Artykuł metodologiczny

Aspiracja mikropipetą komórek przytwierdzonych do podłoża w celu oszacowania sztywności komórek

19.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/3886

⸱

27 września 2012

 ,  ,  , 
1Section of Respiratory, Critical Care and Sleep Medicine, Department of Medicine, University of Illinois, 2Institute for Medicine and Engineering, University of Pennsylvania

W tym artykule

Podsumowanie

W niniejszej pracy opisujemy szybką i prostą metodę pomiaru sztywności komórek. Ogólna zasada tego podejścia polega na pomiarze deformacji błony w odpowiedzi na ściśle określone podciśnienie przyłożone do powierzchni komórki za pomocą mikropipety. Metoda ta stanowi potężne narzędzie do badania właściwości biomechanicznych komórek przytwierdzonych do podłoża.

Streszczenie

Coraz więcej badań wykazuje, że właściwości biomechaniczne poszczególnych komórek odgrywają kluczową rolę w wielu funkcjach komórkowych, w tym w proliferacji, różnicowaniu, migracji oraz w oddziaływaniach międzykomórkowych. Dwiema kluczowymi parametrami biomechaniki komórkowej są odkształcalność lub sztywność komórek oraz ich zdolność do skurczu i generowania siły. Opisujemy tutaj szybką i prostą metodę szacowania sztywności komórek poprzez pomiar stopnia odkształcenia błony w odpowiedzi na podciśnienie przyłożone do powierzchni komórki za pomocą szklanej mikropipety; technika ta nazywana jest aspiracją mikropipetową lub mikroaspiracją.

Mikroaspirację przeprowadza się poprzez wyciąganie kapilary szklanej w celu utworzenia mikropipety z bardzo wąską końcówką (średnica 2-50 μm, w zależności od rozmiaru komórki lub próbki tkanki), którą następnie podłącza się do pneumatycznego przetwornika ciśnienia i zbliża do komórki pod mikroskopem. W momencie, gdy końcówka pipety dotyka komórki, za pomocą pneumatycznego przetwornika ciśnienia przykłada się do niej skokowe podciśnienie, generując ściśle określone ciśnienie na błonę komórkową. W odpowiedzi na ciśnienie błona zostaje zassana do wnętrza pipety, a następnie mierzy się postępującą deformację błony lub „projekcję błony” do wnętrza pipety jako funkcję czasu. Podstawową zasadą tego podejścia eksperymentalnego jest to, że stopień deformacji błony w odpowiedzi na określoną siłę mechaniczną jest funkcją sztywności błony. Im sztywniejsza jest błona, tym wolniejsze jest tempo jej deformacji i krótsza jest długość aspiracji w stanie ustalonym. Technikę tę można stosować w odniesieniu do izolowanych komórek (zarówno w zawiesinie, jak i przytwierdzonych do podłoża), dużych organelli oraz liposomów.

Analizę przeprowadza się poprzez porównanie maksymalnych odkształceń błony uzyskanych pod określonym ciśnieniem dla różnych populacji komórek lub warunków eksperymentalnych. „Współczynnik sztywności” szacuje się, wykreślając długość aspiracji odkształcenia błony jako funkcję przyłożonego ciśnienia. Ponadto dane można dalej analizować w celu oszacowania modułu Younga komórek (E), który jest najczęstszym parametrem służącym do charakteryzowania sztywności materiałów. Należy zauważyć, że błony plazmatyczne komórek eukariotycznych można traktować jako system dwuskładnikowy, w którym lipidowa dwuwarstwa błonowa jest podparta przez podbłonkowy cytoszkielet i to właśnie cytoszkielet stanowi rusztowanie mechaniczne błony oraz dominuje w zakresie odkształcalności otoczki komórkowej. Podejście to pozwala zatem na badanie właściwości biomechanicznych podbłonkowego cytoszkieletu.

Protokół

1. Wytwarzanie szklanych mikropipet

Sprzęt: wyciągacz mikropipet, mikrokuźnia.

Szkło: Kapilary z borokrzemianowego szkła (~1,5 mm średnicy zewnętrznej, ~1,4 mm średnicy wewnętrznej).

  1. Mikropipety są wyciągane przy użyciu tej samej podstawowej metody, która jest stosowana do przygotowywania szklanych mikroelektrod do rejestracji elektrofizjologicznych. W skrócie, kapilara szklana jest podgrzewana w środkowej części, a gdy szkło zaczyna topnieć, dwie połowy kapilary są od siebie odciągane, co generuje dwie mikropipety. Dostępnych jest wiele komercyjnych wyciągaczy do przeprowadzenia tego procesu, od stosunkowo prostych wyciągaczy pionowych, które wykorzystują grawitację do rozdzielenia dwóch pipet, po wysoce zaawansowane wyciągacze poziome, oferujące wiele programowalnych opcji zmiany prędkości i innych parametrów wyciągania. W naszych eksperymentach użyto obu typów wyciągaczy.
  2. Wymagania dotyczące geometrii końcówki pipety: Końcówki pipet używanych w tych eksperymentach mają zazwyczaj średnicę zewnętrzną od 2 do 6 μm, w zależności od wielkości komórki. Innym ważnym parametrem jest kształt końcówki, która powinna przypominać rurkę cylindryczną (patrz Rycina 1). Można to osiągnąć poprzez optymalizację parametrów wyciągania i weryfikację kształtu końcówki pod mikroskopem, aż do uzyskania pożądanego efektu. Optymalna długość trzpienia pipety zależy od oczekiwanej wielkości deformacji: jeśli deformacje są niewielkie <10 μm, wystarczy, aby część cylindryczna pipety była również stosunkowo krótka (tego samego rzędu wielkości); w przypadku większych deformacji należy ją odpowiednio dostosować. Generalnie zwiększenie temperatury i/lub zwiększenie siły „wyciągania” (pull) zmniejsza średnicę końcówki. Zwiększenie siły „wyciągania” powoduje również powstanie końcówki z dłuższym stożkiem. W naszych eksperymentach, przy użyciu poziomego wyciągacza pipet Sutter P-97, program zoptymalizowano do następujących parametrów: Heat 473; Pull 22; Velocity 22, Time 200; Pressure 500. Możliwe jest również tworzenie końcówek cylindrycznych poprzez wyciągnięcie bardzo długiego trzpienia, a następnie jego złamanie i wypolerowanie. Szczegółowe instrukcje dotyczące przygotowania różnych typów pipet znajdują się w instrukcji obsługi Sutter.
  3. Mikrokucie (Microforge): Zaleca się również wypolerowanie końcówki pipety w ogniu, aby uzyskać gładką powierzchnię szkła, która zapewni dobre uszczelnienie z błoną plazmatyczną. Odbywa się to poprzez zbliżenie końcówki pipety do rozgrzanej szklanej kuli na ułamek sekundy przy użyciu mikrokuźni (microforge). Podobna technika jest rutynowo stosowana podczas przygotowywania mikroelektrod do rejestracji elektrofizjologicznych.
  4. Napełnianie mikropipety: Mikropipety należy napełnić fizjologicznym roztworem soli, takim jak PBS lub niefluorescencyjne pożywki wzrostowe. Co ważne, roztwór powinien być uzupełniony o 30% surowicy, co umożliwi płynne wsunięcie się błony komórkowej do wnętrza pipety. Aby pozbyć się pęcherzyków powietrza z końcówki pipety, można zastosować dwa podejścia: (i) najpierw zanurzyć końcówkę pipety w roztworze, aby ciecz wypełniła ją dzięki siłom kapilarnym, a następnie napełnić pipetę od drugiego końca lub (ii) napełnić całą pipetę od tylnego końca, delikatnie opukując trzpień pipety, aby usunąć pęcherzyki z końcówki.
  5. Uwaga: Pipety muszą być przygotowane w dniu przeprowadzenia eksperymentu.

2. Przygotowanie komórek

  1. Wysiewanie komórek: Mikroaspirację przeprowadza się na pojedynczych komórkach utrzymywanych w zawiesinie lub przytwierdzonych do podłoża. Aby aspirować komórki w zawiesinie, należy je oddzielić od podłoża i pipetować do płytkiej komory podłużnej, zamontowanej na mikroskopie odwróconym bezpośrednio przed eksperymentem. W przypadku komórek przytwierdzonych do podłoża, wysiewa się je na małe szkiełka nakrywkowe (średnica ~10 mm), które również można umieścić w komorze mikroaspiracyjnej przed eksperymentem. Zastosowanie płytkiej komory podłużnej ma na celu umożliwienie zbliżenia mikropipety do komórek pod bardzo małym kątem, możliwie jak najbliżej poziomu. Pozwala to na wizualizację błony wciągniętej do mikropipety w jednej płaszczyźnie ostrości (patrz Rysunek 2).
  2. Wizualizacja błony komórkowej: Aby obserwować wypustkę błony w pipecie, błony komórkowe barwi się lipofilnym barwnikiem fluorescencyjnym, takim jak diI, stosując standardowy protokół barwienia.
    1. Podgrzać roztwór PBS.
    2. Rozcieńczyć roztwór stokowy diI do stężenia roboczego (5 μM) za pomocą podgrzanego roztworu PBS.
    3. Sonicować przez 5 min w celu rozbicia agregatów barwnika.
    4. Wirować przez 5 min i pobrać nadsącz.
    5. Przemyć komórki w PBS 3 razy, po 5 min każde płukanie.
    6. Inkubować komórki z roztworem barwnika przez 30 min w inkubatorze w temperaturze 37 °C.
    7. Przemyć komórki w PBS 3 razy, po 5 min każde płukanie.
  3. Uwaga: Można zastąpić barwienie błony diI wizualizacją podbłonowego cytoszkieletu, który jest również wciągany wraz z błoną do pipety. Należy jednak wziąć pod uwagę, że zaburzanie cytoszkieletu może zmienić właściwości biomechaniczne komórki. Ponadto, podczas przeprowadzania eksperymentów mikroaspiracyjnych z komórkami przytwierdzonymi do podłoża, zaleca się stosowanie obrazowania 3D w celu oszacowania długości wypustki błony w pipecie, która jest ustawiona pod kątem do płaszczyzny ogniskowej komórek.

3. Mikroaspiracja i pozyskiwanie obrazów

Sprzęt: Odwrócony mikroskop fluorescencyjny, najlepiej z funkcją dekonwolucji 3D (Zeiss Axiovert 200M z komputerowo sterowanym ruchem osi Z obiektywów lub odpowiednik); kamera wideo podłączona do komputera (AxioCam MRm lub odpowiednik), przetwornik ciśnienia (BioTek lub odpowiednik), stół wibroizolacyjny (TMD lub odpowiednik), mikromanipulator (Narishige, Sutter, Burleigh lub odpowiednik; manipulatory mogą być mechaniczne, hydrauliczne lub piezoelektryczne). Należy również podkreślić, że mikroaspirację można przeprowadzić przy użyciu mikroskopu bez funkcji 3D w celu oszacowania sztywności komórek w zawiesinie, takich jak erytrocyty 1,2 lub neutrofile 3, a także izolowanych organelli, takich jak jądra komórkowe 4 lub sztuczne liposomy 5.

Oprogramowanie do akwizycji obrazów: Zeiss AxioVision lub odpowiednik.

  1. Zamocuj komórki w komorze do mikroaspiracji, zgodnie z powyższym opisem, na odwróconym mikroskopie fluorescencyjnym. Ustaw komórki, wybierając jedną z nich do eksperymentu, i umieść ją w centrum pola widzenia. Ważne jest, aby przeprowadzać te eksperymenty w środowisku wolnym od wibracji, szczególnie w przypadku komórek przytwierdzonych do podłoża, ponieważ drobne wibracje, które zazwyczaj występują na blatach i zwykłych stołach, mogą całkowicie uniemożliwić stworzenie uszczelnienia, doprowadzić do złamania końcówki mikropipety lub spowodować znaczne przesunięcia pozycji końcówki, co zafałszuje analizę wyników.
  2. Umieść mikropipetę wypełnioną roztworem PBS/medium z surowicą w uchwycie do pipet podłączonym do przetwornika ciśnienia za pomocą elastycznego przewodu o średnicy dopasowanej do złącza uchwytu pipety w celu zapewnienia szczelnego dopasowania. Na początku każdego eksperymentu ciśnienie w pipecie jest wyrównywane do ciśnienia atmosferycznego. Pipeta jest zamontowana na mikromanipulatorze, który umożliwia precyzyjną kontrolę ruchów pipety w zakresie mikronowym. Ustaw pipetę pod niewielkim kątem względem dna komory i zbliż jej końcówkę do centrum pola widzenia. Trzon pipety, czyli cylindryczna część końcówki pipety, do której aspirowana jest błona, jest wyrównywany poziomo do płaszczyzny ogniskowej poprzez (1) ustawienie pipety pod jak najmniejszym możliwym kątem (10-15°) oraz (2) dociśnięcie trzonu pipety do dna komory. Ponieważ trzon jest bardzo cienki, jest on wystarczająco elastyczny, aby przesuwać się po dnie komory podczas zbliżania się do komórki, co pokazano schematycznie na Rysunku 1. Powoli opuść mikropipetę do boku pojedynczej komórki za pomocą manipulatora grubokrokowe, aż znajdzie się ona w pobliżu płaszczyzny ostrości komórki. Następnie, używając manipulatora precyzyjnego, przesuń mikropipetę do krawędzi komórki, aż końcówka pipety delikatnie dotknie błony. Wykonaj jedno zdjęcie, aby sprawdzić położenie pipety. Dobre uszczelnienie powstaje, gdy cała końcówka pipety w pełni styka się z powierzchnią komórki i kontakt ten jest stabilny. Nie istnieje jednak silne obiektywne kryterium oceny jakości uszczelnienia poza badaniem wizualnym.
  3. Zastosuj skokowe ciśnienie ujemne za pomocą przetwornika i utrzymuj je do czasu stabilizacji projekcji błony. Ilość ciśnienia potrzebna do aspiracji błony do pipety różni się w zależności od typu komórki i konkretnych warunków eksperymentalnych. W naszych eksperymentach początkową deformację zazwyczaj obserwuje się przy zastosowaniu ciśnienia w zakresie od -2 do -15mm Hg. Po przyłożeniu ciśnienia błona jest stopniowo deformowana do wnętrza pipety, aż ustabilizuje się na określonej długości; proces ten trwa zazwyczaj 2-3 min. W tym czasie obrazy deformacji błony są rejestrowane co 30 sec, aby śledzić postęp wciągania błony do pipety.
  4. Zwiększaj ciśnienie do kolejnego poziomu w krokach 2-5 mm Hg i powtarzaj całą procedurę, aż projekcja błony oddzieli się od komórki i przemieści do wnętrza pipety, w którym momencie eksperyment zostaje przerwany.

4. Analiza

Aby określić stopień deformacji błony, mierzy się długość aspiracji (L) od końcówki pipety do wierzchołka obwodu wypukłości błony. Należy jednak zauważyć, że większa pipeta wywrze większą siłę na błonę komórkową przy tym samym poziomie ciśnienia. Aby uwzględnić zmienność średnic pipet, długość aspiracji jest zatem normalizowana względem średnicy pipety (D) zmierzonej dla każdego eksperymentu.

Dane można poddać dalszej analizie z wykorzystaniem standardowego liniowego modelu wiskoelastycznej półprzestrzeni komórki śródbłonka, zgodnie z opisem w poprzednich badaniach 6,7. W szczególności moduł sprężystości komórek oszacowano za pomocą równania:

Równanie dynamiki płynów dla przewodności hydraulicznej, wzór E=(3aΔp)/(2πl)φ(η), schemat wzoru.

gdzie E jest modułem Younga, a jest promieniem wewnętrznym pipety, Δp jest różnicą ciśnień, L jest odpowiadająca temu długość aspiracji, a φ(η) funkcja ścianki jest obliczana przy użyciu modelu sił, zgodnie z opisem Theret i wsp. 7Ważne jest, aby zauważyć, że do analizy danych z mikroaspiracji wykorzystano wiele modeli, w tym model elementów skończonych, który zakłada, że komórka jest odkształcalną sferą o izotropowych i jednorodnych właściwościach materiałowych, oraz modele kropli cieczy, które zakładają, że komórki przyjmują kształt sferyczny, mogą ulegać ciągłemu odkształceniu i powracają do pierwotnej formy po zwolnieniu, co zostało opisane w kilku znakomitych przeglądach literatury: 8-10Mikroaspirację można również wykorzystać do badania innych parametrów biomechanicznych komórek i tkanek, takich jak właściwości lepkosprężyste komórek, napięcie kory oraz wpływ różnych elementów strukturalnych na biomechanikę komórek i tkanek (więcej informacji znajduje się w powyższych przeglądach literatury).

5. Reprezentatywne wyniki

W poprzednich badaniach aspiracja mikropipetą była przeprowadzana albo na liposomach 5, albo na komórkach nieprzytwierdzonych do podłoża 2,11-13. W naszych badaniach komórki są jednak zazwyczaj utrzymywane w stanie przytwierdzenia do podłoża, aby uniknąć zmian w strukturze cytoszkieletu, które prawdopodobnie występują podczas odrywania się komórek 14-16. Aby zwalidować zastosowanie techniki mikroaspiracji dla komórek przytwierdzonych do podłoża, zbadaliśmy, czy zaburzenie aktyny F prowadzi do zmniejszenia sztywności komórek śródbłonka aorty bydlęcej (BAECs), ocenianej za pomocą tej metody. Rysunek 3 pokazuje, że zgodnie z oczekiwaniami tak właśnie jest. W szczególności Rysunek 3A przedstawia typową serię obrazów fluorescencyjnych błony śródbłonka podlegającej progresywnej deformacji w odpowiedzi na podciśnienie przyłożone za pomocą mikropipety. Zgodnie z oczekiwaniami, błona jest stopniowo aspirowana do pipety, a długość aspiracji zwiększa się w funkcji przyłożonego ciśnienia. Przebiegi czasowe deformacji wykazują, że zaburzenie aktyny F znacząco zwiększa długość aspiracji wypustek we wszystkich warunkach ciśnieniowych (Rysunek 3B) 14.

Stosując to podejście, odkryliśmy, że sztywność komórek wzrasta, gdy błony komórkowe są pozbawione cholesterolu, podczas gdy wzbogacenie w cholesterol nie miało żadnego wpływu 14. Rycina 4 przedstawia komórkę wzbogaconą w cholesterol, komórkę kontrolną oraz komórkę pozbawioną cholesterolu po osiągnięciu maksymalnych długości aspiracji przy -15 mm Hg (4A). Projekcje zazwyczaj zaczynały rozwijać się przy -10 mmHg, a przebieg czasowy deformacji błony można było zmierzyć dla ujemnych ciśnień -10, -15 i -20 mm Hg (4B). Przyłożenie ciśnień powyżej -25 mmHg prowadziło do oddzielenia aspirowanej projekcji, co skutkowało powstaniem osobnego pęcherzyka. Poziom ciśnienia prowadzący do oddzielenia błony był podobny w różnych warunkach stężenia cholesterolu. Obserwacja ta była całkowicie nieoczekiwana, ponieważ wcześniejsze badania wykazały, że w lipidowych dwuwarstwach błonowych wzrost zawartości cholesterolu zwiększa sztywność błony 5,17. Nasze dalsze badania potwierdziły te obserwacje przy użyciu kilku niezależnych metod, w tym mikroskopii sił atomowych (AFM) 18,19 oraz mikroskopii trakcyjnej 20.

Schemat układu optycznego, schemat drogi wiązki; ED=2b, D=2a; konfiguracja zbieżności światła.
Rysunek 1. Schematyczny widok z boku pipety rejestrującej. Pipeta jest wyciągana w celu utworzenia cylindrycznego trzonu na końcówce (widok z boku). Parametry mikropipety: D=2a=średnica wewnętrzna oraz ED=2b=średnica zewnętrzna.

Proces iniekcji komórkowej w mikroskopii, schemat i obrazy przedstawiają kąt igły, penetrację komórki, analizę fluorescencyjną.
Rycina 2. Mikropipeta zbliżająca się do komórki przytwierdzonej do podłoża. (A) Schematyczny widok z boku; (B) Obraz w kontraście jasnym przedstawiający trzon mikropipety dotykający komórki o typowym kształcie, wykorzystanej w eksperymentach z aspiracją; (C) Obraz fluorescencyjny tej samej komórki znakowanej DiIC18. Mikropipeta jest nadal obecna, ale niewidoczna (Z 14).

Obrazy deformacji komórek pod różnym ciśnieniem; Latrunculina A, kontrola; wykres parametrów deformacji.
Rycina 3. Walidacja pomiaru sztywności komórek przytwierdzonych do podłoża z wykorzystaniem mikroaspiracji. A: Obrazy progresywnej deformacji błony BAECs w warunkach kontrolnych oraz po ekspozycji na latrunkulinę. Pipeta jest niewidoczna na obrazach, ponieważ nie fluorescuje. Komórki poddano działaniu 2 μM latrunculiny A przez 10 min, co drastycznie zmniejszyło ilość F-aktyny, co zmierzono za pomocą fluorescencji rodaminy-falloidyny (nie pokazano), lecz nie miało istotnego wpływu na kształt komórek. W komórce traktowanej latrunkulina występuje zwężenie błony w środku aspirowanego wypustu, jednak wypust pozostaje przytwierdzony do komórki. B. Wpływ latrunculiny A na przebieg czasowy deformacji błony, gdzie L to aspirowana długość wypustu błony, a D to średnica pipety dla komórek kontrolnych (n=14) i komórek eksponowanych na 2 μM latrunculiny A przez 10 min (n=5). Komórki aspirowano pod ciśnieniem -10 mm Hg (romby), -15 mm Hg (kwadraty) i -20 mm Hg (trójkąty). (Z 14.)

Analiza dynamiki przepływu; obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej; wykresy L/D w funkcji czasu i ciśnienia.
Rycina 4. Wpływ komórkowego poziomu cholesterolu na deformację błony BAEC. A. Typowe obrazy deformacji błony w komórkach wzbogaconych w cholesterol, pozbawionych cholesterolu oraz w komórkach kontrolnych (komórki kontrolne wystawiono na mieszaninę MβCD:MβCD-cholesterol w stosunku 1:1, co nie miało wpływu na poziom wolnego cholesterolu w komórkach (patrz wstawka). Przedstawione obrazy ukazują maksymalną deformację przy -15 mm Hg. Strzałka wskazuje położenie aspirowanego wypustka. Pasek skali to 30 μm. B. Średnie przebiegi czasowe długości aspiracji dla trzech badanych populacji komórek. C. Maksymalne długości aspiracji przedstawione jako funkcja przyłożonego ciśnienia. Maksymalna znormalizowana długość w komórkach pozbawionych cholesterolu była istotnie niższa niż w komórkach kontrolnych dla ciśnień -15 mm Hg i -20 mm Hg (P < 0.05). (Z 14.)

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Mikroaspiracja stanowi prostą i wysoce powtarzalną metodę szacowania sztywności/odkształcalności komórek poprzez przyłożenie ujemnego ciśnienia do błony komórkowej i pomiar odkształcalności błony w odpowiedzi na ściśle określone ciśnienie. Metoda ta została opracowana po raz pierwszy przez Mitchisona i Swanna (1954), aby scharakteryzować właściwości elastyczne jaj jeżowca w celu uzyskania informacji o mechanizmach podziału komórkowego 21, a następnie do badania właściwości mechanicznych erytrocytów 1

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
wyciągacz pipet SutterSutter InstrumentsP-97
MicroforgeNarishigeMF-830
Odwrócony mikroskop fluorescencyjnyZeissAxiovert 200MMikroskop powinien być najlepiej wyposażony w funkcje 3D/dekonwolucji.
Kamera wideoZeissAxioCam MRm
Oprogramowanie do akwizycji obrazuZeissAxioVision
Przetwornik ciśnienia pneumatycznegoBioTekDPM-1BTester przetworników pneumatycznych DPM1B jest obecnie dostępny w ofercie firmy FLUKE.
Pipeta szklanaRichlandSzkło niestandardowePipety zostały wykonane na zamówienie z wewnętrzną średnicą 1,2 i zewnętrzną średnicą 1,6.
Barwnik DiIInvitrogenD282Dobrze rozpuszcza się w DMSO

Bibliografia

  1. Rand, R. P., Burton, A. C. Mechanical properties of the red cell membrane. I. Membrane stiffness and intracellular pressure. Biophys. J. 4, 115-135 (1964).
  2. Discher, D. E., Mohandas, N., Evans, E. A. Molecular maps of red cell deformation: hidden elasticity and in situ connectivity. Science. 266, 1032-1035 (1994).
  3. Schmid-Schönbein, G. W., Sung, K. L., Tözeren, H., Skalak, R., Chien, S. Passive mechanical properties of human leukocytes. Biophys. J. 36, 243-256 (1981).
  4. Guilak, F., Tedrow, J. R., Burgkart, R. Viscoelastic properties of the cell nucleus. Biochem. Biophys. Re.s Commun. 269, 781-786 (2000).
  5. Needham, D., Nunn, R. S. Elastic deformation and failure of lipid bilayer membranes containing cholesterol. Biophys. J. 58, 997-1009 (1990).
  6. Sato, M., Theret, D. P., Wheeler, L. T., Ohshima, N., Nerem, R. M. Application of the micropipette technique to the measurement of cultured porcine aortic endothelial cell viscoelastic properties. Journal of Biomechanical Engineering. 112, 263-268 (1990).
  7. Theret, D. P., Levesque, M. J., Sato, F., Nerem, R. M., Wheeler, L. T. The application of a homogeneous half-space model in the analysis of endothelial cell micropipette measurements. J. of Biomechanical Engineering. 110, 190-199 (1988).
  8. Hochmuth, R. M. Micropipette aspiration of living cells. J. Biomech. 33, 15-22 (2000).
  9. Lim, C. T., Zhou, E. H., Quek, S. T. Mechanical models for living cells--a review. Journal of Biomechanics. 39, 195(2006).
  10. Zhao, R., Wyss, K., Simmons, C. A. Comparison of analytical and inverse finite element approaches to estimate cell viscoelastic properties by micropipette aspiration. Journal of Biomechanics. 42, 2768(2009).
  11. Chien, S., Sung, K. L., Skalak, R., Usami, S., Tozeren, A. Theoretical and experimental studies on viscoelastic properties of erythrocyte membrane. Biophys. J. 24, 463-487 (1978).
  12. Evans, E., Kuhan, B. Passive material behavior of granulocytes based on large deformation and recovery after deformation tests. Blood. 64, 1028-1035 (1984).
  13. Sato, M., Levesque, M. J., Nerem, R. M. Micropipette aspiration of cultured bovine aortic endothelial cells exposed to shear stress. Arteriosclerosis. 7, 276-286 (1987).
  14. Byfield, F., Aranda-Aspinoza, H., Romanenko, V. G., Rothblat, G. H., Levitan, I. Cholesterol depletion increases membrane stiffness of aortic endothelial cells. Biophys. J. 87, 3336-3343 (2004).
  15. Byfield, F. J., Hoffman, B. D., Romanenko, V. G., Fang, Y., Crocker, J. C., Levitan, I. Evidence for the role of cell stiffness in modulation of volume-regulated anion channels. Acta. Physiologica. 187, 285-294 (2006).
  16. Byfield, F. J., Reen, R. K., Shentu, T. -P., Levitan, I., Gooch, K. J. Endothelial actin and cell stiffness is modulated by substrate stiffness in 2D and 3D. Journal of Biomechanics. 42, 1114(2009).
  17. Evans, E., Needham, D. Physical properties of surfactant bilayer membranes: thermal transitions, elasticity, rigidity, cohesion and colloidal interactions. Journal of Physical Chemistry. 91, 4219-4228 (1987).
  18. Sun, M., Northup, N., Marga, F., Huber, T., Byfield, F. J., Levitan, I., Forgacs, G. The effect of cellular cholesterol on membrane-cytoskeleton adhesion. J. Cell. Sci. 120, 2223-2231 (2007).
  19. Shentu, T. P., Titushkin, I., Singh, D. K., Gooch, K. J., Subbaiah, P. V., Cho, M., Levitan, I. oxLDL-induced decrease in lipid order of membrane domains is inversely correlated with endothelial stiffness and network formation. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 299, 218-229 (2010).
  20. Norman, L. L., Oetama, R. J., Dembo, M., Byfield, F., Hammer, D. A., Levitan, I., Aranda-Espinoza, H. Modification of Cellular Cholesterol Content Affects Traction Force, Adhesion and Cell Spreading. Cell Mol. Bioeng. 3, 151-162 (2010).
  21. Mitchinson, J. M., Swann, M. M. The Mechanical Properties of the Cell Surface: I. The Cell Elastimeter. J. of Experimental Biology. 31, 443-460 (1954).
  22. Byfield, F. J., Tikku, S., Rothblat, G. H., Gooch, K. J., Levitan, I. OxLDL increases endothelial stiffness, force generation, and network formation. J. Lipid Res. 47, 715-723 (2006).
  23. Ohashi, T., Ishii, Y., Ishikawa, Y., Matsumoto, T., Sato, M. Experimental and numerical analyses of local mechanical properties measured by atomic force microscopy for sheared endothelial cells. Biomed. Mater. Eng. 12, 319-327 (2002).
  24. Solon, J., Levental, I., Sengupta, K., Georges, P. C., Janmey, P. A. Fibroblast adaptation and stiffness matching to soft elastic substrates. Biophysical Journal. 93, 4453(2007).
  25. Kowalsky, G. B., Byfield, F. J., Levitan, I. oxLDL facilitates flow-induced realignment of aortic endothelial cells. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 295, 332-340 (2008).
  26. Ketene, A. N., Schmelz, E. M., Roberts, P. C., Agah, M. The effects of cancer progression on the viscoelasticity of ovarian cell cytoskeleton structures. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. , Forthcoming (2011).
  27. Kole, T. P., Tseng, Y., Huang, L., Katz, J. L., Wirtz, D. Rho kinase regulates the intracellular micromechanical response of adherent cells to rho activation. Mol. Biol. Cell. 15, 3475-3484 (2004).
  28. Hall, A. Rho GTPases and the Actin Cytoskeleton. Science. 279, 509-514 (1998).
  29. Okajima, T. Atomic Force Microscopy for the Examination of Single Cell Rheology. In. Methods Mol. Biol. 736, 303-329 (2011).
  30. Wang, N., Butler, J. P., Ingber, D. E. Mechanotransduction across the cell surface and through the cytoskeleton. Science. 260, 1124-1127 (1993).
  31. Fabry, B., Maksym, G. N., Butler, J. P., Glogauer, M., Navajas, D., Fredberg, J. J. Scaling the microrheology of living cells. Physical Review Letters. 87, 148102(2001).
  32. Park, C. Y., Tambe, D., Alencar, A. M., Trepat, X., Zhou, E. H., Millet, E., Butler, J. P., Fredberg, J. J. Mapping the cytoskeletal prestress. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 298, C1245-C1252 (2010).
  33. Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. Traction force microscopy of migrating normal and H-ras transformed 3T3 fibroblasts. Biophys. J. 80, 1744-1757 (2001).
  34. Wirtz, D. Particle-tracking microrheology of living cells: principles and applications. Annu. Rev. Biophys. 38, 301-326 (2009).
  35. Shin, D., Athanasiou, K. Cytoindentation for obtaining cell biomechanical properties. J. Orthop. Res. 17, 880-890 (1999).
  36. Ou-Yang, H. D., Wei, M. T. Complex fluids: probing mechanical properties of biological systems with optical tweezers. Annu. Rev. Phys. Chem. 61, 421-440 (2010).
  37. Hosu, B. G., Sun, M., Marga, F., Grandbois, M., Forgacs, G. Eukaryotic membrane tethers revisited using magnetic tweezers. Phys. Biol. 4, 67-78 (2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Deformacja b onyprzetwornik ci nieniaszklana mikropipetamikroskopia fluorescencyjnanaczyniowe kom rki r db onkamechanika cytoszkieletumodu Youngausuwanie cholesterolu

Powiązane artykuły