Retrogradne znakowanie fluorescencyjne umożliwia ukierunkowaną zewnątrzkomórkową rejestrację pojedynczych jednostek z zidentyfikowanych neuronów in vivo

Podsumowanie

Transport retrogradny barwnika fluorescencyjnego pozwala na oznakowanie subpopulacji neuronów na podstawie projekcji anatomicznej. Oznakowane aksony mogą być celowane wizualnie in vivo, co umożliwia rejestrację pozakomórkową z zidentyfikowanych aksonów. Technika ta ułatwia rejestrację w przypadkach, gdy neurony nie mogą zostać oznakowane poprzez manipulacje genetyczne lub gdy ich izolacja za pomocą „ślepych” metod in vivo jest utrudniona.

Streszczenie

Ogólnym celem tej metody jest rejestracja odpowiedzi pojedynczych jednostek z zidentyfikowanej populacji neuronów. Rejestracje elektrofizjologiczne in vivo z pojedynczych neuronów są kluczowe dla zrozumienia funkcjonowania obwodów neuronalnych w warunkach naturalnych. Tradycyjnie rejestracje te były przeprowadzane „na ślepo”, co oznacza, że tożsamość rejestrowanej komórki była nieznana na początku pomiaru. Tożsamość komórkową można określić następnie za pomocą jontoforezy barwnika drogą wewnątrzkomórkową¹, przykomórkową (juxtacellular)² lub za pomocą techniki loose-patch³, jednak rejestracje te nie mogą być celowane w konkretne neurony w obszarach o funkcjonalnie heterogenicznych typach komórek. Białka fluorescencyjne mogą być eksprymowane w sposób specyficzny dla typu komórek, co umożliwia elektrofizjologię pojedynczych komórek kierowaną wizualnie^4-6. Istnieje jednak wiele systemów modelowych, dla których narzędzia genetyczne te nie są dostępne. Nawet w genetycznie dostępnych systemach modelowych pożądany promotor może być nieznany, a genetycznie homogeniczne neurony mogą mieć zróżnicowane wzorce projekcji. Podobnie, wektory wirusowe były wykorzystywane do znakowania specyficznych podgrup neuronów projekcyjnych⁷, lecz zastosowanie tej metody jest ograniczone przez toksyczność i brak specyficzności transsynaptycznej. W związku z tym niezbędne są dodatkowe techniki oferujące specyficzną prewizualizację w celu rejestracji z zidentyfikowanych pojedynczych neuronów in vivo. Prewizualizacja neuronu docelowego jest szczególnie użyteczna w trudnych warunkach rejestracji, w których klasyczne pomiary z pojedynczych komórek są często zbyt trudne do przeprowadzenia^8-11. Nowa technika opisana w niniejszej pracy wykorzystuje transport retrogradny barwnika fluorescencyjnego aplikowanego za pomocą igieł wolframowych do szybkiego i selektywnego znakowania specyficznej podgrupy komórek w konkretnym obszarze mózgu na podstawie ich unikalnych projekcji aksonalnych, zapewniając tym samym wskazówkę wizualną do uzyskania celowanych rejestracji elektrofizjologicznych z zidentyfikowanych neuronów w nienaruszonym obwodzie w obrębie OUN kręgowców.

Najistotniejszym nowatorskim usprawnieniem naszej metody jest zastosowanie znakowania fluorescencyjnego do celowania w konkretne typy komórek w systemie modelowym niedostępnym genetycznie. Słabo elektryczne ryby stanowią doskonały system modelowy do badania obwodów neuronalnych u czuwających, wykazujących naturalne zachowania zwierząt¹². Wykorzystaliśmy tę technikę do zbadania przetwarzania sensorycznego przez „małe komórki” w przednim jądrze boczno-zewnętrznym (ELa) słabo elektrycznych ryb z rzędu mormyrid. Hipoteza zakłada, że „małe komórki” są neuronami komparatorami czasu, które odgrywają ważną rolę w wykrywaniu submilisekundowych różnic w czasie nadejścia impulsów presynaptycznych¹³. Jednakże cechy anatomiczne, takie jak gęsta mielina, synapsy otaczające oraz małe ciała komórkowe, sprawiły, że rejestracja sygnałów z tych komórek przy użyciu tradycyjnych metod była niezwykle trudna^{11, 14}. W niniejszej pracy wykazujemy, że nasza nowatorska metoda selektywnie znakuje te komórki w 28% preparatów, co umożliwia wiarygodne i stabilne rejestracje oraz charakterystykę odpowiedzi na stymulację elektrosensoryczną.

Protokół

1. Przygotowanie igieł pokrytych barwnikiem

1. Zaostrz elektrolitycznie drut wolframowy o średnicy 160 μm¹⁵. Końcowa średnica czubka igły powinna wynosić od 5-50 μm. Liczba potrzebnych igieł zależy od wielkości regionu podlegającego znakowaniu. Przygotowaliśmy 5 igieł do 3-5 iniekcji do zewnętrznego bocznego jądra tylnego (ELp).
2. W noc poprzedzającą eksperyment nanieś kroplę (<0.25 μl) barwnika Alexa Fluor 10,000 MW sprzężonego z dekstranem o stężeniu 2 mM na dystalne 100 μm każdej igły.
3. Pozostaw igły do wyschnięcia na powietrzu w temperaturze pokojowej, aby na czubku pozostał skoncentrowany barwnik. Przechowuj igły w temperaturze 4 °C w ciemnym pojemniku, aby chronić je przed światłem.

2. Przygotowanie zwierzęcia do operacji

1. Wprowadź rybę w stan narkozy ogólnej, umieszczając ją w roztworze MS-222 o stężeniu 300 mg/L w wodzie z akwarium.
2. Zważ rybę oraz zmierz długość widliczną (od czuba ryjka do widlicy płetwy ogonowej) i wysokość ciała (maksymalna odległość grzbietowo-brzuszna w płaszczyźnie poprzecznej). Pomiary te powinny mieścić się w zakresach podanych w Tabeli 1, aby ryba zmieściła się w komorze pomiarowej na tyle małej, by można było ją umieścić pod obiektywem mikroskopu immersyjnego (Rysunek 1).
3. Unieruchom rybę i wycisz ją elektrycznie, wstrzykując 100 μl flaxedilu w stężeniu 3 mg/ml do mięśni grzbietowych ciała.
4. Napełnij komorę pomiarową (Rysunek 1A) wodą z akwarium. Umieść rybę stroną brzuszną do dołu na platformie w centrum komory (Rysunek 1). Podawaj napowietrzony roztwór MS-222 o stężeniu 100 mg/L za pomocą końcówki pipety umieszczonej w pysku ryby (1-2 ml/min). Stabilizuj rybę za pomocą prętów zamocowanych w wosku, umieszczonych po obu stronach ciała (Rysunek 1C). Monitoruj stan zdrowia ryby, sprawdzając ciągłość przepływu krwi w naczyniach ocznych oraz prawidłowy kolor ciała.
5. Obróć platformę wokół jej długiej osi i opuść tylną część platformy tak, aby jedna strona powierzchni grzbietowej głowy ryby znajdowała się ponad lustrem wody, podczas gdy reszta ciała pozostanie zanurzona. Na każdej niezanurzonej części skóry należy położyć mały kawałek chusteczki Kimwipe, aby zapobiec wysychaniu.

3. Operacja (Rysunek 2)

Podstawowa procedura chirurgiczna opisana w niniejszym opracowaniu jest dobrze ugruntowana i niezawodnie stosowana podczas ślepych rejestracji in vivo u mormyrydów¹⁶. W przypadku innych zastosowań należy odsłonić obszary przeznaczone do znakowania i rejestracji. Region zawierający zakończenia aksonów badanych komórek musi być dostępny za pomocą igły pokrytej barwnikiem. Region zawierający bardziej proksymalne segmenty tych samych aksonów musi posiadać wystarczającą przestrzeń nad tkanką, aby pomieścić odległość roboczą obiektywu imersyjnego w wodzie (w naszym przypadku 2 mm).

1. Za pomocą patyczka higienicznego nanieś 0,4% roztwór lidokainy na odsłoniętą powierzchnię głowy.
2. Za pomocą ostrza skalpela wytnij obrys prostokątnego fragmentu skóry. Usuń prostokąt za pomocą pęsety. Wielkość prostokąta będzie skalować się wraz z rozmiarem ryby, ale dla ryby o długości 6,2 cm powinna wynosić około 3 mm X 5 mm (Rysunek 2A). Boczna krawędź prostokąta powinna znajdować się na wysokości środka oka, krawędź przednia tuż za okiem, a krawędź przyśrodkowa tuż bocznie od linii środkowej ryby.
3. Rozszerz odsłonięty obszar czaszki w kierunku przednio-przyśrodkowym, aby odsłonić dodatkowy, niepokrywający się obszar o wymiarach 2,5 mm na 2,5 mm (Rysunek 2B).
4. Całkowicie oczyść i osusz odsłoniętą powierzchnię czaszki, używając ostrza skalpela do zeskrobania nadmiaru tkanki oraz chusteczek Kimwipes i strumienia powietrza do osuszenia powierzchni (Rysunek 2C).
5. Przyklej metalowy trzpień do przednio-przyśrodkowego odsłoniętego obszaru czaszki za pomocą Super Glue. Odczekaj do całkowitego wyschnięcia kleju (Rysunek 2D).
6. Usuń prostokątny fragment czaszki o wymiarach około 2 mm X 4 mm dla ryby o długości 6,2 cm. Użyj wiertarki stomatologicznej z węglikowym końcem kulistym o średnicy ~0,5 mm, aby odchudzić obrys prostokąta. Następnie, używając skalpela i pęsety, wytnij obrys prostokąta i od niej go, aby odsłonić leżący pod nim mózg. Może być konieczne dodatkowe wiercenie lub cięcie małymi nożyczkami, aby w pełni odsłonić EL (Rysunek 2E). W przypadku krwawienia z mięśni można użyć elektrokoagulatora.
7. Wytnij zarówno oponę twardą (pigmentowaną), jak i oponę miękką (przezroczystą), używając nożyczek sprężynowych lub igły, a następnie usuń wycięte fragmenty pęsetą. Widoczne są teraz przednia i tylna część jądra boczno-zewnętrznego (EL), odpowiednio ELa i ELp (Rysunek 3A).

4. Markowanie wsteczne interesujących aksonów

1. Umieść manipulator z igłą pokrytą barwnikiem (wykonaną w kroku 1) nad obszarem docelowym zawierającym badane aksony, w naszym przypadku ELp.
2. Szybko wprowadź igłę w tkankę na głębokość około 25 μm. Odczekaj 15-30 sekund, aż cały barwnik zostanie uwolniony, a następnie wycofaj igłę.
3. Powtórz czynność z dodatkowymi nowymi igłami w razie potrzeby, umieszczając każdą z nich w innym miejscu, tak aby barwnik został rozprowadzony w całym obszarze docelowym. W naszych badaniach zastosowano 3-5 igieł na preparat.
4. Wypłucz nadmiar barwnika z jamy za pomocą roztworu Ringera według receptury Hickmana.
5. Odczekaj co najmniej 2 godziny w celu pobrania i transportu barwnika.

5. Wizualizacja wybranych aksonów

1. Umieść komorę rejestracyjną wraz z rybą pod obiektywem pionowego mikroskopu epifluorescencyjnego ze stałym stolikiem. Ponieważ ciało ryby blokuje przenikanie światła, zarówno źródło światła białego, jak i fluorescencyjnego musi znajdować się powyżej. Staranne umieszczenie światłowodowego źródła światła nad jamą czaszki pozwala na uzyskanie satysfakcjonujących obrazów w świetle przechodzącym. W przypadku obrazowania epifluorescencyjnego specyfikacja filtrów fluorescencyjnych powinna być dopasowana do widma absorpcji/emisji barwnika.
2. Przełącz system oddychania na świeżą wodę akwariową, zachowując tę samą prędkość przepływu. Umieść przewód uziemiający w odsłoniętej jamie mózgowej i podłącz go do masy głowicy rejestrującej (patrz sekcja 6.3).
3. Umieść parę elektrod rejestrujących u podstawy ogona i podłącz je do wzmacniacza różnicowego oraz urządzenia rejestrującego (np. monitora audio, oscyloskopu lub komputera), aby monitorować sygnał sterujący wyładowaniem organu elektrycznego (EODC). Po wybudzeniu ryby z anestezji sygnał EODC może służyć jako wskaźnik stanu zdrowia zwierzęcia.
4. Przygotuj skalowany szkic obszaru mózgu oglądanego przy małym powiększeniu. Uwzględnij główne naczynia krwionośne jako punkty orientacyjne (mogą się one różnić między osobnikami), aby zidentyfikować dokładną lokalizację znakowanych aksonów, widocznych tylko przy dużym powiększeniu (Rysunek 3D).
5. Potwierdź umieszczenie barwnika. Najpierw obejrzyj całą tkankę w świetle przechodzącym w celu orientacji (Rysunek 3A). Następnie obejrzyj ją przy użyciu oświetlenia fluorescencyjnego (Rysunek 3B). ELp będzie wykazywać rozproszone znakowanie (Rysunki 3B i 3C). Zminimalizuj wzbudzenie fluorescencji, aby ograniczyć fotodynamiczne i fototoksyczne działanie barwnika.
6. Wykorzystaj naczynia krwionośne jako punkty orientacyjne, aby zlokalizować ELa przy dużym powiększeniu. Naświetlaj światłem fluorescencyjnym podczas poszukiwania znakowanego aksonu w pobliżu powierzchni (Rysunek 4).

6. Rejestracja aktywności pozakomórkowej

1. Wytвориć elektrody rejestrujące do ssania, wykorzystując szklane kapilary borokrzemowe o średnicy zewnętrznej (OD) 1 mm i wewnętrznej (ID) 0,58 mm z włóknem. Idealna wielkość końcówki zależy od średnicy docelowych aksonów, która w naszym przypadku wynosi 0,1-0,2 μm¹⁷. W naszej aplikacji średnice końcówek elektrod wynosiły 1,5 ± 0,4 μm (zakres: 1,0-2,4 μm) z wąskim trzonem o długości 5 mm, aby zbliżyć się do oznakowanych aksonów bez przesuwania otaczającej, gęsto upakowanej tkanki.
2. Wypełnić elektrody przefiltrowanym roztworem Ringera według Hickmana. Końcowa rezystancja końcówki wynosi 45,2 ± 38,0 MΩ (zakres: od 16 do 155 MΩ).
3. Umieścić elektrodę w uchwycie do elektrod z portem ciśnieniowym i podłączyć ją do przedwzmacniacza (headstage) zamontowanego na manipulatorze. Poprowadzić linię ciśnieniową z portu ciśnieniowego do złącza T zakończonego manometrem oraz strzykawką, służących odpowiednio do monitorowania i kontrolowania ciśnienia.
4. Podłączyć przedwzmacniacz do wzmacniacza i urządzenia akwizycji sygnałów analogowo-cyfrowych.
5. Przy ciśnieniu zewnętrznym 30 mbar w linii elektrody, umieścić elektrodę obok oznakowanego aksonu. Do wizualizacji rozmieszczenia pipety używa się kamery o niskiej czułości światła zintegrowanej z oprogramowaniem do obrazowania. Rozpocząć w pobliżu powierzchni tkanki i przesuwać elektrodę w kierunku aksonu. Podczas zbliżania się do aksonu, ciśnienie zewnętrzne powinno spowodować lekki, ale zauważalny ruch aksonu.
6. Gdy elektroda znajduje się obok aksonu (Rycina 4A, góra), rejestrować potencjał na elektrodzie podczas podawania bodźców testowych (w naszym przypadku zastosowano 100 msec monofazowe dodatnie i ujemne impulsy poprzeczne o natężeniu 20 mV/cm; Rycina 1A). Potencjały czynnościowe nie powinny być obserwowane, choć artefakt elektryczny potwierdza prawidłowy zapis/stymulację (Rycina 4A, dół).
7. Zwolnić ciśnienie zewnętrzne w elektrodzie i powtórzyć stymulację/rejestrację. Potencjały czynnościowe nadal nie powinny być obserwowane (Rycina 4B).
8. Zastosować lekkie (125 ± 25 mbar) ssanie w elektrodzie i powtórzyć stymulację/rejestrację. Teraz w odpowiedzi na stymulację powinny być obserwowane potencjały czynnościowe (Rycina 4C). Może również wystąpić aktywność spontaniczna. Jeśli potencjały czynnościowe nie są obserwowane, należy zwolnić ssanie, oczyścić elektrodę za pomocą lekkiego ciśnienia, nieznacznie przesunąć elektrodę i ponownie spróbować zastosować ssanie. Po pojawieniu się potencjałów czynnościowych zamknąć linię ciśnieniową.
9. Stymulować i rejestrować zgodnie z potrzebami.

7. Zakończenie i utylizacja

1. Po zakończeniu wszystkich wymaganych pomiarów należy przełączyć rybę na oddychanie w roztworze MS-222 o stężeniu 100 mg/L, aż do całkowitego ustania EODC. Przez co najmniej 10 minut nie powinno być wykrywalnych żadnych sygnałów EODC.
2. Ryby należy zutylizować zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi oraz zatwierdzonymi protokołami opieki nad zwierzętami.

8. Reprezentatywne wyniki

W naszym konkretnym zastosowaniu jesteśmy zainteresowani badaniem kodowania bodźca przez centralne neurony sensoryczne. Pomyślne rejestracje z oznakowanych aksonów umożliwiają analizę odpowiedzi pojedynczych jednostek na stymulację sensoryczną¹⁸. Rysunek 5A przedstawia reprezentatywne potencjały czynnościowe wywołane poprzeczną stymulacją elektrosensoryczną przy użyciu elektrod bipolarnych umieszczonych po wewnętrznych stronach lewej i prawej ściany komory rejestracyjnej. Czasy wystąpienia impulsów można przedstawić na wykresie rastrowym (Rysunek 5B). 25 ms okno rejestracji przed bodźcem wykazuje niski poziom aktywności spontanicznej. Ta konkretna „mała komórka” ELa jest nastrojona jako filtr górnoprzepustowy na czas trwania bodźca przy intensywności bodźca 6 mV/cm, zwiększając liczbę impulsów na powtórzenie wraz z wydłużaniem czasu trwania bodźca (Rysunek 5C). Średnia latencja pierwszego impulsu wynosi 4,28 ± 0,16 ms, co jest zgodne z oczekiwaną latencją dla małych komórek w ELa¹¹.

Rysunek 1. Specyfikacja komory rejestracyjnej, która mieści się pod obiektywem epifluorescencyjnego mikroskopu ze stałym stolikiem. (A) Rysunek w skali kwadratowej komory rejestracyjnej wykonanej z pleksiglasu, przedstawiający widok z góry, z boku i z tyłu. Pary elektrod stymulujących (gwiazdki) na obrzeżach umożliwiają stymulację poprzeczną (czerwono-czarna) lub podłużną (niebiesko-żółta). Dodkowy element z pleksiglasu w narożniku z otworem wyłożonym gumą w centrum (pomarańczowy) utrzymuje pipetę ssącą, która zapewnia stały poziom wody. Dwa pionowe wsporniki ze stali nierdzewnej wkręcone w dno komory (pełny zielony kolor) łączą się z wspornikami ze stali nierdzewnej (zielony obrys) przymocowanymi do platformy podtrzymującej rybę (jasnoszary kolor, szczegóły w C) za pomocą regulowanych zacisków tarczowych. Poniżej rysunku w skali znajduje się fotografia komory. (B) Widoki poszczególnych elementów oraz widok złożonych okrągłych plastikowych zacisków tarczowych służących do mocowania platformy do pionowych wsporników. Każdy zacisk tarczowy posiada rowek (zielony) na wspornik oraz otwór centralny na śrubę dokręcającą. Zaciski tarczowe są obrócone tak, aby rowki były do siebie prostopadłe. Dokręcenie śruby (czerwona) unieruchamia wsporniki, zapobiegając dalszym ruchom pionowym i obrotowym platformy. (C) Widoki w skali z przodu i z boku platformy z pleksiglasu służącej do unieruchomienia ryby. Platforma jest pokryta warstwą parafiny (niebieska), która utrzymuje w miejscu drewniane kołki (czarne paski) podtrzymujące rybę. Rurka do natleniania ryby przechodzi przez otwór w „zagłówku” platformy i kończy się końcówką pipety umieszczoną w pysku ryby. Wspornik głowy ze stali nierdzewnej (szary pasek) łączy się z platformą za pomocą przegubu kulowego umożliwiającego obrót o 360 stopni. Poziome wsporniki ze stali nierdzewnej (zielone) są wkręcone w oba końce platformy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek.

Rysunek 2. Schematyczny przegląd operacji z widokiem z góry na powierzchnię grzbietową głowy. (A) Wykonać cztery nacięcia, w podanej kolejności, aby usunąć prostokątny fragment skóry (czerwony). (B) Rozszerzyć otwór w kierunku przednio-przyśrodkowym, aby usunąć dodatkowy prostokątny fragment skóry (zielony). (C) Zeskrobać pozostałą tkankę tłuszczową lub więzadła, przesuwając ostrze skalpela zgodnie ze strzałką, a następnie całkowicie osuszyć powierzchnię za pomocą chusteczek Kimwipes i wymuszonego przepływu powietrza. (D) Przykleić stalowy trzpień do czaszki za pomocą Super Glue. Skala na rysunku A odnosi się do rysunków A-D. (E) Użyć wiertarki stomatologicznej, aby wykonać cztery nacięcia, w podanej kolejności, w celu usunięcia prostokątnego fragmentu kości (niebieski), odsłaniając przednie i tylne jądra zewnętrzno-boczne (odpowiednio ELa i ELp). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek.

Rysunek 3. Markowanie fluorescencyjne w tylnym boczno-zewnętrznym jądrze 3 godziny po iniekcji dekstranu sprzężonego z Alexa Fluor 568. (A) Przednie i tylne jądra boczno-zewnętrzne (odpowiednio ELa i ELp) uwidocznione przy użyciu oświetlenia w polu jasnym od góry. Należy zwrócić uwagę, że rozległa mielinizacja w obrębie ELa nadaje mu stosunkowo jasny wygląd, który odróżnia je od ELp. (B) Ten sam obszar zwizualizowany przy użyciu epifluorescencji z wykorzystaniem filtra TRITC. (C) Obraz złożony z wykorzystaniem koloru niebieskiego dla A (pole jasne) oraz czerwonego dla B (TRITC). (D) Przykład rysunku w skali przedstawiającego ELa i ELp wraz z głównymi naczyniami krwionośnymi (czerwone linie), które mogą służyć jako punkty orientacyjne do zidentyfikowania dokładnej lokalizacji oznakowanych aksonów widocznych jedynie przy dużym powiększeniu (dokładne rozmieszczenie naczyń krwionośnych różni się u poszczególnych osobników ryb). Linia przerywana oznacza granicę między ELa a ELp. (E) Obrazy próbkowe uzyskane przy użyciu filtra TRITC z 5 różnych preparatów, ilustrujące szereg prawidłowych wzorów znakowania aksonów i som miesiało-małych komórek w ELa. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony schemat.

Rycina 4. Zewnątrzkomórkowa rejestracja pojedynczej jednostki z oznakowanego aksonu. (A) Elektroda rejestrująca (grot strzałki) pod dodatnim ciśnieniem, umieszczona obok oznakowanego aksonu małej komórki w ELa (góra), rejestruje jedynie artefakt krawędziowy (groty strzałek) w odpowiedzi na jednofazowy, przeciwstronnie dodatni, poprzeczny impuls prostokątny o parametrach 100 msec 20 mV/cm (dół). (B) Zwolnienie ciśnienia zewnętrznego z elektrody (grot strzałki) powoduje lekkie przesunięcie aksonu w kierunku elektrody (góra), jednak nadal nie występują odpowiedzi na bodziec (dół). (C) Lekkie podciśnienie wciąga akson do elektrody (góra, grot strzałki), a potencjały czynnościowe w odpowiedzi na początek bodźca są teraz widoczne (dół, gwiazdka). Dolne części wszystkich trzech paneli przedstawiają nałożone na siebie odpowiedzi na 20 powtórzeń bodźca. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą rycinię.

Rysunek 5. Reprezentatywne wyniki uzyskane przy użyciu tej techniki. (A) 5 przykładowych zapisów pokazujących potencjały czynnościowe wywołane jednofazowym, przeciwstronnie dodatnim, poprzecznym impulsem prostokątnym o czasie trwania 0,1 msec i natężeniu 6 mV/cm. (B) Wykres rastrowy przedstawiający czasy wystąpienia impulsów podczas 20 powtórzeń 75 msec okna rejestracji dla tej samej jednostki stymulowanej w czasie 0 bodźcami 6 mV/cm o czasie trwania wymienionym po prawej stronie. (C) Krzywa dostrojenia czasu trwania kwantyfikująca odpowiedzi przedstawione na wykresie rastrowym jako liczba impulsów na powtórzenie bodźca. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek.

	Masa (g)	Długość widelcza (cm)	Wysokość ciała (cm)
Średnia	2.42	6.20	1.14
Odchylenie standardowe	0.64	0.52	0.18
Zakres	1.2-4.0	5.5-8.4	0.9-1.6

Tabela 1. Optymalne zakresy masy, długości i głębokości ciała ryb. Optymalne zakresy masy, długości widlicowej (od czubka ryjca do widlicy płetwy ogonowej) i głębokości ciała (maksymalna odległość grzbietowo-brzuszna w płaszczyźnie poprzecznej), które umożliwiają umieszczenie ryby w komorze rejestracyjnej przedstawionej na Rysunku 1. Ryby zbyt małe mogą mieć mniejszą szansę na przeżycie operacji oraz niewielki ELp, co utrudnia umieszczenie barwnika. Ryby zbyt duże będą posiadać duży, wysunięty móżdżek, który ograniczy dostęp do ELa i ELp oraz może uniemożliwić obniżenie wysokonapływowego obiektywu immersyjnego na odległość wystarczającą do ustawienia ostrości na ELa i ELp.

Miejsce aplikacji	Typ barwnika	Próby na rybach	Etykieta w ELa	Etykieta w ELp	Liczba podjętych jednostek	Nagrania
ELa	Iniekcja Alexa Fluor	32	26 (81.2%)	19 (59.4%)	50	4 (8.0%)
ELa	papier filtracyjny nasączony Alexa Fluor	1	0	0	0	0
ELa	Di-I w DMSO	8	6 (75.0%)	0	0	0
ELa	Kryształy Di-O	5	3 (60.0%)	2 (40.0%)	9	0
ELp	Kryształy Alexa Fluor w formie stałej	2	0	2 (100%)	0	0
ELp	druciki wolframowe pokryte Alexa Fluor	43	29 (67.4%)	41 (95.3%)	119	26 (21.8%)

Tabela 2. Odsetki sukcesu dla każdej metody wstrzykiwania barwnika. Odsetki sukcesu dla każdej metody wstrzykiwania barwnika. Metody zostały podzielone w zależności od miejsca wstrzyknięcia i rodzaju barwnika. Dla każdej metody podano całkowitą liczbę prób na rybach oraz procent tych eksperymentów, które doprowadziły do skutecznego znakowania w ELa i ELp. Należy zauważyć, że docelowy obszar rejestracji znajduje się po przeciwnej stronie niż miejsce aplikacji (pogrubione pola). W przypadku miejsca wstrzyknięcia za sukces wchłaniania barwnika uznano znakowanie zarówno ciał komórek (som), jak i aksonów. Natomiast w miejscu rejestracji za skuteczne eksperymenty znakowania uznano jedynie preparaty ze znakowanymi aksonami. Podano również całkowitą liczbę próbnych jednostek oraz procent tych jednostek, które pozwoliły na przeprowadzenie skutecznych rejestracji.

	Liczba miejsc wstrzyknięcia	Średnia objętość na wstrzyknięcie (μl)	Zakres objętości na wstrzyknięcie (μl)	Średnia całkowita objętość wstrzyknięcia (μl)	Zakres całkowitych objętości wstrzyknięcia (μl)
Mikrowstrzykiwacz z Hamiltonem	3 lub 4	0.144	0.091 - 0.91	0.516	0.378 - 0.669
Nanowstrzykiwacz z pipetą szklaną	2 - 4	0.069 (stała)	Stała objętość wstrzykiwana 1-6 razy	0.621	0.414 - 0.966
Mikrowstrzykiwacz z pipetą szklaną	2 - 6	0.093	0.058 - 0.202	0.360	0.252 - 0.540

Tabela 3. Ilości barwnika zastosowane w każdej z trzech metod wstrzykiwania Alexa Fluor do ELa Ilości barwnika zastosowane w każdej z trzech metod wstrzykiwania Alexa Fluor do ELa (pierwsza metoda z Tabeli 2). Wstrzykiwanie barwnika do ELa przeprowadzono zarówno za pomocą nanowstrzykiwacza, jak i mikrowstrzykiwacza, używając igły strzykawki Hamilton o rozmiarze 33 gauge lub wyciąganej szklanej kapilary. Zmieniano liczbę miejsc wstrzyknięcia, objętość pojedynczego wstrzyknięcia oraz całkowitą objętość wstrzykniętego barwnika.

Dyskusja

Po opanowaniu, technika ta pozwoli na celowanie w zidentyfikowane neurony, w tym pojedyncze aksony, w celu rejestracji in vivo w wielu systemach modelowych. Ponadto technika ta umożliwia niezawodną rejestrację aktywności impulsowej neuronów o unikalnych cechach anatomicznych, które sprawiają, że tradycyjne metody rejestracji in vivo są trudne do zastosowania. Wykorzystaliśmy tę technikę do rejestracji z „małych komórek” ELa u ryb mormiryd słabo elektrycznych. Poprzednie próby zbadania właściwości strojenia „małych komórek” zakończyły się niepowodzeniem ze względu na trudne warunki rejestracji^{11, 14}. Podobne cechy anatomiczne stanowią bariery w uzyskaniu rejestracji pojedynczych jednostek z wielu różnych słuchowych i elektrosensorycznych neuronów kręgowców^8-10. Aby pokonać te trudności w naszym systemie, wykorzystaliśmy fakt, że „małe komórki” są jedynymi komórkami w ELa, które rzutują do ELp. Zatem transport wsteczny barwnika wprowadzonego do ELp ogranicza znakowanie w ELa do som i aksonów „małych komórek”. Fluorescencyjne znakowanie aksonów umożliwiło precyzyjne umieszczenie elektrody obok znakowanych aksonów, co pozwoliło na rejestrację pojedynczych jednostek z zidentyfikowanych komórek pomimo niedostępności som. Próbowaliśmy dokonać rejestracji somatycznej, lecz nie odnieśliśmy sukcesu, prawdopodobnie z powodu otaczających je synaps pochłaniających^11,17. Jednakże znakowanie somatyczne było wyraźnie widoczne, co sugeruje, że technika ta mogłaby zostać wykorzystana do celowanej rejestracji somatycznej w innych typach komórek i innych obwodach. Fluorescencyjne znakowanie neuronów poprzez transport wsteczny in vivo było stosowane do prowadzenia celowanych rejestracji in vitro^19-21. Podobna technika została wykorzystana do celowanych rejestracji in vivo z neuronów ruchowych w rdzeniu kręgowym danio pręgowanego²². Nasza praca stanowi nowatorskie rozwinięcie tego podejścia, w którym zarówno znakowanie, jak i rejestracja są przeprowadzane in vivo w obrębie mózgu. Nasza metoda wykazuje, że znakowanie obszarów OUN in vivo za pomocą znacznika wstecznego może zostać rozszerzone na badanie innych nienaruszonych obwodów z podobnie selektywnymi neuronami projekcyjnymi. Na przykład w ssaczym przetwarzaniu słuchowym wzgórze dolne (IC) służy jako ważne centrum przekaźnikowe dla sygnałów z wielu struktur rombencefalicznych²³. Iniekcja barwnika do IC selektywnie oznakowałaby komórki projekcyjne z każdego z tych jąder. Wzgórze górne (SC) pełni podobną funkcję w przypadku wzroku²⁴. Preparaty rdzenia kręgowego są szczególnie odpowiednie do tej techniki, ponieważ rdzeń kręgowy jest łatwo dostępny, iniekcja barwnika może odbywać się daleko od miejsca rejestracji, a metodę tę można połączyć z rejestracją wewnątrzkomórkową i wypełnianiem wybranych neuronów w celu uzyskania bardziej szczegółowych informacji anatomicznych²⁵. Wreszcie, śledzenie szlaków (tract-tracing) jest uznaną techniką stosowaną w całym ośrodkowym układzie nerwowym do mapowania złożonych obwodów²⁶. Nasza metoda może zostać wykorzystana do dodania informacji funkcjonalnych do tych badań, tak jak miało to miejsce w przypadku wskaźników wrażliwych na wapń w korze wzrokowej kota²⁷.

Zabieg chirurgiczny, który jest dobrze ugruntowany, niezawodny i regularnie stosowany do ślepych rejestracji in vivo ¹⁶, musi zostać przeprowadzony przy minimalnym krwawieniu i bez uszkodzenia powierzchni mózgu, aby zapewnić przeżycie zwierzęcia i tkanki. Dzięki praktyce operacja i aplikacja barwnika mogą zostać ukończone w ciągu 30-45 minut. Pomyślnie oznakowaliśmy aksony „małych komórek” w 67% preparatów. Większość preparatów posiada tylko 1 lub 2 widoczne oznakowane aksony, ale niektóre mają ich aż 8. Z 119 prób rejestracji oznakowanych jednostek uzyskaliśmy rejestracje pojedynczych jednostek z 26 jednostek rozmieszczonych w 12 preparatach (Tabela 2). Zatem dane zostały zebrane z 41% preparatów z oznakowanymi aksonami, co daje całkowity wskaźnik sukcesu na poziomie 28%.

Kluczowym aspektem aplikacji barwnika jest głębokość znakowania. Płytkie wprowadzenie drutu wolframowego spowoduje wypłukanie barwnika. Jednakże, jeśli penetracja będzie zbyt głęboka, znakowane aksony nie będą widoczne do celowania. Ponadto, aby barwnik został odpowiednio pobrany, musi nastąpić pewne uszkodzenie mechaniczne komórki^{25, 28}. Zbyt duże uszkodzenie doprowadzi jednak do śmierci komórek. Próbowaliśmy znakowania przy użyciu innych barwników i metod (Tabela 2), w tym znakowania anterogradnego poprzez wstrzyknięcie barwnika do ELa wraz z rejestracją z znakowanych aksonów w ELp (Tabela 3). Hipotetyzujemy, że znakowanie anterogradne nie powiodło się, ponieważ znakowanie ograniczyło się do komórek z uszkodzeniami somatycznymi, co uczyniło je nieodpowiednimi. Dodatkowo, terminale presynaptyczne mogły zostać zaburzone. W przeciwieństwie do tego, znakowanie retrogradne minimalizuje oba te problemy. Ilość i miejsce aplikacji barwnika można modyfikować w zależności od badanego obwodu. Maksymalne znakowanie występuje przy najwyższym stężeniu barwnika, co osiągnęliśmy stosując powlekane druty wolframowe. Jednak w przypadku znakowania aksonów o głębokich projekcjach, barwnik może odpadać z igły wolframowej podczas jej wprowadzania. W takich przypadkach bardziej odpowiednie byłoby wstrzykiwanie ciśnieniowe. Pobieranie i transport barwnika są szybkie; w naszej preparacji znakowane aksony były widoczne już 2 godziny po wstrzyknięciu, a dodatkowe znakowane aksony pojawiały się do 6 godzin po wstrzyknięciu. Zatem znakowanie i rejestracja mogą zostać przeprowadzone w ciągu jednego dnia, co eliminuje trudności techniczne związane z operacjami przeżyciowymi. Czas trwania będzie się różnił dla każdej aplikacji w zależności od odległości wymaganej do transportu barwnika.

Kolejnym krytycznym aspektem jest rozmieszczenie elektrod. Ważne jest, aby wprowadzić je do tkanki w pobliżu miejsca znajdującego się znakowanego aksonu, aby zapobiec zapchaniu końcówki. W przypadku tkanek gęstych, takich jak w ELa, długa i cienka trzpienie elektrody rejestrującej minimalizuje nadmierny ruch otaczającej tkanki. Jeśli rejestracja nie powiedzie się przy pierwszej próbie, należy powtórzyć czynność z nowymi elektrodami, aż do uzyskania sygnału lub do momentu, w którym tkanka zostanie uszkodzona w stopniu uniemożliwiającym widoczność aksonu. Należy jednak również szybko umieścić elektrodę obok aksonu, aby zminimalizować czas ekspozycji na fluorescencję, która może powodować fototoksyczność, blaknięcie i wpływać na właściwości fizjologiczne komórki^29-31.

Po pomyślnym zassaniu segmentu aksonu do elektrody rejestrującej, pomiary mogą być prowadzone przez kilka godzin. Jeśli jednostki są konsekwentnie tracone w czasie krótszym niż 1 h, należy rozważyć wykonanie mniejszych końcówek elektrod, aby zapobiec wysunięciu się aksonu. Z drugiej strony, zbyt mała końcówka może prowadzić do zapchania, niskiego stosunku sygnału do szumu lub uszkodzenia aksonu. Stały spadek amplitudy potencjału czynnościowego i „powrót” jednostki po zastosowaniu dodatkowego ssania świadczą o tym, że końcówka jest zbyt duża. Zbyt silne ssanie może spowodować nieodwracalne uszkodzenie aksonu. Jednym z rozwiązań jest dopuszczenie niewielkiego wycieku w linii powietrznej, aby ciśnienie powoli wracało do zera. Gwałtowna wyrównanie ciśnienia spowoduje przejściowy względny „wyrzut” na zewnątrz, który może wypchnąć akson.

Choć technika ta stanowi istotną zaletę w uzyskiwaniu ukierunkowanych rejestracji z zidentyfikowanych neuronów projekcyjnych, nie będzie ona użyteczna do rozróżnienia lokalnych interneuronów, ponieważ barwnik zostałby pobrany przez wszystkie typy komórek w miejscu iniekcji. Teoretycznie zastosowanie wielu fluoroforów z oddzielnymi miejscami iniekcji może pozwolić na rozszerzenie tej metody. Na przykład porównanie znakowania pojedynczego i podwójnego mogłoby zostać wykorzystane do rozróżnienia interneuronów od neuronów projekcyjnych po podwójnych iniekcjach w dwóch punktach obwodu³². Podobnie znaczniki retrogradne można łączyć z innymi zaawansowanymi technikami obrazowania, takimi jak obrazowanie dwufotonowe, co zastosowano niedawno w centrum wysokich wokalizacji (HVc) kanarka zebra³². Ponadto obszary rejestracji są ograniczone do tych położonych blisko powierzchni przy użyciu mikroskopów epifluorescencyjnych, ponieważ byliśmy w stanie rozdzielić struktury o wielkości 1 μm jedynie w obrębie pierwszych 30 μm tkanki. Jednak głębokość tę można by zwiększyć poprzez zastosowanie innych technik mikroskopowych, takich jak mikroskopia dwufotonowa³³ lub mikroskopia z płaskim oświetleniem sprzężonym z obiektywem³⁴. Ogólnie rzecz biorąc, technika ta stanowi ważny postęp w badaniu obwodów neuronalnych in vivo, ponieważ może być wykorzystana do rejestracji z pojedynczych neuronów w wielu różnych obwodach w różnorodnych systemach modelowych – w tym w tych, które są stosunkowo niedostępne.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Metanosulfonian trikainy	Sigma-Aldrich	E10521	MS-222
jodopeptyd gallaminy	Sigma-Aldrich	G8134	Flaxedil
Chlorowodorek lidokainy	Sigma-Aldrich	L5647
Hickman’roztwór Ringera	Brak danych	Brak danych	NaCl (6,48 g/l), KCl (0,15 g/l), CaCl2•2H20 (0,29 g/l), MgSO4 (0,12 g/l), NaHCO33 (0,084 g/l), NaH2PO4 (0,06 g/l)
Pompa perystaltyczna	Gilson lub Rainin	Minipulse 3 Model 312; RP-1	10.0 ± 1,0 obr./min; alternatywnie linia zasilana grawitacyjnie z przepływomierzem
Mikroskop stereoskopowy	Nikon	SM2645
Klej błyskawiczny	Super Glue Corporation	SGH2	probówka 2 g
Omni Drill 35	World Precision Instruments	503-598
Wiertło węglikowe z głowicą kulistą #1/4	World Precision Instruments	501860	0,19 DIA (średnica wiertła = 0,48 mm)
Zestaw do kauteryzacji niskotemperaturowej	World Precision Instruments	500391
Manualny mikromanipulator	World Precision Instruments	M3301R
Dextran sprzężony z Alexa Fluor 568	Invitrogen	D-22912	stężenie 2 mM; 10 000 MW. Należy dobrać długość fali barwnika tak, aby odpowiadała ustawieniom filtrów mikroskopu
Mikroskop epifluorescencyjny	Nikon	E600 FN	Akcesorium do zdalnego ustawiania ostrości jest pomocne przy precyzyjnym ustawianiu ostrości filtra TRITC – lub odpowiedniego filtra dopasowanego do płaszczyzn ogniskowych dla różnych długości fal barwników
Obiektyw małej mocy	Nikon	93182	CFI Plan Achromat Series, 4X N.A. 0,1, W.D. 30 mm
Obiektyw o dużej powiększeniu	Nikon	93148	CFI Fluor Series, 40X WI N.A. 0.8, W.D. 2,0 mm
Źródło białego światła	Dolan-Jenner	Model 190	Iluminator światłowodowy
Fluorescencyjne źródło światła	Lumen Dynamics	X-Cite 120Q
Kamera do niskiego poziomu oświetlenia	Fotometria	CoolSnap ES
Manometr cyfrowy	Omega Engineering	HHP-201
Zmotoryzowany mikromanipulator	Sutter Instruments	MP-285
Przedwzmacniacz głowicowy	Molecular Devices	CV-7B	Axon Instruments
Wzmacniacz	Molecular Devices	MultiClamp 700B	Axon Instruments
System akwizycji danych	Molecular Devices	Digidata 1322A	Axon Instruments
Izolowany stymulator impulsowy	A-M Systems	2100
Wytciągacz mikrokapilar metodą wypalania (Browna)	Sutter Instruments	P-97	Ustawienia programu dla naszej aplikacji: Grzanie: ramp + 1, Wyciąganie: ’0’, Prędkość: 60, Czas: 90 Pudełko z filamentem
Pipeta szklana	World Precision Instruments	1B100F-4	Kapilara borokrzemowa z włóknem (średnica zewnętrzna 1 mm, średnica wewnętrzna 0,58 mm)