Hodowla i zastosowania trójwymiarowych modeli komórek nabłonkowych otrzymywanych w bioreaktorze z rotującą ścianką (Rotating Wall Vessel)

Podsumowanie

Opisano rotujący system hodowli komórkowej, który umożliwia wzrost komórek nabłonkowych w warunkach fizjologicznych, co prowadzi do tworzenia trójwymiarowych agregatów komórkowych. Powstałe agregaty wykazują cechy podobne do tych obserwowanych in vivo, których nie stwierdzono w konwencjonalnych modelach hodowli, i służą jako dokładniejszy organotypowy system modelowy dla wielu badań naukowych.

Streszczenie

Komórki i tkanki w organizmie podlegają warunkom środowiskowym, które wpływają na ich architekturę, komunikację międzykomórkową oraz ogólne funkcje. Aby modele hodowli komórkowych in vitro mogły dokładnie naśladować badaną tkankę, środowisko wzrostu hodowli jest kluczowym aspektem, który należy wziąć pod uwagę. Powszechnie stosowane konwencjonalne systemy hodowli komórkowych namnażają komórki nabłonkowe na płaskich, dwuwymiarowych (2-D) powierzchniach nieprzepuszczalnych. Choć dzięki konwencjonalnym systemom hodowli komórkowych zdobyto wiele informacji, wiele odkryć nie znajduje potwierdzenia w badaniach klinicznych z udziałem ludzi ani w eksplantach tkankowych, co może wynikać z braku fizjologicznie istotnego mikrośrodowiska.

W niniejszej pracy opisujemy system hodowli, który dzięki zastosowaniu innowacyjnej technologii bioreaktora z obrotową ścianką (RWV) pozwala pokonać wiele ograniczeń warunków hodowli komórkowych 2-D. My oraz inni badacze wykazaliśmy, że organotypowe modele pochodzące z RWV mogą odtwarzać strukturę, funkcję oraz autentyczne ludzkie reakcje na bodźce zewnętrzne w sposób podobny do ludzkich tkanek eksplantowanych ^1-6. Bioreaktor RWV to system hodowli zawiesinowej, który umożliwia wzrost komórek nabłonkowych w warunkach niskiego fizjologicznego ścinania płynu. Bioreaktory występują w dwóch różnych formatach: naczyniu obrotowym o wysokim stosunku wymiarów (HARV) lub naczyniu bocznym o wolnych obrotach (STLV), które różnią się źródłem napowietrzania. Komórki nabłonkowe dodaje się do wybranego bioreaktora wraz z porowatymi mikronośnikami pokrytymi kolagenem (Ryc. 1A). Komórki wykorzystują mikronośniki jako rusztowanie do wzrostu podczas ciągłego swobodnego opadania w bioreaktorze (Ryc. 1B). Mikrośrodowisko zapewnione przez bioreaktor pozwala komórkom na tworzenie trójwymiarowych (3-D) agregatów wykazujących charakterystyki podobne do tych in vivo, których często nie obserwuje się w standardowych warunkach hodowli 2-D (Ryc. 1D). Charakterystyki te obejmują połączenia ścisłe, produkcję śluzu, orientację apikalno-bazalną, lokalizację białek in vivo oraz dodatkowe właściwości specyficzne dla danego typu komórek nabłonkowych.

Progresja od monowarstwy komórek nabłonkowych do w pełni zróżnicowanego agregatu 3-D zależy od typu komórek^{1, 7-13}. Okresowe pobieranie próbek z bioreaktora umożliwia monitorowanie tworzenia się agregatów nabłonkowych, markerów różnicowania komórkowego oraz żywotności (Rysunek 1D). Po ustaleniu różnicowania komórkowego i formowania się agregatów, komórki są zbierane z bioreaktora, a testy podobne do tych wykonywanych na komórkach 2-D można zastosować do agregatów 3-D, uwzględniając kilka kwestii (Rysunek 1E-G). W niniejszej pracy opisujemy szczegółowe kroki hodowli 3-D agregatów komórek nabłonkowych w systemie bioreaktora RWV oraz szereg potencjalnych testów i analiz, które można przeprowadzić na agregatach 3-D. Analizy te obejmują, między innymi, analizę strukturalną/morfologiczną (konfokalna, skaningowa i transmisyjna mikroskopia elektronowa), sekrecję cytokin/chemokin i sygnalizację komórkową (analiza cytometryczna CBA oraz Western blot), analizę ekspresji genów (real-time PCR), analizę toksykologiczną/lekową oraz interakcje gospodarz-patogen. Wykorzystanie tych testów stanowi podstawę dla bardziej szczegółowych i obszernych badań, takich jak metabolomika, transkryptomika, proteomika i inne zastosowania oparte na macierzach. Naszym celem jest przedstawienie niekonwencjonalnej metody hodowli ludzkich komórek nabłonkowych w celu wytworzenia organotypowych modeli 3-D, które odwzorowują ludzką tkankę in vivo , w prostym i niezawodnym systemie przeznaczonym dla badaczy o zróżnicowanych zainteresowaniach naukowych.

Protokół

Wszystkie etapy należy przeprowadzić w warunkach BSL-2 w komorze z laminarnym przepływem powietrza.

1. Przygotowanie bioreaktora STLV

1. Złożyć bioreaktor STLV zgodnie z protokołem producenta i przeprowadzić protokół detoksykacji, aby zapewnić sterylność bioreaktora. Przykryć otwarte porty zaślepkami luer i napełnić STLV 95% etanolem na 24 h.
2. Usunąć etanol i napełnić STLV wysterylizowaną wodą destylowaną na 24 h.
3. Powtórzyć krok 1.2, używając wyłącznie wysterylizowanej wody destylowanej.
4. Za pomocą narzędzia dostarczonego przez dostawcę poluzować wszystkie śruby, nakrętki i centralny korek w STLV, a następnie autoklawować w 110 °C przez 20 min w worku do sterylizacji.
5. Po ochłodzeniu STLV dokręcić śruby i powtórzyć kroki 1.1-1.4, aby zapewnić sterylność i pełną detoksykację.
6. Dokręcić śruby w schłodzonym STLV i wkręcić wstępnie wysterylizowane zawory jednokierunkowe w każdy port.
7. Otworzyć zawór, ustawiając pokrętła pionowo.
8. Wyjąć tłoki z 10 mL i 5 mL strzykawek luer-lock i ponownie umieścić tłoki w opakowaniach, aby zachować sterylność. Wkręcić strzykawki w zawory (do tego kroku wymagane są strzykawki z końcówką luer-lock).
9. Dodać do strzykawki 10 mL sól fizjologiczną z buforem fosforanowym Dulbecco (DPBS), aż STLV zostanie wypełniony i roztwór zacznie wypełniać strzykawkę 5 mL.
10. Włożyć sterylne tłoki z powrotem do każdej strzykawki i usunąć pozostałe pęcherzyki powietrza w bioreaktorze, naprzemiennie przesuwając tłoki strzykawek.
11. Pozostawić strzykawki przymocowane do bioreaktora po usunięciu wszystkich pęcherzyków. Zamknąć zawory, przymocować STLV do obrotowej platformy pionowej i obracać przez minimum 24 h w celu monitorowania szczelności.

2. Przygotowanie kulek mikronośników

1. Do ~250 mg mikronośników Cytodex w probówce stożkowej o pojemności 50 mL dodać 15 mL DPBS i wysterylizować w autoklawie w tych samych warunkach co STLV (1.4).
2. Po ochłodzeniu usunąć DPBS, dodać pożywkę stosowaną do hodowli badanych komórek nabłonkowych i zakręcić probówką, aby resuspender kuleczki.
3. Powtórzyć etapy płukania pożywką jeszcze dwa razy. Po ostatnim płukaniu dodać do kuleczek 15 mL pożywki wzrostowej.

3. Wysiewanie komórek nabłonkowych i kulek do bioreaktora STLV

1. Hodować interesujące komórki nabłonkowe w monowarstwach w kolbach do hodowli tkankowej do momentu uzyskania ≥1x10⁷ komórek. Usunąć komórki z kolby (np. poprzez trypsynizację, EDTA), policzyć komórki w celu ustalenia ich stężenia oraz określić żywotność komórek za pomocą barwienia wykluczającego błękitem trypanu¹.
2. Do probówki stożkowej zawierającej przygotowane kuleczki (patrz 2.3) dodać pożądane stężenie komórek (2x10⁵-1x10⁷ komórek nabłonkowych)^{2, 8}, w zależności od wybranego typu komórek nabłonkowych (Rysunek 1A). Upewnić się, że wszystkie komórki zostały przeniesione, przepłukując probówkę stożkową.
3. Usunąć DPBS i strzykawki z STLV.
4. Zdjąć korek z portu centralnego i wprowadzić zawiesinę komórek nabłonkowych/kuleczkami do STLV za pomocą pipety serologicznej 10 mL. Przepłukać probówkę stożkową, aby upewnić się, że wszystkie komórki/kuleczki zostały przeniesione do STLV, a następnie założyć korek portu centralnego.
5. Wyjąć tłoki ze strzykawek 5 i 10 mL i ponownie włożyć je w opakowania w celu zachowania sterylności. Wkręcić strzykawki w porty z otwartymi kranikami. Napełnić STLV pożywką, założyć tłoki i zamknąć kraniki.
6. Umieścić nowo zasianą STLV w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 30 min bez rotacji.
7. Otworzyć kraniki, usunąć pęcherzyki powietrza za pomocą tłoków, a następnie zamknąć kraniki.
8. Umieścić STLV w nawilżonym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO₂, rotując z prędkością 20 rpm (Rysunek 1B). Hodowle muszą być rotowane w sposób ciągły przez 24 h na dobę, z wyjątkiem czasu pobierania próbek, wymiany pożywki lub zbierania agregatów (patrz następna sekcja).

4. Hodowla, pobieranie próbek i dokumentacja fotograficzna kultur

1. Po wstępnym 96-120 h hodowaniu komórek w bioreaktorze, wymień pożywkę, przechylając STLV i pozwalając komórkom/kulkom na osiadnięcie. Usuń strzykawki, otwórz oba kurki i odlej ~75% pożywki przez port boczny (Rysunek 1C). W zależności od metabolizmu komórkowego pożywki, wymieniaj ją codziennie lub co drugi dzień po początkowym wysianiu i 96-120 h okresie hodowli.
2. Przykręć strzykawki o pojemności 5 i 10 mL bez tłoków i postępuj zgodnie z protokołem dokarmiania opisanym powyżej (1.7-1.11), a następnie przykręć zamknięty STLV z powrotem na platformie obrotowej.
3. Monitoruj wzrost i żywotność agregatów co 5-7 dni po wysianiu do STLV, ostrożnie pobierając niewielką ilość agregatów (~200 μL) z portu centralnego do dwóch probówek 1,5 mL. Aby uniknąć ścinania agregatów, przy wszystkich przeniesieniach agregatów używaj końcówki do pipety 1000 μL, która została odcięta ~2 cm od czubka i wysterylizowana.
4. Załóż z powrotem korek centralny, wymień strzykawki na nowe, dodaj świeżą pożywkę do STLV zgodnie z opisem powyżej (1.7-1.11) i umieść STLV z powrotem w inkubatorze z obrotem (patrz 3.8).
5. W celu monitorowania żywotności komórek użyj jednej z dwóch aliquot agregatów w probówkach 1,5 mL z kroku 4.3 i oddziel komórki od kulek w ten sam sposób, w jaki komórki nabłonkowe są usuwane z kolb do hodowli tkankowej (tzn. poprzez trypsynizację). Monitoruj żywotność za pomocą barwienia wykluczającego błękitem trypanu¹.
6. W celu obrazowania agregatów komórkowych dodaj 0,5-1 mL pożywki do drugiej aliquoty agregatów 1,5 mL i przenieś ją do małej szalki Petriego za pomocą odciętej końcówki pipety 1000 μL. Obrazuj agregaty za pomocą odwróconego mikroskopu świetlnego (Rysunek 1D).

5. Transferowanie i zbieranie agregatów

1. W przypadku niektórych modeli komórek nabłonkowych konieczne jest przeniesienie agregatów do jednorazowego HARV w celu zwiększenia napowietrzania hodowli². Około tydzień przed zebraniem agregatów do analizy należy usunąć strzykawki i kurki ze STLV, a następnie odlać ~50% medium z bocznego otworu.
2. Należy wyjąć centralny korek STLV i ostrożnie przelać całą zawartość do probówki stożkowej 50 mL przez otwór centralny (Ryc. 1E). STLV należy przepłukać dwukrotnie 5 mL medium, a płuczkę połączyć z resztą agregatów.
3. Należy kontynuować przenoszenie agregatów zgodnie z opisem w punkcie 5.2, przenosząc agregaty z probówki stożkowej 50 mL do HARV.
4. Agregaty należy ostrożnie zebrać z HARV po ~1 tygodniu lub ze STLV (w zależności od typu komórek) w sposób opisany powyżej (5.2). Potencjalne formaty testów, analizy i procedury po zebraniu agregatów opisano poniżej.

6. Analiza potencjału, zastosowania i testy przeprowadzone z wykorzystaniem agregatów

1. Wysiew aggregates dla różnych formatów eksperymentalnych. Przenieś pożądaną ilość aggregates z probówki stożkowej 50 mL do probówki 1,5 mL, płytki 24-dołkowej lub płytki 96-dołkowej, używając wysterylizowanego, odciętego końcówki pipety 1000 μL (Rycina 1F).
2. Przemywanie i przygotowywanie aggregates do analizy. Usuń medium po osiadnięciu aggregates. Rozprowadź DPBS bezpośrednio do centrum probówki lub dołka, aby wszystkie aggregates zostały wzburzone. Po osiadnięciu aggregates na dno, usuń DPBS i powtórz czynność tyle razy, ile jest to konieczne.
3. Transport aggregates do eksperymentów i analiz poza laboratorium. Przenieś pożądaną ilość aggregates do probówki 50 mL i przemyj aggregates zgodnie z pkt 6.2. Wypełnij probówkę 50 mL całkowicie medium, zakręć i zabezpiecz zakrętkę parafilmem, aby uniknąć wycieku. Prześlij aggregates do wybranej lokalizacji w ciągu jednej nocy w temperaturze otoczenia.
4. Fiksacja aggregates do mikroskopii elektronowej (Rycina 2). Mikroskopię skaningową, transmisyjną lub immuno-elektronową można przeprowadzić poprzez przeniesienie 150-300 μL aggregates do probówki 1,5 mL i przemycie aggregates 3 razy DPBS (6.2). Dodaj 200 μL utrwalacza do mikroskopii elektronowej specyficznego dla danej aplikacji (SEM, TEM, immuno-EM itp.) na pożądany czas inkubacji. Usuń utrwalacz, przemyj aggregates 2 razy DPBS i postępuj zgodnie z opisem Hjelm et al. 2010 dla skaningowej i transmisyjnej mikroskopii elektronowej².
5. Obrazowanie w mikroskopii immunofluorescencyjnej (Rycina 3). Przenieś ~100 μL aggregates do probówki 1,5 mL i przemyj aggregates (6.2). Utrwal i oznakuj aggregates przeciwciałem w warunkach podobnych do tych stosowanych dla monowarstw, z wyjątkiem tego, że proces odbywa się w probówce 1,5 mL. Aby zamontować próbkę, nanieś 1 kroplę medium montażowego na szkiełko przedmiotowe, przenieś oznakowane aggregates na medium montażowe za pomocą odciętej końcówki pipety 1000 μL, nałóż szkiełko nakrywkowe na aggregates, zabezpiecz nakrywkę lakierem do paznokci i pozostaw szkiełko do wyschnięcia na noc².
6. Pomiar żywotności/proliferacji komórkowej przy użyciu testu MTT (Rycina 4). Przenieś aggregates na płytkę 24-dołkową i zastąp medium 625 μL medium bez czerwieni fenolowej. Dodaj 62,5 μL Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) o stężeniu 5 mg/mL do każdego dołka i inkubuj przez 4 h w 37 °C. Dodaj 625 μL SDS-0,01 M HCl o stężeniu 100 mg/mL do każdego dołka i inkubuj przez noc. Odczytaj absorbancję przy 570 nm i oblicz % żywotności komórek, korzystając z równania:

7. Badania toksykologiczne. Przenieść agregaty do płytki 24-dołkowej i przeprowadzić test wykluczania trypan blue w ≥2 dołkach w celu określenia początkowej żywotności/stężenia komórek. Do dołków powtórzonych dodać związek testowy w różnych stężeniach. Dla oceny żywotności komórek (Rycina 5A) wypłukać agregaty i przeprowadzić test wykluczania trypan blue po zakończeniu inkubacji. Dla TC₅₀ (Rycina 5B) oznaczyć żywotność komórek w dołkach powtórzonych dla każdego stężenia w czasie i zastosować metodę Reeda-Muencha w celu wyznaczenia stężenia toksycznego 50%^{2, 15}.
8. Cytometryczny układ koralików (CBA) lub ELISA. Nadnadlewy komórkowe można pobierać po wysianiu komórek w dowolnym z przedstawionych schematów eksperymentalnych. Stymulować wysiane agregaty w taki sam sposób, jak komórki hodowane w monowarstwie, zebrać nadnadlewy (≥120 μL) i przechowywać w -80 °C do analizy metodą ELISA lub CBA (Rycina 6).
9. Analiza RNA. Przenieść ≥500 μL agregatów do probówki 1,5 mL i wypłukać agregaty za pomocą DPBS. Kontynuować ekstrakcję, stosując zestaw i protokół Qiagen RNAeasy dla komórek zwierzęcych, z homogenizacją lizatu przy użyciu igły 20G. Przed przeniesieniem nadnadlewu należy upewnić się, że koraliki opadły na dno probówki; NIE wolno przenosić samych koralików do kolumny wirowej (koraliki zapchają membranę kolumny, co spowoduje niską wydajność RNA) (Rycina 7).
10. Analiza białek. Zebrać agregaty metodami analogicznymi do tych stosowanych dla monowarstw, używając probówki 1,5 mL lub większego formatu eksperymentalnego. Jednak po lizie agregatów należy odczekać, aż koraliki opadną, a następnie przenieść lizat do oddzielnej probówki przed przeprowadzeniem elektroforezy białek w żelu lub innej formy analizy białek (Rycina 8).
11. Badania infekcji. Wysiać agregaty w pożądanym formacie eksperymentalnym. Użyć co najmniej dwóch dołków/próbek do trypsynizacji komórek z koralików w celu policzenia komórek i ilościowego określenia ich żywotności. Zainfekować agregaty wybranym patogenem przy określonej wielokrotności infekcji (MOI), analogicznie do procedury dla komórek hodowanych w monowarstwie (Rycina 9). Kroki płukania należy przeprowadzić zgodnie z sekcją 6.2.
12. Cytometria przepływowa: Wysiać agregaty do probówki 50 mL, wypłukać agregaty (6.2) i dodać 2mM EDTA na 5-10 min w 37 °C. Dodać 5-10 mL pożywki do komórek i przelać zawiesinę przez sito komórkowe. Odpipekować 1x10⁶

<

<

<

Dyskusja

Wykorzystanie przedstawionej tutaj technologii bioreaktora RWV może zapewnić badaczom możliwość przejścia z obecnego systemu hodowli komórkowej na bardziej istotny fizjologicznie organotypowy model hodowli komórkowej. System hodowli komórkowej w bioreaktorze RWV zapewnia mikrośrodowisko o niskim ścinaniu, które umożliwia komórkom tworzenie trójwymiarowych agregatów komórkowych o charakterystyce zbliżonej do in vivo, w tym połączeń ścisłych, produkcji mucyn, wypustek zewnątrzkomórkowych (np. mikrokosmków) oraz po...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Alexa Fluor 488	Invitrogen	A21131	Stosowane w rozcieńczeniu 1:500
FACSDiva	BD Biosciences		Cytometr przepływowy
Przeciwciało przeciwko β-tubulinie	Calbiochem	654162	Stosowane w rozcieńczeniu 1:5000
Bio-Plex 2000	Bio-Rad	171-000205	Oprogramowanie v5
Bioreaktor i komponenty	Synthecon	RCCS-4
Sito do komórek	BD Biosciences	352340	Wielkość porów 40μm
Probówka stożkowa (50 mL)	Corning	5-538-60
Kryszalki	VWR international	48366067
Zestawy do analizy cytokin (bead array)	Bio-Rad	Custom human kit
Kuleczki Cytodex	Sigma-Aldrich	C3275
DPBS	GIBCO, by Life Technologies	14190
EDTA	Sigma-Aldrich	ED-500G	Kwas etylenodiaminotetraoctowy
Przeciwciało specyficzne dla nabłonka (ESA)	Chemicon International	CBL251	Stosowane w rozcieńczeniu 1:50
Płodowa surowica bydlęca (FBS)	GIBCO, by Life Technologies	10438	Inaktywowana ciepłem
HARV (jednorazowy)	Synthecon	D-405
Kwas solny	Sigma-Aldrich	258148	37%
Przeciwciało przeciwko inwolukrynie	Sigma-Aldrich	I 9018
Lamelki do mikroskopu	VWR international	16004-368
Odczynnik MTT	MP Biomedicals	194592	Bromek 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ylo)-2,5-difenylotetrazoliu
Przeciwciało MUC1 (mikroskopia)	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	Sc-7313	Stosowane w rozcieńczeniu 1:50
Przeciwciało MUC1 (cytometria przepływowa)	BD Biosciences	559774	Nazywane również CD227, stosować 20μL na test
Paraformaldehyd	Electron Microscopy Sciences	15710	Rozcieńczone do 4% w DPBS
Szalka Petriego (mała)	BD Biosciences	353002
Probówka polistyrenowa z filtrem	BD Biosciences	352235
Probówka polistyrenowa do cytometrii	BD Biosciences	352058
Przeciwciało PR	Dako	M3569	Stosowane w rozcieńczeniu 1:100
ProLong Gold	Invitrogen	P36931	Medium montażowe z DAPI
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74903
Dodecylosiarczan sodu	Sigma-Aldrich	71725
Rękaw do sterylizacji	VWR international	11213-035
Kurki (jednokierunkowe)	MedexSupply	MX5061L
Strzykawka (10 mL)	BD Biosciences	309604	Końcówka Luer-lock
Strzykawka (5 mL)	BD Biosciences	309603	Końcówka Luer-lock
Błękit trypanu	Invitrogen	T10282
Przeciwciało Vp5	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	sc-13525	Przeciwciało HSV-2, klon 6F10; stosowane w rozcieńczeniu 1:5000