Wytrącanie powinowactwa aktywnych czynników GEF białka Rho z wykorzystaniem białka Rho z mutacją z tagiem GST (GST-RhoA(G17A)) z lizatów komórek nabłonkowych

Podsumowanie

Metoda przedstawiona w niniejszej publikacji opisuje test służący do monitorowania aktywacji specyficznych dla RhoA czynników wymiany GDP/GTP (GEFs) w hodowlach komórkowych, z wykorzystaniem zmutowanego białka fuzyjnego RhoA GST, które wykazuje wysokie powinowactwo do aktywowanych GEFs. Białka GEFs są wytrącane z lizatów komórkowych, wykrywane za pomocą techniki Western blotting i ilościowo oznaczane metodą densytometrii.

Streszczenie

Białka z rodziny małych GTPaz Rho są kluczowymi regulatorami cytoszkieletu i kontrolują szeroki wachlarz procesów komórkowych, w tym migrację komórek, ekspresję genów, progresję cyklu komórkowego oraz adhezję komórkową ¹. Białka Rho są przełącznikami molekularnymi, które są aktywne w stanie związania z GTP i nieaktywne w stanie związania z GDP. Ich aktywacja jest pośredniczona przez rodzinę białek czynników wymiany nukleotydów guaninowych (GEF). Rho-GEF stanowią liczną rodzinę o nakładających się swoistościach ². Choć poczyniono znaczne postępy w identyfikacji GEF aktywowanych przez konkretne sygnały, wciąż pozostaje wiele pytań dotyczących regulacji tych białek w obrębie konkretnych szlaków. Liczba Rho-GEF przekracza 70, a każda komórka ekspresuje więcej niż jedno białko GEF. Ponadto wiele z tych białek aktywuje nie tylko Rho, ale i inne członków tej rodziny, co dodatkowo przyczynia się do złożoności sieci regulacyjnych. Co istotne, badanie sposobu regulacji GEF wymaga metody pozwalającej na śledzenie aktywnej puli poszczególnych GEF w komórkach aktywowanych różnymi bodźcami. Przedstawiamy tutaj szczegółowy protokół metody służącej do oceny i ilościowego oznaczania dostępnych aktywnych GEF specyficznych dla Rho z wykorzystaniem testu precypitacji powinowactwa. Test ten został opracowany kilka lat temu w laboratorium Burridge'a ^3,4, a my zastosowaliśmy go w liniach komórkowych kanalików nerkowych ^5,6,7. Test wykorzystuje mutant RhoA „wolny od nukleotydów”, wykazujący wysokie powinowactwo do aktywnych GEF. Mutacja (G17A) sprawia, że białko nie jest w stanie wiązać GDP ani GTP, a stan ten naśladuje stan pośredni związany z GEF. Wersja tego białka mutantowego z tagiem GST jest ekspresowana i oczyszczana z E. coli, wiązana z kuleczkami sefarozy glutationowej i używana do precypitacji aktywnych GEF z lizatów komórek niepoddanych działaniu bodźca oraz komórek stymulowanych. Ponieważ większość GEF jest aktywowana poprzez modyfikacje potranslacyjne lub uwalnianie z wiązań inhibicyjnych, ich stan aktywny jest zachowany w lizatach komórkowych i mogą one zostać wykryte za pomocą tego testu⁸. Wychwycone białka mogą być badane pod kątem znanych GEF poprzez detekcję specyficznymi przeciwciałami z wykorzystaniem Western blottingu lub analizowane metodą spektrometrii mas w celu identyfikacji nieznanych GEF aktywowanych przez określone bodźce.

Protokół

1. Transformacja E. coli konstruktem pGEX-RhoA(G17A)

1. Przygotować agar LB, rozpuszczając 2,5 g LB i 1,5 g agaru w 100 ml dH₂O. Autoklawować i schłodzić do około 50-55 °C, co w praktyce oznacza temperaturę, w której kolbę można wygodnie trzymać w dłoni.
2. Przygotować roztwór zapasowy ampicyliny (Amp), rozpuszczając 50 mg/ ml w dH₂O. Przefiltrować przez filtr strzykawkowy i zamrozić niewykorzystane alikwoty. Do agaru LB z punktu 1.1 dodać 100 μl roztworu zapasowego Amp (stężenie końcowe 50 μg/ml). Wymieszać przez delikatne obracanie i wlać do 10 cm szalek do bakterii (15-20 ml/szalka). Pozostawić do stężenia (15-30 min.), a niewykorzystane szalki przechowywać odwrócone w temperaturze 4 °C przez 2-3 tygodnie.
3. Aby przeprowadzić transformację E. Coli, szybko rozmrozić alikwot kompetentnych komórek DH5α w kąpieli lodowej. Dodać 1 μl DNA pGEXRhoA(G17A) rozcieńczonego do 25-50 ng/μl. Wymieszać poprzez lekkie stuknięcie probówki i inkubować na lodzie przez 30 minut. Poddać szokowi termicznemu w temperaturze 42 °C przez 45 sekund, a następnie ponownie umieścić na lodzie na 2 minuty. Dodać 900 μl pożywki SOC i hodować przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem.
4. Wysiać 50-100 μl transformowanych bakterii na płytkę LB-Agar-Amp, używając zagiętej sterylnej pipety Pasteura. Inkubować płytkę stroną agarową do góry w inkubatorze w 37 °C przez 5 minut, a następnie odwrócić i hodować przez noc.
5. Z płytki pobrać pojedynczą kolonię do przygotowania białka z tagiem GST (krok 2.1). Do późniejszego wykorzystania zapakować i przechowywać płytki odwrócone w temperaturze 4 °C przez około 3 tygodnie. Dodatkowo, do dłuższego przechowywania można przygotować banki bakterii, hodując pojedyncze kolonie w 2 ml sterylnego LB-Amp przez noc w 37 °C z wytrząsaniem. Wymieszać alikwot ze sterylnym 80% glicerolem w stosunku 1:1 i zamrozić w -80 °C.

2. Przygotowanie kulek GST-RhoA(G17A)

1. Przygotować pożywkę LB, dodając 25 g LB do 1 L dH₂0, a następnie poddać autoklawowaniu. Po ostygnięciu dodać 50 μl Amp ze stocku do 50 ml LB (stężenie końcowe 50 μg/ml). Zaszczepić dobrze wyizolowaną kolonią transformowanych bakterii i inkubować przez noc w 37 °C z wytrząsaniem. Po osiągnięciu pełnej gęstości (OD₆₀₀ > 1,0) rozcieńczyć z 450 ml LB-Amp i hodować przez dodatkowe 30 minut w 37 °C.
2. Przygotować 100 mM roztwór stockowy izopropyl-β-D-tiogalaktopiranozydu (IPTG), rozpuszczając 0,238 g w 10 ml dH₂O. Przechowywać w alikwotach w -20 °C. Indukować produkcję białka Rho przez dodanie 500 μl 100 mM IPTG do 500 ml kultury (stężenie końcowe 100 μM). Obniżyć temperaturę do 22-24 °C i hodować przez ok. 16 h.
3. Wirować kulturę przy 3600 g przez 10 minut w 4 °C. W razie potrzeby 500 ml kultury można podzielić do probówek 50 ml w celu odwirowania. Zamrozić osad(y) przez co najmniej 1 godzinę (lub najlepiej przez noc) w -80 °C.
4. Przygotować 200 ml buforu do lizy zawierającego 20 mM HEPES (0,95 g)/ pH 7,5; 150 mM NaCl (1,75 g); 5 mM MgCl₂ (0,203 g); 1% TX-100 (2 ml). Przygotować roztwory stockowe 1M DTT (1,542 g w 10 ml dH₂O) oraz 100 mM PMSF (0,174 g/10 ml EtOH). Aby przygotować bufor do lizy +, uzupełnić 10 ml o 1mM DTT (10 μl ze stocku), 1 mM PMSF (100 μl ze stocku) oraz jedną tabletkę Complete Mini Protease Inhibitor.
5. Pracując na lodzie, dodać 10 ml buforu do lizy+ do osadów z kroku 2.3. Dokładnie resuspendować poprzez delikatne wierzgnięcie (vortexing) i pipetowanie. Unikać pienienia. Sonicować na lodzie przez 1 minutę przy ustawieniu 4 z 50% impulsem. Wirować zsonicowany lizat przy 15 000-20 000 g przez 15 minut w 4 °C i przenieść klarowny sonikat (nadpłyn) do sterylnej zamkniętej probówki 15 ml.
6. Przygotować Glutathione Sepharose, delikatnie mieszając oryginalną probówkę zawierającą 75% zawiesinę, a następnie przenieść 335 μl do probówki 15 ml. Do pipetowania kulek użyć końcówki o szerokim wlocie. Dodać 10 ml zimnego PBS i wirować przy 500 g przez 5 minut w 4 °C. Odrzucić nadpłyn, dodać 1 ml buforu do lizy+ do kulek i wirować tak jak podczas poprzedniego przemywania. Odrzucić nadpłyn i dodać bufor do lizy+, aby przygotować 50% zawiesinę.
7. Dodać 250 μl zrównoważonej zawiesiny kulek do nadpłynu z kroku 2.5. Rotować w 4 °C przez 45 minut.
8. Przygotować 500 ml HBS zawierającego 20 mM HEPES (2,38 g)/pH 7,5 oraz 150 mM NaCl (4,38 g) w dH₂O. Przygotować roztwory stockowe 1M MgCl₂ (0,952 g w 10 ml dH₂O) oraz 1M DTT (1,542 g w 10 ml dH₂O). Aby przygotować HBS+, uzupełnić 100 ml bezpośrednio przed użyciem o 5 mM MgCl₂ (50 μl ze stocku) oraz 1 mM DTT (100 μl ze stocku).
9. Wirować kulki z kroku 2.7 przy 500 g przez 5 minut w 4 °C. Odrzucić nadpłyn i przemyć kulki 2x 10 ml buforem do lizy+ oraz 2x 10 ml HBS+. Po ostatnim przemyciu przygotować 50% zawiesinę poprzez resuspensję kulek w HBS+ uzupełnionym inhibitorem proteaz BD BaculoGold (20 μl 50x BD BaculoGold/ml).
10. Rozcieńczyć 10 μl końcowego preparatu kulek 2x buforem do próbek Laemmli zawierającym β-merkaptoetanol. Przygotować standardy albuminy surowicy bydlęcej (BSA). Użyć stocku 2 mg/ml (0,02 g BSA w 10 ml dH₂O). Wymieszać 10 μl stocku z 10 μl Laemmli (końcowo 20 μg); 5 μl stocku z 5 μl dH₂O i 10 μl Laemmli (końcowo 10 μg); oraz 2,5 μl stocku z 7,5 μl dH₂O i 10 μl Laemmli (końcowo 5 μg). Zagotować wszystkie próbki (5 min). Wirować próbkę z kulkami i nałożyć nadpłyn wraz ze standardami BSA oraz markerami masy cząsteczkowej na 10% żel SDS-poliakrylamidowy.
11. Przygotować barwnik Coomassie Blue (0,1 g w 10 ml kwasu octowego, 40 ml metanolu i 50 ml dH₂O) oraz roztwór do odbarwiania (500 ml dH₂O, 400 ml metanolu i 100 ml kwasu octowego). Przechowywać w temperaturze pokojowej. Barwić żel przez 20-30 minut, usunąć barwnik (można go użyć wielokrotnie) i przemyć roztworem do odbarwiania dwukrotnie. Kontynuować odbarwianie przy delikatnym wstrząsaniu przez kilka godzin, aż prążki będą wyraźnie widoczne.
12. Oszacować stężenie GST-RhoA(G17A) związanego z kulkami, korzystając ze standardów BSA jako referencji (Rys. 2). Alikwotować równą objętość kulek zawierających ok. 10-15 μg białka do probówek do mikrowirowania 1,5 ml. Przechowywać kulki w 4 °C do użycia w ciągu jednego dnia. Zamrozić w -80 °C w mieszaninie HBS+/glicerol w stosunku 3:1 do użycia w ciągu kilku dni.

3. Test GEF Pulldown z użyciem kulek RhoA(G17A) wolnych od nukleotydów

1. Hodować komórki w szalkach 10 cm do osiągnięcia konfluencji. Poddać deprywacji surowicy przez co najmniej 3 godziny i traktować zgodnie z wymaganiami.
2. Przygotować bufor do lizy+ zgodnie z krokiem 2.4. Przygotować ilość buforu wystarczającą na 700 μl/szalkę oraz niewielką nadwyżkę, aby zrekompensować błędy pipetowania. Inhibitory proteaz dodać bezpośrednio przed użyciem.
3. Pracując w lodzie, usunąć pożywkę z szalek i przemyć lodowatym HBS. Usunąć cały HBS i dodać 700 μl buforu do lizy+ do każdej szalki. Zamieszać szalkami okrężnymi ruchami, aby pokryć całą powierzchnię, zeskrobać i zebrać lizaty do ponumerowanych probówek 1,5 ml. Wirować przy 15,000 g przez 1 min w temperaturze 4 °C. Nadpływ zostanie wykorzystany do analizy.
4. Jeśli liczba komórek we wszystkich badanych szalkach jest równa, można pominąć oznaczanie białek i przejść do kroku 3.5. W przeciwnym razie zmierzyć stężenie białka w każdym nadpływie za pomocą testu Bio-Rad quick protein assay i wyrównać objętość oraz stężenie nadpływów. Ilość całkowitego białka zależy od użytych typów komórek (zazwyczaj 1-1,5 mg białka dla komórek LLC-PK1).
5. Pobrać 30 μl każdego nadpływu i zmieszać z 30 μl 2x redukującego buforu do próbek Laemmli, zagotować i odstawić do kroku 3.7. Pozostałe nadpływy dodać do alikwotów kuleczek GST-RhoA(G17A) z kroku 2.12. Inkubować w rotatorze przez 45 minut w temperaturze 4 °C.
6. Wirować kuleczki przy 6800 g przez 10 sekund w temperaturze 4 °C. Odrzucić nadpływ i przemyć kuleczki 3x buforem do lizy, wirować w ten sam sposób pomiędzy myciami. Całkowicie usunąć ostatnią porcję buforu myjącego za pomocą strzykawki 1 cc z igłą 30 G i dodać 20 μl 2x redukującego buforu do próbek Laemmli. Gotować przez 5 min. Wirować, aby osadzić kuleczki, a następnie natychmiast poddać nadpływ elektroforezie (zalecane) lub przechowywać go w temperaturze -80 °C do późniejszej analizy.
7. Nanieść 20 μl całkowitego lizatu komórkowego oraz wszystkie próbki białek wytrąconych na żel SDS-poliakrylamidowy o odpowiednim stężeniu dla wielkości badanego GEF. Wykryć wybrany GEF metodą Western blotting przy użyciu specyficznego przeciwciała.

4. Reprezentatywne wyniki

Część 1 i 2 protokołu opisuje przygotowanie białka GST-RhoA(G17A) sprzężonego z kulkami GSH-sepharose oraz jego weryfikację za pomocą SDS-PAGE (patrz schemat protokołu na Rys. 1). Typowy żel barwiony Coomassie przedstawiono na Rys. 2. Próbka z eluowanym białkiem powinna zawierać pojedynczy prążek o masie około 50 kDa (Rys. 2, ścieżka 6). Stężenie białka można oszacować, korzystając z próbek referencyjnych BSA. W przykładzie na Rys. 2 stężenie RhoA(G17A) szacuje się na 15 μg/10 μl. W związku z tym przygotowano alikwoty po 10 μl na probówkę. Typowa wydajność w naszych badaniach wynosi 15-20 μg białka z 10 ml lizatu bakteryjnego. Część 3 protokołu opisuje test wytrącania powinowactwa (patrz przegląd na Rys. 1). Pomyślny test GEF wykrywający aktywację czynnika wymiany GEF-H1 przedstawiono na Rys. 3. Białko RhoA(G17A) wychwyciło część GEF-H1 z kontrolnych (niepoddanych działaniu czynnika) lizatów komórkowych, co sugeruje, że GEF-H1 wykazuje aktywność podstawową. Ilość wytrąconego białka wzrasta jednak w komórkach traktowanych zapalną cytokiną Tumor Necrosis Factor -α (TNF- α), co jest zgodne z tezą, że TNF-α aktywuje GEF-H1 ^5,7. Co ważne, całkowite lizaty komórkowe wykazują podobne ilości GEF-H1 w próbce kontrolnej i traktowanej, co sugeruje, że zabieg nie zmienił poziomu GEF-H1, a ilość materiału wejściowego użytego w teście była jednakowa.

Rycina 1. Przegląd protokołu.

Rysunek 2. Reprezentatywny wynik protokołu przygotowania kulek. Przedstawiono żel barwiony Coomassie po udanej preparatyce kulek GST-RhoA(G17A). Próbka z kulek oraz standardy białkowe BSA zostały rozdzielone metodą SDS-PAGE przy użyciu żelu z 10% akrylamidem. W celu przetestowania kulek, 10 μl końcowej zawiesiny kulek zawierającej GST-RhoA(G17A) rozcieńczono w stosunku 1:1 z redukującym buforem do próbek Laemmli i gotowano przez 5 minut. Kulki kręcono krótko w wirówce, a nadsącz naniesiono na żel. Naniesiono następujące próbki: ścieżka 1: marker masy cząsteczkowej (MW) (FroggaBio BLUeye prestained protein ladder); ścieżki 2-4: 5, 10 i 20 μg albuminy surowicy bydlęcej (BSA); ścieżka 5 jest pusta; ścieżka 6: 10 μl świeżo przygotowanych kulek RhoA(G17A). Po zakończeniu rozdziału żel zabarwiono błękitem Coomassie, a następnie odbarwiono, aby uwidocznić białka. Masa cząsteczkowa białka GST-RhoA(G17A) wynosi w przybliżeniu 50 kDa i znajduje się na poziomie markera 48 kDa. Stężenie białka GST-Rho w tej konkretnej próbce szacuje się na około 15 μg/10 μl zawiesiny.

Rycina 3. Reprezentatywny test aktywacji GEF wykazujący indukowaną przez TNF-α aktywację GEF-H1. Konfluentne komórki LLC-PK1 poddano działaniu 10 ng/ml TNF-α przez 5 minut. Po zakończeniu inkubacji komórki zlizowano, a aktywne GEF wyizolowano za pomocą kulek związanych z GST-RhoA(G17A). Obecność GEF-H1 w białkach wytrąconych (górny blot) oraz w próbkach całkowitego lizatu komórkowego (dolny blot) wykryto za pomocą techniki Western blotting z użyciem przeciwciała anty-GEF-H1 (Cell Signaling). Należy zwrócić uwagę na zwiększoną ilość wytrąconego GEF-H1 w komórkach traktowanych TNF-α w porównaniu z komórkami nietraktowanymi w stosunku do równoważnych ilości materiału wejściowego, co wskazuje na pomyślny wynik.

Rycina 4. „Nieprawidłowy wynik”. Chociaż przeprowadzony tutaj test pulldown GEF doprowadził do wychwycenia pewnej ilości GEF-H1 przez kuleczki, ilości wytrącone z komórek kontrolnych oraz komórek traktowanych TNF-α są takie same. Zatem TNF-α, znany aktywator GEF-H1, w tym przypadku nie wywołał aktywacji. W tym konkretnym eksperymencie późniejsza analiza przyczyn błędu sugerowała, że użyte TNF-α nie było wystarczająco świeże i prawdopodobnie uległo degradacji.

Dyskusja

Metoda przedstawiona w niniejszym opracowaniu jest jedynym dostępnym nieradiacyjnym testem aktywacji dla GEF, który pozwala na śledzenie aktywnej puli GEF w komórkach. Test ten jest podobny do testów wytrącania stosowanych w celu śledzenia aktywacji małych GTPaz, a także GEF działających na Rac i Cdc42. Testy te wykorzystują różne białka znakowane GST i wykazują niewielkie różnice w stosunku do metody opisanej tutaj, jednak podstawowe kroki pozostają takie same. W związku z tym niniejszy protokół można łatwo dostosować do innych testów aktywacji małych GTPaz i GEF.

Przedstawiony test GEF został niedawno zmodyfikowany w celu zastosowania go do frakcji jądrowych ^9,10. Po wprowadzeniu dalszych modyfikacji możliwe może być również badanie aktywacji GEF w innych przedziałach subkomórkowych.

Przedstawioną metodę wykorzystujemy do badania aktywacji GEF w liniach komórek nabłonkowych^5,6,7. Po pewnej optymalizacji test ten powinien być odpowiedni do wykrywania GEF z dowolnej linii komórkowej. Podczas adaptacji do konkretnego typu komórek należy dobrać optymalną liczbę komórek, objętość buforu do lizy oraz metodę detekcji dla badanego GEF (istotne jest zastosowanie dobrego przeciwciała do Western blottingu). Przy wstępnym ustawianiu testu zaleca się użycie bodźca, o którym wiadomo, że aktywuje badany GEF. W przypadku stosowania nieznanego bodźca należy zawsze użyć kontroli pozytywnej, aby zweryfikować poprawność działania testu. Metodę tę można wykorzystać do wykrywania aktywacji znanych GEF za pomocą Western blottingu. Jest ona jednak równie odpowiednia do identyfikacji nieznanych GEF. W tym celu przechwycone GEF z próbek kontrolnych i stymulowanych należy przeanalizować na żelu barwionym Coomassie. Prążki pojawiające się wyłącznie w próbkach stymulowanych mogą zawierać aktywowane GEF i mogą zostać przekazane do identyfikacji za pomocą spektrometrii mas (np. ⁵).

Na koniec należy zamieścić pewną uwagę ostrzegawczą. Analiza opiera się na założeniu, że modyfikacje potranslacyjne aktywujące GEF są zachowane po lizie komórek. W rzeczywistości jest to ewidentne w przypadku wielu GEF i od momentu opracowania tej metody była ona wykorzystywana przez różne grupy badawcze do wykrywania aktywacji różnych GEF, w tym GEF-H1, p115RhoGEF oraz XPLN (np. ^5,11,12,13). Zachowanie stanu aktywnego może jednak nie wystąpić w przypadku wszystkich GEF, w związku z czym dopuszczalne jest, że analiza ta nie będzie skuteczna dla każdego z nich. Należy również zauważyć, że wiele GEF wykazuje aktywność wobec więcej niż jednej małej GTPazy. Dlatego podczas badania konkretnego GEF zaleca się uzupełnienie tej analizy o testy precypitacji GEF dla innych małych GTPaz, a także o badania funkcjonalne z analizą RhoA, Rac1 oraz Cdc42.

Kluczowe etapy protokołu:

Kolonie przekształconych bakterii należy pobierać ze świeżych, prawidłowo przygotowanych szalek, aby zapewnić odpowiednią selekcję za pomocą Amp, prawidłowy wzrost i wydajność. Warunki transformacji dla komórek kompetentnych uzyskanych z innych źródeł mogą się różnić i powinny zostać sprawdzone.

Wszystkie etapy protokołu przygotowania białka (od kroku 2.3) oraz analizy (od kroku 3.2) należy przeprowadzić w temperaturze 4°C, używając schłodzonych roztworów i wirówek.

Liza bakterii (krok 2.5) powinna być dokładna i pełna, aby uzyskać jednorodną zawiesinę. Podczas lizy bakterii należy naprzemiennie mieszać lizat w wirówce typu vortex oraz pipetować, utrzymując go w temperaturze 4°C; sonikację należy przeprowadzać w lodzie, aby zapobiec denaturacji białka. W przypadku korzystania z innego modelu sonikatora może być konieczne dostosowanie parametrów. Inkubację sonikatu z kuleczkami należy zawsze przeprowadzać w temperaturze 4°C na rotatorze w celu zapewnienia odpowiedniego wiązania, dbając jednocześnie o zachowanie stałego czasu trwania tego procesu.

Mutanty GST-Rho są nieco niestabilne podczas ekspresji w bakteriach, dlatego najlepiej jest użyć przygotowanych kulek od razu lub w ciągu kilku dni.

Test wytrącania (część 3) jest wrażliwy na czas i temperaturę, ponieważ aktywne GEF mogą zostać łatwo utracone z lizatu komórkowego, dlatego poszczególne etapy należy przeprowadzić tak szybko, jak to możliwe.

Poniższa sekcja zawiera wskazówki dotyczące rozwiązywania problemów.

Brak lub bardzo mała ilość zmutowanego białka Rho w końcowym preparacie z koralikami: Może to być spowodowane nieefektywną indukcją, niewystarczającą lizą bakterii lub utratą białka podczas procesu przygotowania lub przechowywania. Aby pomóc w rozwiązaniu tych problemów, próbki bakterii można analizować przed i po indukcji. W przypadku słabej indukcji białka należy powtórzyć proces, wykorzystując kolonię ze świeżo wysianej płytki lub z ponownie transformowanych komórek kompetentnych. Należy również przetestować różne stężenia IPTG oraz czasy indukcji. Jeśli liza jest niewystarczająca (tzn. białko pozostaje w osadzie zamiast w nadosadzie), można spróbować zmienić stężenia soli i detergentów w buforze do lizy. Należy rozważyć zmianę czasu i ustawień sonikacji, a próbki przed i po sonikacji można sprawdzić pod mikroskopem, aby określić wydajność lizy.

Brak wytrąconego GEF, mimo obecności białka GST na kuleczkach: Może to wynikać z problemów technicznych podczas testu wytrącania lub z rzeczywistego braku aktywacji badanego GEF pod wpływem zastosowanego bodźca. Zawsze należy stosować znany bodziec jako kontrolę pozytywną, aby zweryfikować prawidłowe działanie testu. Przygotowane kuleczki należy wykorzystać w ciągu kilku dni. Jeśli test wytrącania nie wykazuje wykrywalnych ilości badanego GEF we wszystkich warunkach, należy sprawdzić, czy GEF jest obecny i dobrze wykrywalny w nadosadzie po wirowaniu, która ma zostać użyta do testu (krok 3.3). Należy upewnić się, że wszystkie bufory i inhibitory proteaz są świeże oraz wykonywać wszystkie kroki na lodzie tak szybko, jak to możliwe. Można zwiększyć ilość białka wejściowego (np. stosując lizaty z 2 płytek/próbkę). Jeśli test wytrącania wykazuje podstawowe wytrącanie GEF, ale nie widać różnic między próbką kontrolną a stymulowaną (Rys. 4), należy rozpocząć rozwiązywanie problemów od weryfikacji skuteczności zastosowanego bodźca, badając inne znane efekty (np. poprzez wykrycie aktywacji innych szlaków sygnalizacyjnych). Warto rozważyć zmianę warunków traktowania i/lub stężeń. W celu przewidzenia prawdopodobnych czasów i stężeń należy oprzeć się na danych literaturowych dotyczących aktywacji Rho lub innych sygnałów przez dany bodziec. Podczas optymalizacji czasu traktowania należy stosować zarówno krótkie, jak i długie punkty czasowe, ponieważ aktywacja GEF może być najlepiej wykrywalna w punkcie czasowym poprzedzającym wyraźną aktywację Rho. Wreszcie, ten sam bodziec może prowadzić do zmiennego stopnia aktywacji z powodu zmiany reaktywności komórek spowodowanej m.in. liczbą pasażów lub konfluencją komórek.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
pGEX-RhoA(G17A)	Addgene	Wkrótce dostępne	Wygenerowano w laboratorium dr. Keitha Burridge'a (University of North Carolina) (ref 3)
DH5α	Invitrogen	18258-012	Przechowywać w -80°C
Pożywka SOC	BioShop Canada	SOC001.10
LB	BioShop Canada	LBL407.1	Przechowywać w warunkach sterylnych
Glicerol	BioShop Canada	GLY002.1
Ampicylina	BioShop Canada	AMP201.25	Przechowywać roztwór stokowy w -20°C
Agar	BioShop Canada	AGR001.500
IPTG (izopropyl-β-D-1-tiogalakto-piranozyd)	Calbiochem	420322	Przechowywać roztwór stokowy w -20°C
Kulki Sepharose z glutationem	GE Healthcare	17-0756-01
PBS 10x	Sigma-Aldrich	D1408
Hepes	Sigma-Aldrich	H4034
NaCl	BioShop Canada	SOD001.10
MgCl2	Sigma-Aldrich	M-9272	Dodać bezpośrednio przed użyciem
TX-100	Sigma-Aldrich	X100
DTT	OmniPur, EMD Millipore	3860	Dodać bezpośrednio przed użyciem
PMSF	Sigma-Aldrich	P-7626	Dodać bezpośrednio przed użyciem
Inhibitor proteaz 50x	BD Biosciences	51-21426Z	Dodać bezpośrednio przed użyciem
Complete Mini, bez EDTA 10x	Roche Group	11 836 170 001	Dodać bezpośrednio przed użyciem
Bufor do próbek Laemmliego 2x	Bio-Rad	161-0737
β-merkapto–etanol	Sigma-Aldrich	M7154	Dodać bezpośrednio przed użyciem
Coomassie Brilliant Blue	Bio-Rad	R-250
Kwas octowy	CALEDON	1000-1
Metanol	CALEDON	6701-7
Bio-Rad Protein Assay	Bio-Rad	500-0114
drabinka BLUeye	FroggaBio	PM008-0500
Tabela 1. Wykorzystane odczynniki
Wirówka RC-5B	Sorvall, Thermo Scientific	Rotor SS-34	Stosować w 4°C
Wirówka	Sorvall, Thermo Scientific	ST-16R	Stosować w 4°C
Mikrowirówka	Eppendorf	5417R	Stosować w 4°C
Inkubator z wytrząsaniem do bakterii	INFORS HT Ecotron	AG CH-1403 Bottmingen	Stosować w 37°C lub w 22°C
Sonikator	Branson	Sonifier-450	Stosować w temperaturze pokojowej
Rotator	Glas-Col	099A CR4012	Stosować w 4°C
Tabela 2. Wykorzystany specjalistyczny sprzęt