Chip do hodowli biofilmu Candida albicans (CaBChip) do wysokoprzepustowego przesiewu leków przeciwgrzybiczych

Podsumowanie

Opracowaliśmy platformę wysokiej gęstości do mikromacierzy, składającą się z 3D nano-biofilmów C. albicans, nazwaną CaBChip. Profil wrażliwości leków testowanych na CaBChip jest porównywalny z konwencjonalnym modelem płytki 96-dołkowej, co sugeruje, że chip grzybiczy jest idealnie dostosowany do prawdziwie wysokoprzepustowego przesiewu leków przeciwgrzybiczych.

Streszczenie

Candida albicans pozostaje głównym czynnikiem etiologicznym kandydozy, która obecnie stanowi czwartą najczęstszą nosokomialną infekcję krwi w szpitalach w USA¹. Te infekcje oportunistyczne stanowią rosnące zagrożenie dla coraz większej liczby osób z upośledzoną odpornością i wiążą się z nieakceptowalnie wysokim wskaźnikiem śmiertelności. Wynika to częściowo z ograniczonego arsenału leków przeciwgrzybiczych, ale także z pojawiania się oporności na najczęściej stosowane środki przeciwgrzybicze. Leczenie komplikuje dodatkowo fakt, że większość postaci kandydozy wiąże się z tworzeniem biofilmów, a komórki w tych biofilmach wykazują zwiększony poziom oporności na większość stosowanych klinicznie leków przeciwgrzybiczych². Opisujemy tutaj opracowanie mikromacierzy o wysokiej gęstości, składającej się z nanobiofilmów C. albicans, którą nazwaliśmy CaBChip³. W skrócie, do nanoszenia komórek drożdżaków C. albicans na stałe podłoże wykorzystuje się robotyczny system do tworzenia mikromacierzy. Podczas nanoszenia komórki drożdżaków są zamykane w trójwymiarowej matrycy przy użyciu objętości tak niskiej jak 50 nL i unieruchamiane na szklanym podłożu z odpowiednią powłoką. Po wstępnym nanoszeniu preparaty są inkubowane w 37 °C przez 24 godziny, aby umożliwić rozwój biofilmu. W tym okresie plamki przerastają w w pełni rozwinięte „nanobiofilmy”, które wykazują typowe cechy strukturalne i fenotypowe związane z dojrzałymi biofilmami C. albicans (i.e. złożoność morfologiczną, architekturę trójwymiarową i oporność na leki)⁴. Ogólnie CaBChip składa się z ~750 równoważnych i przestrzennie odrębnych biofilmów, z dodatkową zaletą, że wiele chipów można nanosić i przetwarzać jednocześnie. Żywotność komórek jest szacowana poprzez pomiar intensywności fluorescencji barwnika metabolicznego FUN1 za pomocą skanera mikromacierzy. Ten chip grzybiczy jest idealnie nadający się do zastosowania w rzeczywistym wysokoprzepustowym screeningu w celu odkrywania leków przeciwgrzybiczych. W porównaniu do obecnych standardów (i.e. modelu tworzenia biofilmu na 96-dołkowej płytce mikrotitracyjnej⁵), głównymi zaletami chipa z biofilmem grzybiczym są automatyzacja, miniaturyzacja, oszczędność ilości i kosztów odczynników oraz czasu analizy, a także eliminacja pracochłonnych etapów. Wierzymy, że taki chip znacząco przyspieszy proces odkrywania leków przeciwgrzybiczych.

Protokół

1. Przygotowanie funkcjonalizowanych szkiełek

1. Umieść szkiełka przedmiotowe w wyjmowalnym kasecie i przemyj dwukrotnie, zanurzając je w słoiku do barwienia zawierającym 99% etanol (klasy histologicznej). Wytrzyj szkiełka do czysta ręcznikami papierowymi (dbając o to, by nie generować pyłu papierowego), a następnie osusz strumieniem sprężonego azotu.

UWAGA: Nie należy używać chusteczek Kim-Wipes do wycierania szkiełek, ponieważ mogłoby to spowodować powstanie drobnego pyłu papierowego.

2. Zanurzyć kasetę z preparatami w słoiku do barwienia wypełnionym stężonym kwasem siarkowym i inkubować w temperaturze pokojowej przez noc.

UWAGA: Aby uniknąć kontaktu ze skórą, podczas pracy ze stężonymi kwasami oraz substancjami toksycznymi i żrącymi należy stosować rękawice odporne na chemikalia i okulary ochronne.

3. Poddać szkiełka sonikacji przez 30 min, a następnie płukać wodą Milli-Q (18 MΩ) przez 30 min i ponownie płukać w acetonie przez 5 min. Zabieg ten odsłania grupy silanolowe na powierzchni szkła.
4. Pokryć czyste szkiełka 2,5% (vol/vol w wodzie) roztworem 3-aminopropyltrietoksysilanu (APTES), zanurzając statyw ze szkiełkami w APTES na 30 min, płucząc 3 razy w wodzie Milli-Q po 15 min każde płukanie, a następnie wypalając szkiełka w piecu w temperaturze 110 °C przez 15 min. Wypalanie umożliwia sieciowanie APTES, co prowadzi do funkcjonalizacji powierzchni grupami -NH2.

UWAGA: Roztwór APTES należy przygotować w plastikowym pojemniku, ponieważ APTES osadza się preferencyjnie na ściankach naczyń szklanych.

5. Używając powlekarki wirowej, pokryj szkiełka 1% (masowo/objętościowo w toluenie) kopolimerem styrenu i bezwodnika maleinowego (PS-MA) (Sigma), aby uzyskać hydrofobową warstwę monomolekularną ⁶. Nanieś 2,0 mL PS-MA na czyste szkiełko przedmiotowe zamocowane w powlekarce wirowej i powlekaj przy 3 000 rpm przez 30 s. Warunki te mogą się różnić w zależności od parametrów powlekania wirowego, takich jak roztwór powlekający, podłoże oraz grubość powłoki, i są określone przez poniższy wzór ⁷

gdzie h to grubość powłoki filmu, e to szybkość parowania, η, C i ρ to odpowiednio lepkość, stężenie i gęstość roztworu powłoki, a ω to prędkość kątowa.

UWAGA: Toluen jest szkodliwy przy długotrwałym wdychaniu, dlatego zaleca się korzystanie z dygestorium.

6. Preparaty można przechowywać w kasecie na slidy do jednego miesiąca w suchych, wolnych od kurzu warunkach w temperaturze 2- 8 °C.

2. Przygotowanie inokulum drożdży i enkapsulacja w kolagenie

1. Przygotować kulturę nocną szczepu C. albicans SC5314 w płynnej pożywce Yeast Peptone Dextrose [YPD; 10 g/L ekstraktu drożdżowego, 20 g/L peptonu i 20 g/L dekstrozy] poprzez zaszczepienie pojedynczej kolonii C. albicans do 10 - 20 mL YPD⁸. Inkubować kulturę w inkubatorze z wytrząsaniem (około 150 - 200 rpm) w temperaturze 30 °C przez noc. Odizolować 1 mL komórek drożdży Candida albicans z nocnych kultur YPD (poprzez wirowanie przy 5,000 rpm przez 5-10 minut) i przemyć dwukrotnie przez 10 min w 1 mL sterylnego roztworu soli fosforanowo-buforowanej (PBS; 10 mM buforu fosforanowego, 2.7 mM chlorku potasu, 137 mM chlorku sodu, pH 7.4) (Sigma) podczas każdego przemywania. Przemyte komórki odizolować również przez wirowanie przy 1900 rpm przez 10 minut. Zawiesić przemyte komórki w 1 mL buforu rekonstrukcyjnego (0.2 N roztwór NaOH z 2.2% (mas/obj) wodorowęglanu sodu i 4.8% (mas/obj) HEPES, pH 7.2).

UWAGA: C. albicans jest mikroorganizmem z grupy ryzyka 1/BSL1. Pamiętaj o stosowaniu odpowiednich technik aseptyki i sterylności podczas pracy z tym mikroorganizmem oraz przestrzegaj procedur instytucjonalnych dotyczących prawidłowej utylizacji materiałów biologicznie niebezpiecznych.

2. Policzyć komórki za pomocą hemocytometru pod mikroskopem w polu jasnym i dostosować gęstość komórek do poziomu 5×10⁷ cells/mL.
3. Dalszo rozcieńczyć zawiesinę dziesięciokrotnie poprzez dodanie 10× RPMI-1640 uzupełnionego o L-glutaminę i buforowanego kwasem morfolinopropanosulfonowym (MOPS) (pH 7.2).
4. Enkapsulować komórki drożdży w kolagenie, mieszając zawiesinę komórek w RPMI-1640 z kolagenem (1.8 mg/mL) (Type 1 z ogona szczura, BD Biosciences, Bedford, MA), aby uzyskać końcowe stężenie 4× 10⁶ cells/mL. Przechowywać zawiesinę kolagenowo-komórkową w lodzie, aby zapobiec żelowaniu kolagenu przed drukowaniem.

3. Przygotowanie CaBChip

1. Wyczyścić i zdezynfekować wszystkie powierzchnie mikroarrayera, w tym stację płyt źródłowych, stację płukania i próżniową, tackę z płytkami próżniowymi oraz komorę drukowania, przecierając je 70% izopropanolem.
2. Umieścić i unieruchomić za pomocą próżni odpowiednią liczbę szkiełek pokrywczych powlekanych PS-MA na platformie do szkiełek mikroarrayera.
3. Mocno wymieszać zawiesinę komórkową w kolagenie za pomocą wortexa i bezpośrednio przed drukowaniem pobrać 100 μL dobrze wymieszanej zawiesiny do dołka płytki 96-dołkowej. Umieścić tę płytkę źródłową w stacji załadunkowej.
4. Włączyć nawilżacz, aby utrzymać względną wilgotność 100% w komorze mikroarrayera przez cały proces drukowania.
5. Nanieść 50 nL zawiesiny komórkowej w układzie 48 rzędów i 16 kolumn z odstępami między punktami wynoszącymi 1.2 mm, używając urządzenia do nanoszenia mikroarrayów (Omnigrid Micro, Digilab Inc., Holliston, MA) poprzez bezkontaktowe nanoszenie z użyciem ceramicznych końcówek o stożkowym zwężeniu i średnicy otworu 190 μm (Digilab).
6. Przygotować, przepłukać i wysuszyć końcówki próżniowo dwukrotnie po każdej serii drukowania.
7. Natychmiast po drukowaniu umieścić szkiełko w szczelnej, nawilżonej komorze (Hybridization cassette, ArrayIt Corporation, Sunnyvale, CA) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 24 hr w celu umożliwienia formowania się biofilmu.

4. Badanie wrażliwości wcześniej uformowanych biofilmów w CaBChip na środki przeciwgrzybicze

1. Z roztworów zapasowych lub proszków leków przeciwgrzybiczych należy przygotować roztwór roboczy w medium RPMI- 1640. Typowe maksymalne stężenia roztworu roboczego wynoszą 1,024 μg/mL dla flukonazolu i 16 μg/mL dla amfoterycyny B⁵. W przypadku innych środków można zastosować inne stężenia.
2. Należy przygotować osiem różnych stężeń związku poprzez dwukrotne rozcieńczanie roztworu zapasowego, obejmując zakres, w którym szacowana wartość IC₅₀ związku znajduje się w środku.
3. Po 24 h wzrostu biofilmu należy użyć mikroarrayera do naniesienia 50 nL ośmiu różnych stężeń leków, wraz z kontrolami pozytywną (brak leku, tj. komórki w samym medium) i negatywną (poddane działaniu podchlorynu sodu przez 20 min), w co najmniej sześciu powtórzeniach na powierzchni biofilmów.

UWAGA: Należy utrzymać wilgotność względną na poziomie 100%, aby zapobiec wysychaniu plamek podczas dodawania leków.

4. Wkrótce po dodaniu leków inkubować chip z lekami w wilgotnej komorze w temperaturze 37 °C przez 24 hr.
5. Wypłukać leki, zanurzając CaBChip 3-5 razy po 2 min za każdym razem w PBS, a następnie zabarwić poprzez inkubację CaBChip z 0.5 μM FUN1 w temperaturze 37 °C przez 30 min⁹.
6. Wypłukać barwnik, zanurzając CaBChip 3-5 razy w PBS przez 1-3 min przy każdym zanurzeniu, a następnie osuszyć CaBChip strumieniem azotu. Odczytać intensywność fluorescencji za pomocą skanera do mikromacierzy (GenePix 4100A, Axon Instruments, CA) przy długości fali 532 nm i wzmocnieniu PMT wynoszącym 380.
7. Przyjąć intensywność fluorescencji dla kontroli pozytywnej (bez leku) oraz dla martwych plamek biofilmu (traktowanych wybielaczem) odpowiednio jako 100% i 0%.
8. Wyznaczyć procent inhibicji na podstawie spadku intensywności fluorescencji (F) względem średniej z plamek kontrolnych, korzystając z następującego równania

gdzie F, F_max oraz F_o to odpowiednio surowe intensywności fluorescencji plamek traktowanych lekiem, kontrolnych bez leku oraz traktowanych wybielaczem. Ustawienia skanera dostosowano tak, aby uzyskać wartości F_max i F_o wynoszące odpowiednio 30000 i 4000 RFU.

9. Obliczyć 50% stężenie hamujące lub IC₅₀, dopasowując równanie Hilla o zmiennym nachyleniu za pomocą oprogramowania GraphPad Prism (La Jolla, CA).

5. Reprezentatywne wyniki

Reprezentatywny CaBChip, składający się z macierzy 48×16 nanobiofilmów C. albicans, przedstawiono na Rysunku 2. Mikroskopia pola jasnego ukazuje ogólną strukturę architektoniczną nanobiofilmu. Obrazy z transmisyjnego mikroskopu elektronowego biofilmu wykazują, że strzępki grzybowe są zatopione w macierzy włókien kolagenowych, których średnica wynosi odpowiednio około 2 μm i 100 nm. Obrazy z mikroarray skanera z barwieniem FUN1 ukazują formy drożdżowe i strzępkowe, które są charakterystyczne dla biofilmów grzybowych. Na obrazach konfokalnych fluorescencyjnych 2D i 3D biofilmów barwionych FUN1 widoczna jest heterogeniczność przestrzenna, z obszarami metabolicznie aktywnych komórek przeplatających się z macierzą zewnątrzkomórkową (składającą się z kolagenu jako materiału otaczającego oraz najprawdopodobniej z materiału egzopolimerowego wytwarzanego przez komórki biofilmu), która nie jest barwiona przez barwnik metaboliczny. Grubość biofilmu oszacowano na około 50 μm. CaBChip został wykorzystany do oceny wrażliwości przeciwgrzybiczej dwóch leków, flukonazolu i amfoterycyny B, a wyniki przedstawiono na Rysunku 3. Zgodnie z opublikowanymi doniesieniami dotyczącymi standardowych przemysłowych testów na płytkach 96-dołkowych, biofilmy wykazują oporność na flukonazol¹⁰, a obliczona wartość IC₅₀ dla amfoterycyny B wynosi 0,3 μg/mL¹¹.

Rysunek 1. Schemat blokowy procesu wytwarzania CaBChip.

Rycina 2. Zdjęcie wysokoprzepustowego układu CaBChip, wydrukowanego przy użyciu robotycznego urządzenia do mikromacierzy, zawierającego 768 punktów na szkiełkach pokrytych PS-MA. Każdy półsferyczny punkt ma objętość 50 nL, średnicę około 700 μm oraz odstęp 1,2 mm między punktami. Przedstawiono również (zgodnie z ruchem wskazówek zegara) obrazy z mikroskopii świetlnej, skanera mikromacierzy, mikroskopii fluorescencyjnej 2D i 3D oraz skaningowej mikroskopii elektronowej poszczególnych biofilmów na CaBChip. Zdjęcie SEM przy dużym powiększeniu 25 000x pokazuje filament strzępki o szerokości 2 μm.

Rysunek 3. Wyniki testów wrażliwości na środki przeciwgrzybicze i wyznaczenie wartości IC₅₀ dla (A) flukonazolu i (B) amfoterycyny B z użyciem CaBChip. Obrazy z mikroskopu fluorescencyjnego biofilmy traktowane amfoterycyną B przedstawiono w punkcie (C). Wyniki przedstawiono jako średnia ± błąd standardowy średniej dla dwóch oddzielnych chipów zawierających 10 powtórzeń dla każdego warunku.

Dyskusja

Opracowaliśmy opartą na komórkach mikrotablicę o wysokiej gęstości, CaBChip, składającą się z nanolitrowych objętości biofilmów Candida albicans. Mikrotablicę naniesiono na modyfikowane podłoża szklane, co pozwoliło na trwałe przytwierdzenie plamek żelu kolagenowego, zapewniając jednocześnie hydrofobowość niezbędną do uzyskania nierozlewającego się, półkulistego żelu 3D. Pojedynczy CaBChip może zastąpić około ośmiu płytek 96-dołkowych, a kilka chipów można wydrukować i przetworzyć w tym samym c...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
3-aminopropylotrietoksysilan (APTES)	Sigma-Aldrich	440140
Kopolimer styrenu i bezwodnika maleinowego (PS-MA)	Sigma-Aldrich	426946
Szklane szkiełka mikroskopowe	Fisher Scientific	12-549-3
Kolagen typu I z ogona szczura	BD Biosciences	354236
Robotyczny system do tworzenia mikromacierzy	Omnigrid Micro	MICROSYS4000/4100A
Skaner mikromacierzy	Genepix Personal 4100A	GENEPIX4100A
Kaseta do hybrydyzacji	ArrayIt Corporation	AHCXD
FUN1 [jodek 2-chloro-4-(2,3-dihydro-3-metylo-(benzo-1,3-tiazol-2-ylo)-metylideno)-1-fenylochinoliniumu]	Invitrogen Corp.	F-7030
Flukonazol	Sicor Pharmaceuticals, Inc.	J02AC01
Amfoterycyna B	Sigma	A2411
RPMI-1640	Mediatech, Inc.	50-020-PC
Końcówka ceramiczna z otworem μm 190	Digilab	60020441-00
Oprogramowanie GraphPad Prism	GraphPad Software, Inc.
Genepix Pro V4.1	Molecular Devices