W niniejszym opracowaniu opisujemy protokoły izolacji makrofagów pęcherzykowych myszy, które są rezydującymi w płucach komórkami odporności wrodzonej, oraz badania ich aktywacji w odpowiedzi na kokulturę z nanocząsteczkami polianhydrydowymi.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Pozyskiwanie makrofagów pęcherzykowych myszy oraz ocena aktywacji komórkowej indukowanej przez nanocząsteczki polianhydrydu
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Biodegradowalne nanocząsteczki stały się wszechstronną platformą do projektowania i wdrażania nowych szczepionek donosowych przeciwko zakaźnym chorobom dróg oddechowych. W szczególności nanocząsteczki polianhydrydowe składające się z alifatycznego kwasu sebacynowego (SA), aromatycznego 1,6-bis(p-karboksyfenoksy)heksanu (CPH) lub amfifilowego 1,8-bis(p-karboksyfenoksy)-3,6-dioksaoctanu (CPTEG) wykazują unikalną kinetykę erozji objętościowej i powierzchniowej1,2 i mogą być wykorzystane do powolnego uwalniania funkcjonalnych biomolekuł (np. antygenów białkowych, immunoglobulin itp.) in vivo3,4,5. Nanocząsteczki te posiadają również wrodzoną aktywność adiuwantową, co czyni je doskonałym wyborem jako platforma do dostarczania szczepionek6,7,8.
W celu wyjaśnienia mechanizmów rządzących aktywacją odporności wrodzonej po donosowej szczepionce śluzówkowej, należy ocenić odpowiedzi molekularne i komórkowe komórek prezentujących antygen (APCs) odpowiedzialnych za inicjację odpowiedzi immunologicznej. Komórki dendrytyczne są głównymi APCs występującymi w drogach oddechowych, podczas gdy w miąższu płuc przeważają makrofagi pęcherzykowe (AMɸ)9,10,11. AMɸ są wysoce efektywne w oczyszczaniu płuc z patogenów drobnoustrojowych i szczątków komórkowych12,13. Dodatkowo typ komórki ten odgrywa istotną rolę w transporcie antygenów drobnoustrojowych do drenujących węzłów chłonnych, co stanowi ważny pierwszy krok w inicjacji adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej9. AMɸ wykazują również podwyższony poziom wrodzonych receptorów rozpoznawania wzorców oraz receptorów scavengerowych, wydzielają mediatory prozapalne i aktywują naiwne limfocyty T12,14. Stosunkowo czystą populację AMɸ (np. powyżej 80%) można łatwo uzyskać poprzez płukanie płuc w celu przeprowadzenia badań laboratoryjnych. Rezydentne AMɸ pobrane od zwierząt immunokompetentnych zapewniają reprezentatywny fenotyp makrofagów, które zetkną się z szczepionką opartą na cząsteczkach in vivo. W niniejszym opracowaniu opisujemy protokoły stosowane do izolacji i hodowli AMɸ z myszy oraz analizy fenotypu aktywacji makrofagów po traktowaniu nanocząsteczkami polianhydrydowymi in vitro.
Protokół
1. Pobieranie makrofagów pęcherzykowych (AMɸ) z myszy za pomocą płukania płuc
- Należy stosować odpowiednie środki ochrony indywidualnej (ŚOI), takie jak fartuch laboratoryjny, jednorazowe rękawiczki oraz odpowiednią ochronę oczu.
- Przed rozpoczęciem zbioru należy przygotować pełne pożywkę AMɸ (cAMɸ). Do 222,25 mL pożywki Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) należy dodać 2,5 mL roztworu penicyliny/streptomycyny (pen/strep), 250 μL β-merkaptoetanolu (2-merkaptoetanolu) oraz 25 mL inaktywowanej ciepłem płodowej surowicy bydlęcej (FBS). Pożywkę cAMɸ należy wysterylizować poprzez filtrację za pomocą filtra nakrętkowego o rozmiarze porów 0,2 μm pod próżnią.
- Zdrową mysz należy uśmiercić poprzez uduszenie CO2 w komorze euthanazyjnej. Chociaż na potrzeby tego projektu wykorzystano mysz C57BL/6 (w wieku 6-8 tygodni), technikę płukania płuc można zastosować u każdej szczepu myszy. Korzystając z butli z gazem sprężonym, należy dopuścić przepływ gazu do komory przez 1 min przed umieszczeniem w niej myszy, aby upewnić się, że komora jest całkowicie wypełniona CO2. Mysz należy pozostawić w komorze przez co najmniej jedną minutę w celu uśmiercenia. Dodatkowo, każdą mysz należy upuścić z krwi poprzez nakłucie serca jako fizyczną metodę potwierdzenia śmierci zwierzęcia, zgodnie z opisem w punkcie 1.4.
- Mysz należy położyć na grzbiecie (strona grzbietowa), spryskać 70% etanolem, zlokalizować mostek i pod kątem 30 stopni względem brzucha wprowadzić igłę 23G (dołączoną do strzykawki 1 mL) na głębokość około 50 mm do jamy klatki piersiowej. Przy prawidłowym umieszczeniu igły powinno być możliwe pobranie od 0,4 do 1 mL krwi, w zależności od wielkości myszy. Należy sprawdzić, czy u zwierzęcia ustały oznaki życiowe.
- Mysz należy położyć na stole laboratoryjnym na brzuchu (strona brzuszna). Mysz należy spryskać 70% etanolem, aby wysterylizować środowisko pracy. Należy uszczypnąć skórę w połowie długości kręgosłupa myszy. Za pomocą nożyc sekcyjnych wysterylizowanych 70% etanolem należy wykonać niewielkie nacięcie skóry.
- Należy chwycić skórę po obu stronach nacięcia i pociągnąć ją w przeciwnych kierunkach wzdłuż osi głowa-ogon myszy. Przy prawidłowym wykonaniu skóra zostanie oddzielona od znajdującego się pod nią tułowia.
- W obszarze szyi myszy powinny być teraz widoczne odsłonięte mięśnie i gruczoły. Należy ostrożnie wyciąć tę tkankę i odsunąć ją pęsetą w stronę przednią myszy, odsłaniając krtani, tchawicę i przełyk. Należy unikać przecięcia żyły szyjnej lub tętnicy szyjnej.
- Tchawica jest teraz widoczna i można ją zidentyfikować jako tkankę z otaczającymi ją pierścieniami chrzęstnymi. Należy delikatnie chwycić tchawicę pęsetą, a następnie ostrożnie unieść i oddzielić ją od przełyku, który znajduje się po stronie grzbietowej.
- Należy wykonać niewielkie nacięcie przed miejscem trzymania tchawicy, ale za krtanią. Nacięcie powinno być wykonane pod kątem około 45°. Nie wolno całkowicie przeciąć tchawicy, ponieważ uniemożliwiłoby to jej cofnięcie się do jamy ciała.
- Strzykawkę 1 cc z założonym cewnikiem Tom Cat należy napełnić sterylnym PBS w przygotowaniu do wprowadzenia cewnika do światła tchawicy. Trzymając tchawicę pęsetą, należy przytrzymać cewnik ręką blisko jego końcówki, aby zwiększyć kontrolę, i delikatnie wprowadzić go w miejsce nacięcia tchawicy. Cewnik należy delikatnie wprowadzić do tchawicy na głębokość około 20 mm. Należy uchwycić tchawicę wokół rurki cewnika, uwalniając drugą rękę.
- Za pomocą strzykawki 1 mL z założonym cewnikiem należy delikatnie wprowadzić do płuc 0,75 mL sterylnego PBS w temperaturze pokojowej, a następnie delikatnie odessać PBS z powrotem do strzykawki. Proces ten należy powtórzyć trzy razy, masując jednocześnie klatkę piersiową z zewnątrz. Należy odłączyć strzykawkę od cewnika i przelać płyn z płukania do probówki wirówkowej 15 mL. Po napełnieniu strzykawki 0,75 mL świeżego PBS i ponownym podłączeniu jej do cewnika, należy powtórzyć kroki 1.9 i 1.10 dwukrotnie dla każdej myszy. Odzysk płynu może być częściowy, a pobrana objętość może być mniejsza niż objętość wprowadzona. W przypadku pobierania komórek od więcej niż jednej myszy, probówkę 15 mL z zebranymi komórkami należy umieścić na lodzie do czasu wykonania wszystkich płukań płuc.
2. Przetwarzanie zebranego materiału z płukania opłucnego w celu uzyskania makrofagów pęcherzykowych (AMɸ)
- Odwiruj płyn z płukania płuc przy 250 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C.
- Stosując technikę sterylną, odlej nadsącz do odpowiedniego pojemnika na odpady wewnątrz komory z laminarnym przepływem powietrza. Resuspenduj pellet komórkowy, delikatnie przesuwając probówkę wirówkową o górną krawędź statywu na probówki. Dodaj 1 mL pożywki cAMɸ w celu resuspensji komórek.
- Policz komórki za pomocą licznika cząstek Coulter Particle Counter Z1, pipetując 20 μL zawiesiny komórkowej do 10 mL rozcieńczalnika Isoton II w fiolce licznika Coulter. Dodaj do fiolki 3 do 4 kropli odczynnika litycznego Zap-oglobin II, delikatnie odwróć fiolkę 3 do 4 razy, a następnie umieść ją w liczniku, aby uzyskać stężenie komórek. Upewnij się, że licznik jest zaprogramowany z czynnikiem rozcieńczenia 2 x 104, aby wyświetlić stężenie komórek jako liczbę komórek na mL.
- Rozcieńcz komórki do stężenia 2,5 x 105 na mL, używając pożywki cAMɸ.
- Rozlej 2 mL zawiesiny o stężeniu 2,5 x 105 komórek/mL do każdego dołka 6-dołkowej płytki do hodowli tkanek.
- Aby wzbogacić frakcję AMɸ, inkubuj płytki w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 przez 6 h, aby umożliwić przyleganie komórek do dna dołka. Delikatnie odessij nadsącz, tak aby nie uszkodzić przylegających komórek.
- Przepłucz dołki sterylnym PBS (bezwapniowym i beztlenkowym), aby usunąć nieprzylegające komórki i zanieczyszczenia. Dodaj 2 mL pożywki cAMɸ do każdego dołka.
- Inkubuj komórki przez noc w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 przed dodaniem stymulatorów. Po tym etapie wzbogacenia około 87% komórek wykazuje pozytywny wynik dla markerów makrofagów CD11b i F4/80 (Ryc. 2c).
3. Dodanie nanocząstek polianhydrydu i traktowanie kontrolne
- Wytworzyć nanocząsteczki metodą nanoenkapsulacji polianhydrydu z użyciem przeciwrozpuszczalnika15. W tym procesie polimer rozpuszcza się w chlorku metylenu (4 °C przy stężeniu 25 mg/mL) i wytrąca w pentanie (-20 °C w stosunku 1:200 chlorek metylenu:pentan).
- Odważyć nanocząsteczki polianhydrydu na wysterylizowanym papierze wagowym przy użyciu wagi zdolnej do dokładnego pomiaru ilości rzędu mikrogramów. Przenieść cząsteczki do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 mL.
- Resuspendować nanocząsteczki w lodowatym cAMɸ. Obliczenia należy przeprowadzić tak, aby do każdej studni dodać nie więcej niż 0,3 mL medium w celu uzyskania pożądanego stężenia nanocząsteczek. Przechowywać resuspendowane cząsteczki w lodzie do momentu dodania nanocząsteczek do studni z kulturą.
- Przed dodaniem nanocząsteczek do kultur AMɸ poddać cząsteczki sonikacji za pomocą sonikatora laboratoryjnego z mikrokońcówką. Przed sonikacją wysterylizować mikrokońcówkę, spryskując ją 70% etanolem i wycierając sterylną chusteczką Kimwipe. Sonikować przy energii 10-20 dżuli przez 30 do 45 s, utrzymując probówkę w lodzie. Makroskopowo ocenić zawiesinę nanocząsteczek. Jeśli cząsteczki nie są wystarczająco rozproszone, pozostawić zawiesinę w lodzie na 1 do 2 min, aby upewnić się, że nanocząsteczki znajdują się poniżej temperatury przejścia szklistego polimeru, a następnie ponownie sonikować przez 30 do 45 s. Celem tego etapu sonikacji jest odpowiednie rozproszenie nanocząsteczek, ponieważ nanocząsteczki 50:50 CPTEG:CPH mają tendencję do agregacji w środowisku wodnym. Niemniej jednak w zawiesinie mogą nadal pozostawać niewielkie agregaty nanocząsteczek.
- Zawiesinę nanocząsteczek (odpowiednio rozproszoną) należy przechowywać w lodzie i zużyć natychmiast, aby zapobiec przedwczesnej erozji powierzchni lub agregacji.
- Wyjąć szalki hodowlane zawierające AMɸ z inkubatora i umieścić je w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Przechylić płytkę pod kątem około 45 stopni i odpipetować objętość medium, która zostanie dodana do zawiesiny nanocząsteczek (nie powinna ona przekraczać 0,3 mL). Podczas usuwania medium nie naruszać przylegających komórek.
- Krótko wymieszać zawiesinę nanocząsteczek polianhydrydu na wirówce typu vortex przed dodaniem jej do odpowiednich studni. Pipetować odpowiednią ilość zawiesiny nanocząsteczek (nie więcej niż 0,3 mL) do konkretnej studni lub studni; nie mieszać jednak poprzez pipetowanie w górę i w dół. Czynność ta mogłaby spowodować odklejenie przylegających AMɸ od dna studni. Cząsteczki opadną na dno studni i nawiążą kontakt z komórkami. W badaniach opisanych w niniejszym raporcie końcowe stężenie nanocząsteczek w ko-kulturze z AMɸ wynosiło 125 μg/mL. Postąpić analogicznie z kolejnymi studniami i grupami traktowania. Do wyznaczonych studni włączyć grupy kontrolne pozytywne i negatywne, takie jak samo medium oraz 200 ng/mL lipopolisacharydu (LPS).
- Przenieść szalki hodowlane do inkubatora z nawilżaniem w temperaturze 37 °C i atmosferą 5% CO2 na 48 h. Badania kinetyczne w naszym laboratorium wykazały, że 48 godzin jest optymalnym okresem hodowli do oceny zarówno ekspresji markerów powierzchniowych komórek, jak i sekrecji cytokin, ponieważ pozwala to na odpowiedni czas transkrypcji i syntezy białek. Chociaż podczas przedłużonego okresu hodowli (np. 72 h) gromadzą się wyższe poziomy cytokin, ocena ekspresji markerów powierzchniowych komórek w tym punkcie czasowym może być zaburzona przez wpływ podwyższonego poziomu cytokin. Obserwowane zmiany w ekspresji markerów powierzchniowych mogą nie wynikać bezpośrednio ze stymulacji samymi nanocząsteczkami.
4. Ocena aktywacji makrofagów pęcherzykowych (AMɸ) z wykorzystaniem cytometrii przepływowej
- Przed zebraniem wysianych makrofagów, które były współhodowane z nanocząsteczkami lub stymulantami, należy przygotować bufor do sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS) (0,1 % azotku sodu i 0,1 % albuminy surowicy bydlęcej (BSA)) w 0,1 M roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (pH 7.4).
- Przygotować roztwory robocze buforu blokującego oraz przeciwciał monoklonalnych. Aby przygotować bufor blokujący, należy rozcieńczyć IgG szczura (Sigma) i przeciwciało anty-CD16/32 (eBioscience) w buforze FACS do stężeń odpowiednio 1 mg/mL i 10 μg/mL. Panel przeciwciał przeciwko markerom powierzchniowym należy rozcieńczyć w buforze FACS do stężenia zalecanego przez producenta lub stężenia zoptymalizowanego przez użytkownika. W wynikach przedstawionych w niniejszej pracy panel markerów powierzchniowych składa się z przeciwciał przeciwko MHC II, CD86, CD40 i CIRE (CD209). W panelu znajdują się również przeciwciała antymysie przeciwko markerom makrofagów F4/80 i CD11b, aby podczas analizy danych jednoznacznie zidentyfikować fenotyp makrofagów. Należy zachować ostrożność przy wyborze przeciwciał przeciwko cząsteczkom MHC II, ponieważ inbredowe linie myszy często różnią się haplotypami MHC II. Wybrane przeciwciała muszą reagować ze specyficznymi alloantygenami MHC ekspresjonowanymi przez badaną linię myszy.
- Po 48 h inkubacji z nanocząsteczkami i/lub stymulantami, naczynia hodowlane należy umieścić na lodzie na 20 min. Aby usunąć adherentne makrofagi z płytek, należy delikatnie zeskrobać zawartość dołków za pomocą skrobaczki do komórek o szerokości 24 cm.
- Używając pipety serologicznej 5 mL, należy delikatnie aspirować komórki wraz z medium góra-dół pięć razy, aby uzyskać zawiesinę pojedynczych komórek. Zawartość poszczególnych dołków należy przenieść pipetą do oddzielnych probówek polistyrenowych o pojemności 5 mL, aby nie wymieszać komórek z różnych grup badawczych.
- Do każdej probówki należy dodać 2 mL buforu FACS.
- Probówki z komórkami należy wirować przy 250 x g w temperaturze 4 °C przez 10 min.
- Należy odlać nadsącz i delikatnie resuspendować osad komórkowy w pozostałej cieczy, przesuwając probówki po górnej krawędzi statywu.
- Aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu przeciwciał monoklonalnych, do każdej probówki z komórkami należy dodać 10 μL buforu blokującego (przygotowanego w pkt 4.2). Probówki należy wymieszać na wirówce typu vortex i inkubować na lodzie przez 30 min.
- Do każdej probówki należy dodać odpowiednią objętość rozcieńczonych przeciwciał monoklonalnych i inkubować w ciemności na lodzie przez 15 min. Probówki zawierające próbki do analizy powinny otrzymać kombinację przeciwciał z panelu polichromatycznego (indywidualne laboratoria powinny wcześniej przeprowadzić optymalizację kombinacji przeciwciał). Należy uwzględnić dodatkowe grupy kontrolne w celu prawidłowego ustawienia parametrów akwizycji na cytometrze przepływowym, w tym probówkę z komórkami nieznakowanymi oraz probówki do kompensacji odpowiadające komórkom znakowanym każdym pojedynczym kolorem osobno. Aby prawidłowo ustawić bramki do analizy cytometrycznej, podczas akwizycji należy uwzględnić kontrole FMO (Fluorescence Minus One). Kontrole FMO to komórki znakowane wszystkimi przeciwciałami sprzężonymi z fluorochromami używanymi w panelu, z wyjątkiem jednego, które zostaje zastąpione odpowiednią kontrolą izotypową. W probówkach kontrolnych FMO i kompensacyjnych powinny znaleźć się również populacje pozytywne i negatywne (tj. oddzielne aliquoty komórek traktowanych stymulantem kontrolnym pozytywnym oraz samym medium).
- Do każdej probówki należy dodać 2 mL buforu FACS, wymieszać na vortexie i wirować przy 250 x g w temperaturze 4 °C przez 10 min.
- Należy odlać nadsącz i resuspendować osad komórkowy w pozostałej cieczy, przesuwając probówki po górnej krawędzi statywu.
- Jeśli panel przeciwciał zawiera przeciwciało niesprzężone bezpośrednio z fluorochromem, lecz sprzężone z biotyną, do wizualizacji markera powierzchniowego konieczne jest zastosowanie streptawidyny sprzężonej z fluorochromem. Na tym etapie należy dodać odpowiednią objętość rozcieńczonej streptawidyny sprzężonej z fluorochromem i inkubować w ciemności przez 15 min na lodzie. Podobnie jak w pkt 4.2, streptawidynę rozcieńcza się do stężenia zalecanego przez producenta lub zoptymalizowanego przez użytkownika. Krok ten jest wymagany tylko w przypadku paneli zawierających biotynjlowane przeciwciała pierwotne.
- Należy wykonać etap płukania zgodnie z opisem w pkt 4.10.
- Należy rozcieńczyć odpowiednią objętość stabilizującego fiksatywa BD w stosunku 1:3 w wodzie dejonizowanej. Do każdej probówki należy dodać 100 μL rozcieńczonego fiksatywu, delikatnie mieszając na vortexie, aby zapobiec aglomeracji komórek. Znakowane i utrwalone komórki można stabilnie przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C przez około jeden tydzień przed akwizycją na cytometrze przepływowym.
5. Reprezentatywne dane
Nanocząstki otrzymane w kroku 3.1 miały średnicę 163 ± 24 nm oraz morfologię zgodną z wynikami uzyskanymi w poprzednich badaniach5,16. Nanocząstki w roztworze przed i po sonikacji przedstawiono na Rysunku 1, aby wykazać konieczność zastosowania sonikacji w celu zapewnienia odpowiedniej dyspersji cząstek. Analiza cytometryczna makrofagów pęcherzykowych (AMɸs) uzyskanych poprzez lavage płuc przedstawiona jest na Rysunku 2. Oznakowanie komórek kombinacją przeciwciał anty-mysich CD11b i anty-mysich F4/80, a także odpowiednimi kontrolami FMO, pozwala na ustalenie poziomu tła, identyfikację AMɸs oraz wyznaczenie bramkowania do dalszej analizy. Traktowanie makrofagów pęcherzykowych nanocząstkami polianhydrydowymi zwiększa ich aktywację, co objawia się wzrostem średniej intensywności fluorescencji dla MHC II, CD40, CD86 oraz CIRE (Rysunek 3).
Rycina 1. Nanocząsteczki CPTEG:CPH w stosunku 50:50 przed (A) i po (B) 30 s sonikacji.
Rycina 2. Analiza cytometryczna zebranych makrofagów pęcherzykowych znakowanych za pomocą (A) Alexa Fluor 700 anty-CD11b i kontroli FMO PE-Cy7, (B) kontroli FMO Alexa Fluor 700 i PE-Cy7 anty-F4/80 oraz (C) Alexa Fluor 700 anty-CD11b i PE-Cy7 anty-F4/80. Liczba w prawym górnym rogu przedstawia procent komórek podwójnie dodatnich.
Rycina 3. Histogramy wykazujące wzrost intensywności fluorescencji dla ekspresji powierzchniowej MHC II (A), CD40 (B), CD86 (C) i CIRE (D) po 48-godzinnej kokulturze makrofagów pęcherzykowych z nanocząsteczkami polianhydrydowymi CPTEG:CPH w stosunku 50:50. Histogramy przedstawiają wyniki dla makrofagów pęcherzykowych (AMɸ) oznaczonych jako kontrole FMO (
), nieleczonych AMɸ oznaczonych przeciwciałami przeciwko wszystkim markerom powierzchniowym komórek (
) oraz AMɸ hodowanych z nanocząsteczkami i oznaczonych przeciwciałami przeciwko wszystkim markerom powierzchniowym komórek (
).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Platformy szczepionkowe oparte na nanocząsteczkach polianhydrydów wykazały skuteczność po podaniu donosowym w pojedynczych dawkach5. Pomiar aktywacji populacji komórek fagocytujących obecnych w płucach, wywołanej przez tę platformę dostarczania szczepionki, pozwala na ocenę jej potencjalnej zdolności do ostatecznego stymulowania adaptacyjnych odpowiedzi immunologicznych.
W szczególności pozyskiwanie makrofagów pęcherzykowych z płynu z przemywania płuc i poddawanie ich działaniu róż...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.
Podziękowania
Autorzy pragną podziękować Dowództwu Badań Medycznych i Materiałowych Armii USA (numery grantów W81XWH-09-1-0386 i W81XWH-10-1-0806) za wsparcie finansowe oraz dr. Shawna Rigby'ego z Flow Cytometry Facility na Iowa State University za ekspercką pomoc techniczną.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| pożywka cAM | |||
| DMEM | Cellgro | 15-013-CV | |
| 50 mM 2-merkapt–etanol | Sigma-Aldrich | M3148-25ML | |
| Penicylina/streptomycyna 10 000 μg/ml roztworu | Cellgro | 30-002-CI | |
| Płodowa surowica bydlęca | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Bufor FACS | |||
| Chlorek sodu | Fisher Scientific | S671-500 | |
| Fosforan sodu | Fisher Scientific | MK7868500 | |
| Chlorek potasu | Fisher Scientific | P217500 | |
| Fosforan potasu | Fisher Scientific | P288-200 | |
| BSA (albuminy surowicy bydlęcej) | Sigma-Aldrich | A7888 | |
| Azydek sodu | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Przeciwciała | |||
| IgG szczura | Sigma-Aldrich | I4341 | |
| anty-Ms CD16/32 | eBioscience | 16-0161 | |
| Przeciwciało przeciwko MHC II mysiem haplotypom I-A/I-E, klon M5/114.15.2, sprzężone z izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) | eBioscience | 11-5321 | |
| Przeciwciało anty-mysie CD86, klon GL-1, koniugowane z allofikocyjaniną (APC)-Cy7 | Biolegend | 105030 | |
| Przeciwciało anty-mysie CD40, klon 1C10, koniugowane z APC | eBioscience | 17-0401 | |
| Przeciwciało anty-mysie CD209, klon 5H10, koniugowane z biotyną | eBioscience | 13-2091 | |
| Przeciwciało anty-mysie CD11b, klon M1/70, koniugowane z Alexa Fluor 700 | eBioscience | 56-0112 | |
| przeciwciało przeciw mysiej białku F4/80, klon BM8, koniugowane z phycoerytryną–rythrin (PE)-Cy7 | eBioscience | 25-4801 | |
| streptawidyna sprzężona z PE-Texas red | BD Biosciences | 551487 | |
| Pozostałe materiały i odczynniki | |||
| Etanol | Fisher Scientific | A405-20 | Stosowany w stężeniu 70% (v/v) |
| Sprężony CO2 | Linweld | 16000060 | |
| Strzykawka 1 ml | BD Biosciences | 309659 | |
| Sovereign 3 ½" Cewnik typu Tom Cat | Kendall | 703021 | |
| Komora z laminarnym przepływem powietrza z systemem bezpieczeństwa biologicznego | NUAIRE | Seria 22 | |
| Nożyczki sekcyjne | Fisher Scientific | 138082 | |
| Pinceta | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-8254 | |
| PBS, 1X bez wapnia i magnezu | Cellgro | 21-040-CM | |
| probówki wirówkowe 15 ml z nakrętką | VWR international | 21008-216 | |
| Płytki sześciodołkowe do hodowli tkankowej | Costar | 3516 | |
| Statywy na probówki z tworzywa sztucznego | Nalge Nunc international | 5970 | |
| Skrobacz do komórek 24 cm | Techno Plastic Products | 99002 | |
| probówka polistyrenowa z okrągłym dnem o pojemności 5 ml | Falcon BD | 352008 | |
| Pipet-aid XL | Drummond Scientific | 4-000-105 | |
| Pipety o pojemności 10, 5 i 2 ml | Fisher Scientific | 13-675 | |
| 200 i 10 μmikropipety L | Gilson Pipetman | F123601 | |
| 200 i 10 μkońcówki do pipet L | Fisher Scientific | 02-707 | |
| Stabilizator utrwalający BD | BD Biosciences | 338036 | |
| Rozcieńczalnik Isoton II | Beckman Coulter Inc. | 8546719 | |
| Odczynnik lityczny Zap-oglobin II | Beckman Coulter Inc. | 7546138 | |
| Probówki polistyrenowe do licznika Coulter'a | Beckman Coulter Inc. | 14310-684 | |
| Probówki | BD Biosciences | 352008 | |
| Sprzęt | |||
| Wirówka chłodząca | Labnet International | 50075040 | |
| Inkubator z nawilżaniem CO22 | Nuaire | Model Autoflow 8500 | |
| Cytometr przepływowy FACSCanto | BD Biosciences | 338960 | |
| Licznik cząstek Coulter Z1 | Beckman Coulter Inc. | WS-Z1DUALPC | |
| Urządzenie do sonikacji cieczy z mikrokońcówką | Misonix | Model nr S-4000 |
Bibliografia
- Mallapragada, S. K., Narasimhan, B. Immunomodulatory biomaterials. Int. J. Pharm. 364, 265-271 (2008).
- Torres, M. P., Vogel, B. M., Narasimhan, B., Mallapragada, S. K. Synthesis and characterization of novel polyanhydrides with tailored erosion mechanisms. J. Biomed. Mater. Res. A. 76, 102-110 (2006).
- Lopac, S. K., Torres, M. P., Wilson-Welder, J. H., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B. Effect of polymer chemistry and fabrication method on protein release and stability from polyanhydride microspheres. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 91, 938-947 (2009).
- Torres, M. P., Determan, A. S., Anderson, G. L., Mallapragada, S. K., Narasimhan, B. Amphiphilic polyanhydrides for protein stabilization and release. Biomaterials. 28, 108-116 (2007).
- Ulery, B. D. Design of a Protective Single-Dose Intranasal Nanoparticle-Based Vaccine Platform for Respiratory Infectious Diseases. PLoS ONE. 6, e17642(2011).
- Petersen, L. K., Xue, L., Wannemuehler, M. J., Rajan, K., Narasimhan, B. The simultaneous effect of polymer chemistry and device geometry on the in vitro activation of murine dendritic cells. Biomaterials. 30, 5131-5142 (2009).
- Petersen, L. K. Activation of innate immune responses in a pathogen-mimicking manner by amphiphilic polyanhydride nanoparticle adjuvants. Biomaterials. 32, 6815-6822 (2011).
- Torres, M. P. Polyanhydride microparticles enhance dendritic cell antigen presentation and activation. Acta. Biomater. 7, 2857-2864 (2011).
- Kirby, A. C., Coles, M. C., Kaye, P. M. Alveolar macrophages transport pathogens to lung draining lymph nodes. J. Immunol. 183, 1983-1989 (2009).
- Barletta, K. E. Leukocyte compartments in the mouse lung: Distinguishing between marginated, interstitial, and alveolar cells in response to injury. J. Immunol. Methods. , (2011).
- Rubins, J. B. Alveolar macrophages: wielding the double-edged sword of inflammation. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 167, 103-104 (2003).
- Sun, K., Gan, Y., Metzger, D. W. Analysis of Murine Genetic Predisposition to Pneumococcal Infection Reveals a Critical Role of Alveolar Macrophages in Maintaining the Sterility of the Lower Respiratory Tract. Infect. Immun. 79, 1842-1847 (2011).
- Morimoto, K. Alveolar Macrophages that Phagocytose Apoptotic Neutrophils Produce Hepatocyte Growth Factor during Bacterial Pneumonia in Mice. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 24, 608-615 (2001).
- Gordon, S., Taylor, P. R. Monocyte and macrophage heterogeneity. Nat. Rev. Immunol. 5, 953-964 (2005).
- Ulery, B. D. Polymer chemistry influences monocytic uptake of polyanhydride nanospheres. Pharm. Res. 26, 683-690 (2009).
- Petersen, L. K., Sackett, C. K., Narasimhan, B. High-throughput analysis of protein stability in polyanhydride nanoparticles. Acta Biomater. 6, 3873-3881 (2010).
- Irvin, C. G., Bates, J. H. Measuring the lung function in the mouse: the challenge of size. Respir. Res. 4, 4(2003).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
