Wsteczne znakowanie fluorescencyjne pozwala na ukierunkowany zewnątrzkomórkowy zapis pojedynczej jednostki ze zidentyfikowanych neuronów in vivo

Summary

Wsteczny transport barwnika fluorescencyjnego oznacza subpopulację neuronów na podstawie projekcji anatomicznej. Znakowane aksony mogą być wizualnie celowane in vivo, co pozwala na zewnątrzkomórkowy zapis ze zidentyfikowanych aksonów. Technika ta ułatwia rejestrację, gdy neurony nie mogą być oznaczone za pomocą manipulacji genetycznej lub są trudne do wyizolowania przy użyciu "ślepych" podejść in vivo.

Abstract

Ogólnym celem tej metody jest rejestrowanie odpowiedzi pojedynczej jednostki z zidentyfikowanej populacji neuronów. Zapisy elektrofizjologiczne in vivo z poszczególnych neuronów mają kluczowe znaczenie dla zrozumienia, jak obwody neuronalne funkcjonują w warunkach naturalnych. Tradycyjnie, nagrania te były wykonywane "na ślepo", co oznacza, że tożsamość nagranej komórki jest nieznana na początku nagrania. Tożsamość komórkową można następnie określić za pomocą wewnątrzkomórkowej¹, juxtacellular² lub luźnej jonoforezy barwnika z luźną plamą³, ale zapisy te nie mogą być wstępnie ukierunkowane na określone neurony w regionach o funkcjonalnie heterogenicznych typach komórek. Białka fluorescencyjne mogą ulegać ekspresji w sposób specyficzny dla typu komórki, co pozwala na wizualnie sterowaną elektrofizjologię pojedynczych komórek^4-6. Istnieje jednak wiele systemów modelowych, dla których te narzędzia genetyczne nie są dostępne. Nawet w genetycznie dostępnych systemach modelowych pożądany promotor może być nieznany lub genetycznie jednorodne neurony mogą mieć różne wzorce projekcji. Podobnie, wektory wirusowe zostały użyte do oznaczania określonych podgrup neuronów projekcyjnych⁷, ale zastosowanie tej metody jest ograniczone przez toksyczność i brak swoistości transsynaptycznej. W związku z tym potrzebne są dodatkowe techniki, które oferują specyficzną wizualizację wstępną do rejestrowania ze zidentyfikowanych pojedynczych neuronów in vivo. Wstępna wizualizacja docelowego neuronu jest szczególnie przydatna w trudnych warunkach nagrywania, dla których klasyczne zapisy jednokomórkowe są często zbyt trudne^8-11. Nowatorska technika opisana w tym artykule wykorzystuje wsteczny transport barwnika fluorescencyjnego nałożonego za pomocą igieł wolframowych w celu szybkiego i selektywnego znakowania określonego podzbioru komórek w określonym regionie mózgu w oparciu o ich unikalne projekcje aksonalne, zapewniając w ten sposób wizualną wskazówkę do uzyskania ukierunkowanych zapisów elektrofizjologicznych ze zidentyfikowanych neuronów w nienaruszonym obwodzie w OUN kręgowców.

Najbardziej znaczącym postępem naszej metody jest użycie znakowania fluorescencyjnego do celowania w określone typy komórek w niedostępnym genetycznie systemie modelowym. Słabo elektryczne ryby są doskonałym systemem modelowym do badania obwodów neuronowych u obudzonych, zachowujących się zwierząt¹². Wykorzystaliśmy tę technikę do badania przetwarzania sensorycznego przez "małe komórki" w przednim jądrze zewnętrznym (ELa) słabo elektrycznych ryb mormyrydów. Przypuszcza się, że "małe komórki" są neuronami komparującymi czas, ważnymi dla wykrywania submilisekundowych różnic w czasach nadejścia impulsów presynaptycznych¹³. Jednak cechy anatomiczne, takie jak gęsta mielina, pochłaniające synapsy i małe ciała komórkowe, sprawiły, że niezwykle trudno jest rejestrować z tych komórek przy użyciu tradycyjnych metod^{11, 14}. Tutaj pokazujemy, że nasza nowatorska metoda selektywnie znakuje te komórki w 28% preparatów, co pozwala na wiarygodne, solidne zapisy i charakterystykę reakcji na stymulację elektrosensoryczną.

Protocol

1. Przygotuj igły pokryte barwnikiem

1. Naostrzyć elektrolitycznie drut wolframowy o średnicy 160 μm¹⁵. Końcowe średnice końcówek igieł powinny wynosić od 5 do 50 μm. Liczba potrzebnych igieł zależy od wielkości obszaru, który jest oznaczany. Przygotowaliśmy 5 igieł do 3-5 iniekcji do jądra tylnego zewnątrzbocznego (ELp).
2. W noc poprzedzającą eksperyment umieść kroplę (<0,25 μl) 2 mM barwnika Alexa Fluor 10 000 MW sprzężonego z dekstranem na dystalnych 100 μm każdej igły.
3. Pozostaw igły do wyschnięcia na powietrzu w temperaturze pokojowej, pozostawiając skoncentrowany barwnik na końcówce. Igły należy przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemnym pojemniku w celu ochrony przed światłem.

2. Przygotowanie zwierzęcia do operacji

1. Wywołaj znieczulenie ogólne, umieszczając ryby w roztworze 300 mg/l MS-222 w wodzie w zbiorniku.
2. Zważyć rybę i zmierzyć długość wideł (od czubka pyska do widełek płetwy ogonowej) i głębokość ciała (maksymalna odległość grzbietowo-brzuszna w płaszczyźnie poprzecznej). Pomiary te powinny mieścić się w zakresach wskazanych w tabeli 1, tak aby ryba zmieściła się w komorze rejestracyjnej wystarczająco małej, aby można ją było umieścić pod obiektywem mikroskopu zanurzeniowego w wodzie (rysunek 1).
3. Unieruchomić i wyciszyć elektrycznie rybę, wstrzykując 100 μl 3 mg/ml flaxedilu w mięśnie grzbietowe ciała.
4. Napełnij komorę nagrywania (rysunek 1A) wodą ze zbiornika. Umieść rybę brzusznie do dołu na platformie pośrodku komory (ryc. 1). Dostarczyć napowietrzony roztwór 100 mg/l MS-222 za pomocą końcówki pipety umieszczonej w pysku ryby (1-2 ml/min). Ustabilizuj rybę za pomocą prętów zamocowanych w wosku umieszczonych po obu stronach ciała (ryc. 1C). Monitoruj zdrowie ryb, sprawdzając ciągły przepływ krwi w naczyniach ocznych i normalny kolor ciała.
5. Obróć platformę wzdłuż jej długiej osi i opuść tylny koniec platformy tak, aby jedna strona grzbietowej powierzchni głowy ryby była odsłonięta nad wodą, podczas gdy reszta ciała ryby pozostała zanurzona. Mały kawałek Kimwipe należy umieścić na dowolnej niezanurzonej części skóry, aby zapobiec wysuszeniu.

3. Chirurgia (Rysunek 2)

Podstawowa procedura chirurgiczna opisana tutaj jest dobrze znana i niezawodnie stosowana do ślepych zapisów in vivo u mormyridów¹⁶. W przypadku innych aplikacji uwidocznij żądane regiony do etykietowania i nagrywania. Obszar zawierający zakończenia aksonów komórek będących przedmiotem zainteresowania musi być dostępny za pomocą igły pokrytej barwnikiem. Obszar zawierający więcej proksymalnych segmentów tych samych aksonów musi mieć wystarczającą przestrzeń nad tkanką, aby pomieścić odległość roboczą soczewki zanurzonej w wodzie (w naszym przypadku 2 mm).

1. Nałóż 0,4% roztwór lidokainy na odsłoniętą powierzchnię głowy za pomocą patyczka higienicznego.
2. Za pomocą ostrza skalpela przetnij obwód prostokątnego kawałka skóry. Usuń prostokąt za pomocą kleszczy. Rozmiar prostokąta będzie skalowany wraz z rozmiarem ryby, ale powinien wynosić około 3 mm X 5 mm dla ryby o długości 6,2 cm (rysunek 2A). Boczna krawędź prostokąta powinna być wyrównana ze środkiem oka, przednia krawędź prostokąta powinna znajdować się tuż za okiem, a środkowa krawędź prostokąta powinna znajdować się tuż obok linii środkowej ryby.
3. Rozszerz odsłonięty obszar czaszki przednio-przyśrodkowo, aby odsłonić dodatkowy kwadratowy obszar o średnicy 2,5 mm bez zachodzenia na siebie (ryc. 2B).
4. Całkowicie oczyść i osusz odsłoniętą powierzchnię czaszki za pomocą ostrza skalpela, aby zeskrobać nadmiar tkanki i chusteczek Kimwipes oraz wymuszone powietrze w celu wysuszenia powierzchni (ryc. 2C).
5. Przyklej metalowy słupek do odsłoniętego przednio-przyśrodkowego obszaru czaszki za pomocą Super Glue. Poczekaj, aż klej całkowicie wyschnie (rysunek 2D).
6. Usuń prostokąt czaszki o wymiarach około 2 mm x 4 mm w przypadku ryby o średnicy 6,2 cm. Użyj wiertła dentystycznego z końcówką z węglika spiekanego o średnicy ~0,5 mm, aby rozrzedzić obwód prostokąta. Następnie, za pomocą skalpela i kleszczy, odetnij obwód prostokąta i oderwij go, aby odsłonić leżący pod spodem mózg. Dodatkowe wiercenie lub cięcie małymi nożyczkami może być konieczne, aby w pełni odsłonić EL (Rysunek 2E). Jeśli dojdzie do krwawienia mięśniowego, można użyć urządzenia do elektrokoagulacji.
7. Odetnij zarówno oponę twardą (pigmentowaną), jak i pia mater (przezroczystą) za pomocą nożyczek sprężynowych lub igły i usuń odcięte części za pomocą kleszczy. Przednia i tylna część jądra zewnątrzstronnego (EL) są teraz widoczne, odpowiednio ELa i ELp (ryc. 3A).

4. Wsteczne oznaczanie interesujących aksonów

1. Umieść manipulator z igłą pokrytą barwnikiem (wykonaną w kroku 1) nad obszarem docelowym zawierającym interesujące nas aksony, w naszym przypadku ELp.
2. Szybko wprowadzić igłę na około 25 μm do tkanki. Odczekaj 15-30 sekund, aż cały barwnik odpadnie, a następnie wycofaj igłę.
3. W razie potrzeby powtórz z dodatkowymi świeżymi igłami, umieszczając każdą z nich w innym miejscu, tak aby barwnik był rozprowadzony w całym obszarze docelowym. Używaliśmy 3-5 igieł na preparat
.
4. Wypłucz nadmiar barwnika z jamy roztworem Dzwonka Hickmana.
5. Odczekaj co najmniej 2 godziny na pobranie i transport barwnika.

5. Wizualizacja interesujących aksonów

1. Umieść komorę zapisu wraz z rybą pod obiektywem pionowego mikroskopu epifluorescencyjnego o stałym stoliku. Ponieważ ciało ryby zasłania przenikanie światła, z góry muszą pochodzić zarówno białe, jak i fluorescencyjne źródła światła. Staranne umieszczenie światłowodowego źródła światła nad jamą czaszki pozwala na uzyskanie zadowalających obrazów w jasnym polu. W przypadku oglądania epifluorescencji specyfikacje filtra fluorescencyjnego powinny odpowiadać widmu absorpcyjnemu/emisyjnemu barwnika.
2. Przełącz oddychanie na świeżą wodę w zbiorniku i utrzymuj to samo natężenie przepływu. Umieść przewód uziemiający w odsłoniętej jamie mózgowej i podłącz do uziemienia sceny głównej nagrywającej (patrz 6.3).
3. Umieść parę elektrod rejestrujących obok podstawy ogona i podłącz do wzmacniacza różnicowego i urządzenia rejestrującego (np. monitora audio, oscyloskopu lub komputera) w celu monitorowania polecenia wyładowania elektrycznego narządu (EODC). Po tym, jak ryba wyzdrowieje ze znieczulenia, EODC może być używany jako wskaźnik stanu ryby.
4. Przygotuj przeskalowany szkic obszaru mózgu oglądanego w małym powiększeniu. Uwzględnij główne naczynia krwionośne jako punkty orientacyjne (mogą się różnić w zależności od ryby), aby określić dokładną lokalizację oznaczonych aksonów widocznych tylko w dużym powiększeniu (ryc. 3D).
5. Potwierdź umieszczenie barwnika. Najpierw wyświetl całą tkankę z oświetleniem w jasnym polu w celu orientacji (ryc. 3A). Następnie view z oświetleniem fluorescencyjnym (Rysunek 3B). ELp będzie miał oznakowanie rozproszone (rysunki 3B i 3C). Zminimalizuj wzbudzenie fluorescencji, aby ograniczyć fotodynamiczne i fototoksyczne działanie barwnika.
6. Użyj statków jako punktów orientacyjnych, aby zlokalizować ELa w dużym powiększeniu. Oświetl światłem fluorescencyjnym, szukając oznaczonego aksonu w pobliżu powierzchni. (Rysunek 4).

6. Rejestruj aktywność zewnątrzkomórkową

1. Wyciągnij elektrody rejestrujące ssanie za pomocą 1 mm OD, 0,58 mm ID borokrzemianowego szkła kapilarnego z żarnikiem. Idealny rozmiar końcówki będzie zależał od średnicy aksonów celu, która w naszym przypadku wynosi 0,1-0,2 μm¹⁷. W naszym zastosowaniu średnice końcówek elektrod wynosiły od 1,5 ± 0,4 μm (zakres: 1,0-2,4 μm) z wąskim trzonkiem o długości 5 mm, aby zbliżyć się do znakowanych aksonów bez przesuwania otaczającej gęsto upakowanej tkanki.
2. Napełnij elektrody przefiltrowanym roztworem dzwonka Hickmana. Końcowa rezystancja końcówki wynosi 45,2 ± 38,0 MΩ (zakres: od 16 do 155 MΩ).
3. Umieść elektrodę w uchwycie elektrody z portem ciśnieniowym i podłącz ją do amplifier headstage zamontowany na manipulatorze. Poprowadź przewód ciśnieniowy od portu ciśnieniowego do trójnika zakończonego odpowiednio manometrem i strzykawką do monitorowania i kontrolowania ciśnienia.
4. Podłącz scenę czołową do amplifier i analogowo-cyfrowe urządzenie akwizycyjne.
5. Przy ciśnieniu zewnętrznym 30 mbar w linii elektrody, umieść elektrodę obok oznaczonego aksonu. Kamera o słabym oświetleniu połączona z oprogramowaniem do obrazowania służy do wizualizacji umieszczania pipet. Zacznij w pobliżu powierzchni tkanki i przesuń elektrodę w kierunku aksonu. W miarę zbliżania się do aksonu, nacisk na zewnątrz powinien powodować niewielki, ale zauważalny ruch aksonu.
6. Podczas gdy elektroda znajduje się obok aksonu (rysunek 4A, u góry), rejestruj potencjał na elektrodzie, prezentując bodźce testowe (w naszym przypadku użyliśmy 100 ms jednofazowych dodatnich i ujemnych impulsów poprzecznych o intensywności 20 mV/cm; Rysunek 1A). Nie należy obserwować potencjałów czynnościowych, chociaż artefakt elektryczny potwierdza prawidłowe rejestrowanie/stymulację (Rysunek 4A, na dole).
7. Zwolnij ciśnienie zewnętrzne w elektrodzie i powtórz stymulację/nagranie. Nadal nie należy obserwować potencjałów czynnościowych (ryc. 4B).
8. Zastosuj lekkie (125 ± 25 mbar) ssanie do elektrody i powtórz stymulację/rejestrację. Potencjały czynnościowe powinny być teraz obserwowane w odpowiedzi na stymulację (ryc. 4C). Może również wystąpić spontaniczna aktywność. Jeśli potencjały czynnościowe nie są obserwowane, zwolnij ssanie, wyczyść elektrodę pod lekkim naciskiem, lekko przesuń elektrodę i spróbuj ponownie zassać. Gdy potencjały czynnościowe są widoczne, zamknij przewód ciśnieniowy.
9. Stymuluj i nagrywaj według uznania.

7. Zakończenie i usunięcie

1. Po zakończeniu wszystkich żądanych zapisów przełącz się na oddychanie za pomocą 100 mg/L MS-222, aż EODC się zatrzyma. Przez co najmniej 10 minut nie powinno być wykrywane żadne EODC.
2. Utylizować ryby zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi i zatwierdzonymi protokołami opieki nad zwierzętami.

8. Reprezentatywne wyniki

Dla naszej konkretnej aplikacji, jesteśmy zainteresowani badaniem kodowania bodźców przez centralne neurony czuciowe. Udane nagrania z oznakowanych aksonów pozwalają na analizę reakcji pojedynczych jednostek na stymulację sensoryczną¹⁸. Rysunek 5A przedstawia reprezentatywne potencjały czynnościowe wywołane przez poprzeczną stymulację elektrosensoryczną za pomocą elektrod bipolarnych umieszczonych po wewnętrznej stronie lewej i prawej ściany komory rejestracyjnej. Czasy skoków można przedstawić jako wykres rastrowy spajków (Rysunek 5B). Okno rejestracji przed bodźcem trwające 25 ms pokazuje niski poziom spontanicznej aktywności. Ta konkretna "mała komórka" ELa jest długoprzepustowa dostrojona do czasu trwania bodźca przy intensywności bodźca 6 mV/cm, zwiększając liczbę skoków na powtórzenie wraz ze wzrostem czasu trwania bodźca (ryc. 5C). Średnie opóźnienie pierwszego skoku wynosi 4,28 ± 0,16 ms, co jest zgodne z oczekiwanym opóźnieniem dla małych komórek w ELa¹¹.

Rysunek 1. Specyfikacja komory rejestracyjnej, która może zmieścić się pod obiektywem mikroskopu epifluorescencyjnego o stałym stoliku. (A) Kwadratowa komora zapisu wykonana z pleksi pokazująca widok z góry, z boku i z tyłu. Sparowane zestawy elektrod stymulujących (gwiazdek) na obrzeżach pozwalają na stymulację poprzeczną (czerwono-czarną) lub podłużną (niebiesko-żółtą). Dodatkowy kawałek pleksi w rogu, z wyłożonym gumą otworem pośrodku (pomarańczowy), mieści pipetę ssącą, która utrzymuje stały poziom wody. Dwa pionowe słupki ze stali nierdzewnej wkręcane w dno komory (świeci na zielono) łączą się ze słupkami ze stali nierdzewnej (zielony obrys) przymocowanymi do platformy podtrzymującej rybę (jasnoszary, szczegółowo opisany w C) za pomocą regulowanych zacisków talerzowych. Zdjęcie komory pokazane jest poniżej rysunku w skali. (B) Indywidualne i zmontowane widoki okrągłych zacisków tarczowych z tworzywa sztucznego używanych do mocowania platformy do słupków pionowych. Każdy zacisk tarczowy ma rowek (zielony) na słupek i środkowy otwór na dokręcającą. Zaciski tarczowe są obracane tak, aby rowki były prostopadłe do siebie. Dokręcenie (czerwonej) zaciska słupki na miejscu, aby zapobiec dalszemu ruchowi pionowemu i obrotowemu platformy. (C) Widok z przodu i z boku na bok platformy z pleksiglasu używanej do utrzymywania ryb w miejscu. Platforma jest pokryta warstwą wosku parafinowego (niebieskiego), która utrzymuje drewniane kołki (czarne pręty) na miejscu, aby podeprzeć rybę. Rurka do oddychania ryby przechodzi przez otwór w "wezgłowiu" platformy i kończy się końcówką pipety umieszczoną w pysku ryby. Słupek główny ze stali nierdzewnej (szary pręt) łączy się z platformą za pomocą przegubu kulowego, który umożliwia obrót o 360 stopni. Poziome słupki ze stali nierdzewnej (zielone) są przykręcane do obu końców platformy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

Rysunek 2. Schematyczny przegląd operacji patrząc w dół na grzbietową powierzchnię głowy. (A) Wykonaj cztery cięcia, we wskazanej kolejności, aby usunąć prostokątny kawałek skóry (czerwony). (B) Przedłuż otwór przednio-przyśrodkowo, aby usunąć dodatkowy prostokątny kawałek skóry (zielony). (C) Zeskrob pozostały tłuszcz lub więzadła, przesuwając ostrze skalpela zgodnie ze strzałką i całkowicie osusz powierzchnię chusteczkami Kimwipes i wymuszonym powietrzem. (D) Przyklej słupek ze stali nierdzewnej do czaszki za pomocą Super Glue. Podziałka liniowa w A ma zastosowanie do A-D. (E) Za pomocą wiertła dentystycznego wykonaj cztery nacięcia, we wskazanej kolejności, aby usunąć prostokątny kawałek kości (niebieski), odsłaniając przednie i tylne jądro zewnątrzboczne (odpowiednio ELa i ELp). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

Rysunek 3. Znakowanie fluorescencyjne w tylnym jądrze zewnątrzbocznym 3 godziny po wstrzyknięciu Alexa Fluor 568 sprzężonego z dekstranem. (A) Jądra przednie i tylne zewnątrzboczne (odpowiednio ELa i ELp) uwidocznione przy jasnym oświetleniu pola z góry. Należy zauważyć, że rozległa mielinizacja w obrębie ELa nadaje mu stosunkowo jasny wygląd, który odróżnia go od ELp. (B) Ten sam obszar uwidoczniony za pomocą epifluorescencji oglądany przez filtr TRITC. (C) Scalony obraz z użyciem koloru niebieskiego dla A (jasne pole) i czerwonego dla B (TRITC). (D) Przykład skalowanego rysunku ELa i ELp, w tym głównych naczyń krwionośnych (czerwone linie), które mogą być wykorzystane jako punkty orientacyjne do określenia dokładnej lokalizacji znakowanych aksonów widocznych tylko w dużym powiększeniu (dokładna lokalizacja naczyń krwionośnych różni się w zależności od ryby). Linia przerywana wyznacza granicę między ELa i ELp. (E) Przykładowe obrazy uzyskane przy użyciu filtra TRITC z 5 różnych preparatów ilustrujących szereg udanych wzorców znakowania aksonów małych komórek i somy w ELa. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

Rysunek 4. Jednojednostkowy zapis zewnątrzkomórkowy z oznakowanego aksonu. (A) Elektroda rejestrująca (grot strzałki) pod dodatnim ciśnieniem umieszczona w sąsiedztwie oznakowanego aksonu małej komórki w ELa (na górze) rejestruje tylko artefakt krawędziowy (groty strzałek) w odpowiedzi na jednofazowy, kontralateralno-dodatni, poprzeczny impuls kwadratowy o długości 100 ms 20 mV/cm (na dole). (B) Uwolnienie ciśnienia na zewnątrz elektrody (grot strzałki) powoduje, że akson przesuwa się lekko w kierunku elektrody (na górze), ale nadal nie ma reakcji na bodziec (na dole). (C) Lekkie podciśnienie wciąga akson do elektrody (góra, grot strzały) i potencjały czynnościowe w odpowiedzi na nadejście bodźca są teraz widoczne (dół, gwiazdka). Dolne części wszystkich trzech paneli są nałożonymi odpowiedziami na 20 powtórzeń bodźca. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

Rysunek 5. Reprezentatywne wyniki przy użyciu tej techniki. (A) 5 śladów próbki wykazujących potencjały czynnościowe wywołane przez monofazowy, kontralateralno-dodatni, poprzeczny impuls impulsowy o długości 0,1 ms 6 mV/cm. (B) Wykres rastrowy przedstawiający czasy skoków podczas 20 powtórzeń okna zapisu trwającego 75 ms dla tej samej jednostki stymulowanej w czasie 0 bodźcami 6 mV/cm w zakresie czasu trwania podanym po prawej stronie. (C) Krzywa dostrajania czasu trwania określająca ilościowo reakcje wyświetlane w rastrze jako skoki na powtórzenie bodźca. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

  Masa (g) Długość widelca (cm) Głębokość korpusu (cm) znaczyć Godzina 2,42 O godz. 6.20 Pytanie 1,14 odchylenie standardowe 0,64 pkt. 0,52 pkt. 0,18 zakres 1,2-4,0 5,5-8,4 0,9-1,6

Tabela 1. Optymalna waga, długość i głębokość ciała dla ryb. Optymalna masa, długość wideł (od czubka pyska do widełek płetwy ogonowej) i głębokość ciała (maksymalna odległość grzbietowo-brzuszna w płaszczyźnie poprzecznej) mieszczą się ryby w komorze rejestracyjnej, co ilustruje rysunek 1. Ryby, które są zbyt małe, mogą mieć mniejsze szanse na przeżycie operacji i będą miały mały ELp, co utrudnia umieszczanie barwnika. Ryby, które są zbyt duże, będą miały duży, nadmiernie sięgający móżdżek, który ograniczy dostęp do ELa i ELp i może zapobiec obniżeniu celu o dużej mocy, zanurzenia w wodzie wystarczająco blisko, aby skupić się na ELa i ELp.

Strona aplikacji Rodzaj barwnika Próba połowu ryb Etykieta w ELa Etykieta w ELp Próby użycia jednostek Nagrania Ela Wstrzyknięcie Alexa Fluor Rozdział 32 26 (81,2%) 19 (59,4%) 50 Rozdział 4 (8,0%) Ela Bibuła filtracyjna nasączona Alexa Fluor 1 0 0 0 0 Ela Di-I w DMSO 8 6 (75,0%) 0 0 0 Ela Kryształy Di-O 5 3 (60,0%) 2 (40,0%) 9 0 Elp Solidne kryształy Alexa Fluor cyfra arabska 0 2 (100%) 0 0 Elp Przewody wolframowe Alexa powlekane fluorem Rozdział 43 29 (67,4%) 41 (95,3%) Rozdział 119 26 (21,8%)

Tabela 2. Wskaźniki sukcesu dla każdej metody wstrzykiwania barwnika. Wskaźniki sukcesu dla każdej metody wstrzykiwania barwnika. Metody są podzielone ze względu na miejsce wstrzyknięcia i rodzaj barwnika. Dla każdej metody pokazana jest całkowita liczba prób połowu ryb oraz odsetek tych eksperymentów, które zakończyły się pomyślnym oznakowaniem w ELa i ELp. Zwróć uwagę, że docelowy obszar nagrywania jest przeciwieństwem miejsca aplikacji (pogrubione pola). W przypadku miejsca wstrzyknięcia wychwyt barwnika uznano za skuteczny przy znakowaniu zarówno somy, jak i aksonów. Natomiast w miejscu rejestracji tylko preparaty z oznakowanymi aksonami zostały zaliczone jako udane eksperymenty z etykietowaniem. Pokazana jest również łączna liczba prób jednostek i procent tych jednostek, które zakończyły się udanymi nagraniami.

  # miejsc wstrzyknięć Średnia objętość na wstrzyknięcie (μl) Zakres objętości na wstrzyknięcie (μl) Średnia całkowita objętość wtrysku (μl) Zakres całkowitych objętości wtrysku (μl) Mikrowtryskiwacz z Hamiltonem 3 lub 4 0,144 pkt. 0,091 - 0,91 0,516 0,378 - 0,669 Nanoiniektor ze szklaną pipetą 2 - 4 0,069 (stały) Stała objętość wstrzykiwana 1-6 razy 0,621 pkt. 0,414 - 0,966 Mikroiniektor ze szklaną pipetą 2 - 6 0,093 pkt. 0,058 - 0,202 0,360 0,252 - 0,540

Tabela 3. Ilości barwnika zastosowanego dla każdej z trzech metod zastosowanych do wstrzyknięcia Alexa Fluor do ELa Ilości barwnika zastosowanego dla każdej z trzech metod zastosowanych do wstrzyknięcia Alexa Fluor do ELa (pierwsza metoda z tabeli 2). Wstrzyknięcie barwnika do ELa wykonano zarówno za pomocą nanoiniektora, jak i mikroiniektora przy użyciu igły strzykawkowej Hamiltona o rozmiarze 33 lub wyciągniętej szklanej pipety kapilarnej. Zmienialiśmy liczbę miejsc wstrzyknięcia, objętość na wstrzyknięcie i całkowitą objętość wstrzyknięcia barwnika.

Discussion

Po opanowaniu, technika ta pozwoli na celowanie w zidentyfikowane neurony, w tym pojedyncze aksony, w celu nagrań in vivo w wielu systemach modelowych. Ponadto technika ta pozwala na niezawodne rejestrowanie wyjścia impulsów z neuronów o unikalnych cechach anatomicznych, które sprawiają, że tradycyjne metody rejestracji in vivo są wyzwaniem. Wykorzystaliśmy tę technikę do nagrania z ELa "małych komórek" u ryb o słabym natężeniu elektrycznym. Poprzednie próby zbadania właściwości strojenia "małych komórek" zakończyły się niepowodzeniem ze względu na trudne warunki nagrywania^{11, 14}. Podobne cechy anatomiczne stwarzają bariery w uzyskiwaniu jednojednostkowych zapisów z wielu różnych neuronów słuchowych i elektrosensorycznych kręgowców^8-10. Aby sprostać tym wyzwaniom w naszym systemie, wykorzystaliśmy fakt, że "małe komórki" są jedynymi komórkami w ELa, które rzutują na ELp. Tak więc wsteczny transport barwnika umieszczonego w ELp ogranicza znakowanie w ELa do "małych komórek" somy i aksonów. Fluorescencyjne znakowanie aksonów pozwoliło na precyzyjne umieszczenie elektrod obok znakowanych aksonów, dzięki czemu możliwe są zapisy pojedynczych jednostek ze zidentyfikowanych komórek pomimo niedostępnych som. Próbowaliśmy nagrań somatycznych, ale nie powiodło się, prawdopodobnie z powodu otaczających synaps pochłaniających^11,17. Jednak znakowanie somatyczne było wyraźnie widoczne, co sugeruje, że technika ta może być wykorzystana do celowania w zapisy somatyczne w innych typach komórek i innych obwodach. Znakowanie fluorescencyjne neuronów poprzez transport wsteczny in vivo zostało wykorzystane do prowadzenia ukierunkowanych nagrań in vitro^19-21. Podobną technikę zastosowano do ukierunkowanych nagrań in vivo z neuronów ruchowych w rdzeniu kręgowym danio pręgowanego²². Nasza praca stanowi nowatorskie rozszerzenie tego podejścia, w którym zarówno etykietowanie, jak i rejestrowanie odbywa się in vivo w mózgu. Nasza metoda pokazuje, że znakowanie in vivo obszarów OUN za pomocą znacznika wstecznego można rozszerzyć na badanie innych nienaruszonych obwodów z podobnie selektywnymi neuronami projekcyjnymi. Na przykład w przetwarzaniu słuchowym ssaków wzgórek dolny (IC) służy jako ważne centrum przekaźnikowe dla danych wejściowych z wielu struktur rombencefalicznych²³. Wstrzyknięcie barwnika do układu scalonego selektywnie znakowałoby komórki projekcyjne z każdego z tych jąder. Wzgórek górny (SC) pełni podobną funkcję dla widzenia²⁴. Preparaty do badania rdzenia kręgowego są szczególnie dobrze przystosowane do tej techniki, ponieważ rdzeń kręgowy jest łatwo dostępny, wstrzyknięcie barwnika może nastąpić daleko od miejsca rejestracji i może być połączone z wewnątrzkomórkowym zapisem i wypełnieniem wybranych neuronów w celu uzyskania bardziej szczegółowych informacji anatomicznych²⁵. Wreszcie, śledzenie dróg jest dobrze ugruntowaną techniką stosowaną w całym ośrodkowym układzie nerwowym do mapowania złożonych obwodów²⁶. Nasza metoda może być wykorzystana do dodania informacji funkcjonalnych do tych badań, tak jak to zrobiono ze wskaźnikami wrażliwymi na wapń w korze wzrokowej kota²⁷.

Operacja, która jest dobrze ugruntowana, wiarygodna i regularnie stosowana do ślepych nagrań in vivo16, musi zostać zakończona przy minimalnym krwawieniu i bez uszkodzenia powierzchni mózgu, aby zwierzę i tkanka mogły przeżyć. Przy nabraniu wprawy zabieg i aplikację barwnika można wykonać w ciągu 30-45 minut. Udało nam się oznaczyć aksony "drobnokomórkowe" w 67% preparatów. Większość preparatów ma tylko 1 lub 2 widoczne oznaczone aksony, ale niektóre mają ich nawet 8. Spośród 119 oznaczonych jednostek, które próbowano wykonać, uzyskaliśmy nagrania pojedyncze z 26 jednostek rozmieszczonych w 12 preparatach (Tabela 2). W ten sposób zebrano dane z 41% preparatów ze znakowanymi aksonami, co dało ogólny wskaźnik sukcesu wynoszący 28%.

Krytycznym aspektem aplikacji barwnika jest głębokość etykietowania. Płytkie włożenie drutu wolframowego spowoduje wypłukanie barwnika. Jeśli jednak penetracja jest zbyt głęboka, oznaczone aksony nie będą widoczne do namierzenia. Ponadto musi dojść do pewnego mechanicznego uszkodzenia komórki, aby barwnik został odpowiednio wchłonięty^{25, 28}. Jednak zbyt duże uszkodzenia zabiją komórki. Próbowaliśmy znakować innymi barwnikami i innymi metodami (Tabela 2), w tym znakowanie następcze poprzez wstrzyknięcie barwnika do ELa w połączeniu z zapisem ze znakowanych aksonów w ELp (Tabela 3). Stawiamy hipotezę, że znakowanie następcze nie powiodło się, ponieważ znakowanie było ograniczone do komórek z uszkodzeniem somatycznym, co powodowało, że nie reagowały. Dodatkowo zakończenia presynaptyczne mogły zostać zakłócone. W przeciwieństwie do tego, etykietowanie wsteczne minimalizuje oba te problemy. Ilość i miejsce aplikacji barwnika można modyfikować w zależności od konkretnego badanego obwodu. Maksymalne znakowanie następuje przy największym stężeniu barwnika, które osiągnęliśmy przy użyciu powlekanych drutów wolframowych. Jednak w przypadku znakowania aksonów z głębokimi projekcjami, barwnik może spaść z igły wolframowej w miarę jej zaawansowania. W takich przypadkach bardziej odpowiednie byłoby wstrzyknięcie ciśnienia. Pobieranie i transport barwnika są szybkie, przy czym znakowane aksony w naszym preparacie są widoczne już 2 godziny po wstrzyknięciu, a dodatkowe znakowane aksony pojawiają się dopiero po 6 godzinach od wstrzyknięcia. W ten sposób etykietowanie i nagrywanie można wykonać w ciągu jednego dnia, eliminując trudności techniczne związane z operacjami przetrwania. Czas będzie się różnić dla każdego zastosowania w zależności od odległości wymaganej do transportu barwnika.

Kolejnym krytycznym aspektem jest umiejscowienie elektrod. Ważne jest, aby wejść do tkanki w pobliżu miejsca znakowanego aksonu, aby zapobiec zatkaniu końcówki. W przypadku gęstych tkanek, takich jak ELa, długi, cienki trzpień elektrody rejestrującej minimalizuje nadmierny ruch otaczającej tkanki. Jeśli pomyślny zapis nie zostanie osiągnięty za pierwszym razem, powtarzaj z nowymi elektrodami, aż do uzyskania zapisu lub tkanki zostanie rozerwana do punktu, w którym akson nie jest już widoczny. Jednak ważne jest również, aby szybko umieścić elektrodę obok aksonu, aby zminimalizować ilość ekspozycji fluorescencyjnej, która może powodować fototoksyczność, bielenie i może wpływać na właściwości fizjologiczne komórki^29-31.

Po pomyślnym zassaniu fragmentu aksonu do elektrody rejestrującej, nagrania można uzyskać przez kilka godzin. Jeśli jednostki są konsekwentnie tracone w czasie krótszym niż 1 godzina, rozważ wykonanie mniejszych końcówek elektrod, aby zapobiec wyślizgnięciu się aksonu. Z drugiej strony, zbyt mała końcówka może spowodować zatkanie, niski poziom sygnału do szumu lub uszkodzenie aksonu. Stały spadek amplitudy skoków i "powrót" jednostki z dodatkowym ssaniem wskazuje, że końcówka jest zbyt duża. Zbyt duże ssanie może spowodować nieodwracalne uszkodzenie aksonu. Jednym z rozwiązań jest dopuszczenie do niewielkiej nieszczelności w przewodzie powietrznym, aby ciśnienie powoli wracało do zera. Gwałtowne wyrównanie ciśnienia spowoduje przejściowe "pchnięcie" względno-zewnętrzne, które może wyrzucić akson.

Chociaż technika ta stanowi główną zaletę w uzyskiwaniu ukierunkowanych nagrań ze zidentyfikowanych neuronów projekcyjnych, nie będzie przydatna do rozróżniania lokalnych interneuronów, ponieważ barwnik byłby pobierany przez wszystkie typy komórek w miejscu wstrzyknięcia. Teoretycznie zastosowanie wielu fluoroforów z oddzielnymi miejscami wstrzyknięcia może pozwolić na rozszerzenie tej metody. Na przykład, porównanie pojedynczego i podwójnego znakowania może być wykorzystane do odróżnienia interneuronów od neuronów projekcyjnych po podwójnym wstrzyknięciu w dwóch punktach obwodu³². Podobnie, znaczniki wsteczne można łączyć z innymi zaawansowanymi technikami obrazowania, takimi jak obrazowanie dwufotonowe, jak to miało miejsce ostatnio w przypadku zeberki zięby High Vocal Center (HVc)³². Ponadto obszary rejestracji są ograniczone do tych blisko powierzchni podczas korzystania z mikroskopów epifluorescencyjnych, ponieważ byliśmy w stanie rozdzielić struktury o wielkości 1 μm tylko w obrębie pierwszych 30 μm tkanki. Głębokość tę można jednak zwiększyć poprzez zastosowanie innych technik mikroskopowych, takich jak mikroskopia^{dwufotonowa33} lub mikroskopia z oświetleniem płaskim sprzężonym z^obiektywem34. Ogólnie rzecz biorąc, technika ta stanowi ważny postęp w badaniu obwodów neuronalnych in vivo , ponieważ może być używana do nagrywania z pojedynczych neuronów w wielu różnych obwodach w różnych systemach modelowych - w tym tych, które są stosunkowo niedostępne.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Metanosulfonian trikainy	Sigma-Aldrich	E10521	MS-222
Trietiodek galaminy	Sigma-Aldrich	G8134
Chlorowodorek lidokainy	Sigma-Aldrich	L5647
Hickmana" s Roztwór Ringera	NA	NA	NaCl (6,48 g/l), KCl (0,15 g/l), CaCl2• 2H20 (0,29 g/l), MgSO4 (0,12 g/l), NaHCO3 (0,084 g/l), NaH2PO4 (0,06 g/l)
Pompa perystaltyczna	Gilson lub Rainin	Minipulse 3 model 312; RP-1	10.0 ± 1.0 obr./min, Alternatywnie linia zasilana grawitacyjnie z przepływomierzem
Mikroskop preparacyjny	Nikon	SM2645
Super Glue	Super Glue Corporation	SGH2	2g tuba
Omni Drill 35	World Precision Instruments	503-598
Wiertło z węglika spiekanego do młyna kulowego #1/4	World Precision Instruments	501860	0,19 DIA (średnica wiertła = 0,48 mm)
Zestaw do kauteryzacji niskotemperaturowej	World Precision Instruments	500391
Ręczny mikromanipulator	World Precision Instruments	M3301R
Dekstran sprzężony Alexa Fluor 568	Invitrogen	D-22912	Stężenie 2mM; 10 000MW Wybór długości fali barwnika należy dobrać tak, aby pasowała do ustawień filtra mikroskopu
Mikroskop epifluorescencyjny	Nikon	E600 FN	Akcesorium do zdalnego ustawiania ostrości jest pomocne w przypadku filtra TRITC z precyzyjną ostrością - lub odpowiedniego filtra dopasowującego płaszczyzny ogniskowych do różnych długości fal barwnika
Obiektyw małej mocy	Nikon	93182	Seria planachromatyczna CFI, 4X N.A. 0.1, WD 30mm
Obiektyw dużej mocy	Nikon	93148	CFI Fluor Series, 40X WI N.A. 0.8, WD 2.0 mm
Źródło światła białego	Dolan-Jenner	Model 190	Oświetlacz światłowodowy
Fluorescencyjne źródło światła	Lumen Dynamics	X-Cite 120Q
Kamera do pracy przy słabym oświetleniu	Fotometria	CoolSnap ES&	nbsp;
Manometr cyfrowy	Omega Engineering	HHP-201
Mikromanipulator z napędem	silnikowym Sutter Instruments	MP-285
Headstage	Molecular Devices	CV-7B	Axon Instruments
Wzmacniacz	Urządzenia molekularne	MultiClamp 700B	Axon Instruments
System akwizycji danych	Urządzenia molekularne	Digidata 1322A	Axon Instruments
Izolowany stymulator impulsów	Systemy AM	2100
Flaming/Brown Ściągacz do mikropipet	Sutter Instruments	P-97	Ustawienia programu dla naszej aplikacji: Ciepło: rampa + 1, Ciągnięcie: ' 0', Prędkość: 60, Czas: 90 Pudełko filamentu
Pipeta Glass	World Precision Instruments	1B100F-4	Borokrzemianowe szkło kapilarne z żarnikiem (1 mm OD, 0,58 mm ID)