Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Hodowla i zastosowania trójwymiarowych modeli komórek nabłonkowych otrzymywanych w bioreaktorze z rotującą ścianką (Rotating Wall Vessel)

26.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/3868

⸱

3 kwietnia 2012

 , 
1Basic Medical Sciences, University of Arizona College of Medicine - Phoenix

W tym artykule

Podsumowanie

Opisano rotujący system hodowli komórkowej, który umożliwia wzrost komórek nabłonkowych w warunkach fizjologicznych, co prowadzi do tworzenia trójwymiarowych agregatów komórkowych. Powstałe agregaty wykazują cechy podobne do tych obserwowanych in vivo, których nie stwierdzono w konwencjonalnych modelach hodowli, i służą jako dokładniejszy organotypowy system modelowy dla wielu badań naukowych.

Streszczenie

Komórki i tkanki w organizmie podlegają warunkom środowiskowym, które wpływają na ich architekturę, komunikację międzykomórkową oraz ogólne funkcje. Aby modele hodowli komórkowych in vitro mogły dokładnie naśladować badaną tkankę, środowisko wzrostu hodowli jest kluczowym aspektem, który należy wziąć pod uwagę. Powszechnie stosowane konwencjonalne systemy hodowli komórkowych namnażają komórki nabłonkowe na płaskich, dwuwymiarowych (2-D) powierzchniach nieprzepuszczalnych. Choć dzięki konwencjonalnym systemom hodowli komórkowych zdobyto wiele informacji, wiele odkryć nie znajduje potwierdzenia w badaniach klinicznych z udziałem ludzi ani w eksplantach tkankowych, co może wynikać z braku fizjologicznie istotnego mikrośrodowiska.

W niniejszej pracy opisujemy system hodowli, który dzięki zastosowaniu innowacyjnej technologii bioreaktora z obrotową ścianką (RWV) pozwala pokonać wiele ograniczeń warunków hodowli komórkowych 2-D. My oraz inni badacze wykazaliśmy, że organotypowe modele pochodzące z RWV mogą odtwarzać strukturę, funkcję oraz autentyczne ludzkie reakcje na bodźce zewnętrzne w sposób podobny do ludzkich tkanek eksplantowanych 1-6. Bioreaktor RWV to system hodowli zawiesinowej, który umożliwia wzrost komórek nabłonkowych w warunkach niskiego fizjologicznego ścinania płynu. Bioreaktory występują w dwóch różnych formatach: naczyniu obrotowym o wysokim stosunku wymiarów (HARV) lub naczyniu bocznym o wolnych obrotach (STLV), które różnią się źródłem napowietrzania. Komórki nabłonkowe dodaje się do wybranego bioreaktora wraz z porowatymi mikronośnikami pokrytymi kolagenem (Ryc. 1A). Komórki wykorzystują mikronośniki jako rusztowanie do wzrostu podczas ciągłego swobodnego opadania w bioreaktorze (Ryc. 1B). Mikrośrodowisko zapewnione przez bioreaktor pozwala komórkom na tworzenie trójwymiarowych (3-D) agregatów wykazujących charakterystyki podobne do tych in vivo, których często nie obserwuje się w standardowych warunkach hodowli 2-D (Ryc. 1D). Charakterystyki te obejmują połączenia ścisłe, produkcję śluzu, orientację apikalno-bazalną, lokalizację białek in vivo oraz dodatkowe właściwości specyficzne dla danego typu komórek nabłonkowych.

Progresja od monowarstwy komórek nabłonkowych do w pełni zróżnicowanego agregatu 3-D zależy od typu komórek1, 7-13. Okresowe pobieranie próbek z bioreaktora umożliwia monitorowanie tworzenia się agregatów nabłonkowych, markerów różnicowania komórkowego oraz żywotności (Rysunek 1D). Po ustaleniu różnicowania komórkowego i formowania się agregatów, komórki są zbierane z bioreaktora, a testy podobne do tych wykonywanych na komórkach 2-D można zastosować do agregatów 3-D, uwzględniając kilka kwestii (Rysunek 1E-G). W niniejszej pracy opisujemy szczegółowe kroki hodowli 3-D agregatów komórek nabłonkowych w systemie bioreaktora RWV oraz szereg potencjalnych testów i analiz, które można przeprowadzić na agregatach 3-D. Analizy te obejmują, między innymi, analizę strukturalną/morfologiczną (konfokalna, skaningowa i transmisyjna mikroskopia elektronowa), sekrecję cytokin/chemokin i sygnalizację komórkową (analiza cytometryczna CBA oraz Western blot), analizę ekspresji genów (real-time PCR), analizę toksykologiczną/lekową oraz interakcje gospodarz-patogen. Wykorzystanie tych testów stanowi podstawę dla bardziej szczegółowych i obszernych badań, takich jak metabolomika, transkryptomika, proteomika i inne zastosowania oparte na macierzach. Naszym celem jest przedstawienie niekonwencjonalnej metody hodowli ludzkich komórek nabłonkowych w celu wytworzenia organotypowych modeli 3-D, które odwzorowują ludzką tkankę in vivo , w prostym i niezawodnym systemie przeznaczonym dla badaczy o zróżnicowanych zainteresowaniach naukowych.

Protokół

Wszystkie etapy należy przeprowadzić w warunkach BSL-2 w komorze z laminarnym przepływem powietrza.

1. Przygotowanie bioreaktora STLV

  1. Złożyć bioreaktor STLV zgodnie z protokołem producenta i przeprowadzić protokół detoksykacji, aby zapewnić sterylność bioreaktora. Otwarte porty zakryć zaślepkami Luer i wypełnić STLV 95% ethanol przez 24 h.
  2. Usunąć ethanol i wypełnić STLV sterylizowaną wodą destylowaną na 24 h.
  3. Powtórzyć krok 1.2, używając wyłącznie sterylizowanej wody destylowanej.
  4. Za pomocą narzędzia dostarczonego przez dostawcę poluzować wszystkie śruby, nakrętki i centralny korek w STLV, a następnie autoklawować w 110 °C przez 20 min w worku do sterylizacji.
  5. Po ostygnięciu STLV dokręcić śruby i powtórzyć kroki 1.1-1.4, aby zapewnić sterylność i całkowitą detoksykację.
  6. Dokręcić śruby w ostudzonym STLV i przykręcić wstępnie wysterylizowane zawory jednokierunkowe do każdego portu.
  7. Otworzyć zawór, ustawiając pokrętła pionowo.
  8. Wyjąć tłoki z strzykawek Luer-lock o pojemności 10 mL i 5 mL i ponownie włożyć tłoki do opakowań, aby zachować sterylność. Przykręcić strzykawki do zaworów (na tym etapie wymagane są strzykawki z końcówką Luer-lock).
  9. Dodać Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) do strzykawki 10 mL, aż STLV zostanie wypełniony i płyn zacznie wypełniać strzykawkę 5 mL.
  10. Włożyć sterylne tłoki do każdej strzykawki i usunąć pozostałe pęcherzyki powietrza w bioreaktorze, naprzemiennie przesuwając tłoki strzykawek.
  11. Pozostawić strzykawki przymocowane do bioreaktora po usunięciu wszystkich pęcherzyków. Zamknąć zawory, przymocować STLV do obrotowej platformy pionowej i obracać przez minimum 24 h w celu monitorowania szczelności.

2. Przygotowanie kulek mikronośników

  1. Do ok. 250 mg kulek mikronośników Cytodex w probówce stożkowej o pojemności 50 mL dodać 15 mL DPBS i wysterylizować w autoklawie w tych samych warunkach, co STLV (1.4).
  2. Po ochłodzeniu usunąć DPBS, dodać pożywkę użytą do hodowli badanych komórek nabłonkowych i zamieszać probówkę w celu resuspensji kulek.
  3. Powtórzyć etapy płukania pożywką jeszcze dwukrotnie. Po ostatnim płukaniu dodać do kulek 15 mL pożywki wzrostowej.

3. Wysiewanie komórek nabłonkowych i kulek do bioreaktora STLV

  1. Hodować wybrane komórki nabłonkowe w monowarstwach w kolbach do hodowli tkanek, aż do uzyskania ≥1x107 komórek. Usunąć komórki z kolby (np. poprzez trypsynizację, EDTA), policzyć komórki w celu ustalenia stężenia oraz określić żywotność komórek za pomocą barwienia wykluczającego błękitem trypanu1.
  2. Do probówki stożkowej zawierającej przygotowane kuleczki (patrz 2.3) dodać pożądane stężenie komórek (2x105-1x107 komórek nabłonkowych)2, 8, w zależności od zamierzonego typu komórek nabłonkowych (Rysunek 1A). Upewnić się, że wszystkie komórki zostały przeniesione, płucząc probówkę stożkową.
  3. Usunąć DPBS oraz strzykawki z STLV.
  4. Zdjąć korek z portu środkowego i wprowadzić zawiesinę komórek nabłonkowych/kuleczek do STLV za pomocą pipety serologicznej 10 mL. Przepłukać probówkę stożkową, aby upewnić się, że wszystkie komórki/kuleczki zostały przeniesione do STLV, a następnie założyć korek portu środkowego.
  5. Wyjąć tłoki ze strzykawek 5 i 10 mL i ponownie włożyć je do opakowań, aby zachować sterylność. Wkręcić strzykawki do portów z otwartymi kranikami. Wypełnić STLV pożywką, włożyć tłoki i zamknąć kraniki.
  6. Umieścić nowo zasiałe STLV w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 30 min bez rotacji.
  7. Otworzyć kraniki, usunąć pęcherzyki powietrza za pomocą tłoków, a następnie zamknąć kraniki.
  8. Umieścić STLV w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C, z 5% CO2, rotując z prędkością 20 rpm (Rysunek 1B). Hodowle muszą być rotowane w sposób ciągły 24 h na dobę, z wyjątkiem momentów pobierania próbek, wymiany pożywki lub zbierania agregatów (patrz następna sekcja).

4. Hodowla, pobieranie próbek i dokumentacja fotograficzna kultur

  1. Po początkowych 96-120 h hodowli komórek w bioreaktorze należy wymienić medium, przechylając STLV i pozwalając komórkom/kulkom osiąść. Należy wyjąć strzykawki, otworzyć oba kurki i odlać ok. 75% medium przez port boczny (Rycina 1C). W zależności od metabolizmu komórkowego medium, wymieniać medium codziennie lub co drugi dzień po początkowym zasiewie i 96-120 h okresie hodowli.
  2. Należy przykręcić strzykawki o pojemności 5 i 10 mL bez tłoków i postępować zgodnie z protokołem dożywiania opisanym powyżej (1.7-1.11), a następnie ponownie przykręcić zamknięty STLV na platformie obrotowej.
  3. Monitorować wzrost i żywotność agregatów co 5-7 dni po zasiewie do STLV, ostrożnie pobierając niewielką ilość agregatów (~200 μL) z portu środkowego do dwóch probówek 1,5 mL. Aby uniknąć ścinania agregatów, przy wszystkich przeniesieniach agregatów należy używać końcówki do pipety 1000 μL, która została odcięta ok. 2 cm od wierzchołka i wysterylizowana.
  4. Włożyć z powrotem korek środkowy, wymienić strzykawki na nowe, dodać świeże medium do STLV zgodnie z opisem powyżej (1.7-1.11), a następnie umieścić STLV z powrotem w inkubatorze z rotacją (patrz 3.8).
  5. Aby monitorować żywotność komórek, należy użyć jednej z dwóch porcji agregatów w probówkach 1,5 mL pobranych w kroku 4.3 i usunąć komórki z kulek w ten sam sposób, w jaki usuwa się komórki nabłonkowe z kolb do hodowli tkanek (tj. poprzez trypsynizację). Żywotność należy monitorować za pomocą barwienia wykluczającego błękitem trypanowym1.
  6. W celu obrazowania agregatów komórkowych dodać 0,5-1 mL medium do drugiej porcji agregatów 1,5 mL i przenieść je do małej szalki Petriego, używając odciętej końcówki pipety 1000 μL. Obrazować agregaty przy użyciu odwróconego mikroskopu świetlnego (Rycina 1D).

5. Przenoszenie i zbieranie agregatów

  1. W przypadku niektórych modeli komórek nabłonkowych konieczne jest przeniesienie agregatów do jednorazowego HARV w celu zwiększenia napowietrzania hodowli2. Około jednego tygodnia przed zbiorami agregatów do analizy, należy usunąć strzykawki oraz kurki z STLV i odlać ~50% pożywki z portu bocznego.
  2. Należy usunąć centralny korek STLV i ostrożnie przelać całą zawartość do probówki stożkowej 50 mL przez port centralny (Rycina 1E). STLV należy przepłukać dwukrotnie 5 mL pożywki, a płuczkę połączyć z resztą agregatów.
  3. Należy kontynuować przenoszenie agregatów zgodnie z opisem w punkcie 5.2, przenosząc agregaty z probówki stożkowej 50 mL do HARV.
  4. Agregaty należy ostrożnie zebrać z HARV po ~1 tygodniu lub z STLV (w zależności od typu komórek) w sposób opisany powyżej (5.2). Poniżej znajdują się potencjalne formaty testów, analizy i badania po zbiorach agregatów.

6. Analiza potencjału, zastosowania i analiz przeprowadzane z agregatami

  1. Wysiewanie agregatów dla różnych formatów eksperymentalnych. Przenieść pożądaną ilość agregatów z probówki stożkowej 50 mL do probówki 1,5 mL, płytki 24-dołkowej lub płytki 96-dołkowej, używając wysterylizowanego, ściętego końcówki pipety 1000 μL (Rysunek 1F).
  2. Przemywanie i przygotowanie agregatów do analizy. Usunąć medium po opadnięciu agregatów. Wlać DPBS bezpośrednio do środka probówki lub dołka, aby wszystkie agregaty zostały wzburzone. Po opadnięciu agregatów na dno usunąć DPBS i powtarzać czynność tyle razy, ile jest to konieczne.
  3. Wysyłka agregatów do eksperymentów i analiz poza laboratorium. Dodać pożądaną ilość agregatów do probówki 50 mL i przemyć agregaty zgodnie z punktem 6.2. Całkowicie wypełnić probówkę 50 mL medium, zakręcić i zabezpieczyć korek parafinią, aby uniknąć wycieku. Bezpiecznie wysłać agregaty do docelowej lokalizacji w ciągu nocy w temperaturze pokojowej.
  4. Fiksacja agregatów do mikroskopii elektronowej (Rysunek 2). Mikroskopię skaningową, transmisyjną lub immuno-elektronową można przeprowadzić, przenosząc 150-300 μL agregatów do probówki 1,5 mL i przemywając agregaty 3 razy DPBS (6.2). Dodać 200 μL fiksaty do mikroskopii elektronowej odpowiedniego dla danej aplikacji (SEM, TEM, immuno-EM itp.) na wymagany czas inkubacji. Usunąć fiksaty, przemyć agregaty 2 razy DPBS i postępować zgodnie z opisem w Hjelm et al. 2010 dla skaningowej i transmisyjnej mikroskopii elektronowej2.
  5. Obrazowanie w mikroskopii immunofluorescencyjnej (Rysunek 3). Przenieść ~100 μL agregatów do probówki 1,5 mL i przemyć agregaty (6.2). Utrwalić i znakować agregaty przeciwciałem w warunkach podobnych jak w przypadku monowarstw, z wyjątkiem tego, że proces odbywa się w probówce 1,5 mL. Aby zamontować preparat, nanieść 1 kroplę medium montażowego na szkiełko przedmiotowe, przenieść znakowane agregaty na medium montażowe za pomocą ściętej końcówki pipety 1000 μL, nałożyć szkiełko nakrywkowe na agregaty, uszczelnić nakrywkę lakierem do paznokci i pozostawić szkiełko do wyschnięcia na noc2.
  6. Pomiar żywotności/proliferacji komórkowej za pomocą testu MTT (Rysunek 4). Przenieść agregaty na płytkę 24-dołkową i zastąpić medium 625 μL medium bez czerwieni fenolowej. Dodać 62,5 μL roztworu 5 mg/mL bromku tetrazolium fenylowego (MTT) do każdego dołka i inkubować przez 4 h w 37 °C. Dodać 625 μL roztworu 100 mg/mL SDS-0,01 M HCl do każdego dołka i inkubować przez noc. Odczytać absorbancję przy 570 nm i obliczyć % żywotności komórek za pomocą równania:

Wzór na obliczenie absorbancji, analiza wyników spektrofotometrii, równanie uwzględniające wartości kontrolne.

  1. Badania toksykologiczne. Przenieść agregaty do płytki 24-dołkowej i przeprowadzić test wykluczania błękitu trypanu w ≥2 dołkach w celu określenia początkowej żywotności/stężenia komórek. Dodać związek testowy w różnych stężeniach do dubletów dołków. W celu oceny żywotności komórek (Rycina 5A), przemyć agregaty i przeprowadzić test wykluczania błękitu trypanu po zakończeniu inkubacji. W celu wyznaczenia TC50 (Rycina 5B), mierzyć żywotność komórkową dubletów dołków dla każdego stężenia w czasie i zastosować metodę Reeda-Muencha w celu wyznaczenia stężenia toksycznego dla 50% komórek2, 15.
  2. Cytometryczna analiza koralików (CBA) lub ELISA. Nadnadkład komórkowy można pobrać po wysianiu komórek w dowolnym przedstawionym formacie eksperymentalnym. Stymulować wysiane agregaty w ten sam sposób, co komórki hodowane w monowarstwie, zebrać nadnadnadkłady (≥120 μL) i przechowywać w temperaturze -80 °C do analizy metodą ELISA lub CBA (Rycina 6).
  3. Analiza RNA. Przenieść ≥500 μL agregatów do probówki 1,5 mL i przemyć agregaty DPBS. Kontynuować ekstrakcję, korzystając z zestawu Qiagen RNAeasy oraz protokołu dla komórek zwierzęcych, z homogenizacją lizatu za pomocą igły 20G. Przed przeniesieniem nadnadkładu należy upewnić się, że koraliki opadły na dno probówki; NIE wolno przenosić pustych koralików do kolumny wirowej (koraliki zapchają membranę kolumny, co spowoduje niską wydajność RNA) (Rycina 7).
  4. Analiza białek. Zbierać agregaty tymi samymi metodami, co w przypadku monowarstw, używając probówki 1,5 mL lub większego formatu eksperymentalnego. Jednak po lizie agregatów należy odczekać, aż koraliki opadną, i przenieść lizat do osobnej probówki przed przeprowadzeniem elektroforezy białek lub innej formy analizy białek (Rycina 8).
  5. Badania infekcji. Wysiać agregaty do wybranego formatu eksperymentalnego. Użyć co najmniej dwóch dołków/próbek do trypsynizacji komórek z koralików w celu przeliczenia liczby komórek i oceny ich żywotności. Zainfekować agregaty wybranym patogenem przy określonej wielokrotności infekcji (MOI), analogicznie do procedury dla komórek hodowanych w monowarstwie (Rycina 9). Kroki płukania należy przeprowadzić zgodnie z instrukcjami w punkcie 6.2.
  6. Cytometria przepływowa: Wysiać agregaty do probówki 50 mL, przemyć agregaty (6.2) i dodać 2mM EDTA na 5-10 min w 37 °C. Dodać 5-10 mL pożywki do komórek i przelać komórki przez sitko komórkowe. Odmierzyć 1x106 komórek do probówki polipropylenowej i przemyć komórki zimnym roztworem blokującym (1%FBS w PBS). Resuspendować komórki z przeciwciałem i inkubować zgodnie z instrukcją producenta. Przemyć komórki poprzez wirowanie, resuspendować w PBS i przenieść komórki do probówki filtrującej do analizy (Rycina 10).

7. Reprezentatywne wyniki

Przykład zróżnicowanego agregatu nabłonkowego człowieka wyhodowanego w systemie bioreaktora STLV przedstawiono na Rysunku 2. Obrazy SEM i TEM zostały uzyskane z ludzkich komórek pochwy hodowanych w STLV przez 39 dni, gdzie można zaobserwować mikrowypustki, inwaginacje, wewnątrzkomórkowe pęcherzyki wydzielnicze oraz mikrokosmki na powierzchni apikalnej. Dalszą demonstrację cech przypominających warunki in vivo komórek nabłonkowych hodowanych w bioreaktorze można zobaczyć na obrazach z konfokalnej mikroskopii immunofluorescencyjnej (Rysunek 3) trójwymiarowych komórek pochwy wykazujących ekspresję mucyny (MUC1) oraz markerów specyficznych dla komórek nabłonkowych (ESA) i różnicowania końcowego (inwolukryna; INV).

Jak pokazano, agregaty 3D wykazują cechy ultrastrukturalne podobne do tkanek, jednak ich bardziej istotne fizjologicznie fenotypy służą również jako doskonała platforma do oceny toksyczności związków. Test MTT, powszechnie stosowany w celu pomiaru żywotności, metabolizmu lub proliferacji komórek, może być wykorzystany do pomiaru toksyczności różnych substancji chemicznych i związków (Rysunek 4). Triton X-100, detergent niszczący błony komórkowe, został użyty jako kontrola dodatnia w celu walidacji testu MTT. Dodatkową metodą pomiaru toksyczności po zastosowaniu badanych związków jest wykluczanie błękitu trypanowego (Rysunek 5). Po zastosowaniu nonoksynolu-9 (N-9) agregaty pochwowe wykazały odpowiedź toksyczną podobną do tej obserwowanej w modelach eksplantów szyjki macicy, ale o innym profilu w porównaniu do monowarstw 2, 16.

Dodatkowe badania wykazujące zdolność komórek nabłonkowych hodowanych w bioreaktorze do funkcjonowania i sygnalizacji w sposób zbliżony do tkanek in vivo przedstawiono na Rysunku 6. Po stymulacji cząsteczkami pochodzącymi z drobnoustrojów, które są rozpoznawane przez receptory Toll-podobne (TLR), agregaty reagują i wydzielają cytokiny prozapalne, w tym IL-61. Ekspresję receptora progesteronu (PR), który reaguje na stymulację hormonalną, można również zaobserwować w komórkach pochwy zarówno na poziomie RNA, jak i białka (odpowiednio Rysunek 7 i Rysunek 8). Agregaty 3-D wykazują nie tylko zdolność do reagowania na cząsteczki patogenów i hormonów, ale są również w stanie funkcjonalnie wspierać infekcję wirusem opryszczki pospolitej typu 2 (HSV-2). Obraz z mikroskopii konfokalnej zainfekowanych HSV-2 trójwymiarowych agregatów pochwy (Rysunek 9) potwierdza obecność infekcji. Równoległe dwuwymiarowe hodowle komórek nabłonka pochwy nie zostały przedstawione ze względu na silną destrukcję komórkową wywołaną przez infekcję HSV-2. Agregaty 3-D pochodzące z RWV zostały również wykorzystane do ilościowego określenia replikacji bakteryjnej i wirusowej, odpowiednio za pomocą krzywych wzrostu wewnątrzkomórkowego oraz testów plackowych8, 9. Na koniec, właściwości fizyczne i funkcjonalne pojedynczych komórek w obrębie agregatów można określić ilościowo za pomocą cytometrii przepływowej. Na przykład zastosowano analizę cytometryczną w celu pomiaru ekspresji powierzchniowej MUC1 na pojedynczych komórkach pochwy (Rysunek 10). Agregaty 3-D pochwy wykazały niższy procent MUC1 (27,7%) w porównaniu do monowarstw (67,2%). Niższy odsetek MUC1 na powierzchni agregatów 3-D w porównaniu do monowarstw może wynikać z faktu, że większość białka MUC1 jest wydzielana z komórek, co obserwuje się w drogach rodnych 17, 18.

Proces hodowli komórkowej 3D, schemat rotującego STLV, pobieranie próbek agregatów, testy nabłonkowe.
Rysunek 1. Schemat hodowli ludzkich komórek nabłonkowych w RWV i potencjalne zastosowania z wykorzystaniem agregatów pochodzących z RWV. A) Komórki nabłonkowe są początkowo hodowane jako monowarstwy w kolbie do hodowli tkanek. Po osiągnięciu konfluencji komórki są usuwane z kolby i łączone z mikronośnikami w bioreaktorze STLV. Pasek skali: 80 μm. B) STLV obraca się na platformie, aby stworzyć stałe środowisko swobodnego spadku o niskim ścinaniu płynów, co pozwala komórkom przytwierdzić się i rosnąć na kuleczkach, tworząc w ten sposób widoczne agregaty komórkowe. C) Po 96 h należy wymienić pożywkę w STLV, aby dostosować ją do metabolizmu komórkowego. Pożywka jest wylewana przez boczny otwór, a w jej miejsce wprowadza się świeżą pożywkę za pomocą dołączonej strzykawki 10 mL (bez tłoka); następnie tłoki strzykawek są wkładane i używane do usunięcia pęcherzyków powietrza. D) Po około 5 dniach (d) zaczynają tworzyć się agregaty. Próbki agregatów są pobierane co 7 dni i obrazowane za pomocą mikroskopii świetlnej w celu monitorowania postępu ich rozwoju (powiększenie 20x ludzkich komórek nabłonka pochwy w 3D). E) Po całkowitym utworzeniu się agregatów i zróżnicowaniu komórkowym, agregaty są zbierane z bioreaktora i przenoszone do stożkowej probówki 50 mL. F) Agregaty mogą być wysiewane do probówek 1,5 mL lub do płytek wielodołkowych w celu przeprowadzenia analiz eksperymentalnych i testów. G) Zarys potencjalnych testów i analiz, które można przeprowadzić na agregatach. Ta reprezentatywna lista analiz nie ma charakteru wyczerpującego katalogu wszystkich potencjalnych zastosowań w dalszych etapach.

Mikrografie SEM ukazujące morfologię nanostruktury przy powiększeniach 100x, 200x i 500x.
Rycina 2. Badanie charakterystyki morfologicznej i strukturalnej 3-D agregatów komórek nabłonkowych za pomocą mikroskopii elektronowej. (A) Obraz z mikroskopii skaningowej (SEM) 3-D agregatu ludzkich komórek nabłonkowych pochwy. Paski skali: 200 μm (100x), 100 μm (200x), 50 μm (500x). Obraz z mikroskopii transmisyjnej (TEM) 3-D agregatu ludzkich komórek nabłonkowych pochwy ze strzałkami wskazującymi na (B) wewnątrzkomórkowe pęcherzyki wydzielnicze i mikrokosmki lub (C) „wyrostki cytoplazmatyczne”. Paski skali: 2 μm (zmodyfikowano na podstawie Hjelm et al. 2010)2.

Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej analizy ekspresji białek MUC1, ESA i INV w komórkach nowotworowych.
Rysunek 3. Konfokalna mikroskopia immunofluorescencyjna wykorzystana do identyfikacji różnicowania połączeń i markerów białkowych w trójwymiarowych agregatach komórek nabłonkowych. Ludzkie trójwymiarowe komórki pochwy pobrane z bioreaktora po 32 dniach, utrwalone i barwione przeciwciałem przeciwko mucynie (A) MUC1, przeciwciałem specyficznym dla komórek nabłonkowych (B) ESA lub przeciwciałem przeciwko inwolukrynie (C) (INV), które rozpoznaje terminalnie zróżnicowane komórki nabłonkowe. Agregaty zostały znakowane pośrednio wtórnym przeciwciałem Alexa 488 (kolor zielony). Pasek skali: 60 μm (zmodyfikowano na podstawie Hjelm et al. 2010)2.

Badanie żywotności komórek; wykres słupkowy; efekt działania Tritonu X-100; wyniki analizy ilościowej; cytotoksyczność.
Rycina 4. Test MTT wykorzystany do pomiaru żywotności komórkowej. Ludzkie agregaty 3-D z nabłonka pochwy wysiano na płytkę 24-dołkową i inkubowano w samym medium (nieleczone) lub z dodatkiem detergentu Triton X-100 w stężeniu 0,01%, 0,1% lub 1,0% przez 1 h w 37 °C. Po zakończeniu inkubacji medium usunięto i przeprowadzono test MTT w celu pomiaru żywotności komórek. ** oznacza p<0,001; jednostronny test t Studenta porównujący komórki traktowane Tritonem X-100 z nieleczoną grupą kontrolną.

Wykres żywotności komórek N-9 i wykres słupkowy TCLD<sub>50</sub>; modele pochwy 3-D vs. warstwa pojedyncza.
Rycina 5. Wykorzystanie 3-D agregatów komórek nabłonkowych do badania toksyczności związków. (A) Krzywa żywotności zależna od dawki Nonoksynolu-9 (N-9) 24 h po potraktowaniu 3-D modelu komórek nabłonkowych pochwy człowieka (linia/słupki czerwone) w porównaniu z tym samym typem komórek hodowanych jako konfluentne warstwy pojedyncze (linia/słupki czarne). (B) Poziomy TC50 dla N-9 w hodowlach komórek nabłonkowych pochwy z (A) w czasie 1,5 h, 4 h, 8 h i 24 h po potraktowaniu. * oznacza p<0,05; jednostronny test t Student'a porównujący warstwy pojedyncze z komórkami 3-D dla każdego czasu ekspozycji. (Zmodyfikowano na podstawie Hjelm et al. 2010)2.

Wykres słupkowy poziomów IL-6; FSL-1, PIC, FLAG, CL097, PBS; wyniki analizy cytokin; skala pg/mL.
Rycina 6. Analiza produkcji cytokin w komórkach nabłonkowych 3D w odpowiedzi na stymulację agonistami receptorów Toll-podobnych (TLR). Trójwymiarowe ludzkie komórki pochwy stymulowano FSL-1 (TLR2/6), PIC (TLR3), FLAG (TLR5) oraz CL097 (TLR7/8) przez 24 h, a poziom wydzielanych cytokin zmierzono za pomocą metody cytometrycznego układu koralików (CBA). Przedstawiono IL-6 jako reprezentatywną cytokinę prozapalną, która została wyprodukowana i zmierzona. * oznacza p<0,05; jednostronny test t Studenta porównujący próbki stymulowane z grupą PBS. (Zmodyfikowano na podstawie Hjelm et al. 2010)2.

Analiza ekspresji białek; wynik elektroforezy białek w żelu; wskazano prążki PR i GAPDH.
Rysunek 7. Monitorowanie ekspresji genów w trójwymiarowych (3-D) komórkach nabłonkowych. Półilościowa analiza RT-PCR ekspresji receptora progesteronu (PR) w monowarstwie (ML) lub 3-D ludzkich komórkach nabłonkowych pochwy. GAPDH przedstawiono jako kontrolę załadunku. Przedstawione produkty amplifikacji są wynikiem ekspresji transkryptu po 30 cyklach PCR. Groty strzał wskazują prążki PR występujące wyłącznie w próbce 3-D.

Western blot pokazujący prążki białkowe dla PR i β-tubuliny w próbkach komórek ML i 3-D.
Rycina 8. Analiza ekspresji białek w komórkach nabłonkowych 3-D. Analiza Western blot lizatów całych komórek nabłonkowych pochwy człowieka w monowarstwie oraz w kulturach 3-D (30μg), z użyciem przeciwciała przeciwko receptorowi progesteronu (PR). β-tubulinę zastosowano jako kontrolę ładunku.

Trójwymiarowe komórki nabłonka pochwy; obraz mikroskopowy z barwieniem VP5 i DAPI do analizy komórkowej.
Rycina 9. Trójwymiarowy model ludzkich komórek nabłonka wspiera produktywną infekcję wirusową. Obraz z konfokalnej mikroskopii immunofluorescencyjnej agregatu trójwymiarowych ludzkich komórek nabłonka pochwy zainfekowanych HSV-2. Komórki zainfekowano przy MOI 1,0 przez dwie godziny, przemyto, utrwalono 24 h po infekcji (4% PFA) i zabarwiono swoistym dla HSV-2 przeciwciałem przeciw kapsydowi VP5 (kolor zielony) oraz barwnikiem jądrowym DAPI (kolor niebieski). Pasek skali: 50 μm.

Analiza cytometryczna単warstw monowarstwowych komórek pochwy i komórek 3D; porównanie danych FITC, PBS, MUC1.
Rysunek 10. Analiza pojedynczych komórek w 3D ludzkim modelu komórek nabłonkowych za pomocą cytometrii przepływowej. (A) Monowarstwy lub (B) 3D agregaty ludzkich komórek nabłonka pochwy rozdzielono przy użyciu EDTA, znakowano przeciwciałem anty-MUC1 sprzężonym z FITC (niebieski), kontrolą izotypową (zielony) lub PBS (czerwony), a następnie ilościowo określono ekspresję FITC za pomocą cytometrii przepływowej. Liczby reprezentują procent komórek wykazujących pozytywne barwienie przeciwciałem przeciwko mucynie, które pozostały po odrzuceniu fluorescencji tła z komórek barwionych kontrolą izotypową. Nieregularne piki są wynikiem licznych wzorów glikozylacji i zmiennego poziomu MUC1 na powierzchni tych komórek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Wykorzystanie przedstawionej tutaj technologii bioreaktora RWV może zapewnić badaczom możliwość przejścia z obecnego systemu hodowli komórkowej na bardziej istotny fizjologicznie organotypowy model hodowli komórkowej. System hodowli komórkowej w bioreaktorze RWV zapewnia mikrośrodowisko o niskim ścinaniu, które umożliwia komórkom tworzenie trójwymiarowych agregatów komórkowych o charakterystyce zbliżonej do in vivo, w tym połączeń ścisłych, produkcji mucyn, wypustek zewnątrzkomórkowych (np. mikrokosmków) oraz po...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie zgłaszają żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować Brooke Hjelm za wiedzę techniczną oraz Andrew Larsen za analizę białek. Praca ta była częściowo finansowana z grantu Alternatives Research Development Foundation (MMHK) oraz NIH NIAID Sexually Transmitted Infections and Topical Microbicides Cooperative Research Center IU19 AI062150-01(MMHK). Z wdzięcznością dziękujemy redakcji Biology of Reproduction za możliwość ponownego wykorzystania rycin.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Alexa Fluor 488InvitrogenA21131Stosowane w rozcieńczeniu 1:500
FACSDivaBD BiosciencesCytometr przepływowy
Przeciwciało przeciwko β-tubulinieCalbiochem654162Stosowane w rozcieńczeniu 1:5000
Bio-Plex 2000Bio-Rad171-000205Oprogramowanie v5
Bioreaktor i komponentySyntheconRCCS-4
Sito do komórekBD Biosciences352340Wielkość porów 40μm
Probówka stożkowa (50 mL)Corning5-538-60
KryszalkiVWR international48366067
Zestawy do analizy cytokin (bead array)Bio-RadCustom human kit
Kuleczki CytodexSigma-AldrichC3275
DPBSGIBCO, by Life Technologies14190
EDTASigma-AldrichED-500GKwas etylenodiaminotetraoctowy
Przeciwciało specyficzne dla nabłonka (ESA)Chemicon InternationalCBL251Stosowane w rozcieńczeniu 1:50
Płodowa surowica bydlęca (FBS)GIBCO, by Life Technologies10438Inaktywowana ciepłem
HARV (jednorazowy)SyntheconD-405
Kwas solnySigma-Aldrich25814837%
Przeciwciało przeciwko inwolukrynieSigma-AldrichI 9018
Lamelki do mikroskopuVWR international16004-368
Odczynnik MTTMP Biomedicals194592Bromek 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ylo)-2,5-difenylotetrazoliu
Przeciwciało MUC1 (mikroskopia)Santa Cruz Biotechnology, Inc.Sc-7313Stosowane w rozcieńczeniu 1:50
Przeciwciało MUC1 (cytometria przepływowa)BD Biosciences559774Nazywane również CD227, stosować 20μL na test
ParaformaldehydElectron Microscopy Sciences15710Rozcieńczone do 4% w DPBS
Szalka Petriego (mała)BD Biosciences353002
Probówka polistyrenowa z filtremBD Biosciences352235
Probówka polistyrenowa do cytometriiBD Biosciences352058
Przeciwciało PRDakoM3569Stosowane w rozcieńczeniu 1:100
ProLong GoldInvitrogenP36931Medium montażowe z DAPI
RNeasy Mini KitQiagen74903
Dodecylosiarczan soduSigma-Aldrich71725
Rękaw do sterylizacjiVWR international11213-035
Kurki (jednokierunkowe)MedexSupplyMX5061L
Strzykawka (10 mL)BD Biosciences309604Końcówka Luer-lock
Strzykawka (5 mL)BD Biosciences309603Końcówka Luer-lock
Błękit trypanuInvitrogenT10282
Przeciwciało Vp5Santa Cruz Biotechnology, Inc.sc-13525Przeciwciało HSV-2, klon 6F10; stosowane w rozcieńczeniu 1:5000

Bibliografia

  1. Herbst-Kralovetz, M. M., et al. Quantification and comparison of toll-like receptor expression and responsiveness in primary and immortalized human female lower genital tract epithelia. Am. J. Reprod. Immunol. 59 (3), 212-224 (2008).
  2. Hjelm, B. E., Berta, A. N., Nickerson, C. A., Arntzen, C. J., Herbst-Kralovetz, M. M. Development and characterization of a three-dimensional organotypic human vaginal epithelial cell model. Biol. Reprod. 82, 617-627 (2009).
  3. Bibliography of Research Publications [Internet]. , Synthecon. Houston, Texas. Available from: http://www.synthecon.com/bibliography.html (2012).
  4. Khaoustov, V. I., et al. Induction of three-dimensional assembly of human liver cells by simulated microgravity. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 35, 501-509 (1999).
  5. Papadaki, M., et al. Tissue engineering of functional cardiac muscle: molecular, structural, and electrophysiological studies. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 280, 168-178 (2001).
  6. Ishikawa, M., et al. Reconstitution of hepatic tissue architectures from fetal liver cells obtained from a three-dimensional culture with a rotating wall vessel bioreactor. J. Biosci. Bioeng. 111, 711-718 (2011).
  7. Carvalho, H. M., Teel, L. D., Goping, G., O'Brien, A. D. A three-dimensional tissue culture model for the study of attach and efface lesion formation by enteropathogenic and enterohaemorrhagic Escherichia coli. Cell Microbiol. 7, 1771-1781 (2005).
  8. Nickerson, C. A., et al. Three-dimensional tissue assemblies: novel models for the study of Salmonella enterica serovar Typhimurium pathogenesis. Infection and Immunity. 69, 7106-7120 (2001).
  9. Honer zu Bentrup, K., et al. Three-dimensional organotypic models of human colonic epithelium to study the early stages of enteric salmonellosis. Microbes Infect. 8, 1813-1825 (2006).
  10. Carterson, A. J., et al. A549 lung epithelial cells grown as three-dimensional aggregates: alternative tissue culture model for Pseudomonas aeruginosa pathogenesis. Infection and Immunity. 73, 1129-1140 (2005).
  11. Smith, Y. C., Grande, K. K., Rasmussen, S. B., O'Brien, A. D. Novel three-dimensional organoid model for evaluation of the interaction of uropathogenic Escherichia coli with terminally differentiated human urothelial cells. Infection and Immunity. 74, 750-757 (2006).
  12. Sainz, B., TenCate, V., Uprichard, S. L. Three-dimensional Huh7 cell culture system for the study of Hepatitis C virus infection. Virol J. 6, 103(2009).
  13. Duray, P. H., et al. Invasion of human tissue ex vivo by Borrelia burgdorferi. J. Infect Dis. 191, 1747-1754 (2005).
  14. Margolis, L. B., et al. Lymphocyte trafficking and HIV infection of human lymphoid tissue in a rotating wall vessel bioreactor. AIDS Res. Hum. Retroviruses. 13, 1411-1420 (1997).
  15. Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. Am. J. Hyg. 27, 493-497 (1938).
  16. Beer, B. E., et al. In vitro preclinical testing of nonoxynol-9 as potential anti-human immunodeficiency virus microbicide: a retrospective analysis of results from five laboratories. Antimicrob Agents Chemother. 50, 713-723 (2006).
  17. Hickey, D. K., Patel, M. V., Fahey, J. V., Wira, C. R. Innate and adaptive immunity at mucosal surfaces of the female reproductive tract: stratification and integration of immune protection against the transmission of sexually transmitted infections. J. Reprod. Immunol. 88, 185-194 (2011).
  18. Andersch-Bjorkman, Y., Thomsson, K. A., Holmen Larsson, J. M., Ekerhovd, E., Hansson, G. C. Large scale identification of proteins, mucins, and their O-glycosylation in the endocervical mucus during the menstrual cycle. Mol. Cell Proteomics. 6, 708-716 (2007).
  19. Barrila, J., et al. 3D cell culture models: Innovative platforms for studying host-pathogen interactions. Nature Reviews Microbiology. 8, 791-801 (2010).
  20. Vamvakidou, A. P., et al. Heterogeneous breast tumoroids: An in vitro assay for investigating cellular heterogeneity and drug delivery. J. Biomol Screen. 12, 13-20 (2007).
  21. Jin, F., et al. Establishment of three-dimensional tissue-engineered bone constructs under microgravity-simulated conditions. Artif Organs. 34, 118-125 (2010).
  22. Vertrees, R. A., et al. Development of a three-dimensional model of lung cancer using cultured transformed lung cells. Cancer Biol Ther. 8, 356-365 (2009).
  23. Hwang, Y. S., et al. The use of murine embryonic stem cells, alginate encapsulation, and rotary microgravity bioreactor in bone tissue engineering. Biomaterials. 30, 499-507 (2009).
  24. Pei, M., He, F., Kish, V. L., Vunjak-Novakovic, G. Engineering of functional cartilage tissue using stem cells from synovial lining: a preliminary study. Clin. Orthop Relat. Res. 466, 1880-1889 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Tr jwymiarowe modele kom rek nab onkowychkuleczki mikrono nikiniski cinaj cy przep yw p ynumikroskopia konfokalnacytometria przep ywowasekrecja cytokinanaliza ekspresji gen winterakcje gospodarz patogenanaliza toksykologiczna
Hodowla i zastosowania trójwymiarowych modeli komórek nabłonkowych otrzymywanych w bioreaktorze z rotującą ścianką (Rotating Wall Vessel)
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.