Przesiewowe badanie oddziaływań pozakomórkowych oparte na awidności (AVEXIS) w celu skalowalnej detekcji słabych oddziaływań między pozakomórkowymi receptorami a ligandami

Podsumowanie

AVEXIS to wysokoprzepustowy test interakcji białkowych opracowany w celu systematycznego przesiewania nowych zewnątrzkomórkowych par receptor-ligand zaangażowanych w procesy rozpoznawania komórkowego. Został on zaprojektowany specjalnie do wykrywania przejściowych interakcji białkowych, które są trudne do zidentyfikowania przy użyciu innych metod wysokoprzepustowych.

Streszczenie

Zewnątrzkomórkowe oddziaływania białko-białko pomiędzy białkami wydzielanymi lub zakotwiczonymi w błonie mają kluczowe znaczenie zarówno dla inicjowania komunikacji międzykomórkowej, jak i zapewnienia spójności organizmów wielokomórkowych. Białka, co do których przewiduje się, że tworzą oddziaływania zewnątrzkomórkowe, są kodowane przez około jedną czwartą ludzkich genów¹, jednak mimo ich znaczenia i liczności, większość z tych białek nie ma udokumentowanego partnera wiążącego. Wynika to przede wszystkim z ich trudności biochemicznych: białka osadzone w błonie są trudne do solubilizacji w ich natywnej konformacji i zawierają istotne strukturalnie modyfikacje potranslacyjne. Ponadto powinowactwa oddziaływań między białkami receptorowymi często charakteryzują się niezwykle niską siłą oddziaływania (okresy półtrwania < 1 sekundy), co uniemożliwia ich wykrycie za pomocą wielu powszechnie stosowanych metod wysokoprzepustowych².

W niniejszej pracy opisujemy test AVEXIS (AVidity-based EXtracellular Interaction Screen), który pozwala przezwyciężyć te wyzwania techniczne, umożliwiając wykrywanie bardzo słabych oddziaływań białkowych (t_1/2 ≤ 0,1 sec) przy niskim odsetku wyników fałszywie dodatnich³. Test ten jest zazwyczaj wdrażany w formacie wysokoprzepustowym, co umożliwia systematyczny screening tysięcy oddziaływań w wygodnym formacie płytek mikrotitracyjnych (Rys. 1). Metoda opiera się na produkcji rozpuszczalnych bibliotek białek rekombinowanych zawierających fragmenty ektodomeny receptorów powierzchni komórkowych lub białek wydzielniczych, w obrębie których poszukiwane są oddziaływania; w związku z tym podejście to jest odpowiednie dla receptorów powierzchni komórkowych typu I, typu II, receptorów związanych z GPI oraz białek wydzielniczych, lecz nie dla białek błonowych wieloprzepustowych, takich jak kanały jonowe czy transportery.

Biblioteki białek rekombinowanych są wytwarzane przy użyciu wygodnego systemu ekspresji ssaczej o wysokiej wydajności⁴, aby zapewnić wprowadzenie istotnych modyfikacji potranslacyjnych, takich jak glikozylacja i mostki dwusiarczkowe. Ekspresowane białka rekombinowane są wydzielane do pożywki i produkowane w dwóch formach: biotynilowanej przynęty (bait), która może zostać wychwycona na fazie stałej pokrytej streptawidyną odpowiedniej do przesiewania, oraz pentameryzowanej ofiary (prey) z dołączonym enzymem (β-laktamazą). Białka przynęty i ofiary są prezentowane sobie nawzajem w układzie binarnym w celu wykrycia bezpośrednich oddziaływań między nimi, w sposób podobny do konwencjonalnego testu ELISA (Rys. 1). Pentameryzacja białek w ofierze jest osiągana poprzez sekwencję peptydową z białka macierzy oligomerycznej chrząstki (COMP), co zwiększa lokalne stężenie ektodomen, zapewniając tym samym znaczący wzrost awidności, który umożliwia wykrycie nawet bardzo przejściowych oddziaływań. Poprzez normalizację aktywności zarówno przynęty, jak i ofiary do określonych poziomów przed przesiewaniem, wykazaliśmy, że oddziaływania o monomerowych okresach połowicznego rozpadu wynoszących 0,1 sec mogą być wykrywane przy niskim poziomie wyników fałszywie dodatnich³.

Protokół

1. Przygotowanie biblioteki wektorów ekspresyjnych dla białek przynęty i białek ofiary

1. Sporządź listę receptorów powierzchniowych komórek oraz białek wydzielniczych, których interakcje mają zostać zbadane, i pobierz ich sekwencje z odpowiedniej bazy danych sekwencji białkowych. Odpowiednie są większość białek zawierających N-terminalny sygnał peptydowy wydzielniczy (obejmują one białka typu I, białka zakotwiczone przez GPI oraz białka wydzielnicze). Zazwyczaj wybierana jest cała rodzina białek (np. superrodzina immunoglobulin lub wszystkie receptory ograniczone do konkretnego typu komórek, np. erytrocytów).
2. Określ zakres regionów zewnątrzkomórkowych, identyfikując położenie peptydu sygnałowego i regionu transbłonowego za pomocą oprogramowania do przewidywania cech białek. Zazwyczaj stosujemy SignalP v3.0⁵ oraz TMHMM v2.0⁶.
3. Zaprojektuj zestawy starterów, które amplifikują cały fragment ektodomeny dla każdego receptora. Dysponujemy zestawem wektorów bait i prey odpowiednich do tego celu, które są dostępne w Addgene (http://www.addgene.org/). Zaprojektuj starter sensowny w obrębie startowej metioniny tak, aby zawierał miejsce restrykcyjne dla enzymu NotI oraz optymalną sekwencję Kozaka; za nimi powinna następować sekwencja specyficzna dla genu o dokładnym dopasowaniu o długości 25 par zasad (Rys. 2A).
4. Zaprojektuj starter antysensowny tak, aby uciąć białka receptorowe typu I tuż przed przewidywanym regionem transbłonowym, w celu ekspresji całej ektodomeny jako rozpuszczalnego białka rekombinowanego. W starterze tym uwzględnij miejsce restrykcyjne AscI, które powinno być w ramce odczytu tłumaczącej na C-terminalny znacznik białkowy rat Cd4d3+4⁷ (Rys. 2A).
5. Amplifikuj fragmenty ektodomeny wszystkich genów przy użyciu tych starterów i sklonuj je do wektora bait lub prey. Czasami pomocne jest najpierw sklonowanie ich do wektorów transportowych (shuttle vectors) przed subklonowaniem do odpowiedniego wektora ekspresyjnego dla ssaków; stosujemy pochodną wektora pTT3^3,4. Zarówno wektory bait, jak i prey zawierają C-terminalne znaczniki białkowe w następujący sposób (Rys. 2B).
   1. Baity: znacznik zawierający domeny 3 i 4 białka rat Cd4 (Cd4d3+4), a następnie sekwencję peptydową będącą substratem dla enzymu BirA z E.coli, co umożliwia monobiotynylację na konkretnym reszcie lizyny (Rys. 2B). Znacznik Cd4d3+4 jest rozpoznawany przez przeciwciało monoklonalne OX68 i służy do ilościowego oznaczania ekspresji białek bait za pomocą testu ELISA. Białka bait są zatem monomerami i są monobiotynylowane. Dostępne są dodatkowe wektory białek bait, w których peptyd podatny na biotynylację został zastąpiony znacznikiem 6-his do celów oczyszczania.
   2. Preye: preye również zawierają znacznik rat Cd4d3+4, a następnie sekwencję peptydową z białka macierzy oligomerycznej chrząstki szczura (COMP) oraz C-terminalny enzym β-laktamaza. Peptyd COMP zapewnia tworzenie pentamerów przez preye po ich ekspresji (Rys. 2B).

2. Ekspresja białek ofiary i przynęty

Do produkcji bibliotek białek wykorzystujemy wygodny system wysokiej ekspresji oparty na hodowli zawiesinowej linii komórkowej HEK293E⁴, jednak odpowiedni powinien być każdy ssaczy system ekspresyjny. Dostępną komercyjnie alternatywą jest system Freestyle. Komórki są rutynowo hodowane na platformie wytrząsowej (125 r.p.m.) w temperaturze 37 °C, przy 5% CO₂ i 70% wilgotności względnej. Należy również wyekspresować białka kontrolne pozytywne i negatywne. Fragment szczura Cd4d3+4 zawierający jedynie znacznik jest dostępny zarówno jako przynęta (bait), jak i ofiara (prey), i stanowi odpowiednią kontrolę negatywną. Podobnie dostępne są wektory przynęty i ofiary kodujące kontrolę pozytywną (Addgene); zazwyczaj wykorzystujemy interakcję szczurzą Cd200- Cd200R⁸.

1. Dzień przed transfekcją wysiej komórki HEK293E z gęstością 2.5 x 10⁵ cells mL^-1. Komórki rutynowo hodujemy w objętości 50 mL w pożywce Freestyle293 zgodnie z zaleceniami producenta. Aby zapewnić wydajną biotinylację, uzupełnij pożywkę do hodowli komórkowej stosowaną do produkcji białek przynęty (bait) o D-biotynę do stężenia końcowego 100 μM. Pożywka stosowana do ekspresji białek ofiary (prey) nie wymaga dodatkowej suplementacji D-biotyną.
2. Następnego dnia przeprowadź transfekcję komórek przy użyciu odpowiedniego odczynnika do transfekcji (np. 293fectin). Do transfekcji 50 mL hodowli użyj 25 μg konstruktów plazmidowych przynęty lub ofiary. W celu wytworzenia biotinylowanych przynęt, przeprowadź kotransfekcję plazmidu kodującego konstrukt przynęty z plazmidem kodującym wydzielaną formę ligazy białko-biotynowej białka E.coli (BirA), która jest dostępna w Addgene. Kotransfekcję plazmidów przynęty wykonaj w stosunku 10:1 (2.5 μg) względem plazmidu kodującego wydzielane białko BirA.
3. Zbierz hodowle pięć dni po transfekcji, najpierw pelletując komórki poprzez wirowanie przy 3000 xg przez 20 minut, a następnie filtrując nadsącz przez filtr 0.22 μM.

[Wskazówka: Białka przynęty (bait) i ofiary (prey) należy przechowywać w postaci niepolepszonej w temperaturze 4°C i, zgodnie z ogólnymi wytycznymi, zużyć w ciągu roku. Aby zapobiec kontaminacji bakteryjnej supernatantów, należy dodać środki bakteriostatyczne, takie jak 50 μg/mL siarczanu polymyksyny B lub 10 mM NaN₃.]

3. Normalizacja próbek przynęty i ofiary

Jedną z kluczowych cech testu AVEXIS jest fakt, że ze względu na wydzielanie białek rekombinowanych, mogą być one rozcieńczane lub zagęszczane (normalizowane) do ustalonych progów aktywności przed użyciem w analizie. Stwierdziliśmy, że poziomy ekspresji białek rekombinowanych obejmują szeroki zakres – do 4 rzędów wielkości – w związku z czym etap normalizacji znacząco zmniejsza liczbę wyników fałszywie dodatnich podczas przesiewów.

3.1 Normalizacja przynęty

Uwaga: Niekoniugowana D-biotyna musi zostać usunięta z pożywki (zazwyczaj poprzez dializę), ponieważ będzie ona konkurować z biotynilowanym białkiem-przynętą o miejsca wiązania streptawidyny.

1. Przenieś nadsącz z przynętą do rurek dializacyjnych, opisz je, szczelnie zaciśnij i poddaj intensywnej dializie przeciwko odpowiedniemu buforowi, np. PBS, aby usunąć wolną biotynę.

[Wskazówka: Stwierdziliśmy, że wystarczającą dializę dla 6 x 50 mL nadsączów przynęty zazwyczaj uzyskuje się przeciwko objętości 4,5 L PBS przy 4 wymianach w ciągu 24 godzin. Niewystarczającą dializę można zaobserwować poprzez inhibicję wiązania białek przy niskich rozcieńczeniach podczas etapu normalizacji przynęty (Rys. 3A.)

2. Wykonaj test ELISA, aby określić względne poziomy ekspresji białek przynęty. Przygotuj serię rozcieńczeń biotynilowanych białek przynęty i unieruchom je na płytce mikrotitracyjnej powlekanej streptawidyną. Do detekcji i kwantyfikacji unieruchomionych białek przynęty wykorzystaj znacznik szczurzy Cd4d3+4, stosując przeciwciało monoklonalne (OX68). Skoncentruj lub rozcieńcz białka przynęty do minimalnej ilości niezbędnej do nasycenia wszystkich miejsc wiązania biotyny w dołku płytki powlekanej streptawidyną.
3. Zablokuj dołki płytki powlekanej streptawidyną, używając soli fizjologicznej z buforem fosforanowym/0,1% Tween-20 (PBST)/2% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) przez 15 minut.
4. Na oddzielnej płytce przygotuj serię rozcieńczeń (zazwyczaj wystarczające są cztery rozcieńczenia 1:3) białek przynęty w PBST/2% BSA i przenieś je do dołków płytki powlekanej streptawidyną. Inkubuj przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
5. Przemyj 3x w PBST. Dodaj 100 μL przeciwciała IgG mysiego przeciwko szczurzemu Cd4d3+4 (OX68) w stężeniu 2 μg/mL i inkubuj przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
6. Przemyj 3x w PBST. Dodaj 100 μL fosfatazy alkalicznej przeciwmysiej w rozcieńczeniu 1:5 000 w PBST/2% BSA i inkubuj przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
7. Przemyj 3x w PBST, a następnie wykonaj końcowe przemywanie w PBS, aby usunąć pozostałości detergentu. Dodaj 100 μL Substrate 104 w stężeniu 1 mg/mL w buforze dietanoloaminowym (10% dietanoloaminy (v/v), 0,5mM MgCl₂, 10 mM NaN₃, pH9,8, przechowywanym w ciemności w temperaturze 4 °C).
8. Po jednej godzinie zmierz absorbancję przy 405 nm. Reprezentatywne wyniki normalizacji przynęty przedstawiono na Ryc. 3A.
9. Białka przynęty, których poziom ekspresji jest niewystarczający do nasycenia wszystkich miejsc wiązania biotyny na płytce powlekanej streptawidyną w formie nierozcieńczonej, należy skoncentrować za pomocą koncentratorów Vivaspin (Vivascience, 10kDa MWCO). Przyjmuje się, że około 5 μg typowego białka przynęty (~80 kDa) jest wystarczające do nasycenia płytki 96-dołkowej.
   1. Białka przynęty wykazujące wysoką ekspresję można rozcieńczyć w PBST/2% BSA do stężenia wystarczającego do nasycenia płytki powlekanej streptawidyną. Po rozcieńczeniu lub koncentracji należy ponownie sprawdzić aktywność przynęt, aby upewnić się, że nasycają one wszystkie miejsca wiązania biotyny na płytce powlekanej streptawidyną.

3.2 Normalizacja ofiary

1. Ilościowo określ względne poziomy ekspresji białek prey, wykorzystując aktywność enzymatyczną β-laktamazy.
2. W pierwszej kolejności przygotuj serię rozcieńczeń supernatantu zawierającego białka prey w buforze PBST/2%BSA. Następnie dodaj 20 μL rozcieńczeń do 60 μL roztworu nitrocefiny o stężeniu 242 μM (0,125 mg/mL) (Calbiochem).
3. Natychmiast przenieś płytkę do czytnika płytek mikrotitracyjnych, który dokonuje pomiaru absorbancji przy 485 nm w każdej minucie przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Reprezentatywne wyniki normalizacji białek prey przedstawiono na rysunku 3B.
4. Skoncentruj próbki za pomocą koncentratorów odwirowczych lub rozcieńcz je w PBST/2%BSA, aby osiągnąć próg aktywności wynoszący ~2 nmol min^-1 obrotu nitrocefiny. W praktyce zostaje to osiągnięte, jeśli cała nitrocefina zostanie zhydrolizowana w ciągu ~7 minut.

4. Procedura przesiewowa AVEXIS

1. Przemyć płytkę pokrytą streptawidyną w PBST.
2. Do każdego dołka dodać 100 μL PBST/2%BSA i inkubować przez 30 minut w celu zablokowania niespecyficznych miejsc wiązania białek w każdym dołku.

[Wskazówka: aby usunąć pozostałości buforu płuczącego po etapach płukania, płytkę należy energicznie ostukać o ręczniki papierowe]

3. Usuń roztwór blokujący, energicznie odwracając płytkę nad zlewem, dodaj 100 μL znormalizowanej biotynilowanej przynęty monomerycznej do odpowiednich studzienek i inkubuj przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
4. Usuń próbki przynęty z płytki, odwracając ją i energicznie strzepując zawartość nad zlewem, a następnie przemyj 3 razy w PBST.
5. Dodaj 100 μL znormalizowanego konstruktu ofiary pentamerycznej do każdej studzienki i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, przemyj zgodnie z krokiem 4.4 i wykonaj jedno końcowe przemywanie samym PBS.
6. Dodaj 60 μL roztworu nitrocefiny o stężeniu 242 μM (rozpuść 5 mg nitrocefiny w 500 μL DMSO, wymieszaj dokładnie, a następnie rozcieńcz nitrocefinę w 40 mL PBS i przefiltruj przez filtr 0,22 μM przed dodaniem do płytek) i inkubuj w temperaturze pokojowej. Pozytywne interakcje można zaobserwować gołym okiem, ponieważ żółta nitrocefina ulega hydrolizie do koloru czerwonego. Ilościowo określ wynik, odczytując absorbancję przy 485 nm za pomocą czytnika płytek. Typową płytkę oraz wyniki ilościowe przedstawiono na Rys. 4.

[Wskazówka: Pozytywne interakcje są zazwyczaj obserwowane w ciągu 2 godzin w temperaturze pokojowej, choć płytki powinny być inkubowane w 4°C przez 16 godzin, aby zapewnić wykrycie wszystkich potencjalnych interakcji. Stwierdzono również, że wytrącony nitrocefin oraz niedoskonałości plastiku płytki mikrotitracyjnej, takie jak zarysowania lub odciski palców, mogą sporadycznie prowadzić do artefaktowych wyników fałszywie dodatnich przy 485 nm, mimo braku wyraźnej hydrolizy nitrocefinu. Zaleca się zatem wykonywanie zdjęć płytek w celu wizualnej rejestracji obrotu nitrocefinu w dołkach.]

5. Reprezentatywne wyniki

Przykład reprezentatywnej płytki przesiewowej AVEXIS przedstawiono na Rysunku 4. W dołkach kontroli pozytywnej (zarówno w przypadku kontroli wychwytu ofiary zapśredniczonego przez przeciwciało, jak i pozytywnej kontroli interakcji) w ciągu około dziesięciu minut powinna być obserwowana hydroliza substratu nitrocefiny (zmiana barwy z żółtej na czerwoną). Niektóre interakcje w badaniu przesiewowym są również obserwowane w tym przedziale czasowym, jednak inne mogą pojawić się później (po kilku godzinach). Zazwyczaj, w zależności od przesiewanych bibliotek białek, typowy wskaźnik trafień wynosi około 0,4-0,6% (jedna pozytywna interakcja na każde 150-250 analizowanych interakcji).

Rysunek 1. Identyfikacja oddziaływań receptor-ligand pośredniczących w procesach rozpoznawania komórkowego z wykorzystaniem metody AVEXIS. Schemat przedstawia dwie oddziałujące ze sobą komórki (A i B) wymieniające informacje poprzez interakcje zachodzące między białkami receptorowymi osadzonymi w błonie. AVEXIS to skalowalny test oddziaływań białkowych, zaprojektowany specjalnie do identyfikacji nowych par receptor-ligand charakteryzujących się bardzo słabym powinowactwem. Rekombinowane biblioteki białek rozpuszczalnych, reprezentujące całe ektodomeny repertuaru receptorów powierzchniowych obu komórek, są przygotowywane albo jako pentameryczne „ofiary” (preys) znakowane β-laktamazą (typ komórki A), albo jako monomeryczne „przynęty” (baits) znakowane biotyną (dla typu komórki B). Pentameryzacja „ofiar” zwiększa lokalną koncentrację ektodomen, co prowadzi do ogólnego wzrostu awidności, umożliwiając wykrycie nawet bardzo przejściowych oddziaływań. Biblioteka przynęt jest rozmieszczona na płytkach pokrytych streptawidyną i systematycznie badana pod kątem oddziaływań z białkami „ofiarami”. Po krótkim przemyciu wszelkie uchwycone „ofiary” są wykrywane z wykorzystaniem aktywności β-laktamazy z nimi związanej.

Rycina 2. Projekt konstruktów bait i prey. (A) Białko receptora Cd200 szczura służy jako przykład określania pełnych ektodomen białek receptorowych powierzchni komórkowej oraz projektowania starterów do tworzenia konstruktów ekspresyjnych typu bait i prey. Przedstawiono sekwencję cDNA i przetłumaczonego białka od N-końcowego peptydu sygnałowego do regionu transbłonowego szczurzego Cd200. Starter sensowny zaprojektowano tak, aby zawierał 5' miejsce restrykcyjne NotI i optymalną sekwencję Kozaka, po których następują 25 zasad sekwencji dokładnie dopasowanej do sekwencji cDNA Cd200. Starter antysensowny zawiera miejsce AscI oraz 25 zasad sekwencji dokładnie dopasowanej, znajdujących się bezpośrednio powyżej wybranego aminokwasu przerwania ektodomeny. Aby zachować ramkę odczytu ektodomeny z tagiem szczurzego Cd4d3+4, miejsce AscI powinno tłumaczyć się jako Gly-Ala-Pro. (B) Schematyczne przedstawienie konstruktów ekspresyjnych bait i prey. Każdy z nich zawiera ektodomeny receptora flankowane miejscami NotI i AscI oraz tag Cd4d3+4. Konstrukty bait zawierają C-końcową sekwencję peptydową, która może zostać specyficznie monobiotynilowana poprzez kotransfekcję z plazmidem ekspresującym wydzielany enzym BirA. Konstrukty prey są zakończone sekwencją pentameryzacyjną z białka macierzy oligomerycznej chrząstki (COMP) oraz enzymem β-laktamazą.

Rysunek 3. Normalizacja białek przynęty (bait) i ofiary (prey). (A) Reprezentatywne przykłady normalizacji przynęty. Seria rozcieńczeń czterech różnych dializowanych supernatantów przynęty została wykryta za pomocą metody ELISA z użyciem monoklonalnego przeciwciała anty-Cd4 tag. Cztery przynęty są wyrażane na różnych poziomach 1>2>3>4. Przynęty powinny zostać znormalizowane do poziomu progowego, który nasyca miejsca wiązania biotyny w każdej dołku. Silnie wyrażane przynęty mogą być rozcieńczane w celu oszczędności białka (np. przynętę 1 można rozcieńczyć ~1:100), a słabo wyrażane przynęty skoncentrowane. W niektórych przynętach (np. przynęta 2) czasami obserwuje się obniżone odczyty przy niskich rozcieńczeniach, co wynika z obecności nieprzypisanej D-biotyny wskutek niepełnej dializy. (B) Poziomy ekspresji białek ofiary są ilościowane przy użyciu szybkości hydrolizy substratu β-laktamazy, nitrocefinu. W przedstawionym przykładzie trzy ofiary są wyrażane na różnych poziomach: ofiara 1>2>3. Ofiary powinny zostać znormalizowane do aktywności ~2 nmol min^-1, co odpowiada całkowitej hydrolizie 14,5 nmol nitrocefinu w ~7 minutach (np. ofiara 1). Pozostałe ofiary w tym przykładzie powinny zostać skoncentrowane przed użyciem w badaniach przesiewowych.

Rycina 4. Reprezentatywne wyniki przesiewania AVEXIS. (A) Fotografia reprezentatywnej płytki do przesiewania AVEXIS. Białko prey jest badane przeciwko 41 różnym białkom bait, a dodatnia interakcja zostaje wykryta w studzience E2. Kontrole zastosowane w płytkach do przesiewania obejmują: biotynilowane przeciwciało anty-Cd4 w celu wychwycenia całego białka prey dodanego do studzienki (G6), interakcję kontrolną: szczurze Cd200 (bait)-Cd200R (prey) z białkiem prey Cd200R zastosowanym w rozcieńczeniu progowym (H3), 1:10 (H4) i 1:100 (H5). Kontrolami negatywnymi były: białko bait Cd4d3+4 badane z białkiem prey poddawanym przesiewaniu (H1) oraz białko prey Cd200R (H2). (B) Ilościowe oznaczenie wartości absorbancji tego samego przesiewania wykonanego w trzech powtórzeniach. Punkty danych reprezentują średnią ± SD.

Dyskusja

Kiedy żywe komórki są obserwowane in vivo, ich błony plazmatyczne wykazują wysoce dynamiczne zachowania: wysuwają i chovają wypustki błonowe podczas kontaktu i komunikacji z sąsiadami². Interakcje fizyczne między białkami receptorowymi osadzonymi w błonie, które pośredniczą w wielu z tych kontaktów, ewoluowały w taki sposób, aby były niezwykle słabe, co umożliwia to wysoce ruchliwe zachowanie. Szacuje się, że siły interakcji monomerowych tak słabe jak 50 μM mogą być wystarczające do wywołania spontanicznych oddziaływań przy fizjologicznych gęstościach receptorów⁹, co sprawia, że wykrywanie nowych interakcji jest niezwykle trudne^2,10. Opisana tutaj metoda AVEXIS zapewnia czuły sposób wykrywania przejściowych zewnątrzkomórkowych interakcji białko-białko, który może być wdrażany w sposób skalowalny przy niskim odsetku wyników fałszywie dodatnich. Choć opracowano inne skalowalne metody wykrywania interakcji zewnątrzkomórkowych^11-15, jedną z zalet AVEXIS jest to, że parametry eksperymentalne, takie jak aktywności białek przynęty (bait) i ofiary (prey), zostały ilościowo określone w celu wykrywania nawet najsłabszych interakcji (t_1/2 ≤ 0.1 s) przy jednoczesnym zachowaniu niskiego odsetka wyników fałszywie dodatnich³. Ponadto usprawnione i solidne procedury przygotowania próbek pozwoliły na wdrożenie tego testu na znacznie większą skalę niż w przypadku innych analiz; niedawno opisaliśmy systemowy screening interakcji obejmujący łącznie ponad ~16 500 potencjalnych oddziaływań¹⁶.

Analizę można przeprowadzić dla każdego białka, dla którego możliwe jest uzyskanie ekspresji rozpuszczalnego fragmentu rekombinowanego białka. Obejmuje to zatem białka zawierające N-końcowy peptyd sygnałowy, takie jak białka typu I, białka zakotwiczone przez GPI oraz białka wydzielnicze. Opracowaliśmy niedawno zestaw wektorów, które umożliwiają nam obecnie wykorzystanie białek typu II jako białek przynęty (baits)¹⁷. Metoda ta nie jest zazwyczaj odpowiednia dla wieloprzepustowych białek błonowych, takich jak transportery jonowe lub pompy, ponieważ jest mało prawdopodobne, aby prawidłowo sfałdowały się one poza kontekstem błony plazmatycznej. Zastosowaliśmy tę procedurę w różnych systemach i z powodzeniem wyekspresowaliśmy białka zewnątrzkomórkowe z ryby *zebrafish*^3,16,18, człowieka, myszy oraz P. falciparum w celu przeprowadzenia analiz interakcji.

Jeśli chodzi o zasoby wymagane do przygotowania badania przesiewowego AVEXIS, stwierdziliśmy, że istotnym wąskim gardłem jest wybór, konstrukcja i pełne sekwencjonowanie plazmidów ekspresyjnych. Ten etap metody może zająć do roku w celu stworzenia około 100 konstruktów przynęty (bait) i ofiary (prey); jednak, ze względu na spadające koszty syntezy genów, obecnie preferujemy outsourcing komercyjny tego etapu projektu. System ekspresji ssaczej wraz z dużym inkubatorem do hodowli tkanek z wytrząsaniem (używamy modelu INFORS HT Multitron Cell) umożliwia jednemu badaczowi ekspresję i normalizację do ok. 100 białek przynęty i ofiary miesięcznie. Po wyprodukowaniu i normalizacji białek proces przesiewania w celu wykrycia interakcji przebiega szybko, co pozwala na wygodne przetwarzanie do dwunastu płytek 96-dołkowych dziennie. Jedynym specjalistycznym urządzeniem, które opracowaliśmy w celu usprawnienia produkcji tak dużej liczby białek, jest tłok napędzany sprężonym powietrzem, który służy do równoległego przepuszczania do pięciu nadnadkładów przez filtr 0,22μm.

Główną klasą oddziaływań, które mogą zostać pominięte w porównaniu z oddziaływaniami oczekiwanymi na podstawie literatury (wyniki fałszywie ujemne), są oddziaływania homofilowe, choć niektóre z nich można wykryć³. W przypadkach, gdy nie wykryto oczekiwanych oddziaływań, uważamy, że wynika to z tworzenia oddziaływań homofilowych przez białka typu prey (efekt „maskowania” prey), co zapobiega dalszym oddziaływaniom z unieruchomionymi białkami typu bait. Częstotliwość wykrywania oddziaływań zależy od zawartości przesiewanej biblioteki białek. Dla orientacji czytelnika, przesiewanie >30 000 oddziaływań w obrębie superrodziny immunoglobulin ryby danio-ostroboki zaowocowało 188 wynikami pozytywnymi – co stanowi częstotliwość 0,6%^3,16,18. Bardzo szybkim sposobem weryfikacji wyników pozytywnych jest sprawdzenie, czy oddziaływanie można wykryć w obu orientacjach bait-prey; tzn. czy to samo oddziaływanie można wykryć niezależnie od tego, czy wiążące białka występują jako bait, czy jako prey. Ilekroć obserwowaliśmy takie wzajemne zachowanie, wykazano następnie, że wiązanie jest specyficzne, demonstrując bezpośrednie wiązanie nasycalne oczyszczonych białek za pomocą rezonansu plazmonowego powierzchni. Należy podkreślić, że ze względu na zwiększenie awidności wiązania poprzez sztuczną pentameryzację białek prey, nie uważamy tego testu za odpowiedni do ilościowego porównywania siły oddziaływań. W celu uzyskania biofizycznych parametrów wiązania oddziaływań stosujemy białka monomeryczne i rezonans plazmonowy powierzchni. Wreszcie, po zidentyfikowaniu oddziaływania, wysokoprzepustowy charakter testu sprawia, że stosunkowo łatwo jest go dostosować do przesiewania odczynników, takich jak przeciwciała lub małe cząsteczki, które blokują dane oddziaływanie.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Pożywka Freestyle	Invitrogen	12338018
Nitrocefina	Calbiochem	484400
Płytki mikrotitracyjne powlekane SA	Nalge Nunc international	734-1284
Przeciwciało OX68	AbD Serotec	MCA1022R
Rurki do dializy	Pierce, Thermo Scientific	PN68100
Polymyksyna B	Sigma-Aldrich	P4932
D-biotyna	Sigma-Aldrich	B4639-5G
Substrat-104	Sigma-Aldrich	1040-506
Koncentratory wirówkowe Vivaspin-20	Sartorius AG	VS2002
Filtry 0.22 μm	Nalge Nunc international	190-2520