Przyłączanie sond biologicznych do krzemionkowych biosensorów optycznych z użyciem silanowych środków sprzęgających

Podsumowanie

Biosensory współpracują ze złożonymi środowiskami biologicznymi i przeprowadzają ukierunkowaną detekcję, łącząc wysokoczułe czujniki z wysoce specyficznymi sondami przytwierdzonymi do czujnika poprzez modyfikację powierzchni. W niniejszym materiale demonstrujemy funkcjonalizację powierzchni krzemionkowych czujników optycznych biotyną przy użyciu czynników sprzęgających na bazie silanów w celu stworzenia pomostu między czujnikiem a środowiskiem biologicznym.

Streszczenie

Aby umożliwić interakcję z środowiskami biologicznymi, platformy biosensorowe, takie jak popularny system Biacore (oparty na technice powierzchniowego rezonansu plazmonowego (SPR)), wykorzystują różnorodne techniki modyfikacji powierzchni. Mogą one na przykład zapobiegać foulingowi powierzchni, dostrajać jej hydrofobowość / hydrofilowość, adaptować ją do różnych środowisk elektronicznych, a najczęściej nadawać specyficzność w kierunku interesującego celu.^1-5 Techniki te rozszerzają funkcjonalność wysokoczułych biosensorów na praktyczne zastosowania w złożonych środowiskach, takich jak analiza krwi, moczu i ścieków.^2,6-7 Chociaż komercyjne platformy biosensoryczne, takie jak Biacore, dysponują dobrze rozumianymi, standardowymi technikami przeprowadzania takich modyfikacji powierzchni, nie zostały one w sposób zestandaryzowany przeniesione na inne platformy biosensoryczne bez użycia znaczników, takie jak optyczne rezonatory w trybie szeptającej galerii (WGM).^8-9

Optyczne rezonatory WGM stanowią obiecującą technologię do bezznakowej detekcji szerokiej gamy substancji w ultra-niskich stężeniach.^6,10-12 Wysoka czułość tych platform wynika z ich unikalnej optyki geometrycznej: optyczne rezonatory WGM ograniczają krążące światło przy określonych, całkowitych częstotliwościach rezonansowych.¹³ Podobnie jak w platformach SPR, pole optyczne nie jest całkowicie ograniczone do urządzenia czujnikowego, lecz wygasa; ten „ogon ewanescentny” może następnie oddziaływać z substancjami w otaczającym środowisku. Oddziaływanie to powoduje zmianę efektywnego współczynnika załamania światła pola optycznego, co skutkuje niewielkim, ale wykrywalnym przesunięciem częstotliwości rezonansowej urządzenia. Ponieważ pole optyczne krąży, może ono wielokrotnie oddziaływać z otoczeniem, co prowadzi do wewnętrznego wzmocnienia sygnału i bardzo wysokiej czułości na niewielkie zmiany w środowisku.^2,14-15

Aby przeprowadzić celowaną detekcję w złożonych środowiskach, platformy te muszą zostać połączone z cząsteczką sondą (zazwyczaj jedną z par wiążących, np. przeciwciałami / antygenami) poprzez modyfikację powierzchni.² Chociaż optyczne rezonatory WGM mogą być wytwarzane w kilku geometriach z różnych systemów materiałowych, najczęściej stosowane są mikrosfery krzemionkowe. Mikrosfery te są zazwyczaj wytwarzane na końcu włókna optycznego, które stanowi „trzon”, umożliwiający manipulowanie mikrosferami podczas funkcjonalizacji i eksperymentów detekcyjnych. Do przyłączania cząsteczek sond do ich powierzchni można zastosować metody chemii powierzchni krzemionki; jednak tradycyjne techniki opracowane dla podłoży płaskich często nie są odpowiednie dla tych trójwymiarowych struktur, ponieważ wszelkie zmiany na powierzchni mikrosfer (kurz, zanieczyszczenia, defekty powierzchniowe i nierównomierne powłoki) mogą mieć poważne, negatywne skutki dla ich zdolności detekcyjnych. W niniejszej pracy przedstawiamy prostą metodę funkcjonalizacji powierzchni optycznych rezonatorów WGM w postaci mikrosfer krzemionkowych z wykorzystaniem silanowych środków sprzęgających do połączenia powierzchni nieorganicznej ze środowiskiem biologicznym poprzez przyłączenie biotyny do powierzchni krzemionki.^8,16 Chociaż w tym raporcie jako system sensoryczny wykorzystujemy rezonatory WGM z mikrosfer krzemionkowych, protokoły te są ogólne i mogą być stosowane do funkcjonalizacji biotyną powierzchni każdego urządzenia krzemionkowego.

Protokół

1. Wstęp

Biotyna jest mocowana do powierzchni tych urządzeń w prostym, trzyetapowym procesie (Rysunek 1). Po pierwsze, oczyszczamy powierzchnię i nasycamy ją grupami hydroksylowymi, poddając urządzenia działaniu plazmy tlenowej lub roztworu piranha. Po drugie, wykorzystujemy osadzanie z fazy gazowej, aby przyłączyć do grup hydroksylowych za pomocą reakcji hydrolizy i kondensacji silanowy czynnik sprzęgający zakończony aminą pierwszorzędową. Po trzecie, mocujemy biotynę do powierzchni przy użyciu chemii estrów N-hydroksysukcynimidu (NHS). Zainteresowanych czytelników odsyłamy do naszych poprzednich prac w celu uzyskania szerszych informacji na temat rozwoju tych technik, a także wyjaśnienia motywacji stojącej za ich wyborem.⁸

Powodzenie tych reakcji można ocenić za pomocą mikroskopii optycznej i fluorescencyjnej po dodaniu aminy pierwszorzędowej, a także po dodaniu biotyny. Podczas gdy mikroskopia optyczna może służyć do określenia, czy protokoły funkcjonalizacji powierzchni spowodowały uszkodzenie powierzchni mikrosfer lub nawet zanieczyszczenie, mikroskopia fluorescencyjna jest wykorzystywana do weryfikacji jakości i jednorodności pokrycia powierzchni cząsteczkami biotyny, a także zdolności biotyny na powierzchni do wiązania się ze (strept)awidyną. Aby ocenić stopień pokrycia powierzchni aminami, zastosowano barwnik fluorescencyjny izotiocyjanian fluoresceiny (FITC), który reaguje z aminami pierwszorzędowymi, tworząc stabilne, kowalencyjne wiązanie tiomocznika z mikrosferą. Barwnik fluorescencyjny Texas Red skoniugowany z awidyną jest używany do znakowania grup biotyny na powierzchni poprzez oddziaływanie biotyna-awidyna. W obu przypadkach wybrano barwniki, które mogą oddziaływać (poprzez oddziaływania receptor-ligand lub wiązania kowalencyjne) z grupami funkcyjnymi na powierzchni.

W tym przypadku środek sprzęgający silanowy, posiadający trzy grupy odchodzące i jedną grupę funkcyjną, stanowi pomost pomiędzy powierzchnią nieorganiczną a organiczną cząsteczką sondy. Funkcjonalność aminy pierwszorzędowej reaguje ilościowo z estrami NHS, tworząc stabilne wiązania amidowe. W tym przypadku stosujemy cząsteczkę sondy biotyny, której łańcuch boczny kwasu walerowego został zmodyfikowany grupą estrową NHS. W praktyce dowolną cząsteczkę sondy, do której można dołączyć grupę estrową NHS, można przytwierdzić do powierzchni, korzystając z poniższych protokołów. Ponadto protokoły te są uniwersalne i mogą być wykorzystane do funkcjonalizacji biotyną dowolnej powierzchni urządzenia krzemionkowego.

Głównym wyzwaniem w przypadku tych protokołów nie jest sama chemia, lecz sposób obchodzenia się z mikrosferami krzemionkowymi. Należy pamiętać, że w trakcie całej procedury mikrosfery należy przemieszczać, delikatnie chwytając ich trzon ostro zakończoną pęsetą. Pozwala to utrzymać pęsetę w bezpiecznej odległości od samych mikrosfer i ułatwia ich transport między poszczególnymi etapami. Wiele kroków w poniższym protokole zostało zaprojektowanych specjalnie z uwzględnieniem tego czynnika.

2. Wytwarzanie mikrosfer

1. Przygotuj obudowę do przechowywania mikrosfer.
   1. Za pomocą noża typu exacto wytnij z tektury o grubości ¼ in kwadrat o wymiarach 1 in x 1 in; przyklej go taśmą do standardowego szkiełka przedmiotowego, a następnie do tektury przyczep 1 in odcinek taśmy klejącej, zwijając ją w rulon tak, aby końce się stykały.
   2. Tworzy to platformę, na której mikrosfera może zostać uniesiona i odizolowana od otoczenia, co zapobiega uszkodzeniom jej powierzchni.
2. Za pomocą nożyczek odetnij 3 inch odcinek włókna optycznego z szpuli włókna optycznego.
3. Za pomocą ściągacza do światłowodów No-Nik usuń ochronną powłokę polimerową z ostatnich 0.5 inches odciętego odcinka włókna, pozostawiając jedynie rdzeń krzemionkowy. Oczyść powierzchnię z pozostałości polimeru za pomocą chusteczki Kimwipe zwilżonej metanolem, delikatnie przecierając włókno.
4. Za pomocą przecinarki do gołych światłowodów przytnij odsłonięty koniec tak, aby na końcu włókna pozostało tylko około 1 millimeter odsłoniętego włókna.
5. Umieść odsłonięty koniec włókna optycznego na drodze wiązki lasera CO₂, dbając o pionowe ustawienie włókna tak, aby jego odsłonięty koniec był skierowany w dół.
6. Włącz laser CO₂ i skieruj go na powierzchnię odsłoniętego końca włókna optycznego. Laser stopi odsłonięty koniec włókna w sferę przy użyciu około 3.5% mocy w czasie 2 seconds.
7. Za pomocą pęsety ostrożnie chwyć trzoneczkę (nieodsłoniętą część włókna optycznego) mikrosfery. Przymocuj trzoneczkę do rulonu taśmy na obudowie mikrosfery. Szkiełko przedmiotowe można przechowywać w szalce Petriego. Zapewnia to bezpieczne przechowywanie mikrosfery.

3. Pokrywanie powierzchni grupami hydroksylowymi

1. Zastosowanie roztworu piranha:
   1. W 60 ml polipropylenowej fiolce z zawiasowym korkiem przygotować roztwór piranha (stosunek objętości 70:30 dymiącego H₂SO₄:H₂O₂ (30% wag.)) poprzez dodanie do fiolki 5 ml nadtlenku wodoru, a następnie 11,6 mL dymiącego kwasu siarkowego. OSTROŻNIE: należy używać rękawic odpornych na kwasy.
   2. Przenieść szkiełko przedmiotowe zawierające co najmniej jedną mikrosferę do fiolki. Mikrosfera powinna znajdować się w kontakcie z cieczą, ale ciecz nie powinna dotykać tektury. W razie potrzeby dostosować objętość roztworu.
   3. Ostrożnie wyjąć szkiełko przedmiotowe z fiolki i umieścić je w drugiej plastikowej fiolce zawierającej DDI H₂O. Pozostawić próbki w roztworze na 5 minut.
   4. Ostrożnie wyjąć szkiełko przedmiotowe z fiolki i umieścić je w piekarniku w temperaturze 80 °C na 10 minut w celu wysuszenia powierzchni.
2. Zastosowanie obróbki plazmą tlenową:
   1. Przenieść szkiełko przedmiotowe zawierające co najmniej jedną mikrosferę do komory plazmy tlenowej.
   2. Ustawić ciśnienie tlenu na 200 mTorr oraz moc na 120 W. Poddać próbkę działaniu plazmy tlenowej przez 2 minuty.
   3. Wyjąć szkiełko przedmiotowe z komory plazmy.

4. Mocowanie środków sprzęgających silanowych do powierzchni

1. Umieść szkiełko przedmiotowe zawierające co najmniej jedną mikrosferę w suszarce próżniowej w dygestorium.
2. W dygestorium otwórz butelkę z silanowym środkiem sprzęgającym (w tym przypadku użyto aminopropylotrimetoksysilanu (APTMS)) i umieść otwartą butelkę w suszarce.
3. Nałóż pokrywę na suszarkę próżniową i podłącz wylot do aspiratora lub stacjonarnej linii próżniowej.
4. Włącz system próżniowy lub linię wodną i odessaj powietrze z suszarki próżniowej. Po utworzeniu się szczelnego zamknięcia między pokrywą a podstawą rozpocznij pomiar czasu reakcji. Spowoduje to osadzenie silanowego środka sprzęgającego na powierzchni w postaci cienkiej warstwy.
5. Po 15 minutach wyłącz próżnię i powoli otwórz zawór, aby wpuścić powietrze do suszarki. W przypadku tego środka sprzęgającego 15 minut jest wystarczające do utworzenia jednorodnej monowarstwy na powierzchni. W przypadku innych środków sprzęgających czas ten może wymagać dostosowania.

5. Mocowanie biotyny do powierzchni

1. Około godziny przed przyłączeniem biotyny przygotować 10 mM roztwór N-hydroksysukcynimidobiotyny (NHS-biotyny) w bezwodnym dimetylosulfotlenku (DMSO) w 60 mL polipropylenowej probówce z zawiasowym zamknięciem.
   1. Jeśli NHS-biotyna była przechowywana w niskiej temperaturze, należy pozostawić ją do wyrównania temperatury do temperatury pokojowej przed odważeniem.
   2. Roztwór poddać sonikacji przez 1 godzinę, aby całkowicie rozpuścić proszek NHS-biotyny w rozpuszczalniku.
2. Przenieść szkiełko zawierające mikrosferę do innej plastikowej probówki tak, aby mikrosfery znajdowały się na dnie, a trzpienie u góry probówki.
3. Za pomocą plastikowej pipety przenieść odpowiednią objętość roztworu NHS-biotyny, spływając po ściance probówki za szkiełkiem (tak, aby roztwór nie dotykał mikrosfery podczas dodawania go do probówki). Dodać wystarczającą ilość roztworu, aby pokryć powierzchnię mikrosfery.
4. Umieścić probówki zawierające mikrosfery i roztwór NHS-biotyny w DMSO w inkubatorze obrotowym (na tacy z odchyleniem) na 30 minut w temperaturze pokojowej, przy prędkości 5 rpm i kącie nachylenia 5 stopni.
5. Ostrożnie wyjąć szkiełko z probówki i delikatnie wsunąć je do drugiej probówki wypełnionej wodą DDI H₂O. Umieścić probówkę na tacy z odchyleniem na kolejne 10 minut przy tej samej prędkości i kącie nachylenia co wcześniej. Powtórzyć ten krok dwukrotnie, za każdym razem używając świeżej wody. Pomaga to usunąć nadmiar DMSO z powierzchni oraz usunąć biotynę zaadsorbowaną fizycznie, która nie została faktycznie szczepiona z powierzchnią.
6. Wyjąć szkiełko z probówki i umieścić je w piekarniku w temperaturze 80 °C na 10 minut lub do czasu usunięcia wszystkich kropel wody z powierzchni.

6. Znakowanie fluorescencyjne krzemionki zakończonej grupami aminowymi

1. Aby oznakować grupy aminowe obecne po traktowaniu APTMS, przygotuj w zaciemnionym pomieszczeniu roztwór FITC, rozpuszczając 1 mg FITC w 1 mL bezwodnego DMSO.
2. Rozcieńcz roztwór z punktu 6.1, dodając 50 μL roztworu FITC do 1 mL 0,1 M buforu wodorowęglanu sodu.
3. Przenieś roztwór do 60 mL polipropylenowej fiolki z zawiasowym zamknięciem, a następnie ostrożnie wsuń do fiolki szkiełko przedmiotowe z naniesionymi mikrosferami z grupami aminowymi.
4. Umieść fiolkę w łaźni lodowej i pozostaw próbkę do reakcji z roztworem FITC w ciemności przez co najmniej 4 godziny.
5. Usuń nadmiar fluoroforu, płukając mikrosfery dwukrotnie przez 10 minut w buforze węglanu sodu. Podobnie jak wcześniej, napełnij 60 mL polipropylenową fiolkę z zawiasowym zamknięciem buforem i ostrożnie wsuń do roztworu szkiełko przedmiotowe, dbając o to, aby roztwór zakrywał jedynie mikrosfery, a nie tekturową obudowę. Przykryj fiolkę folią aluminiową i umieść ją na tacy przechylnej ustawionej pod kątem 5 stopni i z prędkością 5 rpm, analogicznie do poprzednich etapów.
6. Ostrożnie wyjmij szkiełko przedmiotowe z fiolki i delikatnie wsuń je do kolejnej fiolki wypełnionej DDI H₂O i zakrytej folią aluminiową. Umieść fiolkę na tacy przechylnej na kolejne 10 minut przy tej samej prędkości i kącie nachylenia co wcześniej. Powtórz ten krok dwukrotnie, za każdym razem używając świeżej wody. Pomaga to usunąć nadmiar barwnika z powierzchni.
7. Ostrożnie wyjmij szkiełko przedmiotowe z fiolki i wysusz w suszarce ustawionej na 80 C przez 10 minut przed obrazowaniem.

7. Znakowanie fluorescencyjne krzemionki zakończonej biotyną

1. Przygotować roztwór Texas-Red avidyny o stężeniu 10 μg/mL w roztworze soli fizjologicznej fosforanowej (PBS).
2. Przenieść roztwór do 60 mL polipropylenowej fiolki z zawiasowym zamknięciem, a następnie ostrożnie wsunąć szkiełko z mikrosferą zakończoną biotyną do roztworu w taki sposób, aby mikrosfera była ledwie przykryta cieczą.
3. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
4. Usunąć nadmiar fluoroforu poprzez dwukrotne, 10-minutowe płukanie mikrosfer w buforze PBS.
   1. Podobnie jak wcześniej, napełnić 60 mL polipropylenową fiolkę z zawiasowym zamknięciem buforem i ostrożnie wsunąć szkiełko do roztworu, dbając o to, aby roztwór przykrywał jedynie mikrosferę, a nie tekturową obudowę.
   2. Owinąć fiolkę folią aluminiową i umieścić ją na tacy przechylnej ustawionej pod kątem 5 stopni i z prędkością 5 rpm, analogicznie do poprzednich kroków.
5. Ostrożnie wyjąć szkiełko z fiolki i delikatnie wsunąć je do drugiej fiolki wypełnionej wodą DDI H₂O i owiniętej folią aluminiową. Umieścić fiolkę na tacy przechylnej na kolejne 10 minut przy tej samej prędkości i kącie nachylenia co wcześniej. Powtórzyć ten krok dwukrotnie, za każdym razem używając świeżej wody. Pomaga to usunąć nadmiar barwnika z powierzchni.
6. Ostrożnie wyjąć szkiełko z fiolki i suszyć w piekarniku ustawionym na 80 °C przez 10 minut przed obrazowaniem.

8. Reprezentatywne wyniki

Prawidłowo funkcjonalizowane mikrosfery można zidentyfikować za pomocą mikroskopii optycznej i fluorescencyjnej. Jeśli funkcjonalizacja powierzchni została przeprowadzona prawidłowo, powinna ona skutkować jednorodną i gęstą warstwą cząsteczek biotyny na powierzchni, a sama powierzchnia powinna pozostać wolna od defektów i zanieczyszczeń po funkcjonalizacji, aby zachować wysoką czułość podczas eksperymentów detekcyjnych. Mikroskopia optyczna może służyć do weryfikacji tego drugiego aspektu, natomiast mikroskopia fluorescencyjna pozwala zbadać jakość i jednorodność pokrycia powierzchni. Na Ryc. 2 przedstawiamy przykłady prawidłowo funkcjonalizowanych mikrosfer. Obrazy te pokazują brak uszkodzeń powierzchni lub zanieczyszczeń wynikających z funkcjonalizacji (Ryc. 2a) oraz wykazują, że mikrosfery charakteryzują się jednorodnym i spójnym pokryciem powierzchni grupami aminowymi (Ryc. 2b) lub grupami biotyny (Ryc. 2c).

Jeśli mikrosfery nie zostały prawidłowo funkcjonalizowane, na obrazach optycznych mikrosfer będą widoczne zanieczyszczenia powierzchni, aglomeracja lub nierównomierna pokrycie, a także wyraźne defekty powierzchni, takie jak pęknięcia (Rycina 3). Tutaj widzimy typowy przykład zanieczyszczenia powierzchni, będącego wynikiem aglomeracji odczynników na powierzchni.

Rysunek 1. 3-stopniowy schemat reakcji przyłączania cząsteczek sond do powierzchni mikrosfer krzemionkowych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy rysunek.

Rycina 2. Mikrosfery krzemionkowe. a) Mikrografia optyczna mikrosfery krzemionkowej z grupami hydroksylowymi wprowadzonymi poprzez ekspozycję na plazmę tlenową; b) Mikrografia fluorescencyjna mikrosfery krzemionkowej z aminami pierwszorzędowymi oznakowaną barwnikiem FITC; c) Mikrografia fluorescencyjna mikrosfery krzemionkowej z biotyną oznakowaną koniugatem Texas Red-awidyna. Przedrukowano za zgodą Soteropulos, C. E., Hunt, H. K. & Armani, A. M. Determination of binding kinetics using whispering gallery mode microcavities. Appl. Phys. Lett. 99, 103703-103703 (2011). Copyright 2011, American Institute of Physics.¹⁷

Rycina 3. Mikrografia optyczna nieprawidłowo funkcjonalizowanej sfery. Tutaj widoczny jest kurz na górnej prawej powierzchni, a także zanieczyszczenia wystające poza powierzchnię. Dodatkowo, po prawej stronie optycznej mikrosfery widoczne jest niewielkie wgłębienie na powierzchni.

Dyskusja

Zgodnie z opisem w protokołach, stworzyliśmy platformę stabilizującą, która umożliwia transport mikrosfer krzemionkowych za pomocą ich trzpieni podczas całego procesu funkcjonalizacji. Platforma ta została opracowana jako rozwiązanie problemu zanieczyszczeń powierzchniowych i uszkodzeń wynikających z kontaktu mikrosfer ze ściankami różnych naczyń wykorzystywanych w trakcie procesu funkcjonalizacji. Zauważyliśmy, że główna trudność wynika z konieczności ciągłego przenoszenia pojedynczych mikrosfer między różnymi naczyniam...