Metoda krok po kroku rekonstytucji transportera ABC w cząsteczkach lipidowych Nanodisc

Podsumowanie

Nanodyski to małe dyskoidalne cząstki, które zawierają białka błonowe w małym fragmencie dwuwarstwy fosfolipidowej. Udostępniamy protokół wizualny, który pokazuje krok po kroku wbudowywanie transportera MalFGK2 w dysk.

Streszczenie

Nanodysk to dyskoidalna cząstka (~ 10-12 nm duża), która więzi białka błonowe w małym fragmencie dwuwarstwy fosfolipidowej. Nanodysk jest szczególnie atrakcyjną opcją do badania białek błonowych, zwłaszcza w kontekście interakcji ligand-receptor. Metoda zapoczątkowana przez Sligara i współpracowników opiera się na właściwościach amfipatycznych zmodyfikowanego białka rusztowania wysoce a-helisalnego pochodzącego z apolipoproteiny A1. Hydrofobowe powierzchnie białka rusztowania oddziałują z tłuszczowymi acylowymi łańcuchami bocznymi dwuwarstwy lipidowej, podczas gdy obszary polarne są zwrócone w stronę środowiska wodnego. Analizy białek błonowych w nanodyskach mają znaczącą przewagę nad liposomami, ponieważ cząsteczki są małe, jednorodne i rozpuszczalne w wodzie. Ponadto można zastosować metody biochemiczne i biofizyczne zwykle zarezerwowane dla białek rozpuszczalnych i to z obu stron błony. W tym protokole wizualnym przedstawiamy krok po kroku rekonstrukcję dobrze scharakteryzowanego bakteryjnego transportera ABC, kompleksu MalE-MalFGK₂. Formowanie się krążka jest procesem samoorganizacji, który zależy od oddziaływań hydrofobowych zachodzących podczas stopniowego usuwania detergentu. Opisujemy podstawowe kroki i podkreślamy znaczenie wyboru prawidłowego stosunku białka do lipidów w celu ograniczenia tworzenia się agregatów i większych polidyspersyjnych cząstek podobnych do liposomów. Proste kontrole jakości, takie jak chromatografia z filtracją żelową, natywna elektroforeza żelowa i spektroskopia dynamicznego rozpraszania światła, zapewniają, że krążki zostały prawidłowo odtworzone.

Protokół

Ogólny proces rekonstytucji

Proces rekonstytucji rozpoczyna się od zmieszania białka rusztowania błonowego (MSP) z oczyszczonym kompleksem MalFGK₂ w obecności fosfolipidów rozpuszczonych w detergentach. Po tym etapie następuje powolne usuwanie detergentu za pomocą adsorpcyjnego materiału polistyrenowego o nazwie Bio-Beads lub Amberlite (rysunek 1). Proces autoorganizacji zachodzi najprawdopodobniej z powodu niepolarnych oddziaływań między hydrofobowymi fosfolipidami, kompleksem MalFGK₂ i powierzchnią amfipatycznego białka MSP. Produktem końcowym jest dyskoidalna cząstka zbudowana z dwóch cząsteczek MSP owijających się wokół kompleksu MalFGK₂. Cząstki są oddzielane od adduktów i agregatów za pomocą ultrawirowania i analitycznej chromatografii wykluczającej rozmiar. Cząstki charakteryzują się natywną elektroforezą żelową i dynamiczną spektroskopią rozpraszania światła.

1. Przygotowanie białka rusztowania błonowego, MSP

1. Oznaczony przez niego MSP (wersja MSP1D1¹) jest wytwarzany z plazmidu pMSP1D1 w E. coli BL21 (DE3) indukowanego w OD₆₀₀ ~ 0,5 z 0,5 mM izopropylo β-D-1-tiogalaktopiranozydu przez 3 godziny w temperaturze 37 °C.
2. Komórki zbiera się przez odwirowanie w temperaturze 5 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i ponownie zawiesza w buforze TSG10 zawierającym 100 μM fluorku fenylometanosulfonylu.
3. Komórki są poddawane lizie za pomocą prasy francuskiej (3x) przy 8 000 psi, a nierozpuszczalny materiał jest usuwany przez odwirowanie przy 5 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Rozpuszczalną frakcję zawierającą MSP izoluje się przez ultrawirowanie przy 125 000 x g przez 45 minut.
4. MSP jest oczyszczany metodą chromatografii chelatującej nikiel przy użyciu ~1,5 ml Sepharose HP Ni w buforze TSG10. Zanieczyszczenia są wypłukiwane za pomocą buforu TSG10 zawierającego 50 mM imidazolu. MSP jest eluowany za pomocą buforu TSG10 zawierającego 600 mM imidazolu. Oczyszczone białko jest dializowane w buforze TSG10 i przechowywane w temperaturze -70 °C przy stężeniu białka ~10-15 mg/ml.

2. Przygotowanie kompleksu MalFGK₂

1. Kompleks MalFGK₂, znakowany na C-końcu MalK, ulega ekspresji z plazmidu pBAD22-FGK w E. coli BL21 (DE3) i indukowany w OD₆₀₀ ~ 0,5 z 0,2% L-arabinozą przez 3 godziny w 37 °C.
2. Po lizie komórek i odwirowaniu, jak w kroku 1.3, osad membranowy jest ponownie zawieszany w buforze TSG20 w końcowym stężeniu 5 mg/ml. Materiał rozpuszcza się z 1% w/v n-dodecylo-β-maltopyranozydu (DDM) przez 3 godziny w temperaturze 4 °C, delikatnie wstrząsając.
3. Nierozpuszczalny materiał usuwa się przez ultrawirowanie, jak w kroku 1.3, a supernatant zawierający rozpuszczony kompleks MalFGK₂ jest zbierany i oczyszczany jak w kroku 1.4, ale bez dializy.
4. Dalsze oczyszczanie uzyskuje się za pomocą chromatografii żelowej w buforze TSGD na kolumnie Superdex 200 HR 10/300 przy natężeniu przepływu 0,5 ml/min.

3. Przygotowanie fosfolipidów

1. Całkowity ekstrakt lipidowy E. coli rozpuszczony w chloroformie rozdziela się na podwielokrotności 1,000 nmol w zakręcanych probówkach do mikrofugów. Rozpuszczalnik jest odparowywany pod delikatnym strumieniem azotu i suszony dalej przez noc w eksykatorze próżniowym.
2. Folia lipidowa rozpuszcza się w buforze TS o końcowym stężeniu 5 nM, energicznie wiruje i poddaje sonikacji. Rozpuszczone lipidy będą wydawać się lekko nieprzezroczyste ze względu na ich ogólną nierozpuszczalność w wodnym buforze TS, ale powinny pozostać w zawiesinie. DDM dodaje się do końcowego stężenia 0,5% (~10 mM), przy którym roztwór staje się klarowny.
3. Mieszaninę lipidów umieszcza się w łaźni wodnej i poddaje impulsom sonicznym 5 razy przez ~5 sekund. Mieszaninę lipidów przechowuje się w temperaturze 4 °C maksymalnie przez 1 tydzień.

4. Przygotowanie Bio-Koralików

1. Około 10-15 ml (sucha objętość) Bio-Beads umieszcza się w tubce o pojemności 50 ml.
2. Kulki przepłukuje się kolejno 50 ml 100% metanolu, 95% etanolu, miliQ_H2O, a na końcu buforem TS (dwukrotnie).
3. Umyte kulki są przechowywane w temperaturze 4 °C w buforze TS o pojemności ~10 ml.

5. Rekonstrukcja nanodysku

1. MSP rozcieńcza się w buforze TSGD do końcowego stężenia ~7 mg/ml (~0,3 mM).
2. ~ 2 nmol oczyszczonego kompleksu MalFGK₂ miesza się w stosunku białko:MSP:lipid 1:3:60 lub 1:3:400 w buforze TSGD. Stężenie końcowe wynosi 6 μM MalFGK₂, 18 μM MSP i 360 μM lipidów (1:3:60) lub 2,4 mM lipidów (1:3:400). Ostateczna objętość to 300 μl. Końcowe stężenie DDM wynosi 0,08% (~1,6 mM). Końcowe stężenie glicerolu zależy od ilości dodanego lipidu, ale utrzymuje się na poziomie około 5-10% v/v.
3. Do probówki dodaje się ~50 μl zawiesiny Bio-Bead, a mieszaninę inkubuje się przez noc na stole bujanym w temperaturze 4 °C.
4. Kulki są sedymentowane grawitacyjnie, a roztwór jest pipetowany przez wąską końcówkę, aby uniknąć jak największej ilości Bio-Koralików.
5. Duże osady są usuwane przez ultrawirowanie przy 100 000 x g przez 20 minut. Krążki są oczyszczane metodą chromatografii z filtracją żelową, jak w kroku 2.4 w buforze TSG10. Frakcje zawierające krążki są łączone i podwielokrotność powinna być ponownie wstrzyknięta do tej samej żelowej kolumny filtracyjnej w celu zbadania stabilności preparatu.
6. Oczyszczone krążki można przechowywać w temperaturze -70 °C przez dłuższy czas. Po rozmrożeniu na lodzie krążki należy poddać ultrawirowaniu, jak w kroku 5.5, w celu usunięcia potencjalnych osadów. Podwielokrotność powinna być analizowana za pomocą żelowej chromatografii filtracyjnej w celu upewnienia się, że podczas procesu rozmrażania nie wystąpiła znaczna agregacja lub wytrącanie.

6. Natywna elektroforeza żelowa

1. 1 μM nanodysków (~0,2 mg/ml) są analizowane przez natywny PAGE^{6, 7} (Tris-HCl pH 8,8, 4-12%) w celu oceny jakości rekonstytucji (Figura 3A).
2. Wiązanie MalE (1 μM) z kompleksem MalFGK₂ odtworzonym w nanodyskach jest również oceniane za pomocą native-PAGE (Figura 3A).
3. Po elektroforezie żel barwi się kolorem Coomassie blue przez 10 min, a następnie odbarwia przez ~1 godz.

7. Dynamiczne rozpraszanie światła (DLS)

1. Nanodyski są oczyszczane za pomocą chromatografii żelowej filtracji, jak w kroku 2.4 w buforze TSG10, przy użyciu kolumny Superdex 200 HR 10/300 przy natężeniu przepływu 0,1 ml/min. Frakcje zawierające nanodyski są łączone i zagęszczane do ~10 mg/ml za pomocą filtra odśrodkowego Amicon.
2. Próbka jest filtrowana dwukrotnie (filtr 0,22 μm) przed analizą przez DLS przy użyciu instrumentu DynaPro nanostar (technologia Wyatt) w kuwecie kwarcowej o pojemności 1 μl o objętości wewnętrznej. Dane są dopasowywane za pomocą oprogramowania DYNAMICS (technologia Wyatt) w celu oszacowania średnicy i masy cząsteczkowej cząstek.

8. Pomiary ATPazy

1. Aktywność ATPazy nanodysków odtworzonych przez MalFGK₂ określa się za pomocą testu kolorymetrycznego⁸.
2. 1 μM oczyszczonych krążków i 1 mM ATP miesza się razem z rosnącą ilością MalE i inkubuje w temperaturze 37 °C przez 20 minut. Uwalnianie fosforanu nieorganicznego mierzy się przy długości fali 660 nm.
3. Ilość uwalnianego fosforanu porównuje się z krzywą wzorcową wygenerowaną za pomocą roztworu wzorca fosforu.

9. Reprezentatywne wyniki

Nanodyski są oczyszczane za pomocą chromatografii z filtracją żelową (Rysunek 2A, po lewej). Chromatogram pokazuje, że większość odtworzonych krążków (ślad) eluuje się jako pojedynczy pik, podczas gdy krążki zbudowane z nadmiaru lipidów (czerwony ślad) eluują w pustej objętości i jako seria szerokich pików. Jakość nanodysków jest dalej analizowana za pomocą natywnej elektroforezy żelowej i dynamicznej spektroskopii rozpraszania światła (DLS). Prawidłowo rozpuszczone krążki migrują jako ostra wstęga na żelu, podczas gdy te odtworzone w obecności nadmiaru lipidów migrują jako rozmaz (ryc. 2A, po prawej). Analiza przeprowadzona przez DLS pokazuje, że populacja dysku jest jednorodna o średniej średnicy 11,4 nm (ryc. 2B). Odtworzone krążki mają pozorną masę cząsteczkową 215 kDa w oparciu o przybliżenie DLS. Próbki odtworzone w obecności nadmiaru lipidów mają szeroko rozsiane promienie około 100 nm, co jest typowe dla próbek niejednorodnych.

Jakość kompleksu MalFGK₂ jest oceniana za pomocą natywnej elektroforezy żelowej, a jego aktywność za pomocą pomiarów ATPazy (Rysunek 3). Białko wiążące maltozę MalE wiąże się z dużym powinowactwem do transportera MalFGK₂ ^{9, 10}. Za pomocą niedenaturującej elektroforezy żelowej możliwe jest wykrycie kompleksu między MalE i MalFGK₂ (ryc. 3A). Stymulacja aktywności ATPazy MalK₂ przez MalE pokazano na rysunku 3B.

Rysunek 1. Typowy schemat blokowy dla protokołu rekonstytucji.

Rysunek 2. Kontrola jakości preparatu nanodysku. A. Analiza filtracji żelowej (kolumna Superdex 200 HR 10/300) nanodysków odtworzonych przy niskim stosunku lipidów (1/3/60; ślad) lub wysokim stosunku lipidów (1/3/400; czerwony ślad). Natywna elektroforeza żelowa tego samego preparatu krążkowego. Wskazywane są markery masy cząsteczkowej w kDa. B. Analiza dynamicznego rozpraszania światła w tym samym preparacji dysku. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

Rysunek 3. Analiza cząstek 2-nanodysku MalFGK. A. Analiza przesunięcia żelu MalE inkubowanego z rosnącą ilością cząstek_2-nanodysku MalFGK. B. Aktywność ATPazy cząstek_2-nanodysku MalFGK w funkcji stężenia MalE.

Dyskusja

Opisujemy prostą procedurę rekonstytucji transportera maltozy do nanodysków. Transporter jest aktywny w ATPazie, a interakcja z rozpuszczalnym partnerem wiążącym MalE może zostać odtworzona (Figura 3). Udana rekonstytucja transportera w nanodyskach otwiera drogę do dodatkowych analiz biofizycznych i biochemicznych. Szczególnie interesująca będzie systematyczna analiza aktywności ATPazy MalK i transportu maltozy w detergentach, liposomach i nanodyskach. Transportery ABC zmieniają konformacje podczas c...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Filtr odśrodkowy Amicon Ultra-4 50K	Millipore	UFC805008	Postępuj zgodnie z protokołem producenta w celu prawidłowego użycia
Bio-Beads SM-2 Adsorbent	Bio-Rad	152-3920
E. coli lipidy całkowite	Avanti Polar Lipids	100500C	Rozpuszczony w chloroformie, obchodzić się z rozpuszczalnikiem organicznym
Sefaroza ni żywica HP	GE Opieka zdrowotna	17-5268-01
Roztwór wzorcowy fosforu	Sigma-Aldrich	P3869
pMSP1D1	Addgene	20061
Superdex 200 HR 10/300	GE Healthcare	17-5172-01
Tabela I. Określone odczynniki.
Name Kompozycja Komentarze DDM stock 10% w/v DDM Zawiesić w miliQ wodzie i przechowywać w temperaturze -20 ° C MalFGK2 stock 1-2 mg/ml 50 mM Tris-HCl, pH 7,9 100 mM NaCl 10% v/v glicerol 0,03% w/v DDM Przechowywać w temperaturze -70 &; C po oczyszczeniu MSP stock 10-15 mg/ml 50 mM Tris-HCl, pH 7,9 100 mM NaCl 10% v/v glicerolu Przechowywać w temperaturze -70 ° C po oczyszczeniu w < 1 ml podwielokrotności i unikać nadmiernych cykli zamrażania/rozmrażania Fosfolipid stock 5 nM E. coli total lipids 0,5% w/v (10 mM) DDM 50 mM Tris-HCl, pH 7,9 50 mM NaCl Przechowywać w temperaturze 4 ° C przez 1 tydzień TS bufor 50 mM Tris-HCl, pH 7,9 50 mM NaCl Przechowywać w temperaturze 4 stopni; Bufor C TSG10 buffer 50 mM Tris-HCl, pH 7,9 100 mM NaCl 10% v/v glicerolu Przechowywać w temperaturze 4 &; Bufor C TSG20 bufor 50 mM Tris-HCl, pH8 100 mM NaCl 20% v/v glicerol Przechowywać w temperaturze 4 stopni; C TSGD bufor 50 mM Tris-HCl, pH7,9 100 mM NaCl 10% v/v glicerol 0,03% w/v DDM Przechowywać w temperaturze 4 stopni; C i dodaj DDM tuż przed użyciem Tabela II. Przepisy na roztwory.