Wykrywanie mikroRNA w guzach prostaty za pomocą ilościowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym (qPCR)

Podsumowanie

Ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym (qPCR) jest szybką i czułą metodą badania poziomów ekspresji różnych cząsteczek mikroRNA (miRNA) w próbkach nowotworowych. Zastosowanie tej metody pozwala na amplifikację, kwantyfikację i analizę ekspresji setek różnych cząsteczek miRNA z tej samej matrycy cDNA.

Streszczenie

MikroRNA (miRNA) to jednoniciowe, niekodujące cząsteczki RNA o długości od 18 do 24 nukleotydów. Są one zaangażowane w niemal każdy proces komórkowy, w tym rozwój¹, apoptozę² oraz regulację cyklu komórkowego³. Szacuje się, że miRNA regulują ekspresję od 30% do 90% ludzkich genów⁴ poprzez wiązanie się z docelowymi cząsteczkami mRNA (matrycowym RNA)⁵. Powszechna dysregulacja miRNA została zgłoszona w różnych chorobach i podtypach nowotworów⁶. Ze względu na ich rozpowszechnienie i unikalną strukturę, małe cząsteczki te prawdopodobnie staną się kolejną generacją biomarkerów, czynników terapeutycznych i/lub celów terapeutycznych.

Metody stosowane do badania ekspresji miRNA obejmują qPCR oparty na barwniku SYBR green I oraz qPCR z wykorzystaniem sond TaqMan. Aby miRNA mogły być skutecznie wykorzystywane w praktyce klinicznej, niezbędne jest, aby ich detekcja w świeżych i/lub archiwalnych próbkach klinicznych była dokładna, powtarzalna i specyficzna. qPCR jest powszechnie stosowany do walidacji ekspresji miRNA w analizach całego genomu, takich jak badania mikromacierzy⁷. Próbki wykorzystane w niniejszym protokole pochodziły od pacjentów, u których przeprowadzono radykalną prostatektomię z powodu klinicznie zlokalizowanego raka prostaty; można jednak zastosować inne tkanki i linie komórkowe. Próbki prostaty zostały zamrożone szokowo w ciekłym azocie po resekcji. Zmienne kliniczne oraz informacje z obserwacji dla każdego pacjenta zostały zebrane do późniejszej analizy⁸.

Ilościowe oznaczenie poziomów miRNA w próbkach guza prostaty. Główne etapy analizy qPCR guzów to: ekstrakcja całkowitego RNA, synteza cDNA oraz detekcja produktów qPCR przy użyciu specyficznych starterów do miRNA. Całkowite RNA, obejmujące mRNA, miRNA oraz inne małe RNA, wyekstrahowano z próbek przy użyciu odczynnika TRIzol. Do syntezy cDNA i przeprowadzenia qPCR wykorzystano system miScript firmy Qiagen (Rysunek 1). Endogenne miRNA nie są poliadenylowane, dlatego podczas procesu odwrotnej transkrypcji polimeraza poli(A) przeprowadza poliadenylację miRNA. miRNA służy jako matryca do syntezy cDNA z wykorzystaniem oligo-dT i odwrotnej transkryptazy. Uniwersalna sekwencja tagu na końcu 5' starterów oligo-dT ułatwia amplifikację cDNA w etapie PCR. Amplifikację produktu PCR wykrywa się na podstawie poziomu fluorescencji emitowanej przez SYBR Green, barwnik, który wbudowuje się w dwuniciowe DNA. Specyficzne startery miRNA, wraz z uniwersalnym starterem wiążącym się z uniwersalną sekwencją tagu, pozwalają na amplifikację specyficznych sekwencji miRNA.

Zestawy starterów miScript Primer Assays są dostępne dla ponad tysiąca miRNA specyficznych dla ludzi oraz setek miRNA specyficznych dla myszy. W niniejszej pracy do ilościowego oznaczenia ekspresji miRNA zastosowano metodę kwantyfikacji względnej. Aby skorygować zmienność między różnymi próbkami, poziom ekspresji docelowego miRNA normalizuje się względem poziomu ekspresji genu referencyjnego. Wybór genu, względem którego normalizowana jest ekspresja celów, ma krytyczne znaczenie w metodzie analizy kwantyfikacji względnej. Przykładami genów referencyjnych typowo stosowanych w tym celu są małe RNA RNU6B, RNU44 i RNU48, ponieważ uznaje się, że wykazują one stabilną ekspresję w większości próbek. W niniejszym protokole jako gen referencyjny wykorzystano RNU6B.

Protokół

1. Pobieranie próbek prostaty

1. Pobierz próbki prostaty podczas prostatektomii. Orientację preparatu ustalono na podstawie punktów orientacyjnych anatomicznych. Prostatę i pęcherzyki nasienne oznakowano w następujący sposób: prawą stronę kolorem zielonym, lewą stronę kolorem niebieskim.
2. Wykonaj losowy przekrój poprzeczny środkowy prostaty prostopadle do powierzchni odbytnicy, zamroź go w ciekłym azocie i przechowuj w temperaturze -80 °C⁹.
3. Zarchiwizowane plasterki preparatów należy skopiować, zorientować (przód, tył, prawa i lewa strona) oraz podzielić na cztery części. Skrawki należy wyciąć przy użyciu kriostatu.
4. Skrawki barwi się metodą H&E, a następnie poddaje ocenie patomorfologicznej w celu określenia i wyznaczenia obszarów nowotworowych oraz prawidłowych na zabarwionych slajdach i odpowiadającym im obrazie. Zaznaczone obszary służą jako wskazówka do wycięcia tkanki nowotworowej, z której w kolejnych krokach zostanie wyizolowane RNA.

2. Izolowanie całkowitego RNA, w tym miRNA, z próbek

1. Umieścić zamrożone próbki prostaty na suchym lodzie i, kierując się zaznaczonymi obszarami na kserokopii, wyciąć niewielki fragment guza prostaty (od 50 do 100 mg).
2. Zhomogenizować tkankę guza prostaty w 1 mL odczynnika TRIzol. Ilości podane w kolejnych krokach opierają się na użyciu 1 mL odczynnika TRIzol.

Uwaga: W niniejszym protokole do ekstrakcji RNA zastosowano odczynnik TRIzol, jednak można również użyć innych zestawów służących do izolacji całkowitego RNA zawierającego małe RNA.

3. Próbki po homogenizacji inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
4. Do próbek dodać 0,2 mL chloroformu i energicznie wstrząsać przez 15 sekund. Próbki inkubować przez 3 minuty w temperaturze pokojowej, a następnie wirować z prędkością 12 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
5. Bezbarwną górną fazę wodną przenieść do nowych probówek i dodać 0,5 mL alkoholu izopropylowego. Próbki inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie wirować z prędkością 12 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
6. Ostrożnie odessać nadsącz, nie naruszając osadu zawierającego RNA. Osad RNA przemyć 1 mL 75% etanolu. Próbkę wymieszać na wortexie i ponownie osadzić poprzez wirowanie przez 5 minut z prędkością 7 500 x g w temperaturze 4 °C.
7. Ostrożnie odessać nadsącz i suszyć osad RNA przez 5-10 minut, dbając o to, aby osad nie wyschł całkowicie. Rozpuścić ponownie w wodzie wolnej od nukleaz w ilości dostosowanej do wielkości osadu. Stężenie RNA zmierzyć za pomocą spektrofotometru NanoDrop 1000 (mierząc absorbancję przy 260 nm i 280 nm).
8. Jakość i integralność próbek RNA sprawdzić za pomocą systemu Agilent Bioanalyzer.

3. Odwrotna transkrypcja RNA

1. Odwrotą transkrypcję RNA przeprowadzono przy użyciu zestawu miScript Reverse Transcription Kit zgodnie z instrukcjami producenta (Qiagen). Zestaw ten zawiera odwrotną transkryptazę oraz polimerazę poly(A). Bufor miScript RT Buffer zawiera Mg²⁺, dNTP, startery oligo-dT oraz startery randomowe.
2. Do syntezy cDNA należy użyć od 10 pg do 1 μg RNA. W przypadku zastosowania więcej niż 1 μg RNA, należy proporcjonalnie zwiększyć objętość reakcji.
3. Należy przygotować mieszaninę główną (master mix) zawierającą 5X miScript RT Buffer (4 μl), miScript Reverse Transcription Mix (1 μl) oraz wodę wolną od RNaz, aby uzyskać końcową objętość reakcji 20 μl. Do mieszaniny głównej należy dodać również matrycowe RNA (do 1 μg).
4. Próbki należy inkubować przez 60 minut w temperaturze 37 °C, a następnie niezwłocznie inkubować przez 5 minut w temperaturze 95 °C. Krok ten można przeprowadzić w termocyklerze, bloku grzejnym lub kąpieli wodnej. Termocyklery są najbardziej odpowiednią i precyzyjną metodą. cDNA należy przechowywać na lodzie w przypadku krótkoterminowego przechowywania oraz w temperaturze -20 °C w przypadku przechowywania długoterminowego.

4. Tworzenie krzywej wzorcowej

1. Przed przystąpieniem do eksperymentu z docelowymi miRNA należy wyznaczyć krzywą standardową, wykorzystując cDNA o znanych stężeniach w odniesieniu do ich punktów przecięcia (CP) (Rysunek 2).
2. Przygotować szereg rozcieńczeń (2-krotne, 10-krotne, 50-krotne, 250-krotne i 1250-krotne) oryginalnego cDNA z próbki, o której wiadomo, że wykazuje ona znaczną ekspresję badanego genu.
3. Przeprowadzić reakcję PCR zgodnie z opisem w sekcji 5 „Real-time PCR w detekcji miRNA”, z modyfikacją polegającą na zastosowaniu seryjnych rozcieńczeń cDNA zamiast stałego rozcieńczenia 40x.
4. Przeprowadzić analizę za pomocą oprogramowania RelQuant (Roche) w celu wygenerowania krzywej standardowej.

Uwaga: dla każdego badanego genu należy wygenerować nową krzywą standardową.

5. PCR w czasie rzeczywistym do detekcji miRNA

1. Reakcję qPCR dla miRNA przeprowadzono przy użyciu zestawu miScript SYBR Green PCR Kit oraz miScript Primer Assay zgodnie z instrukcjami producenta (Qiagen). Należy przygotować master mix zawierający 2x QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix, 10x miScript Universal Primer, 10x miScript Primer Assay oraz wodę wolną od RNaz. Przygotować master mix dla objętości reakcji 20 μl.
2. Primer Assay jest specyficzny dla badanego miRNA. Aby zrekonstytuować 10x miScript Primer Assay, należy krótko odwirować fiolkę, a następnie dodać 550 μl buforu TE, pH 8.0. Fiolkę należy krótko wymieszać na wirówce typu vortex, podzielić primery na mniejsze alikwoty i przechowywać w temperaturze -20 °C. Wymagane są dwa primery: dla genu docelowego oraz dla genu referencyjnego. Jako gen referencyjny wykorzystano RNU6B.
3. cDNA należy rozcieńczyć 40-krotnie, a nadmiarowe alikwoty przechowywać w temperaturze -20 °C.
4. cDNA służy jako matryca dla PCR. Należy odmierzyć 2 μl 40-krotnie rozcieńczonego cDNA i przenieść do kapilar termocyklera (Roche) o objętości 20 μl.
5. Do każdej kapilary należy dodać 18 μl master mixu, a następnie odwirować za pomocą adaptera do kapilar.
6. Kapilary należy umieścić w termocyklerze czasu rzeczywistego opartym na kapilarach, takim jak system LightCycler 3.5 Real-Time PCR z karuzelą na 32 kapilary.
7. Program cykli PCR należy przeprowadzić w następujący sposób:
   W celu aktywacji polimerazy HotStarTaq zawartej w 2x QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix, należy przeprowadzić preinkubację w temperaturze 95 °C przez 15 minut.
   Następnie wykonać 50 cykli obejmujących:
   Denaturację, 15 s, 94 °C;
   Przyłączanie, 30 s, 55 °C;
   Ekstensję, 30 s, 70 °C.
8. Należy wybrać próbkę, która będzie pełniła rolę kalibratora, i ustawić jej znormalizowaną ilość celu na 1. Następnie porównać względną ekspresję miRNA we wszystkich pozostałych próbkach względem kalibratora.

Uwaga: W ramach jednego badania należy używać tej samej próbki kalibracyjnej, aby zachować spójność wyników.

6. Analiza danych

1. Krzywe amplifikacji dla reakcji PCR są przedstawione graficznie i numerycznie za pomocą oprogramowania Molecular Biochemicals LightCycler w wersji 3.5 (Roche). Przeprowadź kwantyfikację reakcji w zakładce „Quantification”, a następnie wyeksportuj dane do pliku tekstowego.
2. Zaimportuj dane do oprogramowania analitycznego RelQuant (Roche), aby wygenerować wyniki kwantyfikacji. Zaimportuj oddzielne pliki dla danych genu docelowego, genu referencyjnego oraz krzywej wzorcowej.
3. Określ pozycję kalibratora zarówno dla genu docelowego, jak i referencyjnego. Określ również pozycje próbek. Dane są wyrażone jako stosunek genu docelowego do referencyjnego dla poszczególnych próbek podzielony przez stosunek genu docelowego do referencyjnego dla kalibratora. Krzywa wzorcowa, wygenerowana wcześniej dla konkretnego miRNA i genu housekeepingowego, służy jako standard referencyjny do ekstrapolacji danych ilościowych dla celów miRNA o nieznanych stężeniach.
4. Trzy powtórzenia próbek są analizowane jako grupa, a następnie obliczane są średnie stężenia i odchylenia standardowe dla tych powtórzeń. Jeśli jedno z powtórzeń jest niespójne z resztą zestawu, zostanie ono wykluczone przez program.

7. Reprezentatywne wyniki

Przykład analizy qPCR próbek prostaty przedstawiono na Rysunku 3. Wyniki przedstawiono w formie numerycznej oraz graficznej. Wykresy obrazujące poziomy ekspresji genu referencyjnego, U6, wykazują początek amplifikacji wykładniczej około 20. cyklu, podczas gdy ekspresja genu docelowego, miR-98, wykazała opóźnioną amplifikację w okolicach 25. cyklu. Dane z tego eksperymentu zostały wyeksportowane jako plik tekstowy i przeanalizowane za pomocą oprogramowania RelQuant. Określono pozycje kapilar zawierających kalibrator i próbki. Rysunek 4 ilustruje sposób ustawienia kalibratora na wartość 1 oraz ekspresję pozostałych próbek w stosunku do kalibratora.

Rysunek 1. Różne etapy odwrotnej transkrypcji miScript i Real-time PCR.

Rysunek 2. Krzywa standardowa została wygenerowana przy użyciu serii rozcieńczeń oryginalnej próbki cDNA w stosunku 2-krotnym, 10-krotnym, 50-krotnym, 250-krotnym i 1250-krotnym.

Rycina 3. Oprogramowanie Roche Molecular Biochemicals LightCycler przedstawia pełne informacje z eksperymentu w formie graficznej i tekstowej. Wykresy amplifikacji ilościowej PCR w czasie rzeczywistym pokazują wzrost fluorescencji w różnych próbkach.

Rycina 4. Dane zostały ilościowo określone przy użyciu oprogramowania analitycznego RelQuant LightCycler. Zazwyczaj analizuje się grupę trzech powtórzeń próbek, a próbki dające wyraźnie niespójne wyniki są wykluczane, po czym oblicza się średnie stężenia i odchylenia standardowe dla powtórzeń trzykrotnych.

Dyskusja

W guzach prostaty w porównaniu z tkanką prawidłową konsekwentnie stwierdza się aberracyjną ekspresję niektórych miRNA¹⁰, a niektóre z tych miRNA zostały wskazane jako potencjalne nowe środki terapeutyczne w walce z rakiem prostaty¹¹. Zatem aberracyjne poziomy ekspresji miRNA mogą służyć jako przydatne biomarkery diagnostyczne i/lub prognostyczne. Przedstawiona tutaj metoda Real-Time qPCR umożliwia dokładną kwantyfikację poziomów miRNA w tkankach guza prostaty. Zastosowany system miScript PCR pozwala...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Odczynnik TRIzol	Invitrogen	15596
Zestaw do odwrotnej transkrypcji miScript	Qiagen	218061
Zestawy starterów miScript	Qiagen	Specyficzne dla eksperymentu
Zestaw PCR miScript SYBR Green	Qiagen	218073
System Real-Time PCR LightCycler 3.5	Roche Group
Kapilary Light Cycler	Roche Group	04929292001
Spektrofotometr NanoDrop 1000	Thermo Fisher Scientific, Inc.	2538
Bioanalizator Agilent 2100	G2943CA