Badania kliniczne i usuwanie rdzenia kręgowego w modelu mysim stwardnienia zanikowego bocznego (ALS)

Podsumowanie

Model mysi stwardnienia zanikowego bocznego (ALS) poddano badaniu klinicznemu i behawioralnemu. Jako warunek wstępny dla towarzyszącej analizy immunohistologicznej szczegółowo przedstawiono przygotowanie rdzenia kręgowego.

Streszczenie

Stwardnienie zanikowe boczne (ALS) to śmiertelna choroba neurodegeneracyjna prowadząca do postępującej degeneracji neuronów ruchowych. Szczyt zachorowań przypada na około 60. rok życia w przypadku postaci sporadycznej i około 50. rok życia w przypadku postaci rodzinnej. Ze względu na postępujący przebieg choroby 50% pacjentów umiera w ciągu 30 miesięcy od wystąpienia pierwszych objawów. W celu oceny nowych opcji terapeutycznych dla tej choroby opracowano genetyczne modele mysie ALS w oparciu o ludzkie mutacje rodzinne w genie SOD, takie jak mutacja SOD1 (G93A). Najważniejszymi aspektami, które należy ocenić w tym modelu, są całkowite przeżycie, przebieg kliniczny oraz funkcja motoryczna. W niniejszej pracy przedstawiamy ocenę kliniczną, demonstrujemy przeprowadzenie dwóch behawioralnych testów motorycznych i dostarczamy ilościowe systemy punktacji dla wszystkich parametrów. Ponieważ dogłębna analiza mysiego modelu ALS zazwyczaj wymaga badania immunohistochemicznego rdzenia kręgowego, szczegółowo prezentujemy jego przygotowanie z zastosowaniem metody laminektomii grzbietowej. Przedstawione zostały przykładowe wyniki histologiczne. Kompleksowe zastosowanie opisanych metod badawczych w studiach nad mysim modelem ALS umożliwi badaczom wiarygodne testowanie przyszłych opcji terapeutycznych, co może stanowić podstawę do późniejszych badań klinicznych z udziałem ludzi.

Protokół

Zwierzęta zakupiono z Jackson Laboratory (# 002726) ¹. Poddano je ocenie klinicznej oraz testowi funkcji motorycznych (test rotarod) i sile mięśniowej (test zawieszenia na drucie). Wszystkie te badania, a także późniejsze uśmiercenie zwierząt w celu przygotowania rdzenia kręgowego, zostały przeprowadzone w ścisłej zgodności z lokalnymi wytycznymi dotyczącymi prawidłowego prowadzenia eksperymentów na zwierzętach.

1. Ocena kliniczna

Oprócz oceny masy ciała, myszy są badane pod kątem oznak deficytów motorycznych przy użyciu następującego 4-stopniowego systemu punktacji ²:

4 punkty: norma (brak oznak dysfunkcji motorycznej)

3 punkty: drżenia kończyn tylnych są widoczne podczas zawieszenia za ogon

2 punkty: występują nieprawidłowości w chodzie

1 punkt: powleczenie co najmniej jedną kończyną tylną

0 punktów: niedowład symetryczny, niezdolność do utrzymania równowagi lub utrata 20% maksymalnej masy ciała; w takim przypadku zwierzęta są natychmiast uśmiercane, a eksperyment zostaje przerwany

2. Testy funkcji motorycznych i siły mięśniowej

Zawieszenie drutu

Test ten jest wykorzystywany do oceny siły mięśniowej ^{3, 4}. Wszystkie zwierzęta przechodzą ten test co najmniej jeden lub dwa dni po teście rotarod. Każdą mysz umieszcza się na specjalnie wykonanej drucianej pokrywie z odstępami 0,8 cm i ostrożnie odwraca do góry nogami, 60 cm nad dnem wyłożonym słomą. Po trzykrotnym treningu trwającym co najmniej 180 s mierzy się czas do spadnięcia. Każdej myszy daje się do trzech prób utrzymania się na odwróconej pokrywie przez maksymalnie 180 s i rejestruje najdłuższy czas.

Test rotarod

Aparat rotarod (Ugo Basile, Comerio, Włochy) został wykorzystany do pomiaru koordynacji ruchowej, równowagi oraz zdolności uczenia się motorycznego ^{3, 4}. Dobry wynik wymaga wysokiego stopnia koordynacji sensoryczno-motorycznej. Urządzenie należy umieścić w spokojnym środowisku, wolnym od zakłóceń, aby uniknąć bodźców rozpraszających testowane zwierzę. Aparat składa się z sterowanego komputerowo, napędzanego silnikiem obrotowego wrzeciona oraz pięciu torów dla pięciu myszy. Upadki myszy są wykrywane automatycznie poprzez nacisk na plastikową płytkę u dołu. Po trzech kolejnych sesjach treningowych trwających co najmniej 180 s przy stałej prędkości 15 r.p.m., mierzy się czas, przez który zwierzę jest w stanie utrzymać się na obrotowym pręcie. Każde zwierzę przechodzi trzy próby, a rejestrowany jest najdłuższy czas bez upadku. Czas 180 s wybrano jako czas odcięcia, ponieważ większość istotnych różnic w koordynacji ruchowej jest wykrywana w tym przedziale czasowym.

3. Przygotowanie rdzenia kręgowego

1. Zwierzęta są uśmiercane poprzez insuflację CO₂ zgodnie z lokalnymi wytycznymi, a następnie niezwłocznie poddawane perfuzji transkardiakalnej roztworem PBS, a następnie 4% roztworem paraformaldehydu.
2. W celu przygotowania rdzenia kręgowego uśmierzonej myszy, zwierzę umieszcza się na stole operacyjnym, a cztery kończyny unieruchamia się po bokach, aby odsłonić stronę grzbietową myszy.
3. Krótkie przemycie 70% roztworem etanolu oczyszcza miejsce sekcji i wygładza okrycie włosowe.
4. Następnie skórę nacinamy ostrym skalpelem w linii pośrodkowej. Aby ułatwić cięcie, skórę rozciąga się na obie strony. Jeśli mają być przygotowane mięśnie kończyn, ich skóra również musi zostać nacięta.
5. Po zakończeniu nacięcia skóry, odsuwa się ją pęsetą, aby odsłonić znajdującą się pod nią powięź powierzchowną ciała.
6. Mięśnie szyi oraz więzadło karkowe należy usunąć i starannie przygotować. Należy uważać, aby nie naciąć tkanek zbyt głęboko i nie uszkodzić rdzenia kręgowego. Można również usunąć mięśnie barkowe, aby lepiej odsłonić kręgosłup.
7. Następnie z całego kręgosłupa usuwa się mięśnie przykręgowe.
8. W celu otwarcia kanału kręgowego należy wykonać kilka laminektomii. Należy rozpocząć od górnej części czaszkowej w miejscu stawu atlanto-potylicznego.
9. Najłatwiej jest zwolnić unieruchomienie dwóch górnych kończyn i nadmiernie rozciągnąć szyję, aby móc lepiej przeprowadzić laminektomię pierwszych kręgów. Są one odsuwane bez dotykania odsłoniętego rdzenia kręgowego szyjnego.
10. Kolejne kręgi usuwa się poprzez uprzednie przecięcie łuków kręgowych po obu stronach nożyczkami kanciastymi, a następnie pociągnięcie za wyrostki kolczyste. Pozostałe części boczne kręgów powinny zostać usunięte, aby ułatwić późniejsze całkowite wyjęcie rdzenia kręgowego.
11. Punktem orientacyjnym w anatomii lędźwiowej części rdzenia kręgowego jest zgrubienie, które występuje również w odcinku szyjnym rdzenia kręgowego.
12. Po zakończeniu laminektomii całego rdzenia kręgowego należy upewnić się, że przecięto wszystkie korzenie przednie i uwolniono rdzeń kręgowy z twardej opony opon mózgowo-rdzeniowych.
13. Następnie rdzeń kręgowy szyjny przecina się kranialnie i rozpoczyna wyjmowanie rdzenia kręgowego.
14. Na koniec rdzeń kręgowy przecina się również w dystalnej części ogona końskiego, aby całkowicie go uwolnić.
15. Ostatecznie rdzeń kręgowy umieszcza się w roztworze postfiksacyjnym (np. 4% paraformaldehydzie) na noc, po czym może być dalej przetwarzany. Zazwyczaj wykonujemy kriosieki rdzenia kręgowego w celu przygotowania go do analizy immunohistologicznej.  

4. Reprezentatywne wyniki

Tematem niniejszego artykułu wideo jest technika przygotowania rdzenia kręgowego. Jest ona niezbędnym warunkiem wstępnym do późniejszego krojenia tkanek, a w konsekwencji do analizy immunohistologicznej przekrojów rdzenia kręgowego. Jako przykład końcowego rezultatu zaprezentowano analizę immunohistochemiczną obszaru rogu przedniego lędźwiowego odcinka rdzenia kręgowego myszy typu dzikiego (wt) oraz myszy z transgenem SOD G93A (tg). Neurony ruchowe można zidentyfikować za pomocą pierwotnego przeciwciała anty-ChAT i następującego po nim znakowania fluorescencyjnego wtórnym przeciwciałem Cy3. Dodatkowo wykonano barwienie przeciwjądrowe z użyciem DAPI (4,6-diamidino-2-fenyloindol) (Ryc. 1).

Rycina 1. Fluorescencyjne mikrofotografie obrazujące immunodetekcję motoneuronów z użyciem przeciwciała anty-ChAT (czerwony) oraz przeciwbarwienie jąder komórkowych DAPI (niebieski) w przednim rogu lędźwiowego rdzenia kręgowego myszy typu dzikiego (wt) (po lewej) i myszy transgenicznej SOD G93A (tg) (po prawej) w wieku 130 dni. Pasek skali: 40 μm.

Ponieważ analiza immunohistochemiczna myszy SOD G93A nie jest głównym zakresem niniejszego artykułu, w celu uzyskania dalszych informacji należy zapoznać się z oryginalną publikacją, w której scharakteryzowano te myszy transgeniczne, oraz z nowszymi pracami badającymi podejścia terapeutyczne ^{1, 5, 6}. Jeśli efekty terapeutyczne mają zostać rozróżnione na poziomie immunohistologicznym, należy zastosować jasno zdefiniowane algorytmy oceny ilościowej z wykorzystaniem oprogramowania stereologicznego (na przykład patrz ⁷).

Dyskusja

Genetyczny model mysi SOD1 (G93A) jest cennym modelem zwierzęcym do badania przebiegu choroby z progresywną utratą motoneuronów, porównywalnej z ludzkim stwardnieniem zanikowym bocznym ⁸. W modelu tym oceniono szereg różnych schematów terapeutycznych, które stanowią podstawę do późniejszych badań w ramach klinicznych prób z udziałem ludzi ^8-10. Aby móc wykryć istotne różnice w badaniu eksperymentalnym nad leczeniem u tych myszy, niezwykle ważne jest włączenie co najmniej 24 myszy z tych samych miotó...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Rota-Rod dla myszy	Ugo Basile	# 47600
Urządzenie z wiszącym drutem	Wykonanie własne
Stół operacyjny, lampa operacyjna, rękawiczki ochronne
“Iris” nożyczki, zakrzywione	Fine Science Tools	14063-09
Nożyczki sprężynowe Cohan-Vannas, proste	Fine Science Tools	15000-10
Mikropinceta	Hammacher, Solingen, Niemcy	HWC 111-10
Skalpel “präzisa plus”	Dahlhausen, Köln, Niemcy	11.000.00.510, FIG 10