Model mysi stwardnienia zanikowego bocznego (ALS) poddano badaniu klinicznemu i behawioralnemu. Jako warunek wstępny dla towarzyszącej analizy immunohistologicznej szczegółowo przedstawiono przygotowanie rdzenia kręgowego.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Badania kliniczne i usuwanie rdzenia kręgowego w modelu mysim stwardnienia zanikowego bocznego (ALS)
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Stwardnienie zanikowe boczne (ALS) to śmiertelna choroba neurodegeneracyjna prowadząca do postępującej degeneracji neuronów ruchowych. Szczyt zachorowań przypada na około 60. rok życia w przypadku postaci sporadycznej i około 50. rok życia w przypadku postaci rodzinnej. Ze względu na postępujący przebieg choroby 50% pacjentów umiera w ciągu 30 miesięcy od wystąpienia pierwszych objawów. W celu oceny nowych opcji terapeutycznych dla tej choroby opracowano genetyczne modele mysie ALS w oparciu o ludzkie mutacje rodzinne w genie SOD, takie jak mutacja SOD1 (G93A). Najważniejszymi aspektami, które należy ocenić w tym modelu, są całkowite przeżycie, przebieg kliniczny oraz funkcja motoryczna. W niniejszej pracy przedstawiamy ocenę kliniczną, demonstrujemy przeprowadzenie dwóch behawioralnych testów motorycznych i dostarczamy ilościowe systemy punktacji dla wszystkich parametrów. Ponieważ dogłębna analiza mysiego modelu ALS zazwyczaj wymaga badania immunohistochemicznego rdzenia kręgowego, szczegółowo prezentujemy jego przygotowanie z zastosowaniem metody laminektomii grzbietowej. Przedstawione zostały przykładowe wyniki histologiczne. Kompleksowe zastosowanie opisanych metod badawczych w studiach nad mysim modelem ALS umożliwi badaczom wiarygodne testowanie przyszłych opcji terapeutycznych, co może stanowić podstawę do późniejszych badań klinicznych z udziałem ludzi.
Protokół
Zwierzęta zakupiono w Jackson Laboratory (# 002726) 1. Poddano je ocenie klinicznej oraz testowi funkcji motorycznych (test rotarod) i sile mięśniowej (test zwisania na drucie). Wszystkie te badania, a także późniejsze uśmiercenie zwierząt w celu przygotowania rdzenia kręgowego, zostały przeprowadzone w ścisłej zgodności z lokalnymi wytycznymi dotyczącymi prawidłowego przeprowadzania eksperymentów na zwierzętach.
1. Wynik kliniczny
Oprócz oceny masy ciała, myszy są badane pod kątem objawów deficytów motorycznych przy użyciu następującego 4-stopniowego systemu punktacji 2:
4 punkty: norma (brak oznak dysfunkcji ruchowej)
3 punkty: drżenia kończyn tylnych są widoczne podczas zawieszenia za ogon
2 punkty: występują nieprawidłowości w chodzie
1 punkt: ciągnięcie co najmniej jednej kończyny tylnej
0 punktów: symetryczny paraliż, niezdolność do utrzymania równowagi lub utrata 20% maksymalnej masy ciała; w takim przypadku zwierzęta są natychmiast uśmiercane, a eksperyment zostaje zakończony
2. Testy funkcji motorycznych i siły mięśniowej
Zawieszenie drutu
Test ten jest stosowany do oceny siły mięśniowej 3, 4. Wszystkie zwierzęta przechodzą ten test co najmniej jeden lub dwa dni po teście rotarod. Każda mysz jest umieszczana na wykonanej na zamówienie drucianej pokrywie z odstępami 0,8 cm i ostrożnie obracana do góry nogami, 60 cm nad dnem wyłożonym słomą. Po trzech kolejnych sesjach treningowych trwających co najmniej 180 s mierzy się czas do spadnięcia. Każdej myszy przysługuje do trzech prób utrzymania się na odwróconej pokrywie przez maksymalnie 180 s, a rejestrowany jest najdłuższy czas.
Test Rotarod
Aparat rotarod (Ugo Basile, Comerio, Włochy) został wykorzystany do pomiaru koordynacji ruchowej, równowagi oraz zdolności uczenia się motorycznego 3, 4. Dobry wynik wymaga wysokiego stopnia koordynacji sensoryczno-motorycznej. Urządzenie należy umieścić w spokojnym środowisku, wolnym od zakłóceń, aby uniknąć bodźców rozpraszających dla badanego zwierzęcia. Aparat składa się z kontrolowanego komputerowo, napędzanego silnikiem obracającego się wrzeciona oraz pięciu torów dla pięciu myszy. Upadki myszy są wykrywane automatycznie poprzez nacisk na plastikową płytkę znajdującą się na dole. Po trzykrotnym treningu przez co najmniej 180 s przy stałej prędkości 15 r.p.m. mierzy się czas, przez który zwierzę jest w stanie utrzymać się na obracającym się pręcie. Każde zwierzę przechodzi trzy próby, a rejestrowany jest najdłuższy czas utrzymania się bez upadku. Czas 180 s wybrano jako czas odcięcia (cut-off time), ponieważ większość istotnych różnic w koordynacji ruchowej jest wykrywana w tym przedziale czasowym.
3. Przygotowanie rdzenia kręgowego
- Zwierzęta są uśmiercane poprzez insuflację CO2 zgodnie z lokalnymi wytycznymi, a następnie niezwłocznie poddawane perfuzji transkardialnej roztworem PBS, a następnie 4% roztworem paraformaldehydu.
- W celu przygotowania rdzenia kręgowego uśmierzonej myszy, zwierzę umieszcza się na stole operacyjnym, a cztery kończyny unieruchamia się po bokach, aby odsłonić stronę grzbietową myszy.
- Krótkie przemycie 70% roztworem etanolu oczyszcza miejsce sekcji i wygładza okrycie włosowe.
- Następnie skórę nacinamy ostrym skalpelem w linii pośrodkowej. Aby ułatwić cięcie, skórę rozciąga się na obie strony. Jeśli przygotowywane są mięśnie kończyn, należy naciąć również skórę nad nimi.
- Po zakończeniu nacięcia skóry, odciąga się ją pęsetą, aby odsłonić leżącą pod nią powięź powierzchowną ciała.
- Mięśnie szyi oraz więzadło karkowe muszą zostać usunięte i starannie przygotowane. Należy uważać, aby nie naciąć tkanek zbyt głęboko i nie uszkodzić rdzenia kręgowego. W celu lepszego odsłonięcia kręgosłupa można również usunąć mięśnie obręczy barkowej.
- Następnie z całego kręgosłupa usuwa się mięśnie przykręgowe.
- Aby otworzyć kanał kręgowy, należy wykonać kilka laminektomii. Należy rozpocząć od górnej części czaszkowej w obrębie stawu atlanto-potylicznego.
- Najłatwiej jest zwolnić unieruchomienie dwóch górnych kończyn i nadmiernie rozciągnąć szyję, aby móc sprawniej przeprowadzić laminektomię pierwszych kręgów. Są one odsuwane bez dotykania odsłoniętego rdzenia kręgowego szyjnego.
- Kolejne kręgi usuwa się, najpierw przecinając łuki kręgowe po obu stronach nożyczkami kątowymi, a następnie pociągając za wyrostki kolczyste. Pozostałe boczne części kręgów powinny zostać usunięte, aby ułatwić późniejsze całkowite wyjęcie rdzenia kręgowego.
- Punktem orientacyjnym w obrębie lędźwiowego odcinka rdzenia kręgowego jest zgrubienie, które występuje również w odcinku szyjnym.
- Po zakończeniu laminektomii całego rdzenia kręgowego, należy upewnić się, że przecięto wszystkie korzenie przednie i uwolniono rdzeń kręgowy z opony twardej opon mózgowo-rdzeniowych.
- Następnie rdzeń kręgowy w odcinku szyjnym przecina się kranialnie i rozpoczyna jego usuwanie.
- Na koniec rdzeń kręgowy przecina się również w dystalnej części ogona końskiego, aby całkowicie go uwolnić.
- Ostatecznie rdzeń kręgowy umieszcza się na noc w roztworze postfixującym (np. 4% paraformaldehyd), po czym można go dalej przetwarzać. Zazwyczaj wykonujemy kriosieki rdzenia kręgowego w celu przygotowania go do analizy immunohistologicznej.
4. Reprezentatywne wyniki
Tematem niniejszego artykułu wideo jest technika przygotowania rdzenia kręgowego. Jest ona niezbędnym warunkiem wstępnym do późniejszego krojenia tkanek, a w konsekwencji do analizy immunohistologicznej przekrojów rdzenia kręgowego. Jako przykład końcowego rezultatu zaprezentowano analizę immunohistochemiczną obszaru rogu przedniego rdzenia kręgowego odcinka lędźwiowego myszy typu dzikiego (wt) oraz myszy z transgenezem SOD G93A (tg). Neurony ruchowe można zidentyfikować za pomocą pierwotnego przeciwciała anty-ChAT i następującego po nim znakowania fluorescencyjnego wtórnym przeciwciałem Cy3. Dodatkowo wykonano barwienie przeciwjądrowe DAPI (4,6-diamidino-2-fenyloindol) (Rycina 1).
Rysunek 1. Fluorescencyjne mikrofotografie obrazujące immunodetekcję motoneuronów z użyciem przeciwciała anty-ChAT (czerwony) oraz kontrastowe barwienie jąder komórkowych DAPI (niebieski) w rogu przednim lędźwiowego rdzenia kręgowego myszy typu dzikiego (wt) (po lewej) oraz myszy transgenicznej (tg) SOD G93A (po prawej) w wieku 130 dni. Pasek skali: 40 μm.
Ponieważ analiza immunohistochemiczna myszy SOD G93A nie jest głównym przedmiotem niniejszego artykułu, prosimy o zapoznanie się z oryginalną publikacją, w której scharakteryzowano te myszy transgeniczne, oraz z nowszymi pracami badającymi podejścia terapeutyczne 1, 5, 6. W przypadku konieczności rozróżnienia efektów terapeutycznych na poziomie immunohistologicznym należy zastosować jasno zdefiniowane algorytmy oceny ilościowej przy wsparciu oprogramowania stereologicznego (na przykład patrz 7).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Genetyczny model mysi SOD1 (G93A) jest cennym modelem zwierzęcym do badania przebiegu choroby z progresywną utratą motoneuronów, porównywalnej z ludzkim stwardnieniem zanikowym bocznym 8. W modelu tym oceniono szereg różnych schematów terapeutycznych, które stanowią podstawę do późniejszych badań w ramach klinicznych prób z udziałem ludzi 8-10. Aby móc wykryć istotne różnice w badaniu eksperymentalnym nad leczeniem u tych myszy, niezwykle ważne jest włączenie co najmniej 24 myszy z tych samych miotó...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
LT otrzymał wsparcie grantowe z programu Forschungsförderungsprogramm Uniwersytetu Medycznego w Getyndze. PL i MB otrzymali wsparcie z Centrum Badań nad Fizjologią Molekularną Mózgu (CMPB) DFG w Getyndze. Autorzy dziękują dr Larsowi Tatenhorstowi za pomoc w realizacji nagrań wideo oraz Birgit Liebau za pomoc w montażu audio i wideo.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Rota-Rod dla myszy | Ugo Basile | # 47600 | |
| Urządzenie z wiszącym drutem | Wykonanie własne | ||
| Stół operacyjny, lampa operacyjna, rękawiczki ochronne | |||
| “Iris” nożyczki, zakrzywione | Fine Science Tools | 14063-09 | |
| Nożyczki sprężynowe Cohan-Vannas, proste | Fine Science Tools | 15000-10 | |
| Mikropinceta | Hammacher, Solingen, Niemcy | HWC 111-10 | |
| Skalpel “präzisa plus” | Dahlhausen, Köln, Niemcy | 11.000.00.510, FIG 10 |
Bibliografia
- Gurney, M. E. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu, Zn superoxide dismutase mutation. Science. 264 (5166), 1772-1775 (1994).
- Weydt, P. Assessing disease onset and progression in the SOD1 mouse model of ALS. Neuroreport. 14 (7), 1051-1054 (2003).
- Crawley, J. N. Behavioral phenotyping strategies for mutant mice. Neuron. 57 (6), 809-818 (2008).
- Miana-Mena, F. J. Optimal methods to characterize the G93A mouse model of ALS. Amyotroph. Lateral Scler. Other Motor Neuron Disord. 6 (1), 55-62 (2005).
- Zhong, Z. Activated protein C therapy slows ALS-like disease in mice by transcriptionally inhibiting SOD1 in motor neurons and microglia cells. J. Clin. Invest. 119 (11), 3437-3449 (2009).
- Pitzer, C. Granulocyte-colony stimulating factor improves outcome in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Brain. 131 (Pt. 12), 3335-3347 (2008).
- Gowing, G. Ablation of proliferating microglia does not affect motor neuron degeneration in amyotrophic lateral sclerosis caused by mutant superoxide dismutase. J. Neurosci. 28 (41), 10234-10244 (2008).
- Scott, S. interpretation of studies in the standard murine model of ALS. Amyotroph Lateral Scler. 9 (1), 4-15 (2008).
- Turner, B. J., Talbot, K. Transgenics, toxicity and therapeutics in rodent models of mutant SOD1-mediated familial ALS. Prog Neurobiol. 85 (1), 94-134 (2008).
- Corse, A. M. Preclinical testing of neuroprotective neurotrophic factors in a model of chronic motor neuron degeneration. Neurobiol Dis. 6 (5), 335-346 (1999).
- Knippenberg, S. Significance of behavioural tests in a transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Behav Brain Res. 213 (1), 82-87 (2010).
- Burgess, R. W., Cox, G. A., Seburn, K. L. Neuromuscular disease models and analysis. Methods Mol. Biol. 602, 347-393 (2010).
- Hayworth, C. R., Gonzalez-Lima, F. Pre-symptomatic detection of chronic motor deficits and genotype prediction in congenic B6.SOD1(G93A) ALS mouse model. Neuroscience. 164 (3), 975-985 (2009).
- Ludolph, A. C. Guidelines for preclinical animal research in ALS/MND: A consensus meeting. Amyotroph Lateral Scler. 11 (1-2), 38-45 (2010).
- Boillee, S. Onset and progression in inherited ALS determined by motor neurons and microglia. Science. 5778 (3), 1389-1392 (2006).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
