2. Za tym ostatnim powinny następować te same miejsca restrykcyjne, aby umożliwić wstawienie puli genów cap „w ramce odczytu” (szczegóły patrz na Rys. 2). Aby uzyskać całkowite przetrawienie produktu PCR, inkubuj go przez noc z nadmiarem enzymu.
4. Przeprowadź ligację fragmentów cap i odpowiednio przeciętego szkieletu AAV ITR/rep w stosunku molowym 3:1. Przygotuj mastermix o całkowitej objętości 40 μl (wystarczający dla 20 transformacji) z końcowym stężeniem DNA 50 ng/μl i inkubuj przez noc w 16 °C.
5. Przeprowadź transformację reakcji ligacji, mieszając (na lodzie) 2 μl mieszaniny z 30 μl elektrokompetentnych komórek E. coli (wyhodowanych z komórek komercyjnych i uczynionych kompetentnymi zgodnie z dowolnym standardowym protokołem). Przenieś mieszaninę do schłodzonych wcześniej kuwet do elektroporacji (odstęp 1 mm) na lodzie. Wykonaj elektroporację przy 1,8 kV, 200 Ω i 25 μF. Stała czasowa powinna wynosić około 5 ms. Natychmiast dodaj 1 ml podgrzanego wcześniej podłoża SOC i przenieś do kolby o pojemności 250 ml. 20 takich elektroporacji pozwoli uzyskać bibliotekę o różnorodności około 1x10⁶ różnych klonów.
6. Do połączonych transformacji dodaj 1 objętość podgrzanego wcześniej podłoża SOC i inkubuj przy wytrząsaniu w 37 °C i 180 rpm przez 1 h. Następnie zwiększ całkowitą objętość do 800 ml za pomocą podłoża LB z dodatkiem ampicyliny (końcowe stężenie 50 μg/ml) i inkubuj przez kolejne 16 h w tych samych warunkach. Oczyść DNA plazmidowe biblioteki, używając np. zestawu Qiagen Mega prep.

Opcjonalnie w kroku 3.6: Aby obliczyć dokładną różnorodność biblioteki, należy wysiać alikwot roztworu o objętości 800 ml (przed 16-godzinną inkubacją) na płytki LB z ampicyliną (np. 10 μl na płytkę 10 cm) i zliczyć kolonie następnego dnia. Ponadto, w celu potwierdzenia wysokiej wydajności tasowania, należy przeprowadzić sekwencjonowanie np. 24 klonów i dopasować je do rodzicielskich genów cap (patrz również Rys. 8). Na koniec, aby potwierdzić żywotność biblioteki i wysoką różnorodność funkcjonalną, należy subclonować losowo wybrane geny cap do pomocniczego plazmidu AAV, a następnie wykorzystać je do produkcji i analizy wektorów rekombinowanych w małej skali (Rys. 4-5) (patrz również krok 5.4 poniżej).

4. Produkcja biblioteki wirusowej

1. Zasiać 10 15 cm² szalki z komórkami HEK293T (4,5x10⁶ komórek/szalkę) i po 48 h przeprowadzić transfekcję 220 μbiblioteka AAV i 220 μplazmid adenowirusowy (wymagany do propagacji AAV). Należy zatem uprzednio ogrzać PEI (polyethylenimine) oraz 300 mM NaCl do 37 °C. Następnie wymieszać 7,9 ml NaCl i DNA, a potem dodać H₂do całkowitej objętości 15,8 ml. W oddzielnej probówce zmieszaj 3,52 ml PEI, 7,9 ml NaCl i 4,38 ml H2O₂O (wszystkie objętości dla dziesięciu transfekcji). Połączyć mieszaniny (wymieszać w wortexie) i inkubować przez 10 min w temperaturze pokojowej, a następnie równomiernie rozdzielić roztwór pomiędzy szalki (3 ml na szalkę).
2. Po 48 h zeskrobać komórki do pożywki i odwirować je przy 1200 obr./min przez 15 min. Osad komórkowy zawiesić w 6 ml buforu lizującego (50 mM Tris-HCl pH 8,5, 50 mM NaHCO₃) i poddane 5 cyklom zamrażania i rozmrażania (-80/37 °C). Inkubować z 50 U benzonazy na ml przez 1 h w temperaturze 37°C °C, przed odwirowaniem resztek komórkowych przy 3750 obr./min przez 20 min.
3. Przygotować rozcieńczenia 15%, 25% i 40% (z 2,5 μl/ml czerwieni fenolowej) z zapasu 60% jodiksanolu (OptiPrep w PBS-MK) w PBS-MK (1x PBS, 1 mM MgCl2)₂, 2,5 mM KCl).
4. Przygotuj gradient do oczyszczania AAV, używając pipety Pasteura do dodania 5 ml zawiesiny wirusa do probówki wirówkowej Beckman Quick-Seal (14x89 mm), a następnie dodając po 1,5 ml roztworów jodiksanolu o stężeniach 15%, 25% i 40%. Uzupełnij gradient buforem do lizy.
5. Ultrawirówka przy 50 000 obr./min przez 2 h w temperaturze 4°C °C w wirniku Beckman Ti70.1. Następnie należy przemyć zewnętrzną stronę probówki 70% etanolem, wbić igłę w górną część probówki w celu zapewnienia wentylacji i odessać 1,2 ml frakcji 40% jodiksanolu za pomocą igły. Należy uważać, aby nie pobrać materiału z frakcji 25%, ponieważ zawiera ona puste kapsydy AAV.

5. Przesiewanie i selekcja

1. Na tym etapie można iteracyjnie amplifikować całą bibliotekę w hodowlach komórkowych lub w organizmach zwierzęcych, aż do pojawienia się kapsydów chimerycznych wykazujących pożądane właściwości (Rys. 6-11).
2. Aby przeprowadzić selekcję w hodowlach komórkowych, należy koinfekować różne aliquoty biblioteki (np. 1, 10 i 100 μl) oraz Adenowirusem-5 w celu wsparcia wzrostu AAV. Testowanie wielu wariantów biblioteki i pomocniczego adenowirusa jest niezbędne, ponieważ zakaźności biblioteki w danym typie komórek nie da się przewidzieć. Komórki zbiera się po ok. 3 dniach, amplifikowany AAV ekstrahuje poprzez zamrażanie i rozmrażanie, adenowirusy inaktywuje przez 30 min w 56 °C, a następnie ponownie infekuje nowe komórki. Procedurę powtarza się do 5 razy, aż do wzbogacenia konkretnych kapsydów (walidacja poprzez sekwencjonowanie).
3. W przypadku selekcji u zwierząt, należy zainfekować je biblioteką i po ok. 1 tygodniu wyekstrahować pożądaną tkankę lub typ komórek. Nie należy stosować koinfekcji adenowirusem, ponieważ spowodowałoby to niepożądany toksyczność u zwierząt. DNA wirusa odzyskuje się za pomocą PCR, stosując te same primery co poprzednio (Rys. 2), ponownie klonuje pulę cap, produkuje nową bibliotekę i powtarza proces, aż do wzbogacenia konkretnych kapsydów (walidacja poprzez sekwencjonowanie).
   1. Dokładne warunki (objętość, miano, droga podania) selekcji in vivo będą zależeć od docelowej tkanki. W przypadku wątroby myszy są zazwyczaj infekowane 1x10¹¹ do 1x10¹² cząstek wirusa w całkowitej objętości 200 μl PBS poprzez wstrzyknięcie dożylnie do żyły ogonowej (IV). Czynnikiem ograniczającym jest zazwyczaj miano wirusa w pierwotnym preparacie, ponieważ wstrzyknięcie 1x10¹² AAV w 200 μl wymaga miana co najmniej 5x10¹²/ml, czego nie wszystkie laboratoria mogą rutynowo osiągać. Zatem, choć maksymalne miano jest korzystne przy pierwszej infekcji (ponieważ biblioteka nie została jeszcze wzbogacona o wydajne kapsydy w danej tkance i może zatem wykazywać stosunkowo niską ogólną zakaźność), zalecamy stosowanie co najmniej 1x10¹¹ cząstek na mysz w przypadku selekcji w wątrobie.
   2. Jeśli dostępnych jest wiele myszy, bardzo użyteczne jest wstrzykiwanie różnych liczb cząstek, analogicznie do selekcji w hodowlach komórkowych, oraz stosowanie kilku myszy w grupie (a następnie łączenie zebranych wątrób w obrębie każdej grupy) w celu zminimalizowania zmienności i zwiększenia wskaźnika sukcesu, np. 3 myszy przy 1x10¹¹ i 3 myszy przy 1x10¹² cząstek.
   3. Ponieważ AAV jest wirusem niepatogennym i niezdolnym do replikacji (bez wirusa pomocniczego), w przypadku braku adenowirusa nie należy spodziewać się wystąpienia niepożądanych reakcji.
   4. W celu eutanazji zwierzęta znieczulono za pomocą waporyzatora izofluranu, a następnie uśmiercono poprzez zwichnięcie stawu szczytowo-potylicznego.
   5. Tkanki (w tym przypadku wątrobę) pobierano po potwierdzeniu eutanazji zwierząt. W ogólnym ujęciu, w przypadku innych tkanek nie ma potrzeby perfuzji zwierząt ani pobierania zainfekowanych AAV organów przed śmiercią, ponieważ DNA AAV jest stabilne i można je łatwo odzyskać z zamrożonych komórek/tkanek.
4. Aby badać pojedyncze kapsydy (z biblioteki (krok 3.6) lub po selekcji (kroki 5.2-5.3)), należy wyprodukować wektory AAV kodujące gen reporterowy (np. gfp⁶), postępując zgodnie z krokami 4.1-4.5. W tym celu należy sklonować interesujący gen cap do standardowego plazmidu pomocniczego AAV². W kroku 4.1 należy przeprowadzić potrójną transfekcję komórek, stosując po 14.7 μg wektora AAV (kodującego reporter), pomocnika AAV oraz pomocnika adenowirusowego. Zainfekowano hodowle komórkowe lub zwierzęta oczyszczonym wirusem w różnych ilościach i określono wydajność transdukcji np. za pomocą FACS lub mikroskopii.

6. Reprezentatywne wyniki

Zastosowanie opisanego tutaj protokołu zazwyczaj pozwala na uzyskanie bibliotek wirusowych o różnorodności około 1x10⁶ unikalnych kapsydów, które mogą następnie zostać poddane przesiewaniu w celu wyłonienia pojedynczych cząstek wykazujących większość lub wszystkie pożądane właściwości na danej linii komórkowej lub w organizmach zwierzęcych. Poniżej przedstawimy reprezentatywne przykłady wyników z takich przesiewów in vitro lub in vivo.

Przed tym jednak uważamy za ważne, aby ponownie wskazać na użyteczność analizy poszczególnych klonów z oryginalnej biblioteki plazmidowej pod kątem ich funkcjonalności i różnorodności (opcjonalnie w kroku 3.6). Wynika to z faktu, że dwa ostatnie parametry są krytycznymi warunkami wstępnymi dla powodzenia selekcji właściwej biblioteki wirusowej, która jest tworzona na podstawie biblioteki plazmidowej. Można zatem losowo wybrać pojedyncze przetasowane geny cap i wykorzystać je do produkcji rekombinowanych wektorów AAV (ekstraktów surowych lub oczyszczonych cząsteczek, w zależności od pożądanego stopnia dokładności) wykazujących ekspresję łatwo wykrywalnego i mierzalnego genu reporterowego. Typowym testem służącym do porównania różnych wariantów kapsydu jest następnie mikroskopia fluorescencyjna, co przedstawiono na reprezentatywnym przykładzie na Rys. 4.

Alternatywną metodą jest pomiar ekspresji fluorescencyjnego genu reporterowego za pomocą FACS, która oferuje dodatkowe korzyści w postaci możliwości oznaczenia ekspresji genów na pojedynczą komórkę, a także jest możliwa do zastosowania w przypadku komórek w zawiesinie. Rys. 5 przedstawia typowy wynik takiej analizy FACS przeprowadzonej na surowych lizatach wektorów AAV w różnych typach komórek.

Ponieważ opisany powyżej wybór poszczególnych chimer cap jest przypadkowy i ograniczony, nie jest on oczywiście użyteczny jako rzeczywiste podejście do wzbogacania pożądanych kandydatów. Zamiast tego bardziej odpowiednia jest selekcja biblioteki wirusowej w komórkach docelowych lub tkankach zwierząt. Ponieważ warunki i parametry będą się różnić w zależności od zastosowania, przedstawimy jedynie kilka reprezentatywnych wytycznych i wyników.

Najprostszym wyborem jest iteracyjna amplifikacja biblioteki na hodowlach linii komórkowych lub komórkach pierwotnych (krok 5.2). Ponieważ AAV wymaga koinfekcji adenowirusem do swojej propagacji, komórki docelowe muszą być podatne na zakażenie adenowirusem. Można je następnie hodować i infekować np. w płytkach 6-dołkowych, które zapewniają wystarczającą liczbę komórek w dołku, aby zagwarantować pełne pokrycie biblioteki. Drugą istotną kwestią jest to, że równowaga między AAV a adenowirusem jest delikatna; zbyt duża ilość AAV będzie hamować adenowirusa, natomiast nadmiar tego drugiego doprowadzi do śmierci komórek (w przeciwieństwie do AAV, adenowirus wywołuje infekcje lityczne) przed momentem, w którym AAV mogłyby się zreplikować.

Ponieważ jednak zakaźność biblioteki w odniesieniu do określonego typu komórek jest nieznana, znalezienie „dobrych” stosunków AAV:Adenowirus, przy których oba mogą się namnażać, wymaga równoległego testowania różnych kombinacji dawek biblioteki i pomocniczego adenowirusa (np. 10:1, 1:1 oraz 1:10). Dobrym miernikiem skutecznej infekcji adenowirusem jest wystąpienie efektów cytopatycznych trzy dni po inokulacji wirusem, objawiających się zaokrągleniem i odrywaniem komórek, co pokazano na Ryc. 6. I odwrotnie, użytecznym odczytem dla infekcji i amplifikacji AAV jest detekcja białek kapsydu metodą Western blotting, z użyciem przeciwciała B1, które rozpoznaje wysoce konserwatywny epitop kapsydu AAV (Ryc. 7)⁷.

Kolejną ważną decyzją jest wybór surowych ekstraktów AAV do późniejszej reinfekcji nowych komórek (krok 5.2). Idealnie należy wybrać te, w których prążki kapsydu AAV są najmniej wyraźne (Rys. 7), ponieważ sugeruje to silne powiązanie genotypu z fenotypem. To ostatnie opisuje sytuację, w której genom kodujący konkretny wariant kapsydu jest rzeczywiście zapakowany do odpowiadającego mu kapsydu. Osiągnięcie i utrzymanie silnego powiązania genotypu z fenotypem jest kluczowe dla skutecznej selekcji poszczególnych kandydatów wirusowych, ponieważ zapewnia to, że kapsydy o pożądanych właściwościach dostarczą cognatywny matrycy genetycznej do komórek podczas kolejnych rund infekcji. Dlatego zalecamy wybór surowych ekstraktów z umiarkowaną ekspresją kapsydu do reinfekcji oraz stosowanie ich w minimalnych ilościach. Te dwa środki wspólnie zapobiegną przeciążeniu nowo zainfekowanych komórek różnymi kombinacjami kapsyd/genom, co w przeciwnym razie mogłoby zakłócić powiązanie genotypu z fenotypem, gdy reinfekowane wirusy zaczną się replikować i ponownie pakować swoje genomy do niecognatywnych kapsydów.

Ponadto kluczowe jest monitorowanie różnorodności biblioteki podczas powtarzanych rund infekcji za pomocą sekwencjonowania DNA. W idealnym przypadku zauważalne będą zmiany w składzie poszczególnych klonów wskazujące na pomyślną selekcję, i.e., kumulację fragmentów konkretnych serotypów i utratę innych, co zilustrowano na Rys. 8. W optymalnym scenariuszu ostatecznie zostanie wykrytych tylko kilka lub nawet pojedynczych klonów, które można następnie analizować zgodnie z powyższym opisem. Jeśli jednak po czterech lub pięciu pasażach nie zaobserwuje się żadnych zmian, należy albo zwiększyć presję selekcyjną (patrz sekcja Dyskusja), albo rozważyć, czy użyta linia komórkowa jest odpowiednia, gdyż może być zbyt podatna na zbyt wiele serotypów.

W przypadku amplifikacji biblioteki in vivo (krok 5.3) obowiązują te same zasady i uwagi, z dwiema istotnymi różnicami: po pierwsze, nie przeprowadza się przesiewu losowo wybranych klonów u zwierząt ze względu na związane z tym koszty i kwestie etyczne. Po drugie, nie stosuje się koinfekcji z pomocniczym adenowirusem, ponieważ wywołuje on toksyczność lub prowadzi do śmierci zwierząt, a ponadto tropizm adenowirusowy ograniczyłby selekcję do komórek podatnych na wirusa pomocniczego. Zamiast tego bibliotekę AAV wstrzykuje się zwierzętom, odzyskuje z komórek lub tkanek docelowych za pomocą PCR (Rys. 9), a następnie ponownie klonuje i pakuje do nowej rundy infekcji. Podobnie jak w przypadku selekcji w hodowli, proces ten jest powtarzany do momentu wyłonienia się poszczególnych kandydatów.

Niezależnie od zastosowanej procedury selekcji, ostatnim etapem jest walidacja wzbogaconych wariantów kapsydów w odpowiednich układach. Rys. 10 oraz 11 przedstawiają reprezentatywne przykłady z naszej wcześniejszej selekcji chimer AAV, które wykazują wyjątkową skuteczność w hodowlach tkankowych lub w wątrobach myszy. Jak pokazano na Rys. 10, jeden konkretny klon (AAV-DJ³) rzeczywiście przewyższa grupę ośmiu naturalnych typów dzikich AAV w szerokim zakresie linii komórkowych. Ponadto inny klon wyselekcjonowany w hodowlach linii hepatoma wykazuje wyższy tropizm do wątroby mysiej i w konsekwencji mniejszy efekt off-targeting po infuzji obwodowej u dorosłych myszy niż silny wektor kontrolny AAV8 przetestowany w bezpośrednim porównaniu (Rys. 11). Należy zauważyć, że mimo większej specyficzności względem wątroby, klon AAV-DN w rzeczywistości transdukuje ten organ nieco mniej wydajnie niż AAV8. W tym względzie AAV-DN jest dobrym reprezentatywnym przykładem wyniku ewolucji i selekcji AAV, w której finalni kandydaci zazwyczaj wykazują szereg pożądanych właściwości, ale niekoniecznie są idealni pod każdym względem.

Rycina 1. Schemat: Syntetyczna inżynieria kapsydu AAV poprzez tasowanie rodzin DNA i następującą po nim selekcję w komórkach lub u zwierząt. Kroki protokołu są zaznaczone na szaro.

Rycina 2. Plazmidy donora i biorcy genu cap AAV stosowane w naszym laboratorium do tasowania rodzin DNA i generowania bibliotek. Należy pamiętać, że są to jedynie przykłady reprezentatywne, a dokładne miejsca i sekwencje mogą być modyfikowane. Nasz podstawowy plazmid donora pochodzi z komercyjnie dostępnego wektora pBlueScript II KS(+), który zmodyfikowaliśmy tak, aby zawierał przedstawione miejsca wiązania starterów oraz miejsca restrykcyjne, oznaczone odpowiednio strzałkami lub trójkątami. Następnie do plazmidu tego sklonowano geny cap serotypów AAV 1-9 (amplifikowane starterami capF/R), tak aby znalazły się one pomiędzy miejscami restrykcyjnymi Pac I a Asc I. Startery T3 i T7 są używane do izolacji cap w kroku 2.2, natomiast późniejsza amplifikacja ponownie złożonych sekwencji chimerycznych (krok 3.2) może być przeprowadzona przy użyciu par starterów SAF/R lub CUF/R, bądź obu w reakcji nested PCR. Plazmid biorcy zdolny do replikacji niesie odwrócone powtórzenia końcowe (ITR, sygnały replikacji i pakowania) AAV flankujące gen rep AAV2 pod kontrolą promotora p5 AAV. Miejsca restrykcyjne Pac I i Asc I poniżej genu rep umożliwiają klonowanie "w ramce" puli tasowanych genów cap. Przedstawione miejsca wiązania starterów Lseq są przydatne do sekwencjonowania genu cap (krok 3.6).

Rycina 3. Przykład trawienia nukleazą DNase I genów cap (AAV2, 8 i 9). Przedstawiono analizę elektroforetyczną w żelu agarozowym produktów trawienia genów cap przy zastosowaniu wskazanych różnych czasów inkubacji (w minutach:sekundach). Ścieżka U przedstawia nietrawioną pulę fragmentów cap jako kontrolę. Wielkości prążków markera DNA w ścieżkach M podano w kilobazach. W tym przykładzie optymalne trawienie uzyskano przy czasach inkubacji 1:45 lub 2:00 min, co pozwoliło otrzymać preferowany dominujący pik w zakresie od 100 do 500 par zasad (żółta ramka).

Rycina 4. Przykład analizy mikroskopowej trzech ludzkich linii komórkowych zainfekowanych pięcioma różnymi rekombinowanymi wektorami AAV wykazującymi ekspresję Yfp (nazwy u góry), stworzonymi z przetasowanych genów cap wybranych losowo z oryginalnej biblioteki opartej na AAV2, 8 i 9.

Rycina 5. Przykład analizy FACS czterech typów komórek zainfekowanych (w seryjnych rozcieńczeniach dziesięciokrotnych) 18 różnymi rekombinantnymi wektorami AAV wykazującymi ekspresję Yfp (nazwy u góry, w tym te z Ryc. 4), stworzonymi z przetasowanych genów cap wybranych losowo z biblioteki pierwotnej (AAV2, 8 i 9). Ekspresja Yfp została oznaczona kolorami w celu ułatwienia wizualizacji. Przedstawiono wartości procentowe transdukowanych komórek, gdzie kolor czarny zawsze oznacza 0%, a biały najwyższą wartość zmierzoną dla każdego typu komórek. Klon B2 (czerwony) jest przykładem klonu o niskiej ogólnej skuteczności, czego można się spodziewać w przypadku nieoselekcjonowanych kapsydów. Należy zauważyć, że analiza FACS jest bardziej czuła i może być również stosowana w przypadku komórek w zawiesinie (takich jak SupT1), które są mniej podatne na analizę mikroskopową. hu, ludzki; mu, mysi.

Rycina 6. Typowy wygląd efektów cytopatycznych w komórkach (w tym przypadku HeLa) po produktywnej koinfekcji AAV i adenowirusem. Komórki pozostały niezinfekowane (lewy górny panel) lub zostały zainfekowane wskazanymi ilościami (cząsteczek na komórkę) adenowirusa.

Rycina 7. Wykrywanie ekspresji białka kapsydu AAV metodą Western blotting jako miara infekcji i amplifikacji biblioteki. Blat po lewej stronie przedstawia komórki współzakażone różnymi objętościami (w μl) biblioteki AAV i pomocniczego adenowirusa. Dwie pierwsze ścieżki są dobrymi przykładami warunków dającymi ledwo wykrywalną ekspresję białka AAV, co wskazuje na wystarczającą, ale nie nadmierną infekcję i amplifikację AAV, a tym samym pożądane ścisłe powiązanie genotypu z fenotypem. W związku z tym do ponownej infekcji świeżych komórek wykorzystano 0,1, 1 lub 10 μl tych supernatantów (blat po prawej). Komórki na ścieżce C zostały zainfekowane samym AAV jako kontrola negatywna (brak wykrywalnej ekspresji ze względu na brak wirusa pomocniczego).

Rycina 8. Porównanie sekwencji białkowych (liczby oznaczają aminokwasy) klonów AAV z biblioteki opartej na AAV2, 8 i 9 przed i po selekcji. Sekwencje powyżej czerwonej linii przedstawiają rodzicielskie AAV. Fioletowe strzałki wskazują zdarzenia rekombinacji homologicznej. Czerwona strzałka oznacza crossing-over między AAV2 a AAV9 odnotowany we wszystkich wybranych klonach.

Rysunek 9. Odzyskiwanie skutecznie zainfekowanych klonów AAV z tkanek mysich za pomocą PCR. W tym przykładzie geny cap AAV zostały namnożone metodą PCR z wątrób myszy pobranych tydzień po obwodowej infuzji biblioteki, z wykorzystaniem pary starterów SAF/R (Rys. 2). Ścieżka 1 pokazuje oczekiwany prążek o wielkości 2,2 kilobazy, natomiast ścieżka 2 to kontrola bez matrycy. Po restrykcji enzymami Pac I i Asc I, namnożone fragmenty zostały ponownie sklonowane do oryginalnego plazmidu biorcy (Rys. 2) w celu późniejszej produkcji i ponownej infuzji biblioteki wtórnej. Wielkości prążków markera DNA na ścieżkach M podano w kilobazach.

Rysunek 10. Przykład wyższej wydajności wzbogaconej chimery AAV w komórkach hodowlanych. Klon AAV-DJ został opisany przez nas wcześniej³; stanowi on głównie hybrydę serotypów AAV 2, 8 i 9 i został wyselekcjonowany z biblioteki zawierającej te trzy oraz pięć dodatkowych serotypów w ludzkich komórkach wątroby w obecności puli ludzkich antyser. Aby porównać jego wydajność z ośmioma naturalnymi serotypami AAV (oznaczonymi na górze jako 1-6, 8 i 9), wszystkie geny cap wykorzystano do produkcji oczyszczonych samouzupełniających wektorów ekspresyjnych Gfp^8,19. Znormalizowano je tak, aby zawierały 2x10⁹ genomów wektorowych na ml, a następnie wykorzystano do transdukcji pokazanych linii komórkowych w dziesięciokrotnych rozcieńczeniach seryjnych. Po trzech dniach policzono komórki ekspresujące Gfp i określono miana zakaźne, uwzględniając czynnik rozcieńczenia. W przeciwieństwie do kodu na Rys. 5, ciemniejsze kolory oznaczają tutaj wyższą zakaźność w przeliczeniu na liczbę cząsteczek. Jak widać, wybrana chimera AAV-DJ przewyższa wszystkie naturalne typy dzikie AAV, co egzemplifikuje sukces zastosowanego schematu selekcji. fibr, fibroblasty; ha, chomik; hu, człowiek; mu, mysi; si, naczelne.

Rycina 11. Przykład analizy wybranej chimery AAV w wątrobie myszy. Klon AAV-DN wyselekcjonowano na liniach komórkowych hepatomy mysiej, a następnie wykorzystano do produkcji wektorów rekombinowanych wykazujących ekspresję lucyferazy⁸. Przedstawiono reprezentatywne myszy (trzy na grupę) tydzień po obwodowej infuzji równych dawek tego wektora lub kontroli opartej na AAV8 typu dzikiego, jednego z najsilniejszych znanych izolatów naturalnych w wątrobie myszy⁹. Należy zauważyć, że choć klon AAV-DN zapewnia nieco mniejszą ogólną ekspresję w wątrobie (panel (I)), jest on bardziej specyficzny dla tego narządu, ponieważ wykazuje znacznie mniejszą ekspresję poza celem w tkankach pozawątrobowych po dostosowaniu poziomów ekspresji w wątrobie za pomocą oprogramowania do obrazowania (panel (II)).

Dyskusja

W niniejszym opracowaniu przedstawiliśmy kluczowe kroki eksperymentalne oraz wytyczne dotyczące inżynierii kapsydu AAV za pomocą przetasowania rodzin DNA (DNA family shuffling) oraz ewolucji w komórkach lub w organizmach zwierzęcych. W istocie protokoły te są standaryzowanymi wersjami procedur, które po raz pierwszy opisaliśmy w dziedzinie AAV w 2008 roku³. Chociaż w licznych badaniach uzupełniających przeprowadzonych przez innych autorów zgłoszono wiele modyfikacji np.,^10-13, nasze obecne ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
DNase I	Invitrogen	18068-015
Polietylenoimina (PEI)	Sigma-Aldrich	408727
Enzymy restrykcyjne	New England Biolabs	Różne
T4 DNA Ligaza	New England Biolabs	M0202T
Zestaw do oczyszczania z żelu	Qiagen	28704
Zestaw z polimerazą Phusion II	Finnzymes	F-540S
Zestaw z polimerazą HotStar Hifi	Qiagen	202602
DMSO	Finnzymes	F-540S (część zestawu)
EDTA (25 mM)	Invitrogen	18068-015 (część zestawu)
Tris	Carl Roth Gmbh	4855.2
Sód ampicyliny	Carl Roth Gmbh	K029.2
dNTPs (10 mM, 100 μl)	Invitrogen	18427013
Iodiksanol (OptiPrep)	Axis-Shield	1114739
Czerwień fenolowa	Merck & Co., Inc.	107241
Zestaw do mega-prep plazmidów	Qiagen	12181
Ultracentryfuga	Beckman Coulter Inc.	Optima L90K
Probówki do wirówki Quick-Seal	Beckman Coulter Inc.	342414
Urządzenie do elektroporacji	Bio-Rad	GenePulserXcell
Termocykler	Eppendorf	Vapo Protect
Blok grzejny	BIOER	MB-102
Mikroskop fluorescencyjny	Olympus Corporation	IX81
Analizator FACS	Beckman Coulter Inc.	Cytomics FC500 MLP
Komórki MegaX DH10B T1R	Invitrogen	C640003
Benzonukleaza	Merck & Co., Inc.	101695
Adenowirus-5	ATCC	VR-5
Plazmid pBlueScript II KS(+)	Stratagene, Agilent Technologies	212207
cap5F (miejsce Pac I na żółto, sekwencje specyficzne dla cap5 pogrubione): GACTCTTAATTAACAGGTATGTCTTTTGTTGATCACCCTCC	IDT	Starter customowy
cap5R (miejsce Asc I na zielono, sekwencje specyficzne dla cap5 pogrubione): GTGAGGGCGCGCCTTAAAGGGGTCGGGTAAGGTATC	IDT	Starter customowy