Obecna diagnostyka testów wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe opiera się na wzroście planktonicznym izolatów w bogatych w składniki odżywcze warunkach tlenowych. W niniejszej pracy wykorzystujemy alternatywne sztuczne podłoże plwociny, aby zbadać wrażliwość biofilmów Pseudomonas aeruginosa na środki przeciwdrobnoustrojowe zarówno w warunkach tlenowych, jak i mikroaerofilnych, które są bardziej reprezentatywne dla płuc w mukowiscydozie.
Artykuł metodologiczny
Wykorzystanie sztucznej pożywki plwocin do badania skuteczności antybiotyków przeciwko Pseudomonas aeruginosa w warunkach bardziej odpowiadających płucom w mukowiscydozie
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Rośnie zaniepokojenie kwestią relewantności testów wrażliwości przeciwdrobnoustrojowej in vitro w przypadku izolatów P. aeruginosa pochodzących od pacjentów z mukowiscydozą (CF). Istniejące metody opierają się na pojedynczych lub kilku izolatach hodowanych tlenowo i planktonicznie. Do określenia, czy bakterie są wrażliwe, czy oporne na dany antybiotyk, stosuje się wcześniej ustalone wartości graniczne1. Jednakże podczas chronicznych infekcji płuc w przebiegu mukowiscydozy populacje P. aeruginosa występują w biofilmach i istnieją dowody na to, że środowisko to jest w przeważającej mierze mikroaerofilne2. Wyraźna różnica w warunkach bytowania bakterii w płucach i tych panujących podczas testów diagnostycznych poddała w wątpliwość wiarygodność, a nawet zasadność stosowania tych testów3.
Sztuczna pożywka plwocin (Artificial sputum medium, ASM) jest pożywką hodowlaną zawierającą składniki plwocin pacjentów z mukowiscydozą, w tym aminokwasy, mucynę i wolne DNA. Wzrost P. aeruginosa w ASM naśladuje wzrost podczas infekcji w przebiegu mukowiscydozy, z tworzeniem samoporządujących się struktur biofilmu oraz dywergencją populacji4,5,6. Celem niniejszego badania było opracowanie testu na płytkach mikrotitracyjnych do badania wrażliwości P. aeruginosa na środki przeciwdrobnoustrojowe w oparciu o wzrost w ASM, który można zastosować zarówno w warunkach mikroaerofilnych, jak i tlenowych.
Opracowano test ASM w formacie płytki mikrotitracyjnej. Biofilmom P. aeruginosa pozwolono rozwijać się przez 3 dni przed inkubacją z czynnikami przeciwdrobnoustrojowymi w różnych stężeniach przez 24 godziny. Po rozbiciu biofilmu żywotność komórek zmierzono poprzez barwienie rezazuryną. Test ten wykorzystano do oznaczenia minimalnego stężenia hamującego dla komórek osiadłych (SMIC) tobramycyny dla 15 różnych izolatów P. aeruginosa w warunkach tlenowych i mikroaerofilnych, a następnie wartości SMIC porównano z wartościami uzyskanymi w standardowej hodowli w bulionie. Choć zaobserwowano pewne dowody na zwiększenie wartości MIC dla izolatów hodowanych w ASM w porównaniu z ich odpowiednikami planktonicznymi, największe różnice stwierdzono u bakterii badanych w warunkach mikroaerofilnych, które wykazały znacznie większą oporność na tobramycynę w systemie ASM – wzrost aż >128-krotny – w porównaniu do testów przeprowadzonych w warunkach tlenowych.
Brak związku pomiędzy obecnymi metodami badania wrażliwości a wynikiem klinicznym podał w wątpliwość poprawność aktualnych metod3. Wcześniej do badania biofilmów P. aeruginosa wykorzystywano kilka modeli in vitro7, 8. Metody te opierają się jednak na biofilmach przylegających do powierzchni, podczas gdy biofilmy ASM przypominają te obserwowane w płucach osób z mukowiscydozą (CF)9. Ponadto wykazano, że obniżone stężenie tlenu w śluzie zmienia zachowanie P. aeruginosa2 i wpływa na wrażliwość na antybiotyki10. Dlatego zastosowanie ASM w warunkach mikroaerofilnych może zapewnić bardziej realistyczne środowisko do badania wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe.
Protokół
1. Przygotowanie sztucznego medium plwociny (ASM)
- Bardzo powoli, w ciągu kilku godzin, dodaj 4 g DNA z nasienia ryb do 250 ml sterylnej wody. DNA rozpuszcza się całkowicie w ciągu kilku godzin i może być mieszane przez noc w temperaturze pokojowej.
- Powoli dodaj 5 g mucyny z żołądka świni (typ II) do 250 ml sterylnej wody, aż mucyna całkowicie się rozpuści. Roztwór można mieszać przez noc w temperaturze 4 °C.
- Rozpuść 0,25 g każdego niezbędnego i nieistotnego L-aminokwasu, z wyjątkiem L-tyrozyny i L-cysteiny, w 100 ml sterylnej wody. Rozpuść 0,25 g L-cysteiny w 25 ml 0,5 M wodorotlenku potasu (Mr 56,11 g/mol) oraz 0,25 g L-tyrozyny w 25 ml sterylnej wody.
- Rozpuść 5,9 mg kwasu dietylenotriaminopentaoctowego (DTPA), 5 g NaCl oraz 2,2 g KCl w 100 ml sterylnej wody.
- Połącz DNA, mucynę, L-aminokwasy, DTPA, NaCl i KCl w butelce o pojemności 1 litra.
- Dodaj 5 ml emulsji żółtka jaja i dopełnij do około 850 ml sterylną wodą.
- Ustaw pH na 6,9 za pomocą 1 M Tris (pH 8,5; Mr 121,14) i dopełnij objętość do 1 litra sterylną wodą.
- Sterylizuj ASM poprzez filtrację, używając pompy próżniowej membranowej Vacuubrand ME 2 oraz jednostek filtrujących Millipore Steritop o rozmiarze porów 0,22 μm i średnicy 45 mm. Każda jednostka filtrująca Steritop może być użyta ponownie natychmiast do trzech razy; jednak przed ponownym użyciem filtry należy dwukrotnie przepłukać sterylną wodą. Proces filtracji jest powolny i może być przeprowadzany w ciągu 2 dni. Opracowano inne wersje ASM, w których zamiast filtracji stosuje się dodatek antybiotyków11, jednak ze względu na możliwe interakcje leków nie zalecamy tej metody w tym konkretnym zastosowaniu.
- Niefiltrowany i filtrowany ASM należy przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności. Zaleca się stosowanie świeżego ASM, jednak w tych warunkach może być on przechowywany maksymalnie przez jeden miesiąc.
2. Wyznaczenie minimalnego stężenia metabolicznego hamującego dla planktonicznych i osiadłych komórek (PSMIC)
- Aby wyznaczyć wartości minimalnego metabolicznego stężenia hamującego (PSMIC) dla 15 izolatów P. aeruginosa hodowanych planktonicznie, należy przeprowadzić metodę mikrorozcieńczeń zgodnie z wytycznymi British Society for Antimicrobial Chemotherapy BSAC12. Wybrany antybiotyk, w tym przypadku siarczan tobramycyny, jest rozcieńczany seryjnie w pożywce Luria-Bertani (LB) na płytce mikrotitracyjnej z 96 dołkami, aby uzyskać odpowiedni zakres stężeń antybiotyku.
- Należy rozcieńczyć nocne kultury P. aeruginosa w pożywce LB do wartości OD600 wynoszącej 0,05 (±0,01) i dodać objętości 100 μl do dołków płytki mikrotitracyjnej z 96 dołkami zawierających 100 μl seryjnie rozcieńczonego antybiotyku. W tym przypadku końcowe stężenia siarczanu tobramycyny mieściły się w zakresie 512 - 0,5 μg/ml. Należy wykonać osiem powtórzeń dla każdego stężenia antybiotyku.
- Dla każdego izolatu należy przygotować dołki kontrolne ujemne, do których nie dodaje się antybiotyku. Ponadto osiem dołków powinno zawierać wyłącznie pożywkę LB do wykorzystania jako próbka blank podczas dalszej analizy (Sekcja 2.6).
- Płytki mikrotitracyjne z 96 dołkami należy inkubować przez 1 - 2 dni w temperaturze 37 °C bez wytrząsania, w warunkach tlenowych lub mikroaerofilnych (5 % O2, 10 % CO2 i 85 % N2). Warunki mikroaerofilne uzyskuje się za pomocą zestawów do generowania gazu CampyGen w dużych słoikach beztlenowych.
- Po inkubacji wzrost bakterii określa się poprzez pomiar absorbancji kultury bakteryjnej w każdym dołku przy długości fali 600 nm za pomocą czytnika mikropłytek Fluostar Omega oraz oprogramowania do analizy danych MARS Data Analysis Software.
- Absorbancję z planktonicznych kultur traktowanych antybiotykiem (Aantibiotic treated planktonic cells) oraz absorbancję z kontroli ujemnych (Anegative control) należy skorygować poprzez odjęcie absorbancji tła uzyskanej z dołków zawierających tylko LB (Ablank). Procentowe zahamowanie żywotności oblicza się następnie jako (średnia Aantibiotic treated planktonic cells/średnia Anegative control)x 100 %. PSMIC90 definiuje się jako stężenie antybiotyku powodujące 90 % zahamowania planktonicznego wzrostu bakterii.
- Aby określić żywotność bakterii po traktowaniu wybranym antybiotykiem, do każdego dołka dodaje się 10 μl 0,02 % (v/v) rezazuryny (rozcieńczonej w wodzie destylowanej), a płytki inkubuje się w warunkach tlenowych przez 1 - 2 h w temperaturze 37 °C przy wytrząsaniu z prędkością 150 rpm. Żywe komórki zredukują niebieski barwnik rezazurynę do różowej fluorescencyjnej formy rezorufiny.
- Po inkubacji z rezazuryną należy monitorować fluorescencję każdego dołka, używając długości fali wzbudzenia 540 nm i długości fali emisji 590 nm w czytniku mikropłytek Fluostar Omega. Dane należy analizować zgodnie z opisem poniżej.
3. Wyznaczenie minimalnego stężenia hamującego dla komórek osiadłych w biofilmie (BSMIC)
- Kultury nocne P. aeruginosa (w tym przypadku użyto 15 izolatów P. aeruginosa) należy rozcieńczyć w LB do OD600 wynoszącej 0,05 (±0,01), a następnie rozcieńczyć 1:100 w świeżej pożywce ASM (objętość całkowita 1,8 ml).
- Rozcieńczone kultury (1,8 ml) należy dodać do każdego dołka płytki 24-dołkowej przeznaczonej do hodowli tkanek. Trzy dołki powinny zawierać samą pożywkę ASM, aby służyć jako ślepa próba podczas późniejszej analizy (Sekcja 3.9).
- Płytki 24-dołkowe należy zabezpieczyć laboratoryjną folią parafilm i inkubować przez 3 dni w warunkach tlenowych lub mikroaerofilnych w temperaturze 37 °C, przy wytrząsaniu z prędkością 75 rpm. Warunki mikroaerofilne należy uzyskać za pomocą zestawów do generowania gazów CampyGen w dużych słoikach beztlenowych.
- Wybrany antybiotyk, w tym przypadku siarczan tobramycyny, należy rozcieńczyć w świeżej pożywce ASM, aby uzyskać odpowiedni zakres stężeń. W tym przypadku stężenia końcowe mieściły się w zakresie 512 - 1 μg/ml. Każde stężenie antybiotyku należy dodać w objętości 200 μl do odpowiednich dołków płytek 24-dołkowych. Należy wykonać cztery powtórzenia dla każdego stężenia antybiotyku. Biofilmy nieeksponowane na wybrany antybiotyk posłużyły jako kontrola negatywna.
- Płytki 24-dołkowe należy zabezpieczyć laboratoryjną folią parafilm i inkubować w warunkach tlenowych lub mikroaerofilnych przez kolejne 24 h w temperaturze 37 °C, przy wytrząsaniu z prędkością 75 rpm.
- Po inkubacji w obecności wybranego antybiotyku należy rozbić biofilmy bakteryjne za pomocą 100 μl celulazy o stężeniu 100 mg/ml (rozcieńczonej w 0,05 M buforze cytrynianowym [9,6 g/l Citrate.H20 w wodzie, pH dostosowane do 4,6 za pomocą NaOH]) i inkubować płytki 24-dołkowe w warunkach tlenowych w temperaturze 37 °C, przy wytrząsaniu z prędkością 150 rpm przez 1 h. W razie potrzeby na tym etapie biofilmy można dodatkowo rozbić poprzez manualne pipetowanie.
- Aby określić aktywność metaboliczną komórek bakteryjnych uwolnionych z rozbitych biofilmów, do każdego dołka płytek 24-dołkowych należy dodać 100 μl 0,02 % (v/v) rezazuryny (rozcieńczonej w wodzie destylowanej) i inkubować przez 1 - 2 h w temperaturze 37 °C, przy wytrząsaniu z prędkością 150 rpm.
- Po inkubacji z rezazuryną należy zmierzyć fluorescencję każdego dołka, stosując długość fali pobudzenia 540 nm i długość fali emisji 590 nm w czytniku mikropłytek Fluostar Omega przy użyciu oprogramowania MARS Data Analysis Software.
- Fluorescencję biofilmów traktowanych antybiotykiem (Fantibiotic-treated biofilms) oraz fluorescencję kontroli negatywnej (Fnegative control) należy skorygować poprzez odjęcie fluorescencji tła uzyskanej z dołków zawierających samą pożywkę ASM (Fblank). Procentowe zahamowanie żywotności oblicza się następnie jako (średnia Fantibiotic treated biofilms/średnia Fnegative control) x 100 %. BSMIC90 definiuje się jako stężenie antybiotyku powodujące 90 % zahamowania aktywności metabolicznej.
4. Reprezentatywne wyniki
Tworzenie się biofilmu ASM jest możliwe w małych objętościach (2 ml), a biofilmy są w pełni uformowane w ciągu 3 dni (Rycina 1A). Można to zademonstrować poprzez próbę intensywnego pipetowania biofilmu, który powinien być trudny do rozbicia. Mikrokolonie są porównywalne z tymi wyhodowanymi w większych objętościach4 (Rycina 1B). Rycina 2 przedstawia główne różnice między komórkami hodowanymi planktonicznie a tymi w biofilmie, wykryte za pomocą analizy obrazów z mikroskopu elektronowego. Hodowle biofilmowe wyraźnie wykazują znaczny poziom macierzy zewnątrzkomórkowej otaczającej komórki, a poszczególne struktury wewnątrz biofilmu są trudne do zidentyfikowania.
Kilka badań sugeruje, że tryb życia w formie biofilmu może wpływać na podatność na środki przeciwdrobnoustrojowe13, 14. Nasz małkoskalowy test ASM może być wykorzystany do jednoczesnego wyznaczenia BSMIC dla wielu antybiotyków i wielu izolatów. Schemat postępowania w teście przedstawiono na Rysunku 3. Wpływ antybiotyków na żywotność komórek bakteryjnych można zmierzyć za pomocą testu z rezazuryną. Do uformowanego biofilmu można dodać antybiotyki, w tym przypadku tobramycynę, i inkubować przez 24 h. Następnie biofilm zostaje rozbity, a do układu dodaje się rezazurynę.
Komórki metabolicznie czynne mogą redukować barwnik rezazurynowy, co prowadzi do zmiany koloru z niebieskiego (rezazuryna) na różowy (rezorufina) 15. Rysunek 4A przedstawia przykład testu, w którym P. aeruginosa inkubowano z różnymi stężeniami tobramycyny przed rozbiciem biofilmu i dodaniem rezazuryny na płytce mikrotytrucyjnej. Niebieski kolor niefluorescencyjny wskazuje na komórki niezrównoważone, podczas gdy komórki żywe redukują barwnik do różowej formy fluorescencyjnej, czyli rezorufiny. SMIC można następnie obliczyć, przekształcając fluorescencję w procent pozostałej żywotności bakterii. Rysunek 4B przedstawia zmianę % żywotności wraz ze wzrostem stężenia tobramycyny. Jako wartość odcięcia do obliczenia SMIC90 wybrano żywotność na poziomie 10%.
W warunkach aerobowych wartości SMIC90 dla tobramycyny są wyższe dla komórek wyhodowanych w formie biofilmu niż dla kultur planktonicznych. Tabela 1 przedstawia zmienność PSMIC90 oraz BSMIC90 dla wszystkich badanych izolatów. Tabela 2 pokazuje, że w warunkach aerobowych u większości izolatów zaobserwowano gwałtowny wzrost oporności na tobramycynę (wzrost SMIC od 2 do >32 razy) podczas hodowli w ASM (tryb biofilmu) w porównaniu do LB (tryb planktoniczny). Ponadto biofilmy hodowane w warunkach mikroaerofilnych wykazywały wzrost SMIC od 2 do >128 razy w porównaniu do biofilmów hodowanych w warunkach aerobowych.
Rycina 1. Tworzenie biofilmu przez P. aeruginosa w ASM Szczep PAO1 P. aeruginosa tworzy makroskopowo widoczne skupiska (mikrokolonie) podczas wzrostu w ASM. A, Tworzenie biofilmu w kulturach 30 ml ASM (skala makro) po 7 dniach wzrostu w szklanych kolbach Duran z nakrętką. B, Tworzenie biofilmu w kulturach 2 ml ASM (skala mikro) po 3 dniach wzrostu w polistyrenowych płytkach 24-dołkowych.
Rysunek 2. Mikrografie TEM biofilmów ASM A/C Mikrograf TEM (x27 000) szczepu PAO1 hodowanego odpowiednio planktonicznie oraz w ASM, B/D mikrograf TEM (x57 000) szczepu PAO1 hodowanego odpowiednio planktonicznie oraz w ASM. Bakterie hodowane planktonicznie namnażano przez noc w bulionie LB. Biofilmy hodowano przez 7 dni w 30 ml kultur ASM. Czarne strzałki wskazują komórki wewnątrz biofilmu, a gwiazdki oznaczają przestrzenie zewnątrzkomórkowe. Paski skali = 1 μm.
Rysunek 3. Schemat procedury badania wrażliwości biofilmu ASM na środki przeciwdrobnoustrojowe.
Rycina 4. Wykorzystanie rezazureny do wyznaczania wrażliwości na antybiotyki Komórki bakteryjne inkubowano z różnymi stężeniami antybiotyku, a pozostałą aktywność metaboliczną określono za pomocą rezazureny. A, Niebieska, niefluorescencyjna utleniona forma rezazureny wskazuje na nieżywe komórki i jest redukowana przez metabolicznie aktywne komórki do różowej, fluorescencyjnej rezorufiny. B, Intensywność fluorescencji przekształca się w procent pozostałej żywotności bakterii. Jako punkt odcięcia do obliczenia MSMIC90 przyjęto 10% żywotności. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinię.
| Szczepy | PSMIC 90 (μg/ml) 1 | BSMIC 90 (μg/ml) 1 | ||
| Aerobowe | Mikroaerofilowe2 | Aerobowe | Mikroaerofilowe 2 | |
| PAO1 | 4 | 4 | 8 | >512 |
| Izolaty szczepu epidemicznego z Liverpool (LES) | ||||
| LESB5821 | 8 | 64 | 64 | 128 |
| LES40022 | 32 | 128 | 8 | 256 |
| LESB25 | 16 | 32 | 256 | 512 |
| LESB55 | 16 | 64 | 64 | >512 |
| LESB64 | 16 | 64 | >512 | >512 |
| LES43122 | 4 | 8 | 32 | >512 |
| LESB49 | 16 | 64 | 64 | 256 |
| LES109 | 32 | 128 | 32 | >512 |
| Izolaty poza-LES | ||||
| 49461 | 16 | 32 | 16 | >512 |
| 59032 | 0.5 | 2 | 4 | >512 |
| 59073 | >512 | >512 | >512 | >512 |
| 59076 | 16 | 32 | 32 | >512 |
| 27 | 8 | 16 | 4 | >512 |
| 45 | 16 | 32 | 4 | >512 |
Tabela 1. Podatność P. aeruginosa na tobramycynę.
1Do oznaczenia PSMIC i BSMIC zastosowano tobramycynę w szeregowych rozcieńczeniach dwukrotnych
w zakresie od 512 - 0,5 μg/ml (n = 8 dla każdego stężenia) i 512 - 1 μg/ml (n = 4 dla każdego
stężenia), odpowiednio;; PSMIC oznaczono standardową metodą
mikrorozcieńczeń1.
2Warunki mikroaerofilne wynosiły 5 % O2, 10 % CO2 oraz 85 % N2.
| Szczep | Krotność zmiany PSMIC90/BSMIC901 | |||
| PSMICtlenowa → PSMICmikroaerofilna | BSMICtlenowa → BSMICmikroaerofilna | PSMICtlenowa → BSMICtlenowa | PSMICmikroaerofilna → BSMICmikroaerofilna | |
| PAO1 | 0 | >64 | 2 | 128 |
| Izolaty LES | ||||
| LESB58 | 8 | 2 | 8 | 2 |
| LES400 | 4 | 32 | 0.25 | 2 |
| LESB25 | 2 | 2 | 16 | 16 |
| LESB55 | 4 | >8 | 4 | >8 |
| LESB64 | 4 | ND | >32 | >8 |
| LES431 | 2 | >16 | 8 | >64 |
| LESB49 | 4 | 4 | 4 | 4 |
| LES109 | 4 | 16 | 0 | >4 |
| Izolaty nie-LES | ||||
| 49461 | 2 | >32 | 0 | >16 |
| 59032 | 4 | >128 | 8 | >256 |
| 59073 | ND | ND | ND | ND |
| 59076 | 2 | >16 | 2 | >16 |
| 27 | 2 | >128 | 0.5 | >32 |
| 45 | 2 | >128 | 0.25 | >16 |
Tabela 2. Krotność zmiany PSMIC i BSMIC dla tobramycyny.
1ND, nie określono; wartości pogrubione wskazują zmiany krotności SMIC >10.
Dyskusja
W niniejszym badaniu wykorzystaliśmy nowatorski model in vitro oparty na ASM w celu odtworzenia warunków tworzenia biofilmu przez P. aeruginosa w płucach chorych na CF4. Model ten został pomyślnie zmodyfikowany do małoscale'owych badań wysokoprzepustowych w celu testowania środków przeciwdrobnoustrojowych.
Kluczowe etapy tego testu to:
- Spójne przygotowanie pożywki ASM i utrzymanie sterylności. Poświęciliśmy wiele godzin na optymalizację sposobu dodawania każdego składnika, aby za każdym razem uzyskiwać powtarzalne wyniki. Filtracja ASM jest powolna, ale jest preferowana nad autoklawowaniem, które może uszkodzić komponent mucyny. Nie zalecamy dodawania antybiotyków, jak sugerują inni 11, ponieważ może to wywierać znaczną presję selekcyjną, prowadzić do mutacji, indukować lizę profagów 16 i znacząco zmieniać ekspresję wielu genów bakteryjnych.
- Test należy zoptymalizować w zależności od objętości użytej pożywki ASM. Dla mniejszych objętości zwiększa się prędkość wytrząsania, co skutkuje krótszym cyklem życia biofilmu.
Oczywistym zastosowaniem małoscale'owego modelu biofilmu w ASM jest bardziej realistyczne określanie wrażliwości biofilmu na środki przeciwdrobnoustrojowe (BSMIC90). W płucach pacjentów z mukowiscydozą (CF) występują nisze beztlenowe i mikroaerofilne, a istnieją dowody na to, że dostęp do tlenu jest ograniczony w głębi dojrzałych biofilmów2, 17. Wykazaliśmy tutaj, że 10/14 klinicznych izolatów P. aeruginosa z plwociny pacjentów z CF wykazuje znaczny (4- do ≥ 128-krotny) spadek wrażliwości na tobramycynę w warunkach mikroaerofilnych w ASM. Wyniki niniejszego badania sugerują, że antybiotyki, takie jak tobramycyna, mogą być mniej skuteczne w zwalczaniu infekcji P. aeruginosa w płucach z CF, niż wynikałoby to z konwencjonalnych metod badania wrażliwości. Wyniki te odzwierciedlają wcześniejsze badania nad wrażliwością biofilmów na środki przeciwdrobnoustrojowe 10. Zatem testy w małoscale'owym ASM stanowią prostą platformę wysokoprzepustową do generowania istotnych danych o wrażliwości na antybiotyki, co pozwala na lepsze podejmowanie decyzji terapeutycznych. Metoda ta jest ograniczona w ten sam sposób, co konwencjonalne testy wrażliwości na antybiotyki, ponieważ do przesiewu wybierane są pojedyncze kolonie, które mogą nie być reprezentatywne dla całej populacji. Wierzymy jednak, że podejście (i) wykorzystujące wzrost biofilmu nieprzytwierdzonego do powierzchni oraz (ii) możliwe do zastosowania w warunkach mikroaerofilnych, stanowi wyraźną alternatywę i potencjalną poprawę istniejących metod. Konkludujemy, że test ten jest odpowiednim modelem do badania populacji biofilmów P. aeruginosa. Dalsze badania w warunkach klinicznych pozwoliłyby ustalić, czy wrażliwość na antybiotyki oparta na P. aeruginosa hodowanych w biofilmie mogłaby prowadzić do innych wyborów antybiotykoterapii z potencjalnie lepszymi efektami mikrobiologicznymi i klinicznymi. Podobne badania z wykorzystaniem klasycznych modeli biofilmów wykazały, że wartości BSMIC prowadzą do innych zaleceń dotyczących leczenia antybiotykowego5,17.
Oprócz testowania skuteczności środków przeciwinfekcyjnych, system ASM stanowi tanią, prostą i powtarzalną alternatywę dla modeli zwierzęcych w badaniach takich jak te mające na celu zrozumienie dywersyfikacji populacji P. aeruginosa. Zaobserwowaliśmy rozległą heterogeniczność w naturalnych populacjach P. aeruginosa wyizolowanych z plwociny pacjentów z mukowiscydozą 18, 19. Podobną dywersyfikację fenotypową i genotypową można zaobserwować podczas wzrostu w ASM4 (oraz w naszych niepublikowanych danych), co czyni go atrakcyjnym modelem in vitro warunków panujących w płucach w mukowiscydozie. Stosunkowa prostota modelu ASM ułatwia projektowanie długoterminowych eksperymentów adaptacyjnych mających na celu, na przykład, monitorowanie wpływu antybiotyków lub innych stresorów na dywergencję populacji P. aeruginosa. Ponadto w ASM można hodować inne patogeny bakteryjne. Na przykład Fouhy et al. 2007 wykorzystali ASM do badania tworzenia biofilmu przez S. maltophillia20.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Wyrażamy wdzięczność za wsparcie udzielone przez brytyjski National Institute for Health Research, Dr Hadwen Trust for Humane Research – wiodącą w Wielkiej Brytanii organizację charytatywną wspierającą badania medyczne, która finansuje wyłącznie techniki badawcze bez udziału zwierząt w celu zastąpienia eksperymentów na zwierzętach, oraz Wellcome Trust (grant 089215). Dziękujemy również firmie Novartis Pharmaceuticals UK Ltd (nieograniczony grant edukacyjny).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| DNA z nasienia ryb | Sigma-Aldrich | 74782 | |
| Mucyna z żołądka świni, typ II | Sigma-Aldrich | M2378 | |
| L-Alanina | Acros Organics | 102830250 | |
| L-Arginina | Sigma-Aldrich | A5006 | |
| L(+)-Asparagina monohydrat | Acros Organics | 175271000 | |
| L(+)-Kwas asparaginowy | Acros Organics | 105041000 | |
| L-Cysteina | Sigma-Adrich | 168149 | |
| L(+)-Kwas glutaminowy | Acros Organics | 156211000 | |
| L-Glutamina | Sigma-Aldrich | G3126 | |
| Glicyna | Acros Organics | 220911000 | |
| L-Histydyna | Sigma-Adrich | H8000 | |
| L-Izoleucyna | Sigma-Aldrich | I2752 | |
| L-Leucyna | Sigma-Aldrich | L8000 | |
| L(+)-Lizyny monowodorek | Acros Organics | 125222500 | |
| L-Metionina | Sigma-Aldrich | M9625 | |
| L-Fenyloalanina | Acros Organics | 130310250 | |
| L-Prolina | Sigma-Aldrich | P0380 | |
| L-Seryna | Acros Organics | 132660250 | |
| L-Treonina | Acros Organics | 138930250 | |
| L(-)-Tryptofan | Acros Organics | 140590250 | |
| L-Tyrozyna | Acros Organics | 140641000 | |
| L-Walina | Sigma-Aldrich | V0500 | |
| Kwas didetylenotriaminopentaoctowy | Sigma-Aldrich | 32318 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S/3160/60 | |
| KCl | VWR | BDH0258 | |
| KOH | VWR | BDH0262 | |
| Emulsja z żółtka jaja | Sigma-Aldrich | 17148 | |
| Pompa próżniowa membranowa ME 2 | Vacuubrand | 696126 | |
| Filtry Steritop (rozmiar porów: 0,22 μm, rozmiar szyjki: 45 mm) | EMD Millipore | SCGPT10RE | |
| Pożywka Luria-Bertani | Sigma-Aldrich | L2897 | |
| Mikropłytki 96-dołkowe | Sarstedt Ltd | 82.1581 | |
| Płytki 24-dołkowe do hodowli komórkowych | Iwaki, Asahi Techno Glass Corp. | 3820-024 | |
| Pakiety do generowania gazów CampyGen | Oxford Labware | CN0025 | |
| Komora mikroaerofilna | Oxford Labware | HP0011 | |
| Siarczan tobramycyny | Sigma-Aldrich | T1783 | |
| Celulaza z Aspergillus niger | Sigma-Aldrich | 22178 | |
| Rezazurena | Sigma-Aldrich | 199303 | |
| Cytrynian H2O | VWR | BDH0288 | |
| Czytnik mikropłytek Fluostar omega | BMG-Labtech | SPECTROstar Omega |
Bibliografia
- Andrews, J. M. BSAC standardized disc susceptibility testing method (version 8). J. Antimicrob. Chemother. 64, 454-489 (2009).
- Worlitzsch, D. Effects of reduced mucus oxygen concentration in airway Pseudomonas infections of cystic fibrosis patients. J. Clin. Invest. 109, 317-325 (2002).
- Smith, A. L., Fiel, S. B., Mayer-Hamblett, N., Ramsey, B., Burns, J. L. Susceptibility testing of Pseudomonas aeruginosa isolates and clinical response to parenteral antibiotic administration: lack of association in cystic fibrosis. Chest. 123, 1495-1502 (2003).
- Sriramulu, D. D., Lunsdorf, H., Lam, J. S., Romling, U. Microcolony formation: a novel biofilm model of Pseudomonas aeruginosa for the cystic fibrosis lung. J. Med. Microbiol. 54, 667-676 (2005).
- Garbe, J. Characterization of JG024, a pseudomonas aeruginosa PB1-like broad host range phage under simulated infection conditions. BMC Microbiol. 10, 301(2010).
- Naughton, S. Pseudomonas aeruginosa AES-1 exhibits increased virulence gene expression during chronic infection of cystic fibrosis lung. PLoS One. 6, e24526(2011).
- Moskowitz, S. M., Foster, J. M., Emerson, J. C., Gibson, R. L., Burns, J. L. Use of Pseudomonas biofilm susceptibilities to assign simulated antibiotic regimens for cystic fibrosis airway infection. J. Antimicrob. Chemother. 56, 879-886 (2005).
- Field, T. R., White, A., Elborn, J. S., Tunney, M. M. Effect of oxygen limitation on the in vitro antimicrobial susceptibility of clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa grown planktonically and as biofilms. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 24, 677-687 (2005).
- Bjarnsholt, T. Pseudomonas aeruginosa biofilms in the respiratory tract of cystic fibrosis patients. Pediatr. Pulmonol. 44, 547-558 (2009).
- Hill, D. Antibiotic susceptibilities of Pseudomonas aeruginosa isolates derived from patients with cystic fibrosis under aerobic, anaerobic, and biofilm conditions. J. Clin. Microbiol. 43, 5085-5090 (2005).
- Fung, C. Gene expression of Pseudomonas aeruginosa in a mucin-containing synthetic growth medium mimicking cystic fibrosis lung sputum. J. Med. Microbiol. 59, 1089-1100 (2010).
- Andrews, J. M. BSAC standardized disc susceptibility testing method (version 8). The Journal of antimicrobial chemotherapy. 64, 454-489 (2009).
- Rybtke, M. T. The implication of Pseudomonas aeruginosa biofilms in infections. Inflamm Allergy Drug Targets. 10, 141-157 (2011).
- Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., O'Toole, G. A. Pseudomonas aeruginosa biofilm formation in the cystic fibrosis airway. Pulm. Pharmacol. Ther. 21, 595-599 (2008).
- Ahmed, S. A., Gogal, R. M., Walsh, J. E. A new rapid and simple non-radioactive assay to monitor and determine the proliferation of lymphocytes: an alternative to [3H]thymidine incorporation assay. J. Immunol. Methods. 170, 211-224 (1994).
- Fothergill, J. L. Effect of antibiotic treatment on bacteriophage production by a cystic fibrosis epidemic strain of Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob. Agents Chemother. 55, 426-428 (2011).
- Singh, P. K. Quorum-sensing signals indicate that cystic fibrosis lungs are infected with bacterial biofilms. Nature. 407, 762-764 (2000).
- Mowat, E. Pseudomonas Aeruginosa Population Diversity and Turnover in Cystic Fibrosis Chronic Infections. Am. J. Respir. Crit. Care. Med. , (2011).
- Fothergill, J. L., Mowat, E., Ledson, M. J., Walshaw, M. J., Winstanley, C. Fluctuations in phenotypes and genotypes within populations of Pseudomonas aeruginosa in the cystic fibrosis lung during pulmonary exacerbations. J. Med. Microbiol. 59, 472-481 (2010).
- Fouhy, Y. Diffusible signal factor-dependent cell-cell signaling and virulence in the nosocomial pathogen Stenotrophomonas maltophilia. J. Bacteriol. 189, 4964-4968 (2007).
- Winstanley, C. Newly introduced genomic prophage islands are critical determinants of in vivo competitiveness in the Liverpool Epidemic Strain of Pseudomonas aeruginosa. Genome Res. 19, 12-23 (2009).
- Carter, M. E. A subtype of a Pseudomonas aeruginosa cystic fibrosis epidemic strain exhibits enhanced virulence in a murine model of acute respiratory infection. J. Infect. Dis. 202, 935-942 (2010).
Przedruki i uprawnienia
