Artykuł metodologiczny

Mikroskopia wielofotonowa oczyszczonego mózgu mysiego z ekspresją YFP

DOI:

10.3791/3848

⸱

23 września 2012

 ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Yale University, 2Department of Biomedical Engineering, Louisiana Tech University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroskopia wielofotonowa całych organów myszy jest możliwa dzięki optycznemu klarowaniu organu przed obrazowaniem, jednak nie wszystkie protokoły zachowują sygnał fluorescencyjny białek fluorescencyjnych. Stosując metodę klarowania optycznego z dehydratacją opartą na etanolu oraz klarowaniem za pomocą mieszaniny alkoholu benzylowego i benzojanu benzylowego, prezentujemy wysokorozdzielcze obrazy wielofotonowe całego mózgu myszy wykazującego ekspresję YFP.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroskopia wielofotonowa autofluorescencji oraz generacji drugiej harmonicznej (SHG) całych narządów myszy jest możliwa dzięki optycznemu przejrzyszczaniu narządu przed obrazowaniem.1,2 Jednak w przypadku narządów zawierających białka fluorescencyjne, takie jak GFP i YFP, protokoły optycznego przejrzyszczania wykorzystujące odwodnienie metanolem i przejrzyszczanie za pomocą alkoholu benzylowego i benzożanu benzylu (BABB) bez ochrony przed światłem3 nie zachowują sygnału fluorescencyjnego. Przedstawiony tutaj protokół stanowi nową metodę optycznego przejrzyszczania całego mózgu myszy przy jednoczesnym zachowaniu sygnału fluorescencyjnego YFP ekspresowanego w neuronach. Stwierdzono, że zmiana protokołu optycznego przejrzyszczania w taki sposób, aby narząd był odwadniany przy użyciu serii roztworów etanolu o rosnącym stężeniu, zmniejsza uszkodzenia białek fluorescencyjnych i pozwala zachować ich sygnał fluorescencyjny do obrazowania wielofotonowego.4 Stosując zoptymalizowaną metodę optycznego przejrzyszczania z odwodnieniem na bazie etanolu i przejrzyszczaniem za pomocą BABB z osłoną przed światłem, prezentujemy wysokorozdzielcze obrazy wielofotonowe ekspresji żółtego białka fluorescencyjnego (YFP) w neuronach mózgu myszy na głębokości ponad 2 mm poniżej powierzchni tkanki.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Perfuzja zwierząt5 i utrudnianie (klarowanie) całego mózgu myszy

  1. Całkowity czas trwania procedury może się różnić w zależności od czasu trwania każdego etapu odwadniania, jednak cały proces można przeprowadzić w ciągu dwóch dni.
  2. Zważyć myszy YFP, a następnie wprowadzić w stan głębokiej narkozy poprzez podanie dootrzewnowe ketaminy/ksylazyny (100 mg/kg:10 mg/kg).
  3. Przed przystąpieniem do operacji potwierdzić chirurgiczną płaszczyznę głębokiej narkozy. Kontrolować zwierzę co 5 min, sprawdzając, czy reaguje na mocne uciśnięcie palca u nogi lub ogona. Jeśli zwierzę reaguje, wymagana jest dawka uzupełniająca (1/3 dawki pierwotn....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podczas gdy standardowe barwniki organiczne są kompatybilne z szeregiem rozpuszczalników organicznych i w związku z tym nie stanowią szczególnego problemu dla protokołów klarowania, białka fluorescencyjne są często mniej tolerancyjne na zmiany rozpuszczalnika.4 Celem niniejszej pracy było przełamanie poważnego ograniczenia poprzednich protokołów klarowania optycznego, w których fluorescencja białek XFP była tracona lub silnie degradowana. Przedstawione tutaj obrazy wykazują, że zachowano fluorescencję YFP. Opi.......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Doświadczenia na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi i regulacjami ustanowionymi przez Institutional Animal Care & Use Committee Uniwersytetu Yale.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować Jacobowi Solisowi za pomoc w montażu wideo.

Praca ta została częściowo sfinansowana z grantu NSF CAREER Award DBI-0953902 przyznanego MJ Levene.

....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Fosforanowy bufor solny (PBS)Sigma-Aldrich, Inc.D8537500 ml, pH 7.2
ParaformaldehydElectron Microscopy Sciences1571010 x 10 ml, 16% paraformaldehydu
Alkohol etylowyAmerican BioanalyticalAB00515-00500500 ml, 200 proof
Alkohol etylowyPharmco Products, Inc.1110001901 gal., 190 proof
Alkohol benzylowySigma-Aldrich, Inc.402834500 ml, 99+%
Benzozan benzyluSigma-Aldrich, Inc.B6630-IL500 ml, ≥ 99%
Obiektyw 5X/0,5 NANikonAZ Plan Flour 5X15 WD

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Parra, S. G., Chia, T. H., Zinter, J. P., Levene, M. J. Multiphoton microscopy of cleared mouse organs. J. Biomed. Opt. 15, 036017(2010).
  2. Vesuna, S., Torres, R., Levene, M. J. Multiphoton fluorescence, second harmonic generation, and fluorescence....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Przezroczysto optycznaekspresja YFPodwodnienie etanolemutrwalanie BABBobrazowanie m zgu myszyzachowanie bia ek fluorescencyjnychgenerowanie drugiej harmonicznejprzezroczysto tkankiobrazowanie g bokie tkanki

Powiązane artykuły