Wzbogacanie białek o niskiej masie cząsteczkowej na cienkich warstwach mezoporowatej krzemionki w celu odkrywania biomarkerów

Podsumowanie

Opracowaliśmy technologię opartą na cienkiej warstwie krzemionki mezoporowatej do selektywnego odzyskiwania białek i peptydów o niskiej masie cząsteczkowej z surowicy ludzkiej. Właściwości fizykochemiczne naszych chipów mezoporowatych zostały precyzyjnie dostrojone, aby zapewnić znaczną kontrolę nad wzbogacaniem peptydów, a w konsekwencji umożliwić profilowanie proteomu surowicy do celów diagnostycznych.

Streszczenie

Identyfikacja krążących biomarkerów wykazuje ogromny potencjał w zastosowaniach nieinwazyjnych w ramach wczesnej diagnostyki i prognostyki, a także w monitorowaniu efektywności terapeutycznej.^1-3 Krążący proteom o niskiej masie cząsteczkowej (LMWP), składający się z małych białek uwalnianych z tkanek i komórek lub fragmentów peptydowych pochodzących z proteolitycznej degradacji większych białek, był wiązany ze stanem patologicznym u pacjentów i prawdopodobnie odzwierciedla stan choroby.^4,5 Pomimo tych potencjalnych zastosowań klinicznych, wykorzystanie spektrometrii mas (MS) do profilowania LMWP z płynów biologicznych okazało się bardzo trudne ze względu na szeroki zakres dynamiczny stężeń białek i peptydów w surowicy.⁶ Bez wstępnego przygotowania próbki niektóre z białek o wysokiej zawartości uniemożliwiają wykrycie gatunków o niskiej zawartości w surowicy/osoczu. Obecne podejścia oparte na proteomice, takie jak dwuwymiarowa elektroforeza żelowa w poliakrylamidzie (2D-PAGE) oraz metody proteomiki typu shotgun, są pracochłonne, charakteryzują się niską przepustowością i oferują ograniczoną przydatność w zastosowaniach klinicznych.^7-9 W związku z tym niezbędna jest bardziej efektywna strategia izolacji LMWP z krwi, która umożliwi wysokoprzepustowe badanie próbek klinicznych.

W niniejszej pracy przedstawiamy szybki, wydajny i niezawodny system wielofrakcyjny oparty na chipach z krzemionki mezoporowatej do specyficznego wyodrębniania i wzbogacania LMWP.^10,11 Cienkie warstwy krzemionki mezoporowatej (MPS) o regulowanych cechach w skali nano zostały wytworzone przy użyciu metody z matrycą z triblokowego kopolimeru. Stosując różne matryce polimerowe i różne stężenia polimeru w roztworze prekursorowym, określono różne rozkłady wielkości porów, struktury porów, ich łączność oraz właściwości powierzchniowe, a następnie zastosowano je do selektywnego odzyskiwania białek o niskiej masie. Selektywne dzielenie wzbogaconych peptydów na różne podklasy zgodnie z ich właściwościami fizykochemicznymi zwiększy wydajność odzyskiwania i wykrywania gatunków o niskiej zawartości. W połączeniu ze spektrometrią mas i analizą statystyczną wykazaliśmy korelację między charakterystyką nanofazową cienkich warstw krzemionki mezoporowatej a specyficznością i skutecznością pozyskiwania proteomu o niskiej masie. Zaprezentowane tutaj wyniki ujawniają potencjał technologii opartej na nanotechnologii jako potężnej alternatywy dla konwencjonalnych metod pozyskiwania LMWP z złożonych płynów biologicznych. Ze względu na możliwość dostosowania właściwości materiału, potencjał do niskokosztowej produkcji, prostotę i szybkość pobierania próbek oraz znacznie mniejsze wymagania dotyczące ilości próbki do analizy, ta nowa nanotechnologia będzie miała istotny wpływ na dziedzinę badań nad biomarkerami proteomicznymi i kliniczną ocenę proteomiczną.

Protokół

1. Wytwarzanie chipa

1. Przygotuj roztwór powlekający do chipa, zaczynając od roztworu prekursora krzemianu hydrolizowanego. Wymieszaj 14 mL tetraetylortokrzemianu (TEOS) z 17 mL etanolu, 6,5 mL wody dejonizowanej i 0,5 mL 6M HCl przy silnym mieszaniu (1200 rpm) przy użyciu mieszadła magnetycznego z podgrzewaniem. Podgrzewaj ten roztwór w temperaturze 80 °C przez 2 godziny, utrzymując stałe mieszanie.
2. Przygotuj roztwory polimerów, dodając wybrany kopolimer triblokowy (pluronic F127, L121 i P123) do 10 mL etanolu w temperaturze pokojowej przy silnym mieszaniu. Dopełnij mieszaninę, dodając 7,5 ml roztworu krzemianu (z kroku 1.1) do roztworu kopolimeru triblokowego, a następnie mieszaj intensywnie przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Otrzymano w ten sposób końcowy roztwór powlekający.
3. Nanieś 1 mL roztworu powlekającego na 4-calowy wafelek krzemowy metodą spin-coatingu przy prędkości 1500 rpm przez 20 sekund. Następnie podgrzewaj w temperaturze 80 °C przez 12 godzin.
4. Podgrzewaj filmy w celu usunięcia organicznego surfaktantu, zwiększając temperaturę w tempie 1 °C na minutę do 425 °C, a następnie wypalaj przez 5 godzin.
5. Poddaj powierzchnię chipa z mezoporowatej krzemionki (MPS) obróbce wstępnej za pomocą popiółkowania plazmą tlenową (Plasma Asher - March Plasma System). (Przepływ O₂: 80 sccm, moc: 300 W, czas: 10 minut).
6. Opcjonalna chemiczna modyfikacja powierzchni: przeprowadź silanizację chipów w 3% roztworze organosilanu w mieszaninie metanol:woda dejonizowana (19:1) przez 72 godziny w temperaturze pokojowej w komorze rękawicowej z N₂. Płucz sekwencyjnie metanolem i wodą dejonizowaną. Utwardź chipy w temperaturze 110 °C przez 15 minut w piekarniku z wymuszonym obiegiem powietrza.

2. Obróbka wstępna próbek

1. Do każdej próbki surowicy dodać TFA oraz ACN w taki sposób, aby stężenia końcowe wynosiły 0,01% TFA i 5% ACN. Wymieszać za pomocą wstrząsacza wortexowego.
2. Próbki inkubować na wstrząsarce stołowej w temperaturze pokojowej przez 30 minut.

3. Frakcjonowanie surowicy

1. Przedwstępnie wypiekać chipy przez noc w piecu w temperaturze 160 °C. Alternatywnie, przechowywać chipy w deskryka-torze do momentu użycia, aby zapobiec nawodnieniu powierzchni przez wodę zawartą w powietrzu otoczenia.
2. Użyć sprężonego powietrza, aby usunąć wszelkie cząstki, które mogą znajdować się na powierzchni chipa.
3. Przyciąć prefabrykowane, zakupione szkiełka nakrywowe z komorami CultureWell tak, aby zawierały pożądaną liczbę studni. Oczyścić szkiełko nakrywowe 100% etanolem, a następnie umieścić je na powierzchni chipa MPS. Docisnąć szkiełko nakrywowe pęsetą, aby zapewnić całkowite uszczelnienie z chipem.
4. Napipetować 10 μL próbki surowicy do każdej studni o średnicy 3 mm. Inkubować przez 30 minut w wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej.
5. Odssać surowicę ze studni i usunąć. Napipetować 10 μL wody dejonizowanej do każdej studni, aby wypłukać większe białka. Powtórzyć 4 razy.
6. Napipetować 5 μL buforu elucyjnego (0,1% TFA + 50% ACN) do każdej studni z próbką. Pipetować w górę i w dół 30 razy, poruszając końcówką pipety wewnątrz studni, aby wymieszać bufor elucyjny. (Nakładać bufor elucyjny tylko na 1-2 próbki jednocześnie, aby zapobiec zbyt szybkiemu odparowaniu buforu elucyjnego).
7. Po wymieszaniu odessać cały bufor elucyjny i umieścić go w probówce do mikrowirówki do czasu przeprowadzenia analizy MALDI-TOF.
8. Aby zasymulować złożoność próbki biologicznej i ocenić efekt wzbogacania przy pozyskiwaniu gatunków o niskiej masie cząsteczkowej za pomocą naszego systemu frakcjonowania na chipie, wybrano i przygotowano standardową mieszaninę białek i peptydów składającą się z dwudziestu sześciu różnych gatunków o szerokim zakresie mas cząsteczkowych (900-66 500 Da), pI (4,0-10,2) oraz stężeń (0,5-8 pmol/μl) (patrz lista białek w Tabeli 1).

4. Analiza peptydów metodą MALDI-TOF

1. Nanieś 0,5 μL próbki na płytkę docelową MALDI i pozostaw do wyschnięcia.
2. Nanieś 0,5 μL matrycy (kwas α-cyjano-4-hydroksycynamonowy (CHCA), 5 g/L) lub nasyconego roztworu kwasu trans-3,5-dimetoksy-4-hydroksycynamonowego (SA) w 50% acetonitrylu zawierającego 0,1% TFA i pozostaw do współkrystalizacji.
3. Nanieś 0,5 μL roztworu kalibracyjnego na każdy punkt kalibracyjny i pozostaw do wyschnięcia.
4. Włóż płytkę docelową do spektrometru mas MALDI-TOF. Urządzenie powinno być ustawione w trybie reflektora dodatniego z intensywnością lasera 4200 i 3000 impulsów na próbkę. Wybrany zakres masy powinien wynosić od 800 do 5000 Da z masą docelową 2000 Da.
5. Przeprowadź taką samą analizę MALDI-TOF w trybie liniowym, zmieniając zakres masy na 900 do 10 000 Da lub 3000 do 70 000 Da oraz masę docelową na 5000 Da.

5. Analiza danych

1. Surowe widma zostały przetworzone za pomocą oprogramowania ConvertPeakList, a następnie dane wyeksportowano do oprogramowania SpecAlign w celu wstępnego przetwarzania. Wszystkie widma wyrównano metodą korelacji PAFFT, a intensywności znormalizowano względem całkowitego prądu jonowego (TIC) w każdym odpowiadającym im widmie. Wszystkie widma wygładzono oraz odszumiono z zastosowaniem czynników odpowiednio 4 i 0,5. Piki wykryto przy linii bazowej 0,5, oknie masowym 21 i stosunku wysokości 1,5; przed analizą usunięto wartości ujemne.
2. Grupowanie hierarchiczne wykonano przy użyciu programu Cluster 3.0 i zwizualizowano w oprogramowaniu MapleTree. Dane MALDI MS (intensywności pików m/z) poddano transformacji logarytmicznej, normalizacji oraz centrowaniu według mediany. Do obliczenia odległości między próbkami wykorzystano korelację Pearsona, a następnie przeprowadzono grupowanie z pełnym wiązaniem (complete linkage clustering).
3. Do porównania między grupami (n = 2 grupy) dla każdego wykrytego piku MS przed analizą nienadzorowanego grupowania hierarchicznego zastosowano niezależny test t Studenta. Wartość P równą 0,02 lub niższą uznano za istotną statystycznie w celu wyboru peptydów i białek różnicowo pozyskiwanych z różnych mezoporowatych chipów proteomicznych (duże pory vs. małe pory).

6. Reprezentatywne wyniki

Jak pokazano na Rysunku 1, w niniejszym badaniu wytworzono serię cienkich warstw mezoporowatej krzemionki o różnych nanoteksturach i szczegółowo zbadano ich zastosowanie w selektywnym wychwytywaniu i wzbogacaniu niskocząsteczkowych (LMW) peptydów i białek z ludzkiej surowicy. Rysunek 2a oraz b przedstawiają widma MS nieprzetworzonej próbki surowicy odpowiednio dla peptydów w zakresie od 900 do 10 000 Da oraz białek w zakresie od 3 000 do 70 000 Da. Widma te obrazują tłumienie sygnału w obszarze LMW spowodowane obecnością dobrze jonizujących się, wysoką koncentracją występujących białek o wysokiej masie cząsteczkowej (HMW), takich jak albumina. Rysunek 2c oraz d przedstawiają widma MS próbki surowicy po frakcjonowaniu za pomocą MPS L121 (rozmiar porów, 6 nm). Większość dużych cząsteczek została usunięta, co doprowadziło do znacznego wzbogacenia składników LMW. W ramach kontroli tę samą próbkę surowicy naniesiono na nieporowatą powierzchnię czystej krzemionki, aby ocenić swoistość warstw MPS w odzyskiwaniu LMWP. Jak widać na Rysunku 2e oraz f, nie odnotowano znaczącego wychwytu peptydów ani białek z nieporowatej krzemionki. Można zatem wywnioskować, że to architektura mezoporowata, a nie powinowactwo powierzchni krzemionki, stanowi główny czynnik wpływający na wzbogacanie LMWP.

Precyzyjnie kontrolowane zmiany wielkości porów można osiągnąć poprzez zastosowanie kopolimerów o różnych długościach bloków hydrofobowych. Wykorzystując zaprojektowaną mieszaninę białek i peptydów, zbadano wpływ wielkości porów na skuteczność odzyskiwania białek i peptydów o niskiej masie cząsteczkowej (LMW), stosując cienkie warstwy MPS przygotowane z czterech surfaktantów Pluronic (F127, P123, L121 oraz L121 z dodatkiem środka pęczniejącego) o różnych stosunkach objętościowych komponentów hydrofilowych i hydrofobowych, aby utworzyć pory o wielkościach odpowiednio 3,7 nm, 5,2 nm, 7,4 nm i 9,0 nm. Ten zakres wielkości porów pozwolił na odzyskanie różnych zestawów peptydów i białek z tej samej próbki surowicy poprzez wykluczanie wielkościowe i kształtowe (Rycina 3). Widma białek o wysokiej masie cząsteczkowej wykazują punkt odcięcia molekularnego (molecular cut-off) dla każdego typu chipa. Oprócz zależnego od wielkości ubytku białek o wysokiej masie cząsteczkowej (HMW), frakcjonowanie roztworu wzorcowego na chipie wykazuje różnicowe i selektywne wzbogacenie gatunków LMW powiązane z wielkością porów. Dwukierunkowe grupowanie hierarchiczne przedstawione na Rycynie 3b pokazuje wzorzec wzbogacenia standardów LMW uzyskany za pomocą różnych MSC. Nawet jeśli wszystkie peptydy znajdują się poniżej punktu odcięcia molekularnego chipów, istnieje dodatnia korelacja między wielkością porów a masą cząsteczkową uwięzionych gatunków. MSC z dużymi porami, do 9 nm, preferencyjnie wychwytują większe peptydy, podczas gdy mniejsze peptydy są skuteczniej odzyskiwane przez chipy z mniejszymi porami. Przekształcenie strukturalne układu mezoporowatego przeprowadzono poprzez regulację stężenia polimeru matrycy. Zwiększenie stężenia polimeru matrycy doprowadziło do zmniejszenia krzywizny międzyfazowej między fazami wody, kopolimeru i krzemianu, co w konsekwencji zapoczątkowało powiązaną progresję od struktury sferycznej do cylindrycznej. Pluronic F127, dzięki swojej wysokiej masie cząsteczkowej, posiada wysoki stopień okresowości strukturalnej. Poprzez zwiększenie stężenia F127 w roztworze początkowym można uzyskać różne okresowe nanostruktury cienkich warstw MPS, od nanostruktur 3D do nanostruktur 2D. Trójwymiarowe nanostruktury sześcienne i plastromiodowe heksagonalne, posiadające bardziej pożądane połączenia nanoporów i bardziej dostępną morfologię nanoporów, wykazują lepszą wydajność w selektywnym wzbogacaniu peptydów LMW niż struktura heksagonalna 2D, mimo że mają podobne rozkłady wielkości porów i ten sam punkt odcięcia molekularnego dla frakcjonowania surowicy (Rycina 4). Zoptymalizowaliśmy również konjugację organokrzemianu na chipach MPS, wprowadzając popielanie plazmą tlenową w celu wstępnego przygotowania powierzchni chipa. Aby jakościowo zbadać efekt elektrostatyczny na selektywne wzbogacenie na chipie, wykorzystano mieszaninę białek i peptydów. Analiza MS roztworu standardów proteomicznych frakcjonowanych na chipach MPS przygotowanych z L121 i konjugowanych z chemicznymi grupami funkcyjnymi przedstawiona jest na Rycynie 5. Peptydy i białka LMW naładowane dodatnio oraz ujemnie są wychwytywane odpowiednio przez chipy kationowe i anionowe. Ilościowe porównanie wielu chipów MPS w odzyskiwaniu peptydów o dodatnim ładunku netto przedstawiono na Rycynie 5a. Chipy o ładunku ujemnym oraz chipy bez żadnych modyfikacji (pierwotnie z niewielkim ładunkiem ujemnym) wykazują znacznie wyższe wzbogacenie tych peptydów niż chipy modyfikowane APTES (-NH₂). I odwrotnie, naładowane dodatnio chipy MPS posiadają wyjątkową zdolność odzyskiwania peptydów o ujemnym ładunku netto, co wykazano na Rycynie 5b. Natomiast α-Endorfina nie wykazuje znaczącej zmiany ze względu na swój punkt izoelektryczny (PI) wynoszący około 6.

Rysunek 1. Zasada frakcjonowania na chipach MPS i wzbogacania LMW. Po naniesieniu próbki na powierzchnię, białka i peptydy LMW zostają uwięzione w porach, podczas gdy większe cząsteczki pozostają na zewnątrz porów i są usuwane podczas etapów płukania. Wzbogacone frakcje są następnie eluowane i analizowane metodą MALDI.

Rysunek 2. Wzbogacanie peptydów przy użyciu chipów z cienkiej warstwy mezoporowatej krzemionki. Profile MALDI MS zarówno w niskim zakresie mas (900 do 10 000 Da), jak i w wysokim zakresie mas (3000 do 70 000 Da) przed (a,b) i po (c,d) przetwarzaniu surowicy na cienkich warstwach mezoporowatej krzemionki (L121, 6 nm). Odzysk cząsteczek jest znacznie mniejszy w przypadku zastosowania pustych nieporowatych powierzchni krzemionkowych (e,f).

Rysunek 3. Próg odcięcia cząsteczek i wzbogacanie zależne od wielkości w chipach MPS. (a) Powiększony widok widm MALDI demonstrujący charakterystyczny próg odcięcia cząsteczek dla każdego chipa MPS, korelujący z wielkością porów. (b) Dwukierunkowe hierarchiczne grupowanie cech mieszaniny peptydów pomiędzy różnymi chipami. Intensywność koloru czerwonego lub żółtego wskazuje na względne stężenie peptydów. Większe pory zwiększały odzysk większych peptydów (od 3600 do 8500 Da), natomiast mniejsze peptydy (od 900 do 3500 Da) były preferencyjnie odzyskiwane z chipów o mniejszych porach.

Rysunek 4. Charakterystyka fizyczna cienkich warstw MPS oraz selektywnego odzyskiwania z różnymi nanostrukturami. Dyfraktogramy XRD (a, b, c), TEM (wstawki a, b, c), Pluronic F127 w różnych stężeniach w roztworze prekursora: 4,0×10^-3 M (a), 6,0×10^-3 M (b) oraz 8,0×10^-2 M (c). (d) Wykres słupkowy intensywności detekcji ilustrujący selektywne odzyskiwanie peptydów na trójwymiarowych kubicznych i trójwymiarowych heksagonalnych chipach proteomicznych F127 (odpowiednio Cub i Hex). Różne modyfikacje strukturalne wykazują selektywne wzbogacenie.

Rycina 5. Odzyskiwanie specyficzne względem ładunku dla chipów o różnych funkcjach powierzchniowych. Wykres słupkowy intensywności MS detekcji selektywnie wychwyconych peptydów na funkcjonalizowanych chipach. W zależności od punktu izoelektrycznego, peptydy są naładowane dodatnio lub ujemnie przy pH 7.0. (a) Peptydy dodatnie ((1) des-Arg1-bradykinina, (2) bradykinina, (3) substancja P-amid, (4) neurotensyna, (5) ACTH(1-17), (6) ACTH(7-38)) są specyficznie wzbogacane na powierzchniach naładowanych ujemnie. (b) Peptydy ujemne ((7) Glu1-fibrinopeptyd B, (8) α-endorfina, (9) ACTH(18-39), (10) insulina, (11) EGF, (12) insulinopodobny GFII) są specyficznie wzbogacane na powierzchniach naładowanych dodatnio. Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina 6. Stabilizacja frakcjonowanej surowicy na chipie. (a) Reprezentatywne profile MALDI peptydów i białek o niskiej masie cząsteczkowej (LMW) elowanych bezpośrednio po frakcjonowaniu surowicy (góra) lub po 3 tygodniach przechowywania na chipie w temperaturze pokojowej (dół). (b) Od góry do dołu: Analiza regresji liniowej średnich intensywności wykrytych pików MS w każdym powtórzeniu w porównaniu do powtórzenia 1 dla świeżo frakcjonowanej surowicy oraz surowicy frakcjonowanej po 3 tygodniach przechowywania na chipach MPS w temperaturze pokojowej. Wskazano równanie, CV oraz współczynnik determinacji (R²). Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Przybywa dowodów na to, że region niskiej masy cząsteczkowej proteomu krążenia jest bogatym źródłem biomarkerów diagnostycznych do wczesnego wykrywania chorób. W niniejszej technologii zaprezentowano serię chipów z mezoporowatej krzemionki o różnych rozmiarach porów, strukturach porów i modyfikacjach, służących do selektywnego wzbogacania peptydów i białek o niskiej masie cząsteczkowej. Aby ocenić stabilność białek, chipy MPS inkubowano z ludzką surowicą, suszono po przemyciu i przechowywano przez 3wk w temperaturze pokojowej. Uzyskane wzorce białek/peptydów były porównywalne z wzorcami z surowicy świeżo frakcjonowanej (Rysunek 6a), co potwierdziły wyniki analizy statystycznej przedstawione na Rysunku 6b . Zmienność sygnałów pików mierzona średnim współczynnikiem CV oszacowano na 12,7% dla surowicy surowej i na 14,2% dla próbek frakcjonowanych. Te niewielkie różnice mogły wynikać z wewnętrznej zmienności instrumentu MALDI i sugerują, że wstępne przygotowanie oraz przechowywanie na chipie nie wywołały żadnych istotnych zmian w profilach białek MS. Ten sam eksperyment przeprowadzono na nieporowatym krzemie. Wysuszona surowica odzyskana po przechowywaniu na powierzchni krzemowej została poddana frakcjonowaniu na chipach MPS przed analizą MALDI. Uzyskany słaby profil MS wykazał zaletę stabilizacji zapewnianą przez powierzchnię mezoporowatą. W analogii do wcześniej postulowanych mechanizmów, hipotezujemy, że gatunki LMW uwięzione w nanoporach zostały chronione przed degradacją dzięki wykluczeniu rozmiarowemu proteaz lub przez steryczne hamowanie ich aktywności proteolitycznej w ograniczonej przestrzeni nanoporów. Metoda oparta na chipach MPS może być potężnym narzędziem w badaniach profilowania peptydów i białek LMW w złożonych płynach biologicznych. Chipy MPS są tanie w produkcji i pozwalają na skalowanie produkcji w celu jednoczesnego przetwarzania dużej liczby próbek, co zapewnia korzystne funkcje dla badań przesiewowych i odkrywania biomarkerów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Tetraetoksysilan	Sigma-Aldrich	131903	98%
Spin coater	Brewer Science, Inc.	Cee 200X
Plasma Asher	Nordson March	AP-600
Elipsometr spektroskopowy	J. A. Woollam Co.	M-2000DI
MALDI-TOF	Applied Biosystems	Voyager-DE-STR
α-cyano-4-hydroksykwas cynamonowy	Sigma-Aldrich	C8982	Matryca dla MALDI-TOF
trans-3,5-dimetoksy-4-hydroksykwas cynamonowy	Sigma-Aldrich	85429	Matryca dla MALDI-TOF
Mieszadło z podgrzewaniem	Thermo Fisher Scientific, Inc.	11-475-30Q
Pokrywkowe szkiełka z komorami CultureWell	Sigma-Aldrich	GBL103350	śr. 3 mm × głębokość 1 mm, 3-10 μL, sterylne
Pluronic F 127	BASF		PEO106-PPO70-PEO106
Pluronic L121	BASF		PEO5-PPO70-PEO5
Pluronic P123	BASF		PEO20-PPO70-PEO20
Tabela 1. Właściwości fizykochemiczne i zaprojektowane stężenia (masa cząsteczkowa i punkt izoelektryczny) wybranych standardów peptydowych i białkowych.