Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Analiza internalizacji komórkowej nanocząsteczek i bakterii przy użyciu wielospektralnej obrazującej cytometrii przepływowej

16.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/3884

⸱

8 czerwca 2012

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Veterinary Microbiology and Preventive Medicine, Iowa State University, 2Amnis Corporation, 3Department of Chemical and Biological Engineering, Iowa State University

W tym artykule

Podsumowanie

W niniejszym artykule opisujemy metodę wykorzystującą multispektralną przepływową cytometrię obrazową do ilościowego oznaczenia internalizacji nanocząstek polianhydrydowych lub bakterii przez komórki RAW 264.7.

Streszczenie

Systemy nanopartykularne stały się cennymi narzędziami w dostarczaniu szczepionek dzięki swojej zdolności do efektywnego transportu ładunku, w tym białek, do komórek prezentujących antygen1-5. Internalizacja nanopartykuł (NP) przez komórki prezentujące antygen jest krytycznym krokiem w generowaniu skutecznej odpowiedzi immunologicznej na enkapsulowany antygen. Aby określić, w jaki sposób zmiany w formulacji nanopartykuł wpływają na ich funkcję, dążyliśmy do opracowania wysokoprzepustowego, ilościowego protokołu eksperymentalnego, który byłby kompatybilny z wykrywaniem zinternalizowanych nanopartykuł, jak również bakterii. Do tej pory dwiema niezależnymi technikami stosowanymi do badania fagocytozy nanopartykuł były mikroskopia oraz cytometria przepływowa. Wysokoprzepustowy charakter cytometrii przepływowej pozwala na uzyskanie wiarygodnych danych statystycznych. Jednak ze względu na niską rozdzielczość, metoda ta nie pozwala na dokładne ilościowe rozróżnienie nanopartykuł zinternalizowanych od tych związanych z powierzchnią komórki. Mikroskopia generuje obrazy o wysokiej rozdzielczości przestrzennej, jednak jest czasochłonna i wiąże się z analizą małych prób6-8. Wielospektralna cytometria przepływowa z obrazowaniem (MIFC) to nowa technologia łącząca aspekty mikroskopii i cytometrii przepływowej, która jednocześnie wykonuje wielokolorową spektralną fluorescencję oraz obrazowanie w polu jasnym w rdzeniu laminarnym. Możliwość ta zapewnia dokładną analizę intensywności sygnałów fluorescencyjnych oraz relacji przestrzennych między różnymi strukturami a cechami komórkowymi przy wysokiej prędkości pomiaru.

W niniejszej pracy opisujemy metodę wykorzystującą MIFC do charakterystyki populacji komórek, które zinternalizowały nanocząstki polianhydrydu lub Salmonella enterica serowaru Typhimurium. Opisujemy również przygotowanie zawiesin nanocząstek, znakowanie komórek, akwizycję danych w systemie ImageStreamX oraz analizę danych przy użyciu aplikacji IDEAS. Przedstawiamy ponadto zastosowanie techniki, która może służyć do rozróżnienia dróg internalizacji nanocząstek i bakterii poprzez użycie cytochalazyny-D jako inhibitora fagocytozy zależnej od aktyny.

Protokół

1. Hodowla komórek RAW 264.7

  1. Zbierz komórki RAW 264.7 z kolb po osiągnięciu przez nie pełnej konfluencji, delikatnie zeskrobując je skrobakiem do komórek. Policz komórki i wysiej je do 24-dołkowej płytki hodowlanej w gęstości 5 x 105 komórek/dołek w 0,5 mL pełnej pożywki Dulbecco's Modified Eagle Medium (cDMEM; 10% dezaktywowanego cieplnie płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 2 mM Glutamax i 10 mM HEPES), a następnie inkubuj przez noc w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2.

2. Transformacja i hodowla patogennego szczepu Salmonella enterica Serovar Typhimurium 14028

  1. Wprowadzić rekombinowane plazmidy wykazujące ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego (GFP) do S. Typhimurium metodą elektroporacji. Najpierw przygotować hodowlę Salmonella enterica serowaru Typhimurium (ATCC 14028) w bulionie LB i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C z napowietrzaniem.
  2. Następnego dnia odwirować 1 mL bakterii z maksymalną prędkością w mikrowirówce. Przemyć komórki czterokrotnie 1 mL zimnego roztworu MOPS/glicerol (bufor 1 mM kwasu 3-(N-morfolino)propanosulfonowego (MOPS) w 20% glicerolu), delikatnie resuspendując osad pipetą pomiędzy każdym przemyciem9. Po ostatnim przemyciu resuspendować osad w 50 μL roztworu MOPS/glicerol, do którego dodano ~0.5 μg plazmidowego DNA pAKgfp1 lub pAKgfplux110.
  3. Przenieść zawiesinę komórkową do schłodzonej kuwety do elektroporacji z przerwą 1 mm i przeprowadzić elektroporację przy użyciu następujących ustawień: 1800 V, 200 W, 25 mF. Natychmiast po podaniu impulsu dodać 1 mL bulionu LB i przenieść zawiesinę komórkową do nowej probówki 15 mL. Pozostawić komórki do regeneracji w temperaturze 37 °C z napowietrzaniem. Po jednej godzinie skoncentrować komórki poprzez wirowanie i resuspendować w ~100 μL pozostałego supernatantu.
  4. Na koniec wysiać komórki na płytki LB zawierające 100 μg/mL ampicyliny i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C. Pojedyncze kolonie oczyścić poprzez ponowne wysiewanie z selekcją antybiotykową; ekspresję GFP potwierdzić za pomocą oświetlenia ze standardowym zestawem filtrów do izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC).
  5. Zaszczepić 10 mL bulionu LB zawierającego 25 μg/mL ampicyliny (lub odpowiedniego antybiotyku) za pomocą pętli z Salmonella przekształconej do stabilnej ekspresji GFP.
  6. Hodować bakterie przez noc w temperaturze 37 °C.
  7. Rozcieńczyć Salmonella w stosunku 1:10 w nowej probówce z hodowlą zawierającą 10 mL LB z dodatkiem ampicyliny i inkubować przez 5 h w temperaturze 37 °C.
  8. Zmierzyć absorbancję hodowli przy 600 nm i obliczyć stężenie Salmonella na mL, korzystając z wcześniej opracowanej krzywej wzrostu.
  9. Rozcieńczyć Salmonella w cDMEM (0.5 mL/dołek), aby uzyskać wielokrotność infekcji (MOI) wynoszącą 100 na komórkę RAW 264.7.

3. Przygotowanie zawiesiny nanocząsteczek

  1. Przygotować nanocząstki obciążone 1% FITC zgodnie z wcześniejszym opisem11. W skrócie, cząstki są otrzymywane metodą nanoenkapsulacji polianhydrydu z użyciem antyrozpuszczalnika, w której polimer rozpuszcza się w chlorku metylenu (4 °C przy stężeniu 25 mg/mL) i wytrąca w pentanie (-30 °C w stosunku 1:200 chlorku metylenu do pentanu). Nanocząstki odzyskać poprzez filtrację próżniową. Po odparowaniu resztek rozpuszczalnika zważyć wysuszone nanocząstki polianhydrydu za pomocą sterylnego papieru ważącego.
  2. Dodać 5 mg nanocząstek do 0,5 mL zimnego roztworu soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS, bez wapnia i magnezu, pH 7.4) do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL i przechowywać na lodzie do momentu dodania nanocząstek do komórek RAW 264.7.
  3. Sonicować zawiesinę nanocząstek (przechowując ją na lodzie) przy użyciu procesora ultradźwiękowego wyposażonego w mikronakładkę przez około 25 s przy energii od 4 do 6 dżuli.

4. Test fagocytozy

  1. Poddać część komórek RAW 264.7 wstępnej obróbce cytochalasyną-D w stężeniu 5 μg/mL na 1 h przed wprowadzeniem NP lub Salmonella, odsysając medium i zastępując je świeżym cDMEM uzupełnionym o inhibitor. Przenieść hodowle do inkubatora w temperaturze 37 °C.
  2. Po 1 h inkubacji z inhibitorem wyjąć płytki z inkubatora, wymieszać zawiesinę nanocząsteczek w wirówce typu vortex i dodać 10 μL do odpowiednich dołków.
  3. Wymieszać Salmonella w wirówce typu vortex i zainfekować komórki RAW 264.7 z MOI wynoszącym 100, dodając bakterie do odpowiednich dołków.
  4. Kilkakrotnie opukać płytkę, aby wymieszać zawartość, i inkubować w temperaturze 37 °C lub 4 °C (kontrola) przez 45 min.
  5. Wyjąć płytki z inkubatora lub lodówki i umieścić na lodzie. Przemyć komórki dwukrotnie lodowatym PBS (bez Ca2+ i Mg2+), odsysając i usuwając stare medium, aby usunąć niezwiązane cząsteczki, Salmonella oraz martwe lub oderwane komórki RAW 264.7.
  6. W celu zebrania komórek RAW 264.7 po drugim przemyciu, dodać 250 μL lodowatego PBS i delikatnie zeskrobać zawartość dołków.
  7. Przenieść zebrane komórki pipetą do probówek do mikrocentryfugi z przezroczystym dnem i zakrętką typu snap cap i przechowywać je na lodzie.
  8. Przemyć komórki, dodając 1 mL zimnego buforu do mycia (2% inaktywowanego ciepłem FBS, 0,1% azotku sodu w PBS) i wirować z prędkością 250 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C.
  9. Odlać nadsącz i usunąć pozostałości buforu, opukując odwróconą probówkę do mikrocentryfugi o ręcznik papierowy. Resuspender osad komórkowy, delikatnie przesuwając probówkę do mikrocentryfugi po statywie na probówki.
  10. Utrwalić komórki RAW 264.7, dodając 100 μL 4% paraformaldehydu (PFA) w PBS i pozostawić komórki na 15 min w temperaturze pokojowej (RT).
  11. Przemyć komórki RAW 264.7, dodając 1 mL buforu Perm/Wash (BD Biosciences) i wirować z prędkością 250 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C.
  12. Powtórzyć krok 4.9.
  13. Przebarwić aktynę w komórkach RAW 264.7, dodając 100 μl buforu Perm/Wash zawierającego faloidynę Alexa Fluor 660 (AF 660; rozcieńczenie 1:150) na 15 min w temperaturze RT. Powtórzyć kroki 4.11 i 4.12.
  14. Resuspender komórki RAW 264.7 w 50 μL PBS zawierającego 1% PFA i przechowywać je w ciemności w temperaturze 4 °C do czasu akwizycji danych.

Wskazówki i uwagi:

  • Na tym etapie należy przygotować próbki z fluorescencją jednobarwną, które posłużą jako kontrole kompensacji podczas konfiguracji instrumentu ImageStreamX. Kontrole kompensacji uwzględnione w tym eksperymencie obejmowały: komórki RAW 264.7 (nieoznaczone pod kątem aktyny) inkubowane z nanocząsteczkami; komórki RAW 264.7 (nieoznaczone pod kątem aktyny) inkubowane z Salmonella; komórki RAW 264.7 oznaczone wyłącznie pod kątem aktyny.
  • W badaniach nad inhibitorami ważne jest uwzględnienie kontroli nośnika, w którym rozpuszczono inhibitor. W tym eksperymencie cytochalazynę D rozpuszczono w 100% DMSO. W związku z tym inkubowano komórki w cDMEM zawierającym DMSO, a następnie oceniano internalizację nanocząsteczek lub Salmonella. Nie stwierdzono istotnych różnic między grupą z medium a kontrolą DMSO (dane nie pokazano).
  • Przewodnik po przygotowaniu próbek dostępny na stronie internetowej firmy Amnis (https://www.amnis.com/images/1__Sample_Prep_Guide_3L_-_0418081.pdf) stanowi przydatne źródło informacji w celu sprawdzenia kompatybilności fluoroforów z ImageStreamX. Aby uzyskać dostęp do tego dokumentu, użytkownicy muszą najpierw zarejestrować się (bezpłatnie) w firmie Amis.

5. Pozyskiwanie próbek w systemie ImageStreamX

  1. Włącz ImageStreamX i uruchom program INSPIRE.
  2. Zainicjuj układ hydrauliczny (Fluidics). Po zakończeniu tego skryptu powinny być uruchomione SpeedBeads.
  3. W menu plików wybierz Load Default Template.
  4. W menu widoku Image Gallery wybierz ALL i naciśnij Run Setup, aby rozpocząć obrazowanie kulek.
  5. Dostosuj Core Tracking, aby wycentrować obrazy w płaszczyźnie bocznej (jeśli jest to konieczne).
  6. Wybierz kanał Brightfield (BF) i kliknij Set Intensity.
  7. Odczekaj, aż Flow Speed CV będzie stale wynosić mniej niż 0,2%.
  8. Kalibruj instrument codziennie. W karcie ASSIST kliknij Start All, aby uruchomić kalibracje i testy oraz zweryfikować, czy wszystkie zostały pomyślnie zakończone.
  9. Naciśnij Flush Lock and Load (FLL), aby załadować pierwszą próbkę. Załaduj najjaśniejszą próbkę w eksperymencie, która fluorescuje każdym z użytych fluorochromów. Jest to kluczowe, aby uruchomić tę próbkę jako pierwszą w celu ustalenia ustawień instrumentu, a następnie NIE zmieniać ich przez cały eksperyment.
  10. Włącz każdy laser użyty w eksperymencie i ustaw Laser Power tak, aby każdy fluorochrom miał maksymalne wartości pikseli między 100 a 4000 counts, mierzone na wykresach rozrzutu (scatter plots).
  11. Ustaw kryteria klasyfikacji komórek (Cell Classification), aby wyeliminować zbieranie niepożądanych obiektów. Aby zbierać dane tylko z komórek, ustaw Area Lower Limit w kanale BF na 50 μm. Obiekty o powierzchni mniejszej niż 50 μm zostaną uznane za zanieczyszczenia (debris) i nie zostaną zarejestrowane. Wybierz kanały do zbierania danych.
  12. Wpisz nazwę pliku (File Name), folder docelowy (Destination Folder), ustaw Sequence # na 1 oraz liczbę zdarzeń (Number of Events) do zarejestrowania.
  13. Kliknij Run Acquire, aby zebrać i zapisać plik danych z pierwszego eksperymentu.
  14. Kliknij FLL i uruchom kolejną próbkę eksperymentalną. Powtarzaj czynność, aż wszystkie próbki eksperymentalne zostaną zebrane.
  15. Kliknij Comp Settings (wyłącza to kanał brightfield oraz laser scatter i umożliwia zbieranie danych ze wszystkich kanałów) i zbierz 500 komórek pozytywnych z każdej próbki barwionej pojedynczo dla każdego fluoroforu w eksperymencie, aby opracować macierz kompensacji.

Podsumowując, próbki można analizować w następującej kolejności:

  • Najpierw najjaśniejsza próbka.
  • Pozostałe próbki testowe.
  • Kontrole kompensacyjne zawierające pojedynczą fluorescencję barwną.

Wskazówki i uwagi:

  • Szablon INSPIRE można zapisać i ponownie wczytać w celu ustawienia parametrów instrumentu. Po zapisaniu szablonów można wykorzystać autosampler do pracy bezobsługowej, aby analizować próbki eksperymentalne za pomocą jednego szablonu oraz kontrole kompensacji za pomocą osobnego szablonu dla każdej pojedynczej kontroli barwnej.
  • Konfiguracja ImageStreamX dla tych eksperymentów: lasery wzbudzające 488 i 658 nm; laser rozproszenia 785 nm; obiektyw 40X (0.75 NA), system 6-kanałowy ze standardowym zestawem filtrów ISX. Wykorzystano opcję autosamplera, aby umożliwić bezobsługową akwizycję próbek.
  • W eksperymencie zastosowano następujące ustawienia. Nanocząstki obrazowano przy laserze 488 nm ustawionym na 10mW, laserze 658 nm ustawionym na 50 mW, laserze 785 nm ustawionym na 2 mW oraz BF w kanale 1. Komórki zainfekowane Salmonella obrazowano przy laserze 488 nm ustawionym na 20 mW, laserze 658 nm ustawionym na 50 mW, laserze 785 nm ustawionym na 2 mW oraz BF w kanale 1. Kontrole kompensacji zbierano wyłączając BF i 785. Dla każdej z próbek testowych obrazowano co najmniej 5000 zdarzeń (tj. komórek).

6. Analiza obrazu

  1. Uruchom program IDEAS, dwukrotnie kliknij kreator Internalization i wczytaj jeden z testowych plików próbek .rif.
  2. Utwórz macierz kompensacji, klikając „New Matrix” w kroku 2. Uruchomi się kreator kompensacji. Dodaj pliki dla kontroli jednobarwnych w eksperymencie. Przechodź przez kolejne etapy kreatora zgodnie z instrukcjami, aż plik macierzy kompensacji zostanie zapisany i załadowany do pola w kroku 2 kreatora Internalization.
  3. Kliknij Next i postępuj zgodnie z instrukcjami, aż zostanie wygenerowany plik .daf.
  4. Ustaw właściwości wyświetlania obrazów, wybierając kanały obrazowania użyte podczas akwizycji. Kliknij Ch 2 (FITC) i Ch 5 (AF 660). (BF i SSC są zaznaczone domyślnie).
  5. Wybierz kanał obrazowania do wyznaczenia granicy komórki (CH01) oraz kanał, w którym zbierano sygnał z nanocząsteczek lub bakterii (CH02).
  6. Zostanie wygenerowany wykres punktowy zależnosci Brightfield Area od Brightfield Aspect Ratio dla wszystkich komórek. Zdefiniuj populację pojedynczych komórek, klikając w poszczególne punkty i tworząc bramkę wokół singletów. Pojedyncze komórki mają współczynnik proporcji (aspect ratio) około 1, a dublety około 0,5 (Rysunek 1A).
  7. Zostanie wygenerowany histogram Brightfield Gradient Root Mean Square (RMS) obrazu w jasnym polu, a widok populacji w galerii obrazów zostanie ustawiony na wybrany przedział (selected bin) (Rysunek 1B). Klikaj w przedziały, aby określić, gdzie zaczynają się komórki w najlepszej ostrości, a następnie narysuj liniowy obszar, aby wyznaczyć bramkę dla komórek ostrych. Im wyższa wartość Gradient RMS, tym lepsza ostrość. Pomiń następny krok, chyba że chcesz wyznaczyć bramki dla innych barwień.
  8. Zostanie wygenerowany nowy wykres punktowy z intensywnością Kanału 2 na osi x względem Max Pixel Ch2 na osi y (Rysunek 1C). Klikaj w punkty i przeglądaj obrazy, aby pomóc w narysowaniu obszaru wokół komórek pozytywnych pod kątem nanocząsteczek lub bakterii.
  9. Zostaje wygenerowany histogram cechy Internalization z obszarem zaczynającym się od 0, który należy dostosować, obserwując obrazy (Rysunek 1D). Cechą Internalization jest stosunek intensywności wewnątrz komórki do intensywności całej komórki. Jest ona przeskalowana tak, że przy wartości 0 około połowa intensywności znajduje się wewnątrz. Kreator utworzył obszar wyznaczający wnętrze poprzez stworzenie maski, która wykorzystała obraz komórki z kroku 5 do znalezienia powierzchni komórki, a następnie została ona erodowana o 4 piksele. Należy pamiętać, że maskę tę można ręcznie dostosować do różnych typów komórek w razie potrzeby. W tym eksperymencie ręcznie dostosowaliśmy cechę, tworząc najpierw maskę obiektu (Object mask) na obrazie w jasnym polu, a następnie erodowaliśmy ją o 4 piksele. Cechę Internalization obliczono następnie na podstawie tej erodowanej o 4 piksele maski obiektu. Cecha ta pozwala nam odróżnić cząstki i bakterie zinternalizowane, które mają większość sygnału fluorescencyjnego wewnątrz granicy maski, od cząstek i bakterii związanych z powierzchnią, których większość sygnału fluorescencyjnego znajduje się poza granicą maski (Rysunek 2).
  10. Utwórz nowy histogram z nową cechą Internalization opartą na erodowanej masce obiektu. Narysuj obszar, aby wyznaczyć bramkę dla komórek zinternalizowanych, przeglądając obrazy w trybie selected bin. W naszych eksperymentach ustawiliśmy tę bramkę na poziomie 0,3. Komórki z wynikiem niższym niż 0,3 uznano za komórki pozytywne pod kątem cząstek związanych z powierzchnią.
  11. W końcu, aby wyeliminować komórki z tłem i zidentyfikować specyficzne zinternalizowane nanocząstki lub bakterie, użyto funkcji IDEAS Spot Count. Spot count to cecha, która zlicza liczbę składowych spójnych lub małych masek na obrazie. Do zdefiniowania punktów użyto funkcji maskowania Spot, Peak i Intensity. Maska spot znajduje jasne detale na obrazie o określonym przez użytkownika promieniu i progu powyżej lokalnego tła; maska jest następnie dopracowywana poprzez rozdzielenie wysokich intensywności na poszczególne punkty za pomocą funkcji Peak, a następnie uwzględniono punkty o intensywności powyżej 200 counts. Dalsze informacje znajdują się w przewodniku Amnis po maskowaniu punktów (Rysunek 1E). Szablon raportu statystycznego został wygenerowany poprzez uwzględnienie różnych cech w menu Reports.
  12. Plik ten został zapisany jako plik szablonu do późniejszej analizy seryjnej wszystkich plików eksperymentalnych.
  13. W oprogramowaniu IDEAS kliknij Tools→ Batch Data Files i wprowadź wszystkie pliki .rif. Dodaj plik macierzy kompensacji (.ctm) i plik szablonu (.ast) w odpowiednich sekcjach. Prześlij partię do przetworzenia. Po etapie przetwarzania wszystkie pliki .rif zostaną przeanalizowane i dla każdego z oryginalnych plików zostanie wygenerowany plik .daf. Na koniec zostanie wygenerowany plik raportu końcowego ze statystykami dla wszystkich próbek.

Wskazówki i uwagi:

  • Analizę obrazów przeprowadzono przy użyciu oprogramowania IDEAS w wersji 4.0 oraz kreatora Internalization z pewnymi modyfikacjami. Kreator jest samowystarczalny pod kątem instrukcji, a plik wynikowy .daf można wygenerować, postępując zgodnie z wytycznymi kreatora.

7. Reprezentatywne wyniki

Reprezentatywne obrazy na Ryc. 2 wykazują, że MIFC może być skutecznie wykorzystywane do rozróżnienia NP zinternalizowanych (lewy panel) od NP związanych z powierzchnią (prawy panel) (Ryc. 2A) lub Salmonella (Ryc. 2B). Internalizacja NP i Salmonella została ograniczona zarówno poprzez hamowanie aktyny, jak i obniżenie temperatury do 4 °C (Ryc. 3A). Odsetek komórek wykazujących obecność NP związanych z powierzchnią wzrósł z około 8% w 37 °C do ponad 35% po zastosowaniu cytochalazyny D lub obniżeniu temperatury do 4 °C (Ryc. 3B). W przeciwieństwie do tego, odsetek komórek z Salmonella związaną z powierzchnią zmniejszył się z 35% do 15% po zastosowaniu cytochalazyny D. Inkubacja komórek RAW 264.7 z Salmonella w 4 °C zmniejszyła internalizację bez widocznego wzrostu ilości bakterii związanych z powierzchnią w porównaniu z kontrolą w 37 °C. Wspólnie dane te wykazują, że Salmonella i NP są internalizowane w podobnym procesie komórkowym, który wymaga udziału aktyny i jest zależny od temperatury. Co więcej, dane wskazują, że trwałe przyleganie Salmonella do makrofagów wymaga polimeryzacji aktyny.

Schematy analizy komórkowej: sortowanie komórek (A-C), fluorescencja (D-E), obrazy mikroskopowe, wizualizacja danych.
Rysunek 1. Schemat strategii bramkowania wykorzystanej do rozróżnienia nanocząsteczek i bakterii Salmonella zinternalizowanych od tych związanych z powierzchnią. (A) Aby ograniczyć analizę do pojedynczych komórek, ważne jest wyeliminowanie debris oraz zdarzeń wielokomórkowych. Pojedyncze komórki i dublety oddzielono od agregatów wielokomórkowych przy użyciu funkcji IDEAS area (pole) i aspect ratio (stosunek stron) obrazu w jasnym polu (M01). Pole to rozmiar obrazu w mikronach kwadratowych, a stosunek stron to oś mniejsza podzielona przez oś większą, co stanowi miarę kolistości (idealne koło ma stosunek stron równy 1; dublety mają zazwyczaj stosunek stron około 0,5, a agregaty wielokomórkowe zazwyczaj poniżej 0,5). Wyznaczono obszar w celu bramkowania zdarzeń pojedynczych komórek (Krok 6.6). (B) Aby wyselekcjonować komórki będące w ognisku, funkcję IDEAS Gradient RMS obrazu w jasnym polu przedstawiono na histogramie. Funkcja Gradient RMS mierzy ostrość obrazu poprzez wykrywanie zmian wartości pikseli w obrazie. Wyższa wartość Gradient RMS wskazuje na obraz o lepszej ostrości (Krok 6.7). (C) Komórki wykazujące zieloną fluorescencję wyselekcjonowano poprzez bramkowanie komórek o wysokich wartościach Max Pixel oraz Intensity w kanale zielonej fluorescencji (Krok 6.8). (D) Komórki z zinternalizowanymi NP lub Salmonella wybrano poprzez wyselekcjonowanie populacji komórek z wynikiem internalizacji równym lub większym niż 0,3. Komórki z wynikiem mniejszym niż 0,3 uznano za związane z powierzchnią (Krok 6.9). (E) Komórki w bramce „zinternalizowane” poddano dalszej charakterystyce na podstawie liczby plamek (NP lub STM), ponieważ niektóre komórki z barwieniem tła zostały policzone jako zinternalizowane, mimo że wartość plamek dla nich wynosiła zero (Krok 6.11). Dla każdej bramki przedstawiono reprezentatywne obrazy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek.

Wyniki mikroskopii komórkowej, internalizacja NP i Salmonella w porównaniu z wiązaniem powierzchniowym w badaniu fluorescencyjnym.
Rysunek 2. Obrazy komórek z nanocząsteczkami (NP) lub Salmonella zinternalizowanymi oraz związanymi z powierzchnią. (A) Reprezentatywne obrazy komórek RAW 264.7, które zinternalizowały NP (panel lewy) oraz komórek, do których powierzchni NP były przywiązane, ale nie zostały zinternalizowane (panel prawy). (B) Reprezentatywne obrazy komórek RAW 264.7, które zinternalizowały Salmonella (panel lewy) oraz komórek, do których powierzchni Salmonella były przywiązane, ale nie zostały zinternalizowane (panel prawy).

Wykresy słupkowe przedstawiające interakcję nanocząstek z Salmonella, ukazujące internalizację i wiązanie powierzchniowe w różnych temperaturach.
Rycina 3. Traktowanie komórek cytochalazyną-D zahamowało internalizację NP oraz Salmonella. (A) Wstępne traktowanie komórek RAW 264.7 cytochalazyną-D lub inkubacja w 4 °C zmniejszyła częstość internalizacji NP lub Salmonella w porównaniu do komórek RAW 264.7 inkubowanych w pożywce w 37 °C. Komórki RAW 264.7 inkubowane w pożywce zawierającej DMSO (tj. kontrola nośnika) wykazały poziomy internalizacji NP i Salmonella zbliżone do tych obserwowanych w samej pożywce (dane niepokazane). (B) Wstępne traktowanie komórek RAW 264.7 cytochalazyną-D zwiększyło procent komórek z NP związanymi z powierzchnią, jednocześnie zmniejszając procent komórek z Salmonella związanymi z powierzchnią.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Badania wykazały, że biodegradowalne nanocząsteczki oparte na kopolimerze kwasu mlekowego i glikolowego (PLGA) lub polianhydrydach mogą być wykorzystane do dostarczania enkapsulowanych antygenów lub leków do komórek docelowych. Pobieranie tych nanocząsteczek przez komórki fagocytarne jest kluczowe dla ich skuteczności, co sprawia, że ilościowa analiza internalizacji jest krytyczna przy projektowaniu nowych systemów dostarczania nanocząsteczek. Dzięki zastosowaniu tej metody można z łatwością analizować zróżnicowane pobie...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Sherree L. Friend jest zatrudniona w firmie Amnis Corporation, która produkuje system ImageStreamX.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować za wsparcie finansowe w ramach grantu ONR-MURI (NN00014-06-1-1176) oraz U.S. Army Medical Research and Materiel Command (numery grantów W81XWH-09-1-0386 i W81XWH-10-1-0806).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Linia komórkowa RAW 264.7American Type Culture Collection (ATCC)TIB-71
Podłoże DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)Cellgro10-013-CV
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Atlanta BiologicalsS 11150Klasa Premium
GlutamaxGIBCO, by Life Technologies35050-061
HEPESGIBCO, by Life Technologies15630-080
Płytka 24-dołkowaTechno Plastic Products92024
Kolby do hodowli komórkowejTechno Plastic Products90151
Skrobacz do komórekTechno Plastic Products9900224 cm
Salmonella enterica serowar TyphimuriumATCC14028
Elektroporator BTX ECM630 Electro Cell ManipulatorBTX Technologies
MOPSFisher ScientificBP308
Bufor fosforanowy (PBS)Cellgro21-040-CV
Ultradźwiękowy procesor cieczyMisonixS-4000
Cytochalazyna-DSigma-Aldrich,C8273
FormaldehydPolysciences, Inc.04018
Bufor do płukania2% inaktywowana ciepłem FBS, 0,1% azydek sodu w PBS.
Bufor do permeabilizacji i płukaniaBD Biosciences554714
Przezroczyste probówki mikrocentryfugowe z zatrzaskową zakrętkąSigma-AldrichT4816
Alexa Fluor faloidyna 660InvitrogenA22285
ImageStreamXAmnis Corporation100200Opcje: laser 658nm, autopodajnik
Azydek soduFisher ScientificS 227I-500

Bibliografia

  1. Ulery, B. D., Kumar, D., Ramer-Tait, A. E., Metzger, D. W., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B. Design of a protective single-dose intranasal nanoparticle-based vaccine platform for respiratory infectious diseases. PLoS One. 6, e17642(2011).
  2. Kasturi, S. P., Skountzou, I., Albrecht, R. A., Koutsonanos, D., Hua, T., Nakaya, H. I., Ravindran, R., Stewart, S., Alam, M., Kwissa, M., Villinger, F., Murthy, N., Steel, J., Jacob, J., Hogan, R. J., García-Sastre, A., Compans, R., Pulendran, B. Programming the magnitude and persistence of antibody responses with innate immunity. Nature. 470, 543-547 (2011).
  3. Rice-Ficht, A. C., Arenas-Gamboa, A. M., Kahl-McDonagh, M. M., Ficht, T. A. Polymeric particles in vaccine delivery. Curr. Opin. Microbiol. 13, 106-112 (2010).
  4. Jain, J. P., Chitkara, D., Kumar, N. Polyanhydrides as localized drug delivery carrier: an update. Expert. Opin. Drug. Deliv. 5, 889-907 (2008).
  5. Pfeifer, B. A., Burdick, J. A., Little, S. R., Langer, R. Poly(ester-anhydride):poly(beta-amino ester) micro- and nanospheres: DNA encapsulation and cellular transfection. Int. J. Pharm. 304, 210-219 (2005).
  6. Ahmed, F., Friend, S., George, T. C., Barteneva, N., Lieberman, J. Numbers matter: quantitative and dynamic analysis of the formation of an immunological synapse using imaging flow cytometry. J. Immunol. Methods. 347, 79-86 (2009).
  7. Hampton, M. B., Winterbourn, C. C. Methods for quantifying phagocytosis and bacterial killing by human neutrophils. J. Immunol. Methods. 232, 15-22 (1999).
  8. Rieger, A. M., Hall, B. E., Barreda, D. R. Macrophage activation differentially modulates particle binding, phagocytosis and downstream antimicrobial mechanisms. Dev. Comp. Immunol. 34, 1144-1159 (2010).
  9. Murphy, K. C., Campellone, K. G. Lambda Red-mediated recombinogenic engineering of enterohemorrhagic and enteropathogenic E. coli. BMC. Mol. Biol. 4, 11(2003).
  10. Karsi, A., Lawrence, M. L. Broad host range fluorescence and bioluminescence expression vectors for Gram-negative bacteria. Plasmid. 57, 286-295 (2007).
  11. Ulery, B. D., Phanse, Y., Sinha, A., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B., Bellaire, B. H. Polymer chemistry influences monocytic uptake of polyanhydride nanospheres. Pharm. Res. 26, 683-690 (2009).
  12. Doherty, G. J., McMahon, H. T. Mechanisms of endocytosis. Annu. Rev. Biochem. 78, 857-902 (2009).
  13. Vercauteren, D., Vandenbroucke, R. E., Jones, A. T., Rejman, J., Demeester, J., De Smedt, S. C., Sanders, N. N., Braeckmans, K. The use of inhibitors to study endocytic pathways of gene carriers: optimization and pitfalls. Mol. Ther. 18, 561-569 (2010).
  14. Di Marzio, L., Marianecci, C., Cinque, B., Nazzarri, M., Cimini, A. M., Cristiano, L., Cifone, M. G., Alhaique, F., Carafa, M. pH-sensitive non-phospholipid vesicle and macrophage-like cells: binding, uptake and endocytotic pathway. Biochim. Biophys. Acta. 1778, 2749-2756 (2008).
  15. Torres, M. P., Vogel, B. M., Narasimhan, B., Mallapragada, S. K. Synthesis and characterization of novel polyanhydrides with tailored erosion mechanisms. J. Biomed. Mater. Res. A. 76, 102-110 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Multispektralna cytometria przepływowa z obrazowanieminternalizacja nanocząstekfagocytoza bakteryjnainternalizacja zależna od aktynyinhibicja cytochalazyną Dsystem ImageStreamXoprogramowanie analityczne IDEASintensywność sygnału fluorescencyjnegoanaliza rozdzielczości przestrzennejkwantyfikacja cech internalizacji
Analiza internalizacji komórkowej nanocząsteczek i bakterii przy użyciu wielospektralnej obrazującej cytometrii przepływowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.