Artykuł metodologiczny

Wykrywanie bakterii przy użyciu fluorogennych DNAzymów

21.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/3961

⸱

28 maja 2012

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Biomedical Sciences, McMaster University , 2Department of Chemistry and Chemical Biology, McMaster University

W tym artykule

Podsumowanie

Niedawno opisaliśmy nowatorskie podejście do generowania fluorogennych sond DNAzymowych, które mogą być wykorzystane do stworzenia prostego, fluorescencyjnego testu typu „wymieszaj i odczytaj” do wykrywania bakterii. Te specjalne sondy DNA katalizują rozszczepienie zmodyfikowanego chromoforem substratu chimerycznego DNA-RNA w obecności surowej mieszaniny zewnątrzkomórkowej (CEM) produkowanej przez konkretną bakterię, przekładając tym samym detekcję bakterii na generowanie sygnału fluorescencyjnego. W niniejszym raporcie opiszemy kluczowe procedury eksperymentalne, w których specyficzna sonda DNAzymowa oznaczona jako „RFD-EC1” jest wykorzystywana do wykrywania modelowej bakterii Escherichia coli (E. coli).

Streszczenie

Ogniska chorób związane z patogenami przenoszonymi przez żywność oraz patogenami szpitalnymi powodują miliony zgonów i hospitalizacji, a także kolosalne straty ekonomiczne każdego roku. Zapobieganie takim ogniskom oraz minimalizacja skutków trwającej epidemii generują stale rosnący popyt na metody analityczne, które potrafią precyzyjnie zidentyfikować sprawcze patogeny na najwcześniejszym etapie. Chociaż istnieje szeroki wachlarz skutecznych metod wykrywania patogenów, żadna z nich nie spełnia wszystkich pięciu kluczowych wymagań stawianych idealnej metodzie detekcji: wysokiej swoistości (wykrywanie tylko interesującej nas bakterii), wysokiej czułości (zdolność do wykrycia nawet pojedynczej żywej komórki bakteryjnej), krótkiego czasu oczekiwania na wynik (od kilku minut do kilku godzin), dużej prostoty operacyjnej (brak konieczności przeprowadzania długotrwałych procedur pobierania próbek i stosowania specjalistycznego sprzętu) oraz opłacalności kosztowej. Przykładowo, klasyczne metody mikrobiologiczne są wysoce swoiste, ale wymagają dużo czasu (od kilku dni do kilku tygodni) na uzyskanie ostatecznego wyniku.1 Techniki oparte na PCR i przeciwciałach oferują krótszy czas oczekiwania (od kilku godzin do kilku dni), ale wymagają zastosowania drogich odczynników i/lub zaawansowanego sprzętu.2-4 W związku z tym wciąż istnieje duże zapotrzebowanie na badania naukowe nad opracowaniem innowacyjnych metod detekcji bakterii, które oferowałyby poprawione właściwości w jednym lub kilku z wyżej wymienionych aspektów. Nasze laboratorium jest zainteresowane zbadaniem potencjału DNAzymów jako nowej klasy sond molekularnych w zastosowaniach biosensorycznych, w tym w detekcji bakterii.5

DNAzymy (znane również jako ksyloribozymy lub enzymy DNA) to syntetyczne jednoniciowe cząsteczki DNA posiadające zdolność katalizowania reakcji chemicznych.6-8 Cząsteczki te mogą być izolowane z ogromnej puli DNA o losowych sekwencjach (zawierającej nawet 1016 poszczególnych sekwencji) za pomocą procesu znanego jako „selekcja in vitro” lub „SELEX” (systematyczna ewolucja ligandów poprzez wzbogacanie wykładnicze).9-16 Te specjalne cząsteczki DNA były w ostatnich latach szeroko badane jako narzędzia molekularne w zastosowaniach biosensorycznych.6-8

W naszym laboratorium opracowano procedury selekcji in vitro w celu wyizolowania fluorescencyjnych DNAzymów tnących RNA (RFDs; Rys. 1) oraz zbadano zastosowanie RFDs jako narzędzi analitycznych.17-29 RFDs katalizują rozszczepienie chimerycznego substratu DNA-RNA w obrębie pojedynczego złącza rybonukleotydowego (R), które jest flankowane przez fluorofor (F) i wygaszacz (Q). Bliska odległość między F a Q sprawia, że nierozszczepiony substrat wykazuje minimalną fluorescencję. Jednak zdarzenie rozszczepienia prowadzi do rozdzielenia F i Q, czemu towarzyszy znaczny wzrost intensywności fluorescencji.

W ostatnim czasie opracowaliśmy metodę izolacji RFD do detekcji bakteryjnej.5 Te specjalne RFD zostały wyizolowane tak, aby „rozświetlać się” w obecności surowej mieszaniny zewnątrzkomórkowej (CEM) pozostawianej przez konkretny rodzaj bakterii w środowisku lub w pożywce, w której są hodowane (Rys. 1). Wykorzystanie surowej mieszaniny pozwala uniknąć żmudnego procesu oczyszczania i identyfikacji odpowiedniego celu z interesującego mikroba w celu opracowania biosensora (co mogłoby zająć miesiące lub lata). Zastosowanie celów zewnątrzkomórkowych sprawia, że procedura analizy jest prosta, ponieważ nie ma potrzeby wykonywania etapów pozyskiwania celów wewnątrzkomórkowych.

Stosując powyższe podejście, opracowaliśmy RFD, który rozszczepia swój substrat (FS1; Rys. 2A) wyłącznie w obecności CEM produkowanego przez E. coli (CEM-EC).5 Stwierdzono, że ten wykrywający E. coli RFD, nazwany RFD-EC1 (Rys. 2A), reaguje ściśle na CEM-EC, lecz nie wykazuje reakcji na CEM pochodzące od szeregu innych bakterii (Rys. 3).

W niniejszym opracowaniu przedstawiamy kluczowe procedury eksperymentalne służące do przygotowania testów detekcji E. coli z wykorzystaniem RFD-EC1 oraz reprezentatywne wyniki.

Protokół

1. Przygotowanie roztworów chemicznych

  1. 0.5 M kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA): W plastikowym zlewce o pojemności 2 litrów (L) odważone należy odważyć 186,1 g EDTA (EM Science) i dodać 800 mililitrów (mL) autoklawowanej dejonizowanej wody destylowanej (ddH2O). pH należy dostosować do wartości 8,0 za pomocą granulek NaOH (EM Science). Objętość końcową należy uzupełnić do 1 L za pomocą ddH2O. Roztwór należy przelać do szklanych butelek, wysterylizować w autoklawie i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  2. 10× roztwór Tris-boran EDTA (10× TBE; 89 mM Tris, 89 mM kwasu borowego, 2 mM EDTA, pH 7,5): Należy odważyć 432 g Tris-base (BioShop Canada) oraz 220 g kwasu borowego (BioShop Canada) i dodać każdą z tych ilości do plastikowego zlewka o pojemności 4 L. Należy odmierzyć 80 mL 0,5 M EDTA (pH 8,0) i dodać do zlewka. Należy dodać ddH2O do uzyskania objętości końcowej 4 L. Roztwór należy dokładnie wymieszać za pomocą magnetycznego mieszadła do całkowitego rozpuszczenia składników. Roztwór należy przelać do szklanych butelek, wysterylizować w autoklawie i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  3. 10% roztwór zapasu denaturującego żelu poliakrylamidowego: Do plastikowego zlewka o pojemności 4 L należy dodać 1681,7 g mocznika (BioShop Canada), 400 mL 10× TBE oraz 1 L 40% roztworu akryloamidu/bisakryloamidu (29:1) (BioShop Canada). Objętość należy uzupełnić do 4 L za pomocą ddH2O. Mocznik należy rozpuścić podczas mieszania. Roztwór należy przelać do bursztynowych szklanych butelek o pojemności 1 L i przechowywać w temperaturze 4 °C. (Uwaga! Akryloamid powinien być obsługiwany w rękawiczkach, masce, goglach i fartuchu laboratoryjnym, ponieważ przed polimeryzacją jest neurotoksyną).
  4. 2× bufor do nakładania żelu (2× GLB): Do szklanego zlewka o pojemności 200 mL należy dodać 44 g mocznika, 8 g sacharozy (BioShop Canada), 10 mg błękitu bromofenolowego (BioShop Canada), 10 mg ksylenocyjanolu FF (Sigma-Aldrich), 400 μL 10% dodecylosiarczanu sodu (SDS; BioShop Canada) oraz 4 mL 10× TBE. Objętość końcową należy uzupełnić do 40 mL za pomocą ddH2O, a ciała stałe rozpuścić poprzez delikatne podgrzewanie (50 °C) i mieszanie magnetyczne. Należy przygotować aliquoty po 1 mL w probówkach do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL i przechowywać w temperaturze 4 °C. Z naszego doświadczenia wynika, że przed użyciem konieczne jest krótkie podgrzanie 2× GLB w temperaturze 90 °C, ponieważ 2× GLB krzepnie w warunkach przechowywania.
  5. 1 M Tris-HCl (pH 7,5): W szklanym zlewku o pojemności 200 mL należy odważyć 12,1 g Tris-base. Należy dodać 60 mL ddH2O i rozpuścić ciała stałe za pomocą mieszadła magnetycznego. pH należy dostosować do wartości 7,5 za pomocą 1 M HCl (Sigma-Aldrich). Objętość należy uzupełnić do 100 mL za pomocą ddH2O, przelać do szklanej butelki i wysterylizować w autoklawie. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
  6. 5 M NaCl: W szklanym zlewku należy odważyć 58,4 g NaCl (BioShop Canada) i rozpuścić w 150 mL ddH2O. Objętość należy uzupełnić do 200 mL za pomocą ddH2O. Roztwór należy przelać do szklanej butelki, wysterylizować w autoklawie i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  7. Bufor do elucji DNA: W szklanym zlewku należy zmieszać 2 mL 1 M Tris-HCl (pH 7,5), 8 mL 5 M NaCl oraz 0,4 mL 0,5 M EDTA (pH 8,0). Objętość należy uzupełnić do 200 mL za pomocą ddH2O. Wysterylizować w autoklawie i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  8. 2× bufor reakcyjny (2× RB; 100 mM HEPES, 300 mM NaCl, 30 mM MgCl2): Do probówki Falcon 50 mL (BD Falcon) należy dodać 1,2 g HEPES (BioShop Canada), 0,88 g NaCl, 0,30 g MgCl2•6H2O (EMD Chemicals) oraz 30 mL ddH2O. Mieszać delikatnie przez wstrząsanie do całkowitego rozpuszczenia składników. pH należy dostosować do wartości 7,5 poprzez dodanie roztworu 10 N NaOH i uzupełnić objętość końcową do 50 mL za pomocą ddH2O. Roztwór należy oczyścić za pomocą jednostki filtrującej napędzanej strzykawką (0,22 μm, Millipore) i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  9. Pożywka Luria Bertani (LB): W zlewce należy odważyć 20,0 g proszku LB (Sigma-Aldrich), a następnie dodać 1 L ddH2O. Roztwór należy dokładnie wymieszać za pomocą magnetycznego mieszadła i przelać do kolby stożkowej. Roztwór należy wysterylizować w autoklawie i przechowywać w temperaturze pokojowej.
  10. 1,5% agar LB: W kolbie o pojemności 250 mL należy odważyć 1,5 g agaru (BioShop Canada) i dodać 100 mL płynnej pożywki LB. Mieszaninę należy wysterylizować w autoklawie i przechowywać w temperaturze pokojowej.
  11. Przygotowanie płytek agarowych: Agar LB należy roztopić w mikrofalówce i schłodzić roztwór do ok. 50 °C. Roztwór należy wlać do szalek Petriego (Fisher Scientific) w płomieniu palnika. Z naszego doświadczenia wynika, że 100 mL agaru LB pozwala na przygotowanie 5-6 płytek.

2. Konstrukcja RFD-EC1 i RFSS1 za pomocą enzymatycznej ligacji sterowanej matrycą

RFD-EC1 (Rys. 2A) to analizowany DNAzym. Składa się on z sekwencji katalitycznej EC1 oraz sekwencji substratu FS1 (oznaczonych czarną i zieloną linią na Rys. 2A). RFSS1 (Rys. 2A) to wersja zrandomizowana RFD-EC1, w której sekwencja katalityczna EC1 jest częściowo przemieszana w SS1, natomiast część FS1 pozostaje niezmieniona. RFD-EC1 oraz RFSS1 otrzymano poprzez enzymatyczną ligację z matrycą, łącząc oligonukleotyd FS1 z oligonukleotydem EC1 lub SS1 w obecności LT1 jako matrycy ligacji (patrz wstawka na Rys. 2A). Procedura przeprowadzania reakcji ligacji przedstawiona jest poniżej. FS1 pozyskano z Keck Oligo Synthesis Facilities na Uniwersytecie Yale, a następnie poddano deprotekcji i oczyszczaniu za pomocą elektroforezy żelowej zgodnie z wcześniej ustalonym protokołem.17-24 EC1, SS1 oraz LT1 zakupiono w firmie Integrated DNA Technologies i oczyszczono za pomocą elektroforezy żelowej.

  1. Przygotować 100 μM roztwory zapasowe FS1, EC1, SS1 i LT1 w ddH2O. Przechowywać je w temperaturze -20 °C do momentu użycia.
  2. Przenieść 5 μL roztworu zapasowego FS1 do dwóch probówek mikrocentryfużkowych o pojemności 1,5 μL, oznaczonych jako Probówka 1 i Probówka 2. Do każdej probówki dodać 38,5 μL ddH2O, a następnie 5 μL 10× buforu A do reakcji z T4 polinukleotydową kinazą (PNK) (MBI Fermentas), zawierającego 500 mM Tris-HCl (pH 7,6, 25 °C), 100 mM MgCl2, 50 mM DTT i 1,0 mM spermidyny. Każdy roztwór wymieszać poprzez pipetowanie (kilkukrotne zasysanie i wypuszczanie roztworu).
  3. Dodać 1 μL ATP (100 mM; MBI Fermentas) i wymieszać poprzez pipetowanie.
  4. Dodać 0,5 μL T4 polinukleotydowej kinazy (PNK; 10 units/μL; MBI Fermentas) i wymieszać poprzez pipetowanie. Inkubować mieszaniny reakcyjne w temperaturze 37 °C przez 30 min. Należy pamiętać o owinięciu probówek folią aluminiową, aby zminimalizować fotoblaknięcie fluoroforu.
  5. Zatrzymać reakcję poprzez ogrzewanie w temperaturze 90 °C przez 5 min. Chłodzić mieszaniny reakcyjne w temperaturze pokojowej przez 10 min.
  6. Dodać 5 μL roztworu zapasowego EC1 do Probówki 1 oraz 5 μL roztworu zapasowego SS1 do Probówki 2.
  7. Do każdej probówki dodać 5 μL roztworu zapasowego LT1 i wymieszać poprzez pipetowanie. Ogrzewać mieszaniny reakcyjne w temperaturze 90 °C przez 1 min, a następnie chłodzić do temperatury pokojowej przez 10 min.
  8. Dodać 118 μL ddH2O, a następnie 20 μL 10× buforu do T4 ligazy DNA (MBI Fermentas), zawierającego 400 mM Tris-HCl (pH 7,8 przy 25 °C), 100 mM MgCl2, 100 mM DTT i 5 mM ATP. Wymieszać roztwór poprzez pipetowanie.
  9. Dodać 2 μL T4 ligazy DNA (5 units/μL; MBI Fermentas) i wymieszać poprzez pipetowanie. Inkubować mieszaniny reakcyjne w temperaturze pokojowej przez 1 h.
  10. Do każdej probówki dodać 20 μL 3 M NaOAc (pH 7,0), wymieszać w wirówce laboratoryjnej (vortex) i odwirować. Do każdej probówki dodać 500 μL zimnego 100% etanolu, wymieszać roztwór w wirówce laboratoryjnej i umieścić probówki w zamrażarce w temperaturze -20 °C na 30 min.
  11. Odwirować mieszaniny przy 11 000 g przez 20 min w temperaturze 4 °C w wirówce chłodzącej (Allegra X22-R, Beckman Coulter), a następnie ostrożnie usunąć nadsącz poprzez pipetowanie.
  12. Osuszyć pellet DNA za pomocą koncentratora DNA (Savant DNA Speedvac, Thermo Scientific) przez 10 min.
  13. Resuspender pellety DNA w 30 μL 1× buforu do ładowania żelu (GLB), krótko wymieszać w wirówce laboratoryjnej i odwirować w mikrocentryfudze (Minicentrifuge, VWR Scientific). Próbki ligowanego DNA są gotowe do nałożenia na żel dPAGE 10%.

3. Przygotowanie żelu dPAGE 10%

Poniższe kroki krótko opisują aparaturę do elektroforezy żelowej oraz jej konfigurację. Więcej szczegółów na temat aparatury, ustawień i obsługi znajduje się w naszych wcześniej opublikowanych protokołach.30,31

  1. Umyć i osuszyć dwie płytki szklane, dwie przekładki 0,75 mm oraz grzebień 16-dołkowy. Złożyć płytki szklane i przekładki za pomocą zacisków i ułożyć poziomo na płaskiej powierzchni, tak aby płytka z nacięciem była skierowana do góry.
  2. Przenieść 40 mL 10% mieszaniny dPAGE do zlewki o pojemności 150 mL. Dodać 40 μL tetrametyloetylenodiaminy (TEMED; Bioshop Canada), 400 μL 10% APS i wymieszać, delikatnie obracając zawartość za pomocą pipety.
  3. Ostrożnie wlać mieszaninę pomiędzy płytki i niezwłocznie włożyć grzebień. Pozostawić mieszaninę do polimeryzacji na 10 do 20 min. Polimeryzację można potwierdzić, sprawdzając pozostałą w zlewce mieszaninę żelu.
  4. Po upływie czasu polimeryzacji ostrożnie wyjąć grzebień i wypłukać dołki za pomocą ddH2O, aby usunąć pozostały w nich roztwór żelu.
  5. Zamocować płytki w aparacie do elektroforezy żelowej, kierując prostokątną płytkę bez nacięcia na zewnątrz, a za płytką z nacięciem umieścić metalową płytkę. Zastosowanie metalowej płytki pomaga zapobiec przegrzaniu, które mogłoby doprowadzić do pęknięcia płytek szklanych.
  6. Dolać 1× TBE do górnej i dolnej komory aparatu. Upewnić się, że dołki są wypełnione buforem, a dolna krawędź żelu jest w nim zanurzona.
  7. Przyłożyć prąd 40 mA (lub 750 V) i przeprowadzić wstępny przebieg przez 10 do 15 min.

4. Oczyszczanie ligowanych RFD-EC1 i RFSS1 za pomocą żelu dPAGE 10%

  1. Po wykonaniu kroku 3.7, przepłucz dołki 1× TBE za pomocą strzykawki i igły.
  2. Nanieś mieszaninę ligacji RFD-EC1 oraz mieszaninę RFSS1 (z punktu 2.13) do 2 dołków (jedna do każdego), używając pipety i końcówek do nakładania na żel (Diamed). Przyłóż prąd 40 mA (750 V), aż barwnik dolny (błękit bromofenolowy) znajdzie się około 5 cm powyżej dolnej krawędzi płytek.
  3. Wyjmij płytki szklane z aparatu do elektroforezy, połóż je na płaskim blacie i ostrożnie usuń dystanse.
  4. Ostrożnie zdejmij górne płytki szklane z żelu i owiń żel folią spożywczą (staraj się unikać zmarszczek i zagięć folii na żelu).
  5. Produkty ligacji można zwizualizować za pomocą cieniowania UV (260 nm) lub transiluminacji (360 nm), co spowoduje powstanie widocznego prążka DNA kilka centymetrów powyżej EC1 lub SS1 (jako marker można użyć 100 pmol EC1 lub SS1, nanosząc je do dołka w kroku 4.2). Zaznacz pożądane prążki DNA markerem.
  6. Wytnij prążek DNA za pomocą sterylnych żyletek, potnij żel na małe kawałki i przenieś do nowej probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL.
  7. Rozdrobnij kawałki żelu w probówce do mikrocentryfugi za pomocą sterylnej końcówki do pipety (rozmiar 200 μL).
  8. Dodaj 500 μL buforu do elucji DNA do każdej probówki i przykryj je folią aluminiową, aby chronić fluorofory przed światłem. Inkubuj próbki na wirówce wortexowej przez 10 min.
  9. Centryfuguj próbki przy 11 000 g przez 4 min w temperaturze 4 °C w wirówce z chłodzeniem (Allegra X22-R, Beckman Coulter) i ostrożnie przenieś 350 μL supernatantu do nowej probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL (w razie potrzeby można przeprowadzić drugą elucję z użyciem 350 μL świeżego buforu do elucji przez kolejne 10 min).
  10. Dodaj 35 μL (0,1× objętości próbki) 3 M octanu sodu (NaOAc, pH 7.0) do każdej probówki, wymieszaj za pomocą wortexa i odwiruj. Dodaj 900 uL zimnego 100% etanolu do każdej probówki. Wymieszaj każdą próbkę, potrząsając probówką przez kilka sekund. Przechowuj probówki w temperaturze -20 °C przez co najmniej 1 h.
  11. Centryfuguj próbki przy 11 000 g przez 20 min w temperaturze 4 °C w wirówce z chłodzeniem i ostrożnie usuń supernatant za pomocą pipety.
  12. Dodaj 100 μL zimnego 70% etanolu i użyj go do delikatnego przepłukania całej wewnętrznej ścianki probówki. Ponownie centryfuguj przy 11 000 g przez 7 min w temperaturze 4 °C. Usuń supernatant i osusz osad za pomocą koncentratora DNA przez 10 min.
  13. Rozpuść osady DNA w 100 μL ddH2O i wymieszaj wortexem. Określ stężenie DNA na podstawie absorbancji UV przy 260 nm. Przechowuj próbki w temperaturze -20 °C do czasu użycia.

5. Przygotowanie bakterii

  1. Docelowy szczep bakteryjny E. coli K12 (MG1655) oraz odpowiednie szczepy kontrolne należy najpierw wysiać na płytki z agarem LB z zapasów w glicerolu. Pod palnikiem lub w komorze z laminarnym przepływem powietrza, dotknąć końcówką sterylnej pipety zapasu bakteryjnego w glicerolu i delikatnie rozprzestrznić go na powierzchni płytki, aby nie uszkodzić agaru LB.
  2. Odwrócić wysiane płytki i inkubować w temperaturze 37 °C przez 14 h. Po inkubacji szczelnie zabezpieczyć cały obwód płytek Parafilmem (Pechiney Plastic Packaging) i przechowywać w temperaturze 4 °C. Płytki te można przechowywać maksymalnie przez 4 tygodnie.

6. Przygotowanie surowych mieszanin zewnątrzkomórkowych (CEMs)

  1. Do sterylnych probówek do hodowli o pojemności 14 mL (BD Falcon) odmierzyć 2 mL pożywki LB za pomocą pipety automatycznej (Corning).
  2. Za pomocą sterylnego końcówki do pipety pobrać pojedynczą kolonię z płytki agarowej przygotowanej w punkcie 5.2 i przenieść ją do probówki z hodowlą. Probówki umieścić w inkubatorze (New Brunswick Scientific) ustawionym na 37 °C i inkubować przy wstrząsaniu z prędkością 250 rpm przez 14 h.
  3. Kultura z ponownym szczepieniem 1%: Do probówek do hodowli o pojemności 14 mL odmierzyć 2 mL świeżej pożywki LB i dodać 20 μL kultur bakteryjnych przygotowanych w punkcie 6.2. Inkubować probówki w temperaturze 37 °C przy wstrząsaniu z prędkością 250 rpm, aż każda zawiesina bakteryjna osiągnie OD600 (gęstość optyczna mierzona przy 600 nm) wynoszącą około 1. Aby zmierzyć OD600, przenieść 1 mL każdej kultury do jednorazowej kuwety i zmierzyć absorbancję przy 600 nm za pomocą spektrofotometru UV (Genesys UV 10, Thermo Scientific).
  4. Przenieść 1 mL każdej kultury do nowej probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL iy odwirować komórki przez centryfugację przy 11,000 g przez 5 min w temperaturze pokojowej.
  5. Przenieść klarowny supernatant do nowej probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL i przechowywać w temperaturze -20 °C, jeśli nie zostanie użyty natychmiast.

7. Detekcja przy użyciu spektrofluorometru

  1. Włączyć spektrofotometr fluorescencyjny (Cary Eclipse, Varian Inc) i ustawić parametry akwizycji danych z wzbudzeniem przy 488 nm i emisją przy 520 nm. Odczyty można wykonywać w odstępach jednominutowych przez 1 h.
  2. Przemyć 3 kwarcowe kuwety (Varian Cary) wodą ddH2O, a następnie 100% etanolem. Osuszyć kuwety za pomocą strumienia azotu. Oznaczyć kuwety jako C1 (kontrola 1), C2 (kontrola 2) i T (test).
  3. Przenieść 24 μL ddH2O do kuwety C1 oraz 24 μL CEM-EC do kuwet C2 i T. Dodać 25 μL 2× RB do każdej kuwety i umieścić je w spektrofotometrze fluorescencyjnym. Rozpocząć zbieranie danych fluorescencji przez pierwsze 5 min.
  4. Dodać 1 μL RFSS1 (z roztworu zapasowego 5 μM) do kuwety C2 oraz 1 μL RFD-EC1 (z roztworu zapasowego 5 μM) do kuwet T i C1. Wymieszać każdy roztwór poprzez pipetowanie. Czynność tę należy przeprowadzić ostrożnie, aby nie przerwać odczytów fluorescencji. Pozostawić reakcję do zakończenia pozostałego czasu akwizycji (łącznie 1 h).
  5. Zapisać dane w formacie pliku Excel, przenieść je na komputer osobisty i przetworzyć w celu utworzenia wykresu.

8. Detekcja za pomocą elektroforezy żelowej

Te same mieszaniny reakcyjne przygotowane w kroku 7.4 mogą zostać wykorzystane do analizy za pomocą elektroforezy żelowej; alternatywnie można w podobny sposób przygotować nowe reakcje i inkubować je w probówkach do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL. W obu przypadkach:

  1. Zatrzymaj reakcje (po 1 h), dodając 5 μL 3 M NaOAc oraz 125 μL 100% etanolu. Wymieszaj każdy roztwór w wirówce typu vortex i umieść probówki w zamrażarce w temperaturze -20 °C na 1 h.
  2. Odwiruj mieszaniny reakcyjne przy 11 000 g przez 20 min w temperaturze 4 °C i ostrożnie usuń nadsącz za pomocą pipety.
  3. Osusze osady za pomocą koncentratora DNA przez 10 min.
  4. Resuspenduj osady w 20 μL 1× GLB, krótko mieszając w wirówce typu vortex. Krótko odwiruj probówki w wirówce stołowej (Minicentrifuge, VWR Scientific). Próbki te są gotowe do naniesienia na żel dPAGE.
  5. Przygotuj 10% żel dPAGE zgodnie z opisem w punktach 3.1-3.7. Nanieś próbki z reakcji (z kroku 8.4) do studzienek za pomocą pipety i końcówek do nakładania próbek na żel (Diamed). Przyłóż prąd 40 mA (750 V), aż dolny barwnik (błękit bromofenolowy) znajdzie się około 5 cm powyżej dolnej krawędzi płyt.
  6. Wyjmij płyty szklane i dokładnie umyj je wodą z kranu, aby usunąć resztki żelu. Wytrzyj płyty chusteczką kimwipe (Kimberly-Clark Professional).
  7. Zeskanuj płytę żelu pod kątem fluorescencji, używając skanera Typhoon (Typhoon 9200, Variable mode, GE Healthcare). Przeanalizuj dane za pomocą oprogramowania ImageQuant (Molecular Dynamics).

9. Specyficzność detekcji

  1. W celu zbadania specyficzności bakteryjnej, te same procedury opisane powyżej dla hodowli E. coli, przygotowania jej CEM oraz przeprowadzenia testu reakcji rozszczepienia można zastosować dla szeregu różnych szczepów bakteryjnych, takich jak B. subtilis, P. peli, Y. ruckeri, L. planturum, P. acidilactici (pokazanych na Rys. 3A).

10. Detekcja pojedynczych komórek

Przygotuj 1 mL zapasu glicerynowego E. coli o stężeniu 2 CFU/mL (CFU: jednostka tworząca kolonię) poprzez rozcieńczenia seryjne i potwierdź stężenie CFU poprzez wysiew na podłoża.5 Zapas ten powinien zawierać 0,2 CFU/100 μL. Przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia.

  1. Przygotować 10 probówek hodowlanych zawierających 2 mL LB.
  2. Zaszczepić każdą kulturę 100 μL zapasu w glicerolu o stężeniu 2 CFU/mL i inkubować w temperaturze 37 °C przy wytrząsaniu z prędkością 250 rpm. Wykorzystanie całego zapasu w glicerolu (1 mL) powinno pozwolić na uzyskanie 10 kultur.
  3. Pobrać 300 μL z każdej zaszczepionej probówki hodowlanej w następujących punktach czasowych: 4, 8, 12, 16 i 24 h. Pozostałą kulturę pozostawić do wzrostu przez 24 h.
  4. Zmierzyć OD600 i wytrącić komórki poprzez wirowanie przy 11 000 g przez 5 min.
  5. Przenieść CEM do nowych probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL i przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu użycia.
    Uwaga: Ponieważ w próbkach pobranych w punktach czasowych 4, 8 i 12 OD600 może być niewykrywalna, należy pozwolić pozostałej kulturze rosnąć przez 24 h w celu zidentyfikowania kultur zawierających bakterie (na podstawie mętności i pomiaru OD). Po szczepieniu tylko jedna lub dwie z 10 kultur mogą zawierać E. coli, a pozostałe probówki nie będą zawierać żadnych komórek.
  6. Wykorzystać CEM odzyskane z kultur pozytywnych (przechowywane w -20 °C) w wyznaczonych punktach czasowych do przygotowania reakcji cięcia z RFD-EC1, a następnie przeanalizować mieszaniny reakcyjne za pomocą elektroforezy w żelu dPAGE, zgodnie z opisem w sekcji 8.

11. Koncepcja i reprezentatywne wyniki

Koncepcja wykorzystania fluorescencyjnego DNAzymu przecinającego RNA (RFD) do detekcji bakterii została przedstawiona na Rys. 1. RFD przecina chimeryczny substrat DNA/RNA w obrębie pojedynczego wiązania RNA (niebieskie R), flankowanego odpowiednio przez dwa nukleotydy znakowane fluoroforem (F) oraz wygaszaczem (Q). Wraz ze wzrostem interesowanej bakterii (np. E. coli) w pożywce, powstaje surowa mieszanina zewnątrzkomórkowa (CEM). Ta CEM w całości jest następnie wykorzystywana w eksperymencie selekcji in vitro w celu otrzymania RFD, który reaguje specyficznie na CEM; prawdopodobnie RFD oddziałuje ze specyficzną cząsteczką (fioletowa gwiazdka) w CEM, będącą cząsteczką sygnaturową danej bakterii. Po dodaniu CEM do roztworu reakcyjnego zawierającego RFD, dochodzi do aktywacji aktywności przecinania RNA przez RFD. Przecięcie substratu oddziela F od Q, co skutkuje powstaniem sygnału fluorescencyjnego, który można wykryć za pomocą fluorymetru lub elektroforezy żelowej.

Eksperymentalna walidacja powyższej koncepcji została przeprowadzona z wykorzystaniem CEM z E. coli (CEM-EC). Poprzez selekcję in vitro otrzymano 3 cząsteczki RFD, z czego najskuteczniejszą oznaczono jako RFD-EC1 (Rys. 2A).5 Przebadano aktywność tnącą RFD-EC1 (wraz z sekwencją zmutowaną nazwaną RFSS1) w odpowiedzi na CEM-EC. Zarówno RFD-EC1, jak i RFSS1 przygotowano poprzez ligację enzymatyczną fragmentów DNAzymu do substratu FS1 (wszystkie sekwencje przedstawiono na Rys. 2A). W eksperymencie z pomiarem fluorescencji (Rys. 2B) CEM-EC inkubowano osobno przez 5 min, po czym dodano RFD-EC1 lub RFSS1 i kontynuowano inkubację przez kolejne 55 min. Natężenie fluorescencji roztworu odczytywano w sposób ciągły w każdej minucie, a uzyskane dane wykorzystano do obliczenia względnej fluorescencji (RF; obliczanej jako stosunek natężenia fluorescencji w czasie t do natężenia fluorescencji w czasie 0). Wartości RF w funkcji czasu inkubacji przedstawiono na Rys. 2B. Stwierdzono, że RFD-EC1 generowało wysoki poziom sygnału fluorescencyjnego po dodaniu CEM-EC; w przeciwieństwie do tego RFSS1 nie wytworzyło silnego sygnału fluorescencyjnego. Zatem funkcja generowania fluorescencji przez RFD-EC1 po kontakcie z CEM-EC jest specyficzna dla sekwencji.

Aby zweryfikować, czy obserwowany wzrost fluorescencji wynika z rozszczepienia wiązania RNA, analizowano mieszaniny reakcyjne za pomocą dPAGE. Oczekuje się, że rozszczepienie RFD-EC1 spowoduje powstanie dwóch fragmentów DNA: fragmentu 5', zachowującego fluorofor, oraz fragmentu 3', zachowującego wygaszacz. Za pomocą obrazowania fluorescencyjnego można było wykryć jedynie nierozszczepiony RFD-EC1 (unclv) oraz fragment 5′ (clv). Wynik dPAGE przedstawiony na Rys. 2C wykazuje, że mieszanina reakcyjna RFD-EC1 i CEM-EC rzeczywiście wytworzyła oczekiwany produkt rozszczepienia, podczas gdy mieszanina RFSS1/CEM-EC go nie wytworzyła.

Swoistość RFD-EC1 zbadano przy użyciu CEM pobranych z kilku innych bakterii Gram-ujemnych i Gram-dodatnich, a wyniki przedstawiono na Rys. 3A. Jedynie próbka zawierająca CEM-EC (krzywa niebieska) spowodowała wzrost fluorescencji. Brak reaktywności krzyżowej z CEM z innych bakterii wskazuje, że RFD-EC1 jest wysoce selektywny wobec E. coli.

Zbadaliśmy również czas potrzebny na hodowlę pojedynczej komórki E. coli w celu wyprodukowania wystarczającej ilości CEM zdolnej do indukcji rozszczepienia RFD-EC1. W tym doświadczeniu próbkę E. coli o określonej liczbie CFU (jednostek tworzących kolonie) odpowiednio rozcieńczono, aby uzyskać stężenie 1 CFU/mL. Następnie 100 μL rozcieńczonej próbki bakterii zmieszano z pożywką wzrostową i inkubowano przez 4, 8, 12, 16 oraz 24 h. Dla każdego punktu czasowego zebrano CEM i przetestowano ich zdolność do indukcji aktywności rozszczepiania RFD-EC1. Wynik dPAGE przedstawiony na Ryc. 3B wskazuje, że wymagany czas hodowli wynosi 12 h.

Należy zauważyć, że początkowy niewielki wzrost sygnału zaobserwowany w pomiarach fluorescencji po dodaniu sekwencji RFSS1 (jako kontroli negatywnej) do CEM-EC (Ryc. 2B; krzywa czerwona) lub RFD-EC1 do innych bakteryjnych CEM-ów (Ryc. 3B; wszystkie krzywe poza niebieską) przypisuje się fluorescencji wewnętrznej modułu FRQ (wynikającej z niepełnego gaszenia F przez Q). Zatem oczekuje się, że dodanie sekwencji znakowanych F i Q spowoduje początkowy wzrost fluorescencji. Jednak tylko mieszaniny RFD-EC1/CEM-EC są zdolne do wygenerowania wysokiego poziomu fluorescencji w czasie.

Schemat fluorogenicznej DNAzimy przecinającej RNA, ilustrujący detekcję bakterii poprzez kompleks RFD-cel.
Rysunek 1. Schematyczna ilustracja sondy fluorescencyjnej DNAzimy przecinającej RNA (RFD), która fluorescuje po kontakcie z surową mieszaniną pozakomórkową (CEM) wytwarzaną przez konkretne, poszukiwane komórki bakteryjne. RFD przecina chimeryczny substrat DNA/RNA w obrębie pojedynczego wiązania RNA (niebieskie R), flankowanego przez dwa nukleotydy oznakowane odpowiednio fluoroforem (F) i wygaszaczem (Q). Przed reakcją cięcia poziom fluorescencji RFD jest minimalny ze względu na bliskie sąsiedztwo F i Q. Po przecięciu Q oddala się od F, w wyniku czego generowany jest silny sygnał fluorescencyjny.

Edycja genów; schemat procesu ligacji, wykres reakcji, wyniki elektroforezy żelowej, analiza DNA.
Rycina 2. RFD wykrywający E. coli. (A) RFD-EC1 jest sondą DNAzymową, która może być aktywowana przez CEM-EC. RFSS1 to sekwencja wymieszana (scrambled) RFD-EC1 użyta jako kontrola. RFD-EC1 oraz RFSS1 zostały wytworzone poprzez ligację FS1 z EC1 oraz SS1 odpowiednio, w obecności LT1 jako matrycy. F: modyfikowana fluoresceiną dezoksytymidyna. Q: modyfikowana dabcylem dezoksytymidyna. R: rybonukleotyd adeniny. (B) Profile sygnałów fluorescencyjnych RFD-EC1 i RFSS1 w obecności CEM-EC. (C) Analiza dPAGE mieszanin reakcyjnych cięcia z punktu B (czas reakcji: 60 min). Przedstawiono obraz fluorescencyjny żelu dPAGE uzyskany za pomocą skanera Typhoon. Ścieżka NC: RFD-EC1 lub RFSS1 w samym buforze reakcyjnym; ścieżka CEM-EC: RFD-EC1 lub RFSS1 w buforze reakcyjnym zawierającym CEM-EC. Marker: RFD-CE1 traktowany 0,25 N NaOH, procedura znana z wywoływania pełnego cięcia RNA. unclv: nieprzecięty RFD-EC1. clv: fragment po cięciu zawierający fluorofor.

Oczyszczanie białek, wyniki elektroforezy; analiza wykresu cięcia białka w czasie.
Rysunek 3. (A) Profil sygnału fluorescencyjnego RFD-EC1 w CEM przygotowanych z różnych komórek bakteryjnych. EC: Escherichia coli-K12; PP: Pseudomonas peli; BD: Brevundimonas diminuta; HA: Hafnia alvei; YR: Yersinia ruckeri; OG: Ochrobactrum grignonese; AX: Achromobacter xylosoxidans; MO: Moraxella osloensis; AI: Acinetobacter lwoffi; SF: Serratia fonticola; BS: Bacillus subtilis; LM: Leuconostoc mesenteroides; LP: Lactobacillus planturum; PA: Pediococcus acidilactici; AO: Actinomyces orientalis. Każdą próbkę CEM inkubowano przez 5 min, po czym dodano RFD-EC1. (B) Analiza dPAGE mieszanin RFD-EC1/CEM-EC po 60-minutowej reakcji. Ścieżka NC1: RFD-EC1 w samym buforze reakcyjnym. Ścieżka NC2: RFD-EC1 w buforze reakcyjnym zawierającym CEM-BS (CEM przygotowany z Bacillus subtilis). Ścieżki oznaczone liczbami 4, 8, 12, 16 i 24: RFD-EC1 w buforze reakcyjnym zawierającym CEM-EC pobrany z hodowli bakteryjnej zawierającej pojedynczą komórkę E. coli po okresie wzrostu wynoszącym odpowiednio 4, 8, 12, 16 i 24 h.

Dyskusja

Większość powszechnie stosowanych obecnie metod wykrywania bakterii jest albo powolna (klasyczna mikrobiologia), albo wymagająca technicznie (przeciwciała, PCR). W związku z tym uważamy, że nowa generacja narzędzi detekcyjnych powinna kłaść nacisk na szybkość i prostotę. W tym celu stworzyliśmy DNAzym rozcinający RNA i generujący sygnał fluorescencyjny, który może być wykorzystany do opracowania prostych testów zgłaszających obecność bakterii poprzez generowanie sygnału fluorescencji. Przedstawiona sonda DNAzymowa, RFD-EC1, jest aktywowana przez CEM produkowane podczas wzrostu E. coli w pożywkach hodowlanych. Ponieważ nasza metoda wykorzystuje surowe mieszaniny zewnątrzkomórkowe bakterii jako cel detekcji i pomija żmudne etapy ekstrakcji oraz amplifikacji celu, może być ona stosowana do tworzenia bardzo prostych testów typu „wymieszaj i odczytaj” do wykrywania bakterii. Zastosowanie naszego DNAzymu nie ogranicza się do metod detekcji opartych na fluorescencji. Przykładowo, detekcję kolorymetryczną z wykorzystaniem tego samego układu DNAzymowego można zaprojektować, stosując wcześniej opisaną metodę wykorzystującą amplifikację przez toczący się krąg (RCA) w połączeniu z barwnikiem organicznym.32 Przewidujemy, że wykorzystanie DNAzymów do wykrywania bakterii będzie atrakcyjnym kierunkiem w tworzeniu nowych biosensorów bakteryjnych o większej prostocie operacyjnej.

Oświadczenia

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Finansowanie niniejszych badań zostało zapewnione przez Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) oraz Sentinel Bioactive Paper Network.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AgarBioShop CanadaAGR003
Persiarzan sodu (APS)BioShop CanadaAMP001
Akrylamid/Bis-akrylamid (40%, 29:1)BioShop CanadaACR004
Kwas borowyBioShop CanadaBOR001
Błękit bromofenolowySigma-AldrichB8026
EDTAElectron Microscopy SciencesEXO539-1
HClSigma-Aldrich38281
HEPESBioShop CanadaHEP001
Pożywka LBSigma-AldrichL3022
MgCl2EMD MilliporeB10149-34
NaClBioShop CanadaSOD002
NaOAcEMD MilliporeSXO255-1
NaOHEMD MilliporeSXO590-1
SDSBioShop CanadaSDS001
TEMEDBioShop CanadaTEM001
Tris-baseBioShop CanadaBST666
Tween 20Sigma-AldrichP9416
MocznikBioShop CanadaURE001
Ksylenocyjanol FFSigma-AldrichX4126
Koncentrator DNAThermo Fisher Scientific, Inc.Savant DNA SpeedVac 120
Jednostka filtrująca MillexEMD MilliporeSLGP033RS
Końcówki do nakładania na żelDiamedTEC200EX-K
Oprogramowanie ImageQuantMolecular DynamicsVersion 5.0
Chusteczki KimwipesKimberly-Clark Corporation34705
Mini-vortexVWR international58816-121
ParafilmPechiney Plastic PackagingPM996
Szalki PetriegoFisher ScientificFisherbrand 08-757-12
Stripettor Plus (pistolet do pipet)Corning07764714
Kuwety kwarcoweVarian Inc., Agilent66-100216-00
Inkubator z wytrząsarkąNew Brunswick ScientificClassic Series C24
Skaner TyphoonGE Healthcare9200 Variable mode
WirówkaBeckman Coulter Inc.Allegra X22-R
Spektrofotometr UVThermo Fisher Scientific, Inc.GenesysUV 10
Spektrofotometr fluorescencyjnyVarian Inc., AgilentCary Eclipse

Bibliografia

  1. Principles of Bacterial Detection: Biosensors, Recognition Receptors and Microsystems. Zourob, M., Elwary, S., Truner, A. , Springer. New York. (2008).
  2. Call, D. R. Challenges and Opportunities for Pathogen Detection Using DNA Microarrays. Crit. Rev. Microbiol. 31, 91-99 (2005).
  3. Lazcka, O., Campo, D. el, J, F., Muñoz, F. X. Pathogen detection: A perspective of traditional methods and biosensors. Biosens. Bioelectron. 22, 1205-1217 (2007).
  4. Velusamy, V. An overview of foodborne pathogen detection: In the perspective of biosensors. Biotechnol. Adv. 28, 232-254 (2010).
  5. Ali, M. M. Fluorogenic DNAzyme Probes as Bacterial Indicators. Angew. Chem. Int. Ed. 50, 3751-3754 (2011).
  6. Navani, N. K., Li, Y. Nucleic acid aptamers and enzymes as sensors. Curr. Opin. Chem. Biol. 10, 272-281 (2006).
  7. Liu, J., Cao, Z., Lu, Y. Functional Nucleic Acid Sensors. Chem. Rev. 109, 1948-1998 (2009).
  8. Li, Y., Lu, Y. Functional Nucleic Acids for Analytical Applications. , Springer. New York. (2009).
  9. Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249, 505-510 (1990).
  10. Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346, 818-822 (1990).
  11. Joyce, G. F. Forty Years of In Vitro Evolution. Angew. Chem. Int. Ed. 46, 6420-6436 (2007).
  12. Breaker, R. R., Joyce, G. F. A DNA enzyme that cleaves RNA. Chem. Biol. 1, 223-229 (1994).
  13. Cuenoud, B., Szostak, J. W. A DNA metalloenzyme with DNA ligase activity. Nature. 375, 611-614 (1995).
  14. Chinnapen, D. J., Sen, D. A deoxyribozyme that harnesses light to repair thymine dimers in DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 65-69 (2004).
  15. Schlosser, K., Li, Y. Biologically inspired synthetic enzymes made from DNA. Chem. Biol. 16, 311-322 (2009).
  16. Silverman, S. K. DNA as a versatile chemical component for catalysis, encoding, and stereocontrol. Angew. Chem. Int. Ed. 49, 7180-7201 (2010).
  17. Mei, S. H. An efficient RNA-cleaving DNA enzyme that synchronizes catalysis with fluorescence signaling. J. Am. Chem. Soc. 125, 412-420 (2003).
  18. Liu, Z. Assemblage of signaling DNA enzymes with intriguing metal-ion specificities and pH dependences. J. Am. Chem. Soc. 125, 7539-7545 (2003).
  19. Kandadai, S. A., Li, Y. Characterization of a catalytically efficient acidic RNA-cleaving deoxyribozyme. Nucleic Acids Res. 33, 7164-7175 (2005).
  20. Rupcich, N. Quenching of fluorophore-labeled DNA oligonucleotides by divalent metal ions: implications for selection, design, and applications of signaling aptamers and signaling deoxyribozymes. J. Am. Chem. Soc. 128, 780-790 (2005).
  21. Shen, Y., Brennan, J. D., Li, Y. Characterizing the secondary structure and identifying functionally essential nucleotides of pH6DZ1, a fluorescence-signaling and RNA-cleaving deoxyribozyme. Biochemistry. 44, 12066-12076 (2005).
  22. Chiuman, W., Li, Y. Revitalization of six abandoned catalytic DNA species reveals a common three-way junction framework and diverse catalytic cores. J. Mol. Biol. 357, 748-754 (2006).
  23. Chiuman, W., Li, Y. Evolution of high-branching deoxyribozymes from a catalytic DNA with a three-way junction. Chem. Biol. 13, 1061-1069 (2006).
  24. Shen, Y. Catalysis and rational engineering of trans-acting pH6DZ1, an RNA-cleaving and fluorescence-signaling deoxyribozyme with a four-way junction structure. Chem BioChem. 7, 1343-1348 (2006).
  25. Ali, M. M., Kandadai, S. A., Li, Y. Characterization of pH3DZ1 - An RNA-cleaving deoxyribozyme with optimal activity at pH 3. Can. J. Chem. 85, 261-273 (2007).
  26. Chiuman, W., Li, Y. Efficient signaling platforms built from a small catalytic DNA and doubly labeled fluorogenic substrates. Nucleic Acids Res. 35, 401-405 (2007).
  27. Chiuman, W., Li, Y. Simple fluorescent sensors engineered with catalytic DNA MgZ based on a non-classic allosteric design. PLoS ONE. 2, e1224(2007).
  28. Shen, Y. Entrapment of fluorescence signaling DNA enzymes in sol gel-derived materials for metal ion sensing. Anal. Chem. 79, 3494-3503 (2007).
  29. Kandadai, S. A. Characterization of an RNA-cleaving deoxyribozyme with optimal activity at pH 5. Biochemistry. 48, 7383-7391 (2009).
  30. Zhao, W., Brook, M. A., Li, Y. Periodic assembly of nanospecies on repetitive DNA sequences generated on gold nanoparticles by rolling circle amplification. Methods Mol. Biol. 474, 79-90 (2008).
  31. Navani, N. K., Mok, W. K., Li, Y. In vitro selection of protein-binding DNA aptamers as ligands for biosensing applications. Methods Mol. Biol. 504, 399-415 (2009).
  32. Ali, M. M., Li, Y. Colorimetric sensing by using allosteric-DNAzyme-coupled rolling circle amplification and a peptide nucleic acid-organic dye probe. Angew. Chem. Int. Ed. 48, 3512-3515 (2009).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Wykrywanie bakteriidetekcja E. colisurowa mieszanina zewnątrzkomórkowasonda DNAzymowatest fluorescencyjnyelektroforeza w żeluselekcja in vitroidentyfikacja patogenówopracowywanie biosensorów
Wykrywanie bakterii przy użyciu fluorogennych DNAzymów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.