Badania przesiewowe interakcji zewnątrzkomórkowych oparte na awidności (AVEXIS) do skalowalnego wykrywania interakcji receptor-ligand zewnątrzkomórkowy o niskim powinowactwie

Podsumowanie

AVEXIS to wysokoprzepustowy test interakcji białkowych, opracowany do systematycznego badania przesiewowego nowych par receptor-ligand zewnątrzkomórkowy biorących udział w procesach rozpoznawania komórkowego. Jest specjalnie zaprojektowany do wykrywania przejściowych interakcji białek, które są trudne do zidentyfikowania przy użyciu innych podejść o wysokiej przepustowości.

Streszczenie

Białko zewnątrzkomórkowe:interakcje białkowe między białkami wydzielanymi lub uwięzionymi przez błonę są kluczowe zarówno dla zainicjowania komunikacji międzykomórkowej, jak i zapewnienia spójności w organizmach wielokomórkowych. Białka, które zgodnie z przewidywaniami tworzą interakcje zewnątrzkomórkowe, są kodowane przez około jedną czwartą ludzkich genów^1, ale pomimo ich znaczenia i obfitości, większość z tych białek nie ma udokumentowanego partnera wiążącego. Wynika to przede wszystkim z ich nieuleczalności biochemicznej: białka osadzone w błonie są trudne do rozludnienia w swojej naturalnej konformacji i zawierają strukturalnie ważne modyfikacje potranslacyjne. Ponadto powinowactwa oddziaływań między białkami receptorowymi często charakteryzują się wyjątkowo niską siłą oddziaływania (okres półtrwania < 1 sekundę), co uniemożliwia ich wykrycie za pomocą wielu powszechnie stosowanych metod o wysokiej przepustowości².

Tutaj opisujemy test AVEXIS (AVidity-based EXtracellular Interaction Screen), który pokonuje te techniczne wyzwania, umożliwiając wykrywanie bardzo słabych interakcji białkowych (t_1/2 ≤ 0,1 s) z niskim odsetkiem wyników fałszywie dodatnich3. Test jest zwykle wykonywany w formacie o wysokiej przepustowości, aby umożliwić systematyczne badanie przesiewowe wielu tysięcy interakcji w wygodnym formacie płytki do mikromiareczkowania (rys. 1). Opiera się na produkcji rozpuszczalnych bibliotek białek rekombinowanych, które zawierają fragmenty ektodomeny receptorów powierzchniowych komórek lub wydzielanych białek, w których należy przeprowadzić badania przesiewowe pod kątem interakcji; dlatego to podejście jest odpowiednie dla receptorów powierzchniowych komórek i wydzielanych białek połączonych z GPI, typu II, ale nie dla wieloprzebiegowych białek błonowych, takich jak kanały jonowe lub transportery.

Biblioteki białek rekombinowanych są tworzone przy użyciu wygodnego i wysokiego poziomu systemu ekspresji ssaków⁴, aby zapewnić dodanie ważnych modyfikacji potranslacyjnych, takich jak glikozylacja i wiązania dwusiarczkowe. Eksprymowane białka rekombinowane są wydzielane do pożywki i produkowane w dwóch formach: biotynylowanej przynęty, którą można wychwycić na fazie stałej pokrytej streptawidyną, odpowiedniej do badań przesiewowych, oraz zdobyczy znakowanej pentameryzacją (β-laktamaza). Białka przynęty i ofiary są prezentowane sobie nawzajem w sposób binarny, aby wykryć bezpośrednie interakcje między nimi, podobnie jak w konwencjonalnym teście ELISA (ryc. 1). Pentameryzacja białek w ofierze odbywa się poprzez sekwencję peptydową z białka macierzy oligomerycznej chrząstki (COMP) i zwiększa lokalne stężenie ektodomen, zapewniając w ten sposób znaczny wzrost awidności, aby umożliwić wykrycie nawet bardzo przejściowych interakcji. Normalizując aktywność zarówno przynęty, jak i ofiary do z góry określonych poziomów przed badaniem przesiewowym, wykazaliśmy, że interakcje o okresie półtrwania monomerycznej wynoszącym 0,1 sekundy można wykryć przy niskim odsetku wyników fałszywie dodatnich³.

Protokół

1. Kompilacja biblioteki wektorów ekspresji plazmidów przynęty i ofiar

1. Sporządź listę receptorów na powierzchni komórki i wydzielanych białek będących przedmiotem zainteresowania, które mają być badane pod kątem interakcji, a następnie pobierz ich sekwencje z odpowiedniej bazy danych sekwencji białek. Większość białek zawierających N-końcowy wydzielniczy peptyd sygnałowy jest odpowiednia (należą do nich białka typu I, połączone z GPI i wydzielane). Zazwyczaj wybiera się rodzinę białek (np. nadrodzinę immunoglobulin lub wszystkie receptory ograniczone do określonego typu komórek, takich jak erytrocyty).
2. Określ zasięg regionów zewnątrzkomórkowych, identyfikując lokalizację peptydu sygnałowego i regionu transbłonowego za pomocą oprogramowania do przewidywania cech białek. Zazwyczaj używamy usługi SignalP w wersji 3.0⁵ i TMHMM w wersji 2.0⁶.
3. Zaprojektuj zestawy starterów, które amplifikują cały fragment ektodomeny dla każdego receptora. Mamy zestaw wektorów przynęt i zdobyczy, które są odpowiednie do tego celu, które są dostępne w Addgene (http://www.addgene.org/). Zaprojektuj elementarz zmysłowy wokół początkowej metioniny tak, aby zawierał miejsce enzymu restrykcyjnego NotI i optymalną sekwencję Kozaka; po tym następuje 25 par zasad o dokładnie dopasowanej sekwencji specyficznej dla genu (ryc. 2A).
4. Zaprojektuj starter antysensowny, aby obciąć białka receptora typu I tuż przed przewidywanym regionem transbłonowym, tak aby wyrazić całą ektodomenę jako rozpuszczalne białko rekombinowane. Uwzględnij w tym starterze miejsce restrykcyjne AscI, które powinno następnie przekształcić się w ramce na C-końcowy znacznik białka Cd4d3 + 4 szczura 7 (ryc. 2A).
5. Amplifikuj fragmenty ektodomeny ze wszystkich genów za pomocą tych starterów i sklonuj je do wektora przynęty lub ofiary. Czasami uważamy, że pomocne jest najpierw sklonowanie ich do wektorów wahadłowych przed subklonowaniem do odpowiedniego wektora ekspresji ssaków, używamy pochodnej wektora pTT3^3,4. Zarówno wektory przynęty, jak i ofiary zawierają C-końcowe znaczniki białkowe w następujący sposób (ryc. 2B).
   1. Przynęty: Znacznik zawierający domeny 3 i 4 szczurzego białka Cd4 (Cd4d3 + 4), po którym następuje sekwencja peptydowa, która jest substratem dla enzymu E. coli BirA i dlatego może być monobiotynylowana na określonej reszcie lizyny (ryc. 2B). Znacznik Cd4d3+4 jest rozpoznawany przez przeciwciało monoklonalne OX68 i służy do ilościowego określenia ekspresji białek przynęty metodą ELISA. Białka przynęty są zatem monomeryczne i monobiotynylowane. Dostępne są dodatkowe wektory białkowe przynęty, w których peptyd biotynowy jest zastępowany znacznikiem 6-his w celu oczyszczenia.
   2. Ofiary: Ofiary zawierają również szczurzy znacznik Cd4d3 + 4, po którym następuje sekwencja peptydowa z białka oligomerycznej macierzy chrząstki szczura (COMP) i C-końcowy enzym β-laktamazy. Peptyd COMP zapewnia, że ofiara tworzy pentamery po ekspresji (ryc. 2B).

2. Ekspresja białka ofiary i przynęty

Używamy wygodnego systemu ekspresji wysokiego poziomu, wykorzystującego hodowlę zawiesinową HEK293E linii^{komórkowej 4} do produkcji naszych bibliotek białek, ale każdy system ekspresji ssaków powinien być odpowiedni. Komercyjnie dostępną alternatywą jest system Freestyle. Komórki są rutynowo hodowane na platformie wytrząsającej (125 obr./min) w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ przy wilgotności względnej 70%. Musi być również wyrażane zarówno dodatnie, jak i ujemne białka kontrolne. Szczur Cd4d3+4 tylko fragment znacznika jest dostępny zarówno jako przynęta, jak i zdobycz i jest odpowiednią kontrolą negatywną. Podobnie dostępne są wektory przynęty i ofiary, które kodują kontrolę pozytywną (Addgene); zwykle używamy interakcji szczur Cd200-Cd200R⁸.

1. Wysiewaj HEK293E komórek dzień przed transfekcją o gęstości 2,5 x 10⁵ komórek ^mL-1. Rutynowo hodujemy komórki w objętości 50 ml na pożywce Freestyle293 zgodnie z zaleceniami producenta. Aby zapewnić efektywną biotynylację, należy uzupełnić pożywkę do hodowli komórkowych używaną do produkcji białek przynęty w D-biotynę do końcowego stężenia 100 μM. Pożywka używana do ekspresji białek ofiary nie musi być uzupełniana dodatkową D-biotyną.
2. Następnego dnia należy przetransfekować komórki za pomocą odpowiedniego odczynnika do transfekcji (np. 293fektyny). Użyj 25 μg konstruktów plazmidowych przynęty lub ofiary, aby transfekować 50 ml kultury. Aby wyprodukować biotynylowane przynęty, należy dokonać jednoczesnej transfekcji plazmidu kodującego konstrukt przynęty plazmidem, który koduje wydzielaną formę ligazy białkowej E.coli i biotyny (BirA), która jest dostępna w firmie Addgene. Plazmidy przynęty kotransfekcyjnej w stosunku 10:1 (2,5 μg) plazmidu kodującego wydzielane białko BirA.
3. Zbieraj kultury pięć dni po transfekcji, najpierw granulując komórki przez wirowanie przy 3000 xg przez 20 minut, a następnie filtrując supernatant przez filtr 0,22 μM.

[Wskazówka: Białka przynęty i zdobyczy powinny być przechowywane w postaci nierozcieńczonej w temperaturze 4°C i zgodnie z ogólną wskazówką powinny być zużyte w ciągu roku. Dodać bakteriostatyki, takie jak 50 μg/ml siarczanu polimyksyny B lub 10 mM NaN₃, aby zapobiec skażeniu bakteryjnemu supernatantów.]

3. Normalizacja próbek przynęty i zdobyczy

Jedną z kluczowych cech testu AVEXIS jest to, że ponieważ rekombinowane białka są wydzielane, mogą być rozcieńczone lub skoncentrowane (znormalizowane) do ustalonych parametrów progowych przed użyciem w teście. Odkryliśmy, że poziomy, przy których dochodzi do ekspresji rekombinowanych białek, obejmują szeroki zakres - do 4 rzędów wielkości - a zatem etap normalizacji znacznie zmniejsza liczbę wyników fałszywie dodatnich podczas badań przesiewowych.

3.1 Normalizacja przynęty

Uwaga: Niesprzężona D-biotyna musi zostać usunięta z pożywki (zazwyczaj przez dializę), ponieważ będzie konkurować z biotynylowanym białkiem przynęty o wiązanie z miejscami wiązania streptawidyny.

1. Przenieść supernatanty przynęty do rurki dializowej, oznaczyć, bezpiecznie przyciąć i intensywnie dializować w stosunku do odpowiedniego buforu, takiego jak PBS, w celu usunięcia wolnej biotyny.

[Wskazówka: Odkryliśmy, że wystarczająca ilość dializy jest zwykle osiągana dla 6 x 50 ml supernatantów przynęty na objętość 4,5 l PBS z 4 zmianami w ciągu 24 godzin. Niedostateczną dializę można zaobserwować poprzez zahamowanie wiązania białek przy niskich rozcieńczeniach na etapie normalizacji przynęty (ryc. 3A).

2. Wykonaj test ELISA, aby określić względne poziomy, na których dochodzi do ekspresji białek przynęty. Przygotować serię rozcieńczeń biotynylowanych białek przynęty i wychwycić je na płytce do mikromiareczkowania pokrytej streptawidyną. Użyj znacznika szczura Cd4d3+4, aby wykryć i określić ilościowo przechwycone białka przynęty za pomocą przeciwciała monoklonalnego (OX68). Skoncentrować lub rozcieńczyć białka przynęty do minimalnej ilości wymaganej do nasycenia wszystkich miejsc wiązania biotyny w studzience płytki pokrytej streptawidyną.
3. Zatkać studzienki płytki pokrytej streptawidyną roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanem/0,1% Tween-20 (PBST)/2% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) na 15 minut.
4. Na oddzielnej płytce wykonać serię rozcieńczeń (zwykle wystarczają cztery rozcieńczenia 1:3) białek przynęty w PBST/2% BSA i przenieść do studzienek płytki pokrytej streptawidyną. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
5. Umyć 3x w PBST. Dodać 100 μl 2 μg/ml mysiego przeciwciała przeciw szczurom Cd4d3+4 IgG (OX68) inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
6. Umyć 3x w PBST. Dodać 100 μl przeciwmysiej fosfatazy alkalicznej w rozcieńczeniu 1:5 000 w PBST/2% BSA i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
7. Umyj 3x w PBST i wykonaj końcowe pranie w PBS, aby usunąć wszelkie pozostałości detergentu. Dodać 100 μl 1 mg/ml substratu 104 do buforu dietanoloaminy (10% dietanoloaminy (v/v), 0,5 mM MgCl₂, 10 mM NaN₃, pH 9,8, przechowywać w bezpiecznym miejscu przed światłem w temperaturze 4 °C).
8. Po godzinie zmierzyć absorbancję przy 405 nm. Reprezentatywne wyniki normalizacji przynęty przedstawiono na rysunku 3A.
9. Białka przynęty, których ekspresja jest niewystarczająca do nasycenia wszystkich miejsc wiązania biotyny na płytce pokrytej streptawidyną, gdy są używane w postaci nierozcieńczonej, powinny być zagęszczane przy użyciu koncentratorów Vivaspin (Vivascience, 10kDa MWCO). Jako wskazówkę szacujemy, że ~5 μg typowego białka przynęty (~80 kDa) wystarcza do nasycenia 96-dołkowej płytki.
   1. Białka przynęty ulegające ekspresji na wysokich poziomach można rozcieńczyć w PBST/2% BSA do stężenia wystarczającego do nasycenia płytki pokrytej streptawidyną. Aktywność przynęt powinna być ponownie sprawdzona po rozcieńczeniu lub zagęszczeniu, aby upewnić się, że nasycają one wszystkie miejsca wiązania biotyny na płytce pokrytej streptawidyną.

3.2 Normalizacja zdobyczy

1. Określić ilościowo względne poziomy, przy których białka ofiar ulegają ekspresji, wykorzystując aktywność enzymu β-laktamazy.
2. Najpierw należy wykonać serię rozcieńczeń supernatantu zawierającego białka ofiary w buforze PBST/2% BSA. Następnie dodać 20 μl rozcieńczeń do 60 μl roztworu nitrocefin o stężeniu 242 μM (0,125 mg/ml) (Calbiochem).
3. Natychmiast przenieść płytkę do czytnika płytek do mikromiareczkowania, który co minutę przez 20 minut w temperaturze pokojowej dokonuje pomiaru absorbancji przy długości fali 485 nm. Wyniki normalizacji reprezentatywnych ofiar przedstawiono na rysunku 3B.
4. Zagęścić próbki za pomocą koncentratorów odśrodkowych lub rozcieńczyć je w PBST/2%BSA, aby osiągnąć aktywność progową ~2 nmol ^min-1 obrotu nitrocefiny. W praktyce można to osiągnąć, jeśli cała nitrocefina zostanie zhydrolizowana w ciągu ~7 minut.

4. Procedura przesiewowa AVEXIS

1. Umyj płytkę pokrytą streptawidyną w PBST.
2. Dodaj 100 μl PBST/2%BSA do każdego dołka i inkubuj przez 30 minut, aby zablokować wszelkie fałszywe miejsca wiązania białek w każdym dołku.

[Wskazówka: aby usunąć resztki bufora mycia po etapach mycia, płyta jest energicznie stukana - w ręczniki papierowe]

3. Usunąć roztwór blokujący sprytnym ruchem płytki nad zlewem i dodać 100 μl znormalizowanej biotynylowanej przynęty monomerycznej do odpowiednich studzienek i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
4. Usuń próbki przynęty z talerza, odwracając talerz i sprytnie przesuwając go po zlewie, a następnie umyj 3 razy w PBST.
5. Dodać 100 μl znormalizowanego pentameryzowanego konstruktu zdobyczy do każdej studzienki i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, przemyć jak w kroku 4.4 i wykonać jedno końcowe płukanie tylko przy użyciu PBS.
6. Dodać 60 μl 242 μM roztworu nitrocefin (rozpuścić 5 mg nitrocefiny w 500 μl DMSO, dokładnie wymieszać, a następnie dalej rozcieńczyć nitrocefinę w 40 ml PBS i przepuścić przez filtr 0,22 μM przed dodaniem do płytek) i inkubować w temperaturze pokojowej. Pozytywne interakcje można zaobserwować gołym okiem, ponieważ żółta nitrocefina jest hydrolizowana do czerwonego koloru. Określić ilościowo, odczytując absorbancję przy 485 nm za pomocą czytnika płytek. Typową płytkę i ocenę ilościową przedstawiono na rys. 4.

[Tip: Pozytywne interakcje są zwykle obserwowane w ciągu 2 godzin w temperaturze pokojowej, chociaż płytki powinny być umieszczane w temperaturze 4°C przez 16 godzin, aby upewnić się, że wszystkie potencjalne interakcje są wykrywane. Odkryliśmy również, że wytrącona nitrocefina i niedoskonałości na plastiku płytki mikromiareczkowej, takie jak zadrapania/odciski palców, mogą czasami prowadzić do fałszywych wyników fałszywie dodatnich przy długości fali 485 nm, pomimo braku jawnej hydrolizy nitrocefiny. Dlatego zaleca się zrobienie zdjęć płytek, aby wizualnie zarejestrować obrót nitrocefin w studzienkach.]

5. Reprezentatywne wyniki

Przykład reprezentatywnej płyty przesiewającej AVEXIS jest pokazany na rysunku 4. W ciągu około dziesięciu minut należy zaobserwować hydrolizę (od żółtego do czerwonego) substratu nitrocefiny w studzienkach kontroli pozytywnej (zarówno kontrola chwytania zdobyczy za pośrednictwem przeciwciał, jak i interakcja kontroli pozytywnej). Niektóre interakcje na ekranie są również obserwowane w tej skali czasowej, ale inne mogą pojawić się dłużej (kilka godzin). Zazwyczaj typowy jest współczynnik trafień wynoszący około 0,4-0,6% (pozytywna interakcja na każde 150-250 przesiewanych interakcji), w zależności od bibliotek białek poddawanych badaniom przesiewowym.

Rysunek 1. Identyfikacja oddziaływań receptor-ligand pośredniczących w procesach rozpoznawania komórkowego z wykorzystaniem AVEXIS. Schemat przedstawia dwie oddziałujące na siebie komórki (A i B) wymieniające informacje poprzez interakcje między białkami receptorowymi osadzonymi w błonie. AVEXIS jest skalowalnym testem interakcji białkowych, zaprojektowanym specjalnie do identyfikacji nowych par receptor-ligand, które charakteryzują się bardzo słabą siłą oddziaływania. Rekombinowane biblioteki rozpuszczalnych białek reprezentujące całą ektodomenę repertuaru receptorów powierzchniowych komórek obu komórek są kompilowane jako pentameryczne ofiary znakowane β-laktamazą (typ komórki A) lub monomeryczne przynęty znakowane biotyną (dla typu komórki B). Pentameryzacja ofiar zwiększa lokalne stężenie ektodomen, aby uzyskać ogólny przyrost awidności, dzięki czemu można wykryć nawet bardzo przejściowe interakcje. Biblioteka przynęt jest ułożona na płytkach pokrytych streptawidyną i systematycznie badana pod kątem interakcji z białkami ofiary. Po krótkim myciu wszelkie schwytane ofiary są wykrywane za pomocą aktywności β-laktamazy związanej z ofiarą.

Rysunek 2. Projekt przynęty i zdobyczy. (A) Białko receptora Cd200 szczura jest podane jako przykład tego, w jaki sposób określa się całe ektodomeny białek receptorów na powierzchni komórki, a startery są projektowane do tworzenia konstruktów ekspresji zarówno przynęty, jak i ofiary. cDNA i translowana sekwencja białka są pokazane od N-końcowego peptydu sygnałowego do obejmującego błonę regionu transbłonowego szczura Cd200. Elementarz zmysłów został zaprojektowany tak, aby zawierał miejsce enzymu restrykcyjnego 5' NotI i optymalną sekwencję Kozaka, a następnie 25 zasad o dokładnie dopasowanej sekwencji do sekwencji cDNA Cd200. Starter antysensowny zawiera miejsce AscI i 25 zasad o dokładnej sekwencji dopasowania, zlokalizowanych bezpośrednio przed wybraną pozostałością po obcięciu ektodomeny. Aby utrzymać ektodomenę w ramce ze znacznikiem szczura Cd4d3+4, strona AscI powinna zostać przetłumaczona jako Gly-Ala-Pro. (B) Schematyczne reprezentacje konstrukcji wyrażeń przynęty i ofiary. Każdy z nich zawiera ektodomeny receptorów otoczone miejscami NotI i AscI oraz znacznikiem Cd4d3+4. Przynęty zawierają C-końcową sekwencję peptydową, która może być specyficznie monobiotynylowana przez kotransfekcję z plazmidem wyrażającym wydzielany enzym BirA. Po ofiarach następuje sekwencja pentameryzacji z białka macierzy oligomerycznej chrząstki (COMP) i enzymu β-laktamazy.

Rysunek 3. Normalizacja białek przynęty i ofiary. (A) Reprezentatywne przykłady normalizacji przynęty. Seria rozcieńczeń czterech różnych dializowanych supernatantów przynęty została wykryta za pomocą testu ELISA przy użyciu przeciwciała monoklonalnego ze znacznikiem anty-Cd4. Cztery przynęty są wyrażane na różnych poziomach 1>2>3>4. Przynęty powinny być znormalizowane do poziomu progowego, który nasyca miejsca wiązania biotyny w każdym dołku. Przynęty o wysokiej ekspresji mogą być rozcieńczone w celu zaoszczędzenia białka (np. przynęta 1 może być rozcieńczona ~1:100), a przynęty o niskiej ekspresji mogą być skoncentrowane w celu zaoszczędzenia białka. W przypadku niektórych przynęt (np. przynęty 2) czasami obserwuje się zmniejszone odczyty przy niskich rozcieńczeniach, co można przypisać obecności niesprzężonej D-biotyny z powodu niepełnej dializy. (B) Poziomy, przy których dochodzi do ekspresji białek ofiar, określa się ilościowo przy użyciu szybkości hydrolizy substratu β-laktamazy, nitrocefiny. W pokazanym przykładzie trzy zdobycze są wyrażone na różnych poziomach: zdobycz 1>2>3. Ofiary powinny być znormalizowane do aktywności ~2 nmol ^min-1, co odpowiada całkowitej hydrolizie 14,5 nmol nitrocefiny w ciągu ~7 minut (np. ofiara 1). Pozostałe ofiary w tym przykładzie powinny być skoncentrowane przed użyciem w badaniach przesiewowych.

Rysunek 4. Reprezentatywne wyniki badań przesiewowych AVEXIS. (A) Fotografia reprezentatywnej płyty projekcyjnej AVEXIS. Białko ofiary jest badane na 41 różnych przynętach i wykrywa się pozytywną interakcję w studzience E2. Kontrole stosowane na płytkach przesiewowych obejmują: biotynylowane przeciwciało anty-Cd4 w celu wychwycenia całego białka ofiary dodanego do studzienki (G6), interakcję kontrolną: szczur Cd200 (przynęta)-Cd200R (zdobycz) z ofiarą Cd200R stosowaną przy rozcieńczeniu progowym (H3), 1:10 (H4) i 1:100 (H5). Kontrolą ujemną były: przynęta Cd4d3+4 badana z białkiem ofiary poddawanym badaniom przesiewowym (H1) i ofiarą Cd200R (H2). (B) Kwantyfikacja wartości absorbancji tego samego badania przesiewowego przeprowadzona w trzech egzemplarzach. Punkty danych są średnie ± SD.

Dyskusja

Kiedy żywe komórki są obserwowane in vivo, ich błony plazmatyczne wykazują bardzo dynamiczne zachowania: wydłużanie i cofanie procesów błonowych, gdy stykają się i komunikują ze swoimi sąsiadami². Fizyczne interakcje między białkami receptorowymi osadzonymi w błonie, które pośredniczą w wielu z tych kontaktów, ewoluowały tak, aby były niezwykle słabe, aby umożliwić to wysoce ruchliwe zachowanie. Szacuje się, że siła oddziaływań monomerycznych tak słaba jak 50 μM może być wystarczająca do napędzania spontanicznych interakcji przy fizjologicznych gęstościach receptorów⁹ , co sprawia, że wykrywanie nowych interakcji jest niezwykle trudne^2,10. Opisana tutaj metoda AVEXIS zapewnia czułą metodę wykrywania przejściowych zewnątrzkomórkowych interakcji białko-białko, które mogą być realizowane w sposób skalowalny z niskim odsetkiem wyników fałszywie dodatnich. Podczas gdy inne skalowalne metody zostały opracowane do wykrywania interakcji zewnątrzkomórkowych^11-15, jedną z zalet AVEXIS jest to, że parametry eksperymentalne, takie jak aktywność przynęty i ofiary, zostały określone ilościowo, aby wykryć nawet najsłabsze interakcje (t_1/2 ≤ 0,1 s) przy zachowaniu niskiego odsetka wyników fałszywie dodatnich³. Ponadto usprawnione i solidne procedury przygotowania próbek umożliwiły wdrożenie tego testu na znacznie większą skalę niż inne testy, a ostatnio opisaliśmy systematyczne badanie przesiewowe interakcji obejmujące łącznie ponad ~16 500 potencjalnych interakcji¹⁶.

Test można przeprowadzić na dowolnym białku, dla którego możliwa jest ekspresja rozpuszczalnego rekombinowanego fragmentu białka. Obejmuje to zatem białka, które zawierają N-końcowy peptyd sygnałowy, takie jak białka typu I, połączone z GPI i wydzielane. Niedawno zaprojektowaliśmy zestaw wektorów, które umożliwiają nam ekspresję białek typu II jako przynęty¹⁷. Test nie jest ogólnie odpowiedni dla wieloprzebiegowych białek błonowych, takich jak transportery jonów lub pompy, ponieważ jest mało prawdopodobne, aby były one prawidłowo sfałdowane poza kontekstem błony plazmatycznej. Zastosowaliśmy to do wielu różnych systemów i z powodzeniem przeprowadziliśmy ekspresję białek zewnątrzkomórkowych od danio pręgowanego^3,16,18, człowieka, myszy i P. falciparum do badań przesiewowych interakcji.

Jeśli chodzi o zasoby wymagane do skonfigurowania badania przesiewowego AVEXIS, stwierdziliśmy, że znaczącym wąskim gardłem jest selekcja, budowa i pełne sekwencjonowanie plazmidów ekspresyjnych. Ten aspekt metody może zająć nawet rok, aby stworzyć ~ 100 konstruktów przynęty i zdobyczy; Jednak ze względu na malejące koszty syntezy genów, obecnie opowiadamy się za komercyjnym outsourcingiem tego aspektu projektu. System ekspresji ssaków wraz z dużym inkubatorem do hodowli tkanek wstrząsających (używamy komórki INFORS HT Multitron Cell) umożliwia jednemu badaczowi ekspresję i normalizację do ~100 białek przynęty i ofiary miesięcznie. Po wyprodukowaniu i znormalizowaniu białek badania przesiewowe pod kątem interakcji przebiegają szybko, a dziennie wygodnie przetwarza się do dwunastu 96-dołkowych płytek. Jedynym specjalnie opracowanym przez nas sprzętem ułatwiającym produkcję tak dużej liczby białek jest tłok napędzany sprężonym powietrzem, który służy do równoległego przepuszczania do pięciu supernatantów przez filtr 0,22 μm.

Główną klasą interakcji, które mogą zostać pominięte w porównaniu z interakcjami oczekiwanymi w literaturze (wyniki fałszywie ujemne), są interakcje homofilne, chociaż niektóre z tych interakcji można wykryć³. W przypadkach, w których oczekiwane interakcje nie są wykrywane, uważamy, że jest to spowodowane tworzeniem homofilnych interakcji przez białka ofiary (efekt "maskowania" ofiary), który następnie zapobiega dalszym interakcjom z unieruchomionymi białkami przynęty. Częstotliwość, z jaką wykrywane są interakcje, zależy od zawartości biblioteki białek poddawanej badaniom przesiewowym. Jako przewodnik dla czytelnika, ekran > 30 000 interakcji w nadrodzinie immunoglobulin danio pręgowanego dał 188 pozytywnych wyników - częstość 0,6%^3,16,18. Bardzo szybką kontrolą, którą można przeprowadzić w celu zweryfikowania wszelkich pozytywnych trafień, jest ustalenie, czy interakcję można wykryć w obu orientacjach przynęta-zdobycz; Oznacza to, że można wykryć tę samą interakcję niezależnie od tego, czy białka wiążące są obecne jako przynęta, czy zdobycz. Za każdym razem, gdy obserwowaliśmy to zachowanie posuwisto-zwrotne, wykazano, że wiązanie jest specyficzne, demonstrując bezpośrednie saturalne wiązanie oczyszczonych białek za pomocą powierzchniowego rezonansu plazmonowego. Należy podkreślić, że ponieważ zwiększamy awidność wiązania poprzez sztuczne pentameryzowanie białek ofiary, nie uważamy tego testu za odpowiedni do ilościowego porównywania sił oddziaływań. Do uzyskania biofizycznych parametrów wiązania oddziaływań wykorzystujemy białka monomeryczne oraz powierzchniowy rezonans plazmonowy. Wreszcie, po zidentyfikowaniu interakcji, wysoka przepustowość testu sprawia, że stosunkowo łatwo jest dostosować test do badań przesiewowych pod kątem odczynników, takich jak przeciwciała lub małe cząsteczki, które blokują interakcję.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Freestyle media	Invitrogen	12338018
Nitrocefin	Calbiochem	484400
Płytki do mikromiareczkowania powlekane SA	Nalge Nunc international	734-1284
OX68 przeciwciało	AbD Serotec	MCA1022R
rurki do dializy	Pierce, Thermo Scientific	PN68100
Polimyksyna B	Sigma-Aldrich	P4932
D-biotyna	Sigma-Aldrich	B4639-5G
Substrate-104	Sigma-Aldrich	1040-506
Koncentratory odśrodkowe Vivaspin-20	Sartorius AG	VS2002
0,22 μ m filtry	Nalge Nunc international	190-2520