Mikroskopia wielofotonowa całych organów myszy jest możliwa dzięki optycznemu klarowaniu organu przed obrazowaniem, jednak nie wszystkie protokoły zachowują sygnał fluorescencyjny białek fluorescencyjnych. Stosując metodę klarowania optycznego z dehydratacją opartą na etanolu oraz klarowaniem za pomocą mieszaniny alkoholu benzylowego i benzojanu benzylowego, prezentujemy wysokorozdzielcze obrazy wielofotonowe całego mózgu myszy wykazującego ekspresję YFP.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Mikroskopia wielofotonowa oczyszczonego mózgu mysiego z ekspresją YFP
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Mikroskopia wielofotonowa autofluorescencji oraz generacji drugiej harmonicznej (SHG) całych narządów myszy jest możliwa dzięki optycznemu przejrzyszczaniu narządu przed obrazowaniem.1,2 Jednak w przypadku narządów zawierających białka fluorescencyjne, takie jak GFP i YFP, protokoły optycznego przejrzyszczania wykorzystujące odwodnienie metanolem i przejrzyszczanie za pomocą alkoholu benzylowego i benzożanu benzylu (BABB) bez ochrony przed światłem3 nie zachowują sygnału fluorescencyjnego. Przedstawiony tutaj protokół stanowi nową metodę optycznego przejrzyszczania całego mózgu myszy przy jednoczesnym zachowaniu sygnału fluorescencyjnego YFP ekspresowanego w neuronach. Stwierdzono, że zmiana protokołu optycznego przejrzyszczania w taki sposób, aby narząd był odwadniany przy użyciu serii roztworów etanolu o rosnącym stężeniu, zmniejsza uszkodzenia białek fluorescencyjnych i pozwala zachować ich sygnał fluorescencyjny do obrazowania wielofotonowego.4 Stosując zoptymalizowaną metodę optycznego przejrzyszczania z odwodnieniem na bazie etanolu i przejrzyszczaniem za pomocą BABB z osłoną przed światłem, prezentujemy wysokorozdzielcze obrazy wielofotonowe ekspresji żółtego białka fluorescencyjnego (YFP) w neuronach mózgu myszy na głębokości ponad 2 mm poniżej powierzchni tkanki.
Protokół
1. Perfuzja zwierząt5 i oczyszczanie całego mózgu myszy
- Całkowity czas trwania procedury może się różnić w zależności od czasu trwania poszczególnych etapów odwodnienia, jednak cały proces można przeprowadzić w ciągu dwóch dni.
- Zważyć myszy YFP, a następnie wprowadzić w stan głębokiej anestezji poprzez podanie dootrzewnowe ketaminy/ksylazyny (100 mg/kg:10 mg/kg).
- Przed przystąpieniem do zabiegu potwierdzić osiągnięcie chirurgicznej płaszczyzny głębokiej anestezji. Sprawdzać stan zwierzęcia co 5 min, obserwując reakcję na mocne ściśnięcie palca u nogi lub ogona. Jeśli zwierzę reaguje, należy podać dawkę uzupełniającą (1/3 dawki pierwotnej) ketaminy/ksylazyny.
- Po wprowadzeniu w stan głębokiej anestezji unieruchomić mysz, przymocowując każdą kończynę do podłoża chirurgicznego za pomocą taśmy laboratoryjnej, tak aby mysz znajdowała się w pozycji na plecach (leżenie grzbietowe), z odsłoniętą klatką piersiową do zabiegu. Podłoże chirurgiczne jest zazwyczaj wykonane z metalowej lub plastikowej siatki i umieszczone w zlewie lub w kuwecie z rantem, aby krew i odpady z utrwalacza mogły być łatwo zbierane.
- W celu rozpoczęcia wykonać nacięcie poniżej wyrostka mieczykowatego. Za pomocą nożyczek i pęsety przeciąć wzdłuż podstawy klatki piersiowej, odsuwając skórę w miarę postępu cięcia. Wykonać dwa cięcia wzdłuż obu stron mostka myszy (przez żebra), aby stworzyć płat tkanki, który zostanie odsunięty od jamy klatki piersiowej za pomocą kleszczyków hemostatycznych, pozostawiając serce odsłonięte.
- Wprowadzić igłę 23 g do lewej komory serca i wykonać małe nacięcie w ścianie mięśniowej prawego przedsionka, aby umożliwić odpływ krwi. Film z tej procedury znajduje się w artykule JoVE 2497.5
- Natychmiast po nacięciu prawego przedsionka rozpocząć perfuzję chłodnym (4 °C) fosforanowym roztworem buforowanym, PBS (pH 7.2), aż do momentu, gdy z prawego przedsionka serca przestanie wypływać krew (30 - 40 ml przy przepływie około 5 ml/min).
- Po całkowitym odprowadzeniu krwi (płyn wypływający z prawego przedsionka jest przejrzysty), zmienić medium perfuzyjne na schłodzony 4% roztwór PFA. Perfuzję prowadzić do momentu, gdy ciało myszy stanie się wyraźnie sztywne i zimne w dotyku (ok. 30 - 40 ml przy przepływie około 5 ml/min). (Stężony 16% roztwór PFA należy rozcieńczyć zgodnie z instrukcjami producenta i dodać NaOH, aż do osiągnięcia pH 7.2. Należy używać rękawiczek oraz fartucha laboratoryjnego, a odczynniki chemiczne przygotowywać i mieszać w dygestorium).
- Po perfuzji zdjąć mysz z podłoża chirurgicznego i przeprowadzić dekapitację w celu rozpoczęcia wycięcia mózgu.
- Za pomocą pęsety i nożyczek irydowych usunąć czaszkę w małych sekcjach, zaczynając od tyłu czaszki i przesuwając się do przodu. Nożyczkami wykonywać małe cięcia co 2 - 4 mm w poprzek czaszki, jednocześnie ostrożnie odsuwając kość od mózgu pęsetą w małych fragmentach. Powtarzać czynność do momentu odsłonięcia całej górnej powierzchni mózgu.
- Wyjąć mózg z czaszki za pomocą płaskiej szpatułki o szerokości 5 mm i umieścić go w szklanej fiolce. Zanurzyć w 4% PFA na 6 hr w temperaturze 4 °C w celu dofixacji.
- Po dofixacji przemyć mózg dwukrotnie w PBS w temperaturze pokojowej, wylewając PFA z fiolki i zastępując go PBS. Delikatnie zamieszać mózg w roztworze PBS przed wylaniem go i ponownym zastąpieniem nową porcją PBS do drugiego przemycia.
- Odwodnić mózg w temperaturze pokojowej poprzez inkubację w stopniowanej serii roztworów etanolu (raz w 50%, 70%, 95% i dwukrotnie w 100%) przez 2 hr na każdą inkubację, a następnie przez 12 hr podczas drugiej inkubacji w 100% etanolu, aby usunąć wodę z utrwalonej tkanki. Dla każdej inkubacji wylać poprzedni roztwór etanolu z fiolki i zastąpić go kolejnym roztworem, aż mózg zostanie całkowicie zanurzony.
- Po drugiej inkubacji w 100% etanolu wylać roztwór i zastąpić go mieszaniną etanolu i roztworu przejaśniającego zawierającego alkohol benzylowy i benzoesan benzylu w równych częściach (stosunek objętościowy 1:2 vol:vol). Po 2 hr inkubacji odlać ten roztwór i zastąpić go 100% roztworem alkoholu benzylowego i benzoesanu benzylu (stosunek objętościowy 1:2 vol:vol). Współczynnik załamania światła roztworu przejaśniającego wynosi n = 1.54.
- Po umieszczeniu w BABB mózg stanie się wyraźnie przezroczysty w ciągu 4 - 5 hr. Aby uzyskać najlepsze rezultaty przejaśniania, pozostawić mózg w roztworze na 6 dni w temperaturze pokojowej, chroniąc go przed silnym światłem.
2. Konfiguracja mikroskopu
- Gdy mózg zostanie oczyszczony i będzie gotowy do obrazowania, należy przymocować go do dna szalki Petriego za pomocą cyjanoakrylanu. Przed przejściem do kolejnego etapu należy odczekać do wyschnięcia kleju.
- Po wyschnięciu mózg zanurza się w BABB, a szalkę Petriego umieszcza pod obiektywem mikroskopu w celu obrazowania.
- Używamy mikroskopu wielofotonowego wyposażonego w tytanowy laser szafirowy Mai Tai z regulowaną długością fali wzbudzenia w zakresie od 710 nm do 990 nm. Długość fali wzbudzenia stosowana do generowania sygnałów YFP wynosi 886 nm. Moc lasera waha się od 30 - 100 mW w zależności od głębokości obrazowania.
- Sygnał fluorescencyjny odbity należy zarejestrować za pomocą obiektywu Nikon 5X (NA, 0,5), który umożliwia obrazowanie w szerokim polu widzenia (2 x 2 mm).
- Sygnał fluorescencyjny odbity należy przefiltrować za pomocą filtra pasmowo-przepustowego 535/50 i zebrać go za pomocą PMT GaAsP (H7422PA-40, Hamamatsu, Bridgewater, New Jersey).
- Obrazy przetwarza się za pomocą oprogramowania ScanImage6 w rozdzielczości 2048 x 2048 pikseli, przy szybkości skanowania 2 ms na linię, aby uzyskać wysokorozdzielcze obrazy YFP.
- Po zakończeniu obrazowania mózg należy wyjąć z szalki Petriego pęsetą i przechowywać w BABB w warunkach osłoniętych od światła do późniejszego obrazowania. W przypadku próbek przyklejonych tkankę usuwa się, przesuwając ostrze żyletki między klejem a szalką Petriego pod kątem nie większym niż 30 stopni. Próbki przechowywane przez nas w BABB przez okres do 1 roku nie wykazywały widocznej degradacji.
3. Reprezentatywne wyniki
Przedstawione tutaj reprezentatywne obrazy i filmy demonstrują możliwości wysokorozdzielczego obrazowania wielofotonowego, które stało się możliwe dzięki optycznemu utrudnianiu (optical clearing). Obrazowanie całego mózgu pozwala na wyraźną wizualizację neuronów znakowanych YFP w różnych warstwach hipokampa i kory na głębokości do 2 mm poniżej powierzchni tkanki. Rycina 1 przedstawia reprezentatywny obraz przekroju czołowego odpowiadający cechom anatomicznym hipokampa w odległości 2,92 mm ku dołowi od bregmy7. Głębokość obrazowania w próbce wynosiła 1,94 mm. Część tej różnicy wynikała z usunięcia móżdżku z tylnego końca mózgu, a pozostała część ze skurczenia się tkanki w procesie odwodnienia. Inny obraz z serii pokazuje neurony piramidowe warstwy V/VI neocortex ekspresujące YFP 2 mm poniżej powierzchni tkanki (Rycina 2). Wszystkie obrazy zostały pozyskane przy użyciu obiektywu Nikon 5X, a powiększenie uzyskano dzięki funkcji cyfrowego zoomu podczas akwizycji obrazu w oprogramowaniu ScanImage.
Po powiększeniu obrazu neocortex, poszczególne aksony i ciała komórkowe neuronów piramidowych w warstwie V neocortex są wyraźnie rozróżnialne na głębokości do 1,02 mm pod powierzchnią tkanki (Rysunek 3). Wykorzystując stos obrazów z Rysunku 3, za pomocą oprogramowania ImageJ8 wykonano rekonstrukcję 3D obszaru neuronów (Rysunek 4).
Wysoka rozdzielczość MPM pozwala nam również na prezentację obrazów całych, pojedynczych neuronów. Przedstawiamy tutaj rekonstrukcję neuronu piramidalnego warstwy V neocortex, w której wyraźnie widoczne są pojedyncze wypustki dendrytyczne (Rysunek 5).
Rycina 1. Reprezentatywny obraz z zestawu obrazów o grubości 1,2 mm (0,8 - 2 mm poniżej powierzchni tkanki) całego mózgu myszy, przedstawiający neocortex oraz różne warstwy hipokampa. Cechy hipokampa są widoczne 1,1 mm poniżej powierzchni tkanki i zostały oznaczone zgodnie z następującym kodem: DG = zakręt zębaty, GrDG = warstwa ziarnista DG, Lmol = warstwa lacunosum moleculare, Mol = warstwa molekularna DG, Or = warstwa oriens, PoDG = warstwa polimorficzna DG, Py = warstwa komórek piramidowych, Rad = stratum radiatum.7 Rozmiar obrazu wynosi 1,8 x 1,8 mm, pasek skali = 200 μm. Przedni koniec mózgu przymocowano do szalki Petriego, tak aby koniec tylny był skierowany w górę w stronę obiektywu. Ułatwiło to obrazowanie w płaszczyźnie czołowej.
Rysunek 2. Reprezentatywna klatka z zestawu obrazów o grubości 1.2 mm (0.8 - 2 mm poniżej powierzchni tkanki) całego mózgu myszy, z zaznaczonym neokorteksem. Komórki piramidalne oraz wypustki wykazujące ekspresję YFP w warstwie V/VI kory są widoczne 2 mm poniżej powierzchni tkanki. Stopień znakowania jest zgodny z wcześniejszymi doniesieniami dotyczącymi rzadkiego znakowania w neokorteksie.9 Wstawka (po prawej) stanowi powiększenie obszaru zaznaczonego ramką po lewej. Rozmiar obrazu wynosi 1.8 x 1.8 mm, pasek skali = 200 μm (50 μm we wstawce).
Rycina 3. Reprezentatywna klatka pobrana z głębokości 774 μm poniżej powierzchni tkanki z serii obrazów neuronów piramidowych warstwy V w neocortex mózgu. Seria obejmuje zakres od 700 μm do 1,020 μm poniżej powierzchni tkanki. W celu uchwycenia szczegółów, takich jak cienkie wypustki, zastosowano 8-krotny zoom cyfrowy. Rozmiar obrazu wynosi 225 x 225 μm, pasek skali = 20 μm.
Rysunek 4. Reprezentatywny obraz rekonstrukcji 3D (225 x 225 x 320 μm) stosu obrazów przedstawionego na Rysunku 3. Rozmiar obrazu wynosi 225 x 225 μm, pasek skali = 28 μm.
Rysunek 5. Zrekonstruowany obraz o wysokiej rozdzielczości neuronu piramidalnego warstwy V neokory z zastosowaniem 10-krotnego powiększenia cyfrowego. Neuron ma długość 485 μm, pasek skali = 25 μm. Pole widzenia dla każdego kafelka obrazu wynosi 180 μm x 180 μm. Każdy kafel znajduje się na innej głębokości (poziomie z). Apikalne dendryty korowe zazwyczaj nie wykazują tak silnej ekspresji YFP jak soma. Aby uzyskać oba te elementy w tym samym polu widzenia, jak pokazano tutaj, obniżono moc, aby zminimalizować nasycenie somy; sprawia to, że cienkie wypustki wydają się ciemniejsze. Naszym celem było tutaj zademonstrowanie pola widzenia, a nie drobnych detali. Aby ujawnić szczegóły, należy zastosować powiększenie cyfrowe, skupić się na obszarze bez somy i zwiększyć moc lasera.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Podczas gdy standardowe barwniki organiczne są kompatybilne z szeregiem rozpuszczalników organicznych i w związku z tym nie stanowią szczególnego problemu dla protokołów klarowania, białka fluorescencyjne są często mniej tolerancyjne na zmiany rozpuszczalnika.4 Celem niniejszej pracy było przełamanie poważnego ograniczenia poprzednich protokołów klarowania optycznego, w których fluorescencja białek XFP była tracona lub silnie degradowana. Przedstawione tutaj obrazy wykazują, że zachowano fluorescencję YFP. Opi...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Doświadczenia na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi i regulacjami ustanowionymi przez Institutional Animal Care & Use Committee Uniwersytetu Yale.
Podziękowania
Chcielibyśmy podziękować Jacobowi Solisowi za pomoc w montażu wideo.
Praca ta została częściowo sfinansowana z grantu NSF CAREER Award DBI-0953902 przyznanego MJ Levene.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Fosforanowy bufor solny (PBS) | Sigma-Aldrich, Inc. | D8537 | 500 ml, pH 7.2 |
| Paraformaldehyd | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 10 x 10 ml, 16% paraformaldehydu |
| Alkohol etylowy | American Bioanalytical | AB00515-00500 | 500 ml, 200 proof |
| Alkohol etylowy | Pharmco Products, Inc. | 111000190 | 1 gal., 190 proof |
| Alkohol benzylowy | Sigma-Aldrich, Inc. | 402834 | 500 ml, 99+% |
| Benzozan benzylu | Sigma-Aldrich, Inc. | B6630-IL | 500 ml, ≥ 99% |
| Obiektyw 5X/0,5 NA | Nikon | AZ Plan Flour 5X | 15 WD |
Bibliografia
- Parra, S. G., Chia, T. H., Zinter, J. P., Levene, M. J. Multiphoton microscopy of cleared mouse organs. J. Biomed. Opt. 15, 036017(2010).
- Vesuna, S., Torres, R., Levene, M. J. Multiphoton fluorescence, second harmonic generation, and fluorescence lifetime imaging of whole cleared mouse organs. J. Biomed. Opt. 16, 106009(2011).
- Zucker, R. M. Whole insect and mammalian embryo imaging with confocal microscopy: Morphology and apoptosis. Cytometry. A69, 1143-1152 (2006).
- Sakhalkar, H. S. Functional imaging in bulk tissue specimens using optical emission tomography: Fluorescence preservation during optical clearing. Phys. Med. Biol. 52, 2035-2054 (2007).
- Dazai, J., Spring, S., Cahill, L. S., Henkelman, R. M. Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging. J. Vis. Exp. (48), e2497(2011).
- Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomed. Eng. Online. 2, (2003).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , 2nd Ed, Elsevier Science. San Diego, CA, USA. (2001).
- Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).
- Feng, G., Mellor, R. H., Bernstein, M., Keller-Peck, C., Nguyen, Q. T., Wallace, M., Nerbonne, J. M., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Imaging Neuronal Subsets in Transgenic Mice Expressing Multiple Spectral Variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Hama, H. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat. Neuro. 14, 1481-1488 (2011).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
