Method Article

Analiza internalizacji komórkowej nanocząstek i bakterii za pomocą cytometrii przepływowej obrazowania wielospektralnego

DOI:

10.3791/3884

⸱

June 8th, 2012

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Veterinary Microbiology and Preventive Medicine, Iowa State University, 2Amnis Corporation, 3Department of Chemical and Biological Engineering, Iowa State University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym artykule opisujemy metodę wykorzystującą wielospektralną obrazowanie cytometrią przepływową do ilościowego określenia internalizacji nanocząstek polibezwodnika lub bakterii przez komórki RAW 264.7.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Systemy nanocząstek stały się cennymi narzędziami w dostarczaniu szczepionek dzięki ich zdolności do efektywnego dostarczania ładunku, w tym białek, do komórek prezentujących antygen1-5. Internalizacja nanocząstek (NP) przez komórki prezentujące antygen jest krytycznym krokiem w generowaniu skutecznej odpowiedzi immunologicznej na zamknięty w kapsułkach antygen. Aby określić, w jaki sposób zmiany w recepturze nanocząstek wpływają na funkcję, staraliśmy się opracować wysokoprzepustowy, ilościowy protokół eksperymentalny, który byłby kompatybilny z wykrywaniem zinternalizowanych nanocząstek, a także bakterii. Do tej pory dwie niezależne techniki, mikroskopia i cytometria przepływowa, były metodami stosowanymi do badania fagocytozy nanocząstek. Wysoka przepustowość cytometrii przepływowej generuje solidne dane statystyczne. Jednak ze względu na niską rozdzielczość nie jest w stanie dokładnie określić ilościowo nanocząstek zinternalizowanych i związanych z komórkami. Mikroskopia generuje obrazy o wysokiej rozdzielczości przestrzennej; Jest to jednak czasochłonne i obejmuje małe próbyo rozmiarach 6-8. Wielospektralna obrazowanie przepływowe (MIFC) to nowa technologia, która łączy w sobie aspekty zarówno mikroskopii, jak i cytometrii przepływowej, która wykonuje wielokolorową fluorescencję spektralną i obrazowanie w jasnym polu jednocześnie przez rdzeń laminarny. Ta funkcja zapewnia dokładną analizę intensywności sygnału fluorescencyjnego i relacji przestrzennych między różnymi strukturami i cechami komórkowymi z dużą prędkością.

Tutaj opisujemy metodę wykorzystującą MIFC do scharakteryzowania populacji komórek, które mają zinternalizowane nanocząstki polibezwodnika lub serowar Salmonella enterica Typhimurium. Opisujemy również przygotowanie zawiesin nanocząstek, znakowanie komórek, akwizycję na systemie ImageStreamX oraz analizę danych za pomocą aplikacji IDEAS. Pokazujemy również zastosowanie techniki, która może być wykorzystana do różnicowania szlaków internalizacji nanocząstek i bakterii poprzez zastosowanie cytochalazyny-D jako inhibitora fagocytozy za pośrednictwem aktyny.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. RAW 264.7 Hodowla komórkowa

  1. Zbierz komórki RAW 264.7 z ich kolb, gdy osiągną konfluencję, delikatnie zeskrobując je skrobakiem do komórek. Policz je i umieść w 24-dołkowym naczyniu do hodowli komórek o gęstości 5 x 105 komórek/basenik w 0,5 ml kompletnego zmodyfikowanego podłoża Dulbecco's Eagle Medium (cDMEM; 10% inaktywowana termicznie płodowa surowica bydlęca (FBS), 2 mM Glutamax i 10 mM HEPES) i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 .

2. Chorobotwórcze Salmonella enterica Serovar Typhimurium 14028 Transformacja i hodowla

  1. Wprowadzić rekomb....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania wykazały, że biodegradowalne nanocząstki na bazie kwasu poli(mlekowo-ko-glikolowego (PLGA) lub polibezwodników mogą być wykorzystywane do dostarczania kapsułkowanych antygenów lub leków do komórek docelowych. Wychwyt tych nanocząstek przez komórki fagocytarne jest ważny dla ich skuteczności, co sprawia, że ilościowa analiza internalizacji ma kluczowe znaczenie w projektowaniu nowych systemów dostarczania nanocząstek. Dzięki zastosowaniu tej metody można z łatwością analizować zróżnicowany wychwyt nanocząstek prze.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sherree L. Friend jest zatrudniona w firmie Amnis Corporation, która produkuje system ImageStreamX .

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować ONR-MURI Award (NN00014-06-1-1176) oraz U.S. Army Medical Research and Materiel Command (numery grantów W81XWH-09-1-0386 i W81XWH-10-1-0806) za wsparcie finansowe.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
RAW 264.7 linia komórkowaAmerican Type Culture Collection (ATCC)TIB-71
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Cellgro10-013-CV
Surowica bydlęcapłodu Atlanta BiologicalsS 11150Premium Grade
GlutamaxGIBCO, firmy Life Technologies35050-061
HEPESGIBCO, firmy Life Technologies15630-080
Płytka 24-dołkowaTechno Plastic Products92024
Kolby do hodowli komórkowychProdukty z tworzywa sztucznego Techno90151
Skrobak do komórekTechno Plastic Products9900224 cm
Salmonella entericaserowar TyphimuriumATCC14028
BTX ECM630 Manipulator elektrokomórkowyBTX Technologies
MOPSFisher ScientificBP308
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Cellgro21-040-CV
Ultradźwiękowy procesor cieczyMisonixS-4000
Cytochalazyna-DSigma-Aldrich,C8273
FormaldehydPolysciences, Inc.04018
Bufor płuczący2% inaktywowany termicznie FBS, 0,1% azydek sodu w PBS.
Bufor do trwałej ondulacji/płukaniaBD Biosciences554714
Mikroprobówki zatrzaskowe Clear-viewSigma-AldrichT4816
Alexa Fluor falloidyna 660InvitrogenA22285
ImageStreamXAmnis Corporation100200Opcje: laser 658nm, automatyczny podajnik
próbek Azydek soduFisher NaukowyS 227I-500

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ulery, B. D., Kumar, D., Ramer-Tait, A. E., Metzger, D. W., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B. Design of a protective single-dose intranasal nanoparticle-based vaccine platform for respiratory infectious diseases. PLoS One. 6, e17642(2011).
  2. Kasturi, S. P., Skountzou, I., Albrecht, R. A., Koutsonanos, D., Hua, T., Nakaya, H. I., Ravindran, R., Stewart, S., Alam, M., Kwissa, M., Villinger, F., Murthy, N., Steel, J., Jac....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Multispectral Imaging Flow CytometryNanoparticle InternalizationBacterial PhagocytosisActin dependent InternalizationCytochalasin D InhibitionImageStreamX SystemIDEAS Analysis SoftwareFluorescent Signal IntensitySpatial Resolution AnalysisInternalization Feature Quantification

Related Articles