Metoda krok po kroku rekonstytucji transportera ABC w cząsteczkach lipidowych Nanodisc

Podsumowanie

Nanodyski to małe dyskoidalne cząstki, które zawierają białka błonowe w małym fragmencie dwuwarstwy fosfolipidowej. Udostępniamy protokół wizualny, który pokazuje krok po kroku wbudowywanie transportera MalFGK2 w dysk.

Streszczenie

Nanodysk to dyskoidalna cząstka (~ 10-12 nm duża), która więzi białka błonowe w małym fragmencie dwuwarstwy fosfolipidowej. Nanodysk jest szczególnie atrakcyjną opcją do badania białek błonowych, zwłaszcza w kontekście interakcji ligand-receptor. Metoda zapoczątkowana przez Sligara i współpracowników opiera się na właściwościach amfipatycznych zmodyfikowanego białka rusztowania wysoce a-helisalnego pochodzącego z apolipoproteiny A1. Hydrofobowe powierzchnie białka rusztowania oddziałują z tłuszczowymi acylowymi łańcuchami bocznymi dwuwarstwy lipidowej, podczas gdy obszary polarne są zwrócone w stronę środowiska wodnego. Analizy białek błonowych w nanodyskach mają znaczącą przewagę nad liposomami, ponieważ cząsteczki są małe, jednorodne i rozpuszczalne w wodzie. Ponadto można zastosować metody biochemiczne i biofizyczne zwykle zarezerwowane dla białek rozpuszczalnych i to z obu stron błony. W tym protokole wizualnym przedstawiamy krok po kroku rekonstrukcję dobrze scharakteryzowanego bakteryjnego transportera ABC, kompleksu MalE-MalFGK₂. Formowanie się krążka jest procesem samoorganizacji, który zależy od oddziaływań hydrofobowych zachodzących podczas stopniowego usuwania detergentu. Opisujemy podstawowe kroki i podkreślamy znaczenie wyboru prawidłowego stosunku białka do lipidów w celu ograniczenia tworzenia się agregatów i większych polidyspersyjnych cząstek podobnych do liposomów. Proste kontrole jakości, takie jak chromatografia z filtracją żelową, natywna elektroforeza żelowa i spektroskopia dynamicznego rozpraszania światła, zapewniają, że krążki zostały prawidłowo odtworzone.

Protokół

Ogólny proces rekonstytucji

Proces rekonstytucji rozpoczyna się od zmieszania białka rusztowania błony (MSP) z oczyszczonym kompleksem MalFGK₂ w obecności fosfolipidów solubilizowanych detergentem. Następnie następuje powolne usuwanie detergentu za pomocą adsorbentu z polistyrenu, zwanego Bio-Beads lub Amberlite (Rysunek 1). Proces samorzutnego montażu zachodzi najprawdopodobniej w wyniku oddziaływań apolarnych między hydrofobowymi fosfolipidami, kompleksem MalFGK₂ a powierzchnią amfipatycznego białka MSP. Produktem końcowym jest cząstka dyskoidalna składająca się z dwóch cząsteczek MSP otaczających kompleks MalFGK₂. Cząstki są oddzielane od adduktów i agregatów za pomocą ultrawirowania oraz analitycznej chromatografii wykluczania rozmiarów. Cząstki są charakteryzowane za pomocą natywnej elektroforezy w żelu oraz spektroskopii dynamicznego rozpraszania światła.

1. Przygotowanie białka rusztowania błonowego, MSP

1. MSP z tagiem histydynowym (wersja MSP1D1¹) jest produkowana z plazmidu pMSP1D1 w szczepie E. coli BL21 (DE3) indukowanym przy OD₆₀₀~0,5 za pomocą 0,5 mM izopropyl-β-D-1-tiogalaktopiranozydu przez 3 h w 37 °C.
2. Komórki są zbierane przez wirowanie przy 5 000 x g przez 10 min w 4 °C i resuspendowane w buforze TSG10 zawierającym 100 μM fluorku fenylometanosulfonylu.
3. Komórki są lizowane w prasie francuskiej (3x) pod ciśnieniem 8 000 psi, a materiał nierozpuszczalny jest usuwany przez wirowanie przy 5 000 x g przez 10 min w 4 °C. Frakcja rozpuszczalna zawierająca MSP jest izolowana przez ultrawirowanie przy 125 000 x g przez 45 min.
4. MSP jest oczyszczane metodą chromatografii z wykorzystaniem chelatu niklu przy użyciu ~1,5 ml Ni Sepharose HP w buforze TSG10. Zanieczyszczenia są wypłukiwane buforem TSG10 zawierającym 50 mM imidazolu. MSP jest eluowane buforem TSG10 zawierającym 600 mM imidazolu. Oczyszczone białko jest dializowane w buforze TSG10 i przechowywane w -70 °C przy stężeniu białka ~10-15 mg/ml.

2. Przygotowanie kompleksu MalFGK₂

1. Kompleks MalFGK₂, z tagiem His na C-końcu MalK, jest ekspresowany z plazmidu pBAD22-FGK w E. coli BL21 (DE3) i indukowany przy OD₆₀₀~0,5 za pomocą 0,2% L-arabinozy przez 3 h w 37 °C.
2. Po lizie komórek i wirowaniu zgodnie z krokiem 1.3, osad błonowy zawiesza się w buforze TSG20 do końcowego stężenia 5 mg/ml. Materiał jest solubilizowany przy użyciu 1% w/v n-dodecyl-β-maltopiranozyd (DDM) przez 3 h w 4 °C przy łagodnym wytrząsaniu.
3. Materiał nierozpuszczalny jest usuwany poprzez ultrawirowanie zgodnie z krokiem 1.3, a supernatant zawierający solubilizowany kompleks MalFGK₂ jest zbierany i oczyszczany zgodnie z krokiem 1.4, jednak bez dializy.
4. Dalsze oczyszczanie przeprowadza się za pomocą chromatografii żelowej w buforze TSGD na kolumnie Superdex 200 HR 10/300 przy szybkości przepływu 0,5 ml/min.

3. Przygotowanie fosfolipidów

1. Wyekstrahowane całkowite lipidy E. coli rozpuszczone w chloroformie dzieli się na alikwoty po 1 000 nmol w probówkach do mikrocentryfugi z nakrętką. Rozpuszczalnik odparowuje się pod delikatnym strumieniem azotu, a następnie dodatkowo suszy przez noc w eksykatorze próżniowym.
2. Film lipidowy rozpuszcza się w buforze TS do końcowego stężenia 5 nM, a następnie intensywnie miesza na wortexie i poddaje sonikacji. Rozpuszczone lipidy będą lekko mętne ze względu na ich ogólną nierozpuszczalność w wodnym buforze TS, jednak powinny pozostać w zawiesinie. Dodaje się DDM do końcowego stężenia 0,5% (~10 mM), po czym roztwór staje się klarowny.
3. Mieszaninę lipidową umieszcza się w łaźni wodnej i poddaje sonikacji impulsowej 5 razy po około 5 s. Mieszaninę lipidową przechowuje się w temperaturze 4 °C przez maksymalnie 1 tydzień.

4. Przygotowanie Bio-Beads

1. Do probówki o pojemności 50 ml wsypuje się około 10-15 ml (objętość sypka) Bio-Beads.
2. Kuleczki płucze się kolejno 50 ml 100% metanolu, 95% etanolu, wody milliQ H₂O, a na koniec buforem TS (każdym z nich po dwa razy).
3. Wypłukane kuleczki przechowuje się w temperaturze 4 °C w ~10 ml buforu TS.

5. Rekonstytucja nanodysków

1. MSP rozcieńcza się w buforze TSGD do końcowego stężenia ~7 mg/ml (~0,3 mM).
2. ~2 nmol oczyszczonego kompleksu MalFGK₂ miesza się w stosunku białko:MSP:lipid 1:3:60 lub 1:3:400 w buforze TSGD. Końcowe stężenia wynoszą 6 μM MalFGK₂, 18 μM MSP i 360 μM lipidów (1:3:60) lub 2,4 mM lipidów (1:3:400). Końcowa objętość wynosi 300 μl. Końcowe stężenie DDM wynosi 0,08% (~1,6 mM). Końcowe stężenie glicerolu zależy od ilości dodanych lipidów, ale utrzymuje się na poziomie około 5-10% v/v.
3. Do probówki dodaje się ~50 μl zawiesiny Bio-Beads, a mieszaninę inkubuje się przez noc na stole kołyszącym w temperaturze 4 °C.
4. Kuleczki osadza się grawitacyjnie, a roztwór odpipetowuje za pomocą wąskiej końcówki, aby uniknąć pobrania jak największej liczby kuleczek Bio-Beads.
5. Duże osady usuwa się za pomocą ultrawirowania przy 100 000 x g przez 20 min. Dyski oczyszcza się metodą chromatografii filtracyjnej zgodnie z krokiem 2.4 w buforze TSG10. Frakcje zawierające dyski łączy się, a alikwot należy ponownie wprowadzić na tę samą kolumnę do filtracji żelowej w celu sprawdzenia stabilności preparatu.
6. Oczyszczone dyski można przechowywać w temperaturze -70 °C przez dłuższy czas. Po rozmrożeniu na lodzie dyski należy poddać ultrawirowaniu zgodnie z krokiem 5.5 w celu usunięcia potencjalnych osadów. Alikwot należy przeanalizować za pomocą chromatografii filtracyjnej, aby upewnić się, że podczas procesu rozmrażania nie doszło do znacznej agregacji lub precypitacji.

6. Elektroforeza w żelu natywnym

1. Nanodyski o stężeniu 1 μM (~0.2 mg/ml) analizuje się za pomocą natywnego PAGE^{6, 7} (Tris-HCl pH 8.8, 4-12%), aby ocenić jakość rekonstytucji (Rycina 3A).
2. Wiązanie MalE (1 μM) z kompleksem MalFGK₂ rekonstytuowanym w nanodyskach jest również oceniane za pomocą natywnego PAGE (Rycina 3A).
3. Po elektroforezie żel barwi się błękitem Coomassie przez 10 min, a następnie odbarwia przez ~1 hr.

7. Dynamiczne rozpraszanie światła (DLS)

1. Nanodyski oczyszcza się metodą chromatografii filtracyjnej żelowej, analogicznie do kroku 2.4, w buforze TSG10 przy użyciu kolumny Superdex 200 HR 10/300 i szybkości przepływu 0.1 ml/min. Frakcje zawierające nanodyski są łączone i zagęszczane do stężenia ~10 mg/ml za pomocą wirówkowego filtra Amicon.
2. Przed analizą metodą DLS próbkę filtruje się dwukrotnie (filtr 0.22 μm), a następnie analizuje za pomocą instrumentu DynaPro nanostar (Wyatt Technology) w kuwecie kwarcowej o objętości wewnętrznej 1 μl. Dane są dopasowywane przy użyciu oprogramowania DYNAMICS (Wyatt Technology) w celu oszacowania średnicy oraz masy cząsteczkowej cząstek.

8. Pomiary aktywności ATPase

1. Aktywność ATPase nanodysków zrekonstytuowanych z MalFGK₂ jest określana za pomocą testu kolorymetrycznego⁸.
2. 1 μM oczyszczonych dysków i 1 mM ATP miesza się z rosnącymi ilościami MalE i inkubuje w temperaturze 37 °C przez 20 min. Uwalnianie fosforanu nieorganicznego mierzy się przy 660 nm.
3. Ilość uwolnionego fosforanu porównuje się z krzywą wzorcową wygenerowaną przy użyciu roztworu wzorcowego fosforu.

9. Reprezentatywne wyniki

Nanodyski są oczyszczane za pomocą chromatografii filtracyjnej żelowej (Ryc. 2A, lewo). Chromatogram wykazuje, że większość zrekonstytuowanych dysków (linia czarna) eluje jako pojedynczy pik, podczas gdy dyski otrzymane z nadmiarem lipidów (linia czerwona) eluują w objętości martwej oraz jako seria szerokich pików. Jakość nanodysków jest następnie analizowana za pomocą natywnej elektroforezy w żelu oraz spektroskopii dynamicznego rozpraszania światła (DLS). Prawidłowo zrekonstytuowane dyski migrują jako ostry prążek w żelu, natomiast te zrekonstytuowane w obecności nadmiaru lipidów migrują w formie rozmycia (Ryc. 2A, prawo). Analiza DLS wykazuje, że populacja dysków jest jednorodna, ze średnią średnicą 11,4 nm (Ryc. 2B). Zrekonstytuowane dyski mają pozorną masę cząsteczkową 215 kDa na podstawie przybliżenia DLS. Próbki zrekonstytuowane w obecności nadmiaru lipidów wykazują szeroki rozkład promieni wokół 100 nm, co jest typowe dla próbek niejednorodnych.

Jakość kompleksu MalFGK₂ jest oceniana za pomocą natywnej elektroforezy w żelu, a jego aktywność poprzez pomiary aktywności ATPase (Rysunek 3). Białko wiążące maltozę MalE wiąże się z wysokim powinowactwem do transportera MalFGK₂^{9, 10}. Dzięki zastosowaniu niedenaturującej elektroforezy żelowej możliwe jest wykrycie kompleksu między MalE a MalFGK₂ (Rysunek 3A). Stymulacja aktywności ATPase MalK₂ przez MalE została przedstawiona na Rysunku 3B.

Rysunek 1. Typowy schemat blokowy protokołu rekonstytucji.

Rycina 2. Kontrola jakości preparatu nanodysków. A. Analiza filtracji żelowej (kolumna Superdex 200 HR 10/300) nanodysków zrekonstytuowanych przy niskim stosunku lipidów (1/3/60; linia czarna) lub wysokim stosunku lipidów (1/3/400; linia czerwona). Natywna elektroforeza w żelu tych samych preparatów dysków. Oznaczono markery masy cząsteczkowej w kDa. B. Analiza dynamicznego rozpraszania światła tych samych preparatów dysków. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinę.

Rycina 3. Analiza cząsteczek MalFGK₂-nanodisc. A. Analiza przesunięcia w żelu dla MalE inkubowanego z rosnącymi ilościami cząsteczek MalFGK₂-nanodisc. B. Aktywność ATPase cząsteczek MalFGK₂-nanodisc w funkcji stężenia MalE.

Dyskusja

Opisujemy prostą procedurę rekonstytucji transportera maltozy do nanodysków. Transporter jest aktywny w ATPazie, a interakcja z rozpuszczalnym partnerem wiążącym MalE może zostać odtworzona (Figura 3). Udana rekonstytucja transportera w nanodyskach otwiera drogę do dodatkowych analiz biofizycznych i biochemicznych. Szczególnie interesująca będzie systematyczna analiza aktywności ATPazy MalK i transportu maltozy w detergentach, liposomach i nanodyskach. Transportery ABC zmieniają konformacje podczas c...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Filtr odśrodkowy Amicon Ultra-4 50K	Millipore	UFC805008	Postępuj zgodnie z protokołem producenta w celu prawidłowego użycia
Bio-Beads SM-2 Adsorbent	Bio-Rad	152-3920
E. coli lipidy całkowite	Avanti Polar Lipids	100500C	Rozpuszczony w chloroformie, obchodzić się z rozpuszczalnikiem organicznym
Sefaroza ni żywica HP	GE Opieka zdrowotna	17-5268-01
Roztwór wzorcowy fosforu	Sigma-Aldrich	P3869
pMSP1D1	Addgene	20061
Superdex 200 HR 10/300	GE Healthcare	17-5172-01
Tabela I. Określone odczynniki.
Name Kompozycja Komentarze DDM stock 10% w/v DDM Zawiesić w miliQ wodzie i przechowywać w temperaturze -20 ° C MalFGK2 stock 1-2 mg/ml 50 mM Tris-HCl, pH 7,9 100 mM NaCl 10% v/v glicerol 0,03% w/v DDM Przechowywać w temperaturze -70 &; C po oczyszczeniu MSP stock 10-15 mg/ml 50 mM Tris-HCl, pH 7,9 100 mM NaCl 10% v/v glicerolu Przechowywać w temperaturze -70 ° C po oczyszczeniu w < 1 ml podwielokrotności i unikać nadmiernych cykli zamrażania/rozmrażania Fosfolipid stock 5 nM E. coli total lipids 0,5% w/v (10 mM) DDM 50 mM Tris-HCl, pH 7,9 50 mM NaCl Przechowywać w temperaturze 4 ° C przez 1 tydzień TS bufor 50 mM Tris-HCl, pH 7,9 50 mM NaCl Przechowywać w temperaturze 4 stopni; Bufor C TSG10 buffer 50 mM Tris-HCl, pH 7,9 100 mM NaCl 10% v/v glicerolu Przechowywać w temperaturze 4 &; Bufor C TSG20 bufor 50 mM Tris-HCl, pH8 100 mM NaCl 20% v/v glicerol Przechowywać w temperaturze 4 stopni; C TSGD bufor 50 mM Tris-HCl, pH7,9 100 mM NaCl 10% v/v glicerol 0,03% w/v DDM Przechowywać w temperaturze 4 stopni; C i dodaj DDM tuż przed użyciem Tabela II. Przepisy na roztwory.