Wykrywanie bakterii za pomocą fluorogennych DNAzymów

Summary

Niedawno opisaliśmy nowatorskie podejście do generowania sond fluorogenicznego DNAzyme, które można zastosować do stworzenia prostego, "mieszanego i odczytywanego" testu fluorescencyjnego do wykrywania bakterii. Te specjalne sondy DNA katalizują rozszczepienie zmodyfikowanego chromeforem chimerycznego substratu DNA-RNA w obecności surowej mieszaniny zewnątrzkomórkowej (CEM) wytwarzanej przez określoną bakterię, przekładając w ten sposób wykrywanie bakterii na generowanie sygnału fluorescencji. W tym raporcie opiszemy kluczowe procedury eksperymentalne, w których specyficzna sonda DNAzyme oznaczona jako "RFD-EC1" jest wykorzystywana do wykrywania modelowej bakterii, Escherichia coli (E. coli).

Abstract

Epidemie związane z patogenami przenoszonymi przez żywność i szpitale odpowiadają za miliony zgonów i hospitalizacji, a także za kolosalne straty ekonomiczne każdego roku. Zapobieganie takim epidemiom i minimalizowanie skutków trwającej epidemii stwarza coraz większe zapotrzebowanie na metody analityczne, które mogą dokładnie zidentyfikować sprawców patogenów na najwcześniejszym etapie. Chociaż istnieje szeroki wachlarz skutecznych metod wykrywania patogenów, żadna z nich nie jest w stanie spełnić wszystkich następujących pięciu głównych wymagań zawartych w idealnej metodzie wykrywania: wysoka swoistość (wykrywanie tylko interesującej nas bakterii), wysoka czułość (zdolna do wykrycia nawet pojedynczej żywej komórki bakteryjnej), krótki czas oczekiwania na wyniki (od minut do godzin), duża prostota obsługi (brak konieczności stosowania długich procedur pobierania próbek i stosowania specjalistycznego sprzętu), i opłacalność. Na przykład klasyczne metody mikrobiologiczne są wysoce specyficzne, ale wymagają długiego czasu (dni lub tygodni), aby uzyskać ostateczny wynik. ¹ Techniki oparte na PCR i przeciwciałach oferują krótszy czas oczekiwania (od godzin do dni), ale wymagają użycia drogich odczynników i/lub zaawansowanego sprzętu. ^2-4 W związku z tym nadal istnieje duże zapotrzebowanie na badania naukowe mające na celu opracowanie innowacyjnych metod wykrywania bakterii, które oferują lepsze właściwości w zakresie jednego lub więcej z wyżej wymienionych wymagań. Nasze laboratorium jest zainteresowane badaniem potencjału DNAzymes jako nowej klasy sond molekularnych do zastosowań biosensorycznych, w tym wykrywania bakterii. ⁵

Zymy DNA (znane również jako dezoksyrybozymy lub enzymy DNA) to stworzone przez człowieka jednoniciowe cząsteczki DNA zdolne do katalizowania reakcji chemicznych. ^Cząsteczki te można wyizolować z ogromnej puli DNA o losowej sekwencji (która zawiera aż 10¹⁶ pojedynczych sekwencji) w procesie znanym jako "selekcja in vitro" lub "SELEX" (systematyczna ewolucja ligandów przez wykładnicze wzbogacanie). ^9-16 Te specjalne cząsteczki DNA były szeroko badane w ostatnich latach jako narzędzia molekularne do zastosowań biosensorycznych. ^6-8 Rozdział

Nasze laboratorium ustaliło procedury selekcji in vitro do izolowania fluorescencyjnych DNAzymów (RFD; Rys. 1) i zbadano wykorzystanie RFD jako narzędzi analitycznych. ^17-29 RFD katalizują rozszczepienie chimerycznego substratu DNA-RNA w pojedynczym połączeniu rybonukleotydowym (R), które jest otoczone fluoroforem (F) i wygaszaczem (Q). Bliskie sąsiedztwo F i Q sprawia, że nierozdrobniony substrat ma minimalną fluorescencję. Jednak zdarzenie rozszczepienia prowadzi do oddzielenia F i Q, czemu towarzyszy znaczny wzrost intensywności fluorescencji.

Niedawno opracowaliśmy metodę izolowania RFD do wykrywania bakterii. ⁵ Te specjalne RFD zostały wyizolowane w celu "zaświecenia się" w obecności surowej mieszaniny zewnątrzkomórkowej (CEM) pozostawionej przez określony typ bakterii w ich środowisku lub w pożywce, w której są hodowane (ryc. 1). Zastosowanie surowej mieszanki pozwala uniknąć żmudnego procesu oczyszczania i identyfikowania odpowiedniego celu z mikroba będącego przedmiotem zainteresowania do opracowania biosensorów (co może zająć miesiące lub lata). Zastosowanie celów zewnątrzkomórkowych oznacza, że procedura oznaczania jest prosta, ponieważ nie ma potrzeby podejmowania kroków w celu uzyskania celów wewnątrzkomórkowych.

Korzystając z powyższego podejścia, uzyskaliśmy RFD, który rozszczepia swoje podłoże (FS1; Rys. 2A) tylko w obecności CEM wytwarzanego przez E. coli (CEM-EC). ⁵ Stwierdzono, że ten RFD wykrywający E. coli, nazwany RFD-EC1 (ryc. 2A), jest ściśle wrażliwy na CEM-EC, ale nie reaguje na CEM z wielu innych bakterii (ryc. 3).

Tutaj prezentujemy kluczowe procedury eksperymentalne do tworzenia testów wykrywania E. coli przy użyciu RFD-EC1 i reprezentatywnych wyników.

Protocol

1. Przygotowanie roztworów chemicznych

1. 0,5 M kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA): W plastikowej zlewce o pojemności 2 litrów (L) odważyć 186,1 g EDTA (EM Science) i dodać 800 mililitrów (ml) autoklawowanej wody dejonizowanej (ddH₂O). Dostosuj pH do 8,0 za pomocą granulek NaOH (EM Science). Uzupełnić końcową objętość do 1 l za pomocą ddH₂O. Przenieść roztwór do szklanych butelek, umieścić w autoklawie i przechowywać w temperaturze 4 °C.
2. 10× Tris-boranowy roztwór EDTA (10× TBE; 89 mM Tris, 89 mM kwas borowy, 2 mM EDTA, pH 7,5): Odważyć 432 g zasady Tris (BioShop Canada) i 220 g kwasu borowego (BioShop Canada) i dodać każdy z nich do 4 l plastikowej zlewki. Odmierzyć 80 ml 0,5 M EDTA (pH 8,0) i dodać do zlewki. Dodać ddH₂O do końcowej objętości 4 l. Dokładnie wymieszać roztwór za pomocą mieszadła magnetycznego, aż składniki całkowicie się rozpuszczą. Przenieść roztwór do szklanych butelek, umieścić w autoklawie i przechowywać w temperaturze 4 °C.
3. 10% denaturujący żel poliakrylamidowy: Do plastikowej zlewki o pojemności 4 l dodać 1681,7 g mocznika (BioShop Canada), 400 ml 10× TBE, 1 l 40% roztworu akryloamidu/bisakryloamidu (29:1) (BioShop Canada). Zwiększyć objętość do 4 l za pomocą ddH₂O. Rozpuść mocznik, mieszając. Przenieść roztwór do butelek ze szkła oranżowego o pojemności 1 l i przechowywać w temperaturze 4 °C. (Uwaga! Z akrylamidem należy obchodzić się w rękawiczkach, masce, okularach i fartuchu laboratoryjnym, ponieważ przed polimeryzacją jest neurotoksyną).
4. 2× bufor ładujący żel (2× GLB): Do szklanej zlewki o pojemności 200 ml dodać 44 g mocznika, 8 g sacharozy (BioShop Canada), 10 mg błękitu bromofenolowego (BioShop Canada), 10 mg ksylenecyanolu FF (Sigma-Aldrich), 400 μl 10% dodecylosiarczanu sodu (SDS; BioShop Canada) i 4 ml 10× TBE. Dostosować końcową objętość do 40 ml za pomocą ddH₂O i rozpuścić ciała stałe przez łagodne ogrzewanie (50 °C) i mieszanie za pomocą pręta magnetycznego. Przenieść 1 ml podwielokrotności do 1,5 ml probówek do mikrowirówek i przechowywać w temperaturze 4 °C. Z naszego doświadczenia wynika, że przed użyciem konieczne jest krótkie podgrzanie 2× GLB w temperaturze 90 °C, ponieważ 2× GLB krzepnie w warunkach przechowywania.
5. 1 M Tris-HCl (pH 7,5): Odważyć 12,1 g Tris-base w szklanej zlewce o pojemności 200 ml. Dodać 60 ml ddH₂O i rozpuścić ciała stałe, mieszając mieszadłem magnetycznym. Dostosuj pH do 7,5 za pomocą 1 M HCl (Sigma-Aldrich). Uzupełnić objętość do 100 ml roztworem_ddH2O i przenieść do szklanej butelki i autoklawu. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
6. 5 M NaCl: W szklanej zlewce odważyć 58,4 g NaCl (BioShop Canada) i rozpuścić w 150 ml ddH₂O. Dostosować objętość do 200 ml za pomocą ddH₂O. Przenieść roztwór do szklanej butelki, umieścić w autoklawie i przechowywać w temperaturze 4 °C.
7. Bufor elucyjny DNA: W szklanej zlewce wymieszać 2 ml 1 M Tris-HCl (pH 7,5), 8 ml 5 M NaCl i 0,4 ml 0,5 M EDTA (pH 8,0). Dostosować objętość do 200 ml za pomocą ddH₂O. Autoklaw i przechowywać w temperaturze 4 °C.
8. 2× bufor reakcyjny (2× RB; 100 mM HEPES, 300 mM NaCl, 30 mM MgCl₂): Do 50 ml probówki Falcon (BD Falcon) dodać 1,2 g HEPES (BioShop Canada), 0,88 g NaCl i 0,30 g MgCl₂•6H₂O (EMD Chemicals) i 30 ml ddH₂O. Wymieszać, delikatnie wstrząsając, aż składniki całkowicie się rozpuszczą. Doprowadzić pH do 7,5 przez dodanie 10 N roztworu NaOH i dostosować końcową objętość do 50 ml za pomocą ddH₂O. Oczyścić roztwór za pomocą jednostki filtrującej napędzanej strzykawką (0,22 μm, milipore) i przechowywać w temperaturze 4 °C.
9. Rosół Luria Bertani (LB): W zlewce odważyć 20,0 g proszku LB (Sigma-Aldrich), a następnie dodać 1 l ddH₂O. Dokładnie wymieszać roztwór za pomocą mieszadła magnetycznego, przenieść roztwór do kolby stożkowej. Roztwór należy sterylizować w autoklawie i przechowywać w temperaturze pokojowej.
10. Agar 1,5% LB: Zważ 1,5 g agaru (BioShop Canada) w kolbie o pojemności 250 ml i dodaj 100 ml płynu LB. Mieszaninę należy sterylizować w autoklawie i przechowywać w temperaturze pokojowej.
11. Posiewanie agarowe: Rozpuść agar LB w kuchence mikrofalowej i ostudź roztwór do ~50 °C. Wlej roztwór do szalek Petriego (Fisher Scientific) pod płomieniem. Z naszego doświadczenia wynika, że 100 ml agaru LB może dać 5-6 płytek.

2. Budowa RFD-EC1 i RFSS1 za pomocą ligacji enzymatycznej za pośrednictwem szablonu

RFD-EC1 (rys. 2A) to wyróżniony DNAzyme. Składa się z sekwencji katalitycznej EC1 i sekwencji substratu FS1 (oznaczonej czarnymi i zielonymi liniami na rys. 2A). RFSS1 (rys. 2A) to zaszyfrowana wersja RFD-EC1, w której sekwencja katalityczna EC1 jest częściowo tasowana do SS1, ale część FS1 pozostaje niezmieniona. RFD-EC1 i RFSS1 wykonano metodą enzymatycznej ligacji oligonukleotydu FS1 za pośrednictwem matrycy z oligonukleotydem EC1 lub SS1 w obecności LT1 jako matrycy ligacji (patrz wstawiona ramka na ryc. 2A). Procedura przeprowadzania reakcji podwiązania jest przedstawiona poniżej. FS1 uzyskano z Keck Oligo Synthesis Facilities na Uniwersytecie Yale, zdeprotektowano i oczyszczono za pomocą elektroforezy żelowej zgodnie z wcześniej ustalonym protokołem. ^17-24 EC1, SS1 i LT1 zakupiono od Integrated DNA Technologies i oczyszczono za pomocą elektroforezy żelowej.

1. Przygotować 100 μM roztwór podstawowy FS1, EC1, SS1 i LT1 przy użyciu ddH₂O. Przechowywać je w temperaturze -20 °C do czasu użycia.
2. Przenieść 5 μl roztworu podstawowego FS1 do dwóch probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 μl oznaczonych jako Probówka 1 i Probówka 2. Do każdej probówki dodać 38,5 μl ddH₂O, a następnie 5 μl 10× buforu reakcyjnego kinazy polinukleotydowej T4 (PNK) (MBI Fermentas), który zawiera 500 mM Tris-HCl (pH 7,6, 25 °C), 100 mM MgCl₂, 50 mM DTT, 1,0 mM spermidyny. Wymieszać każdy roztwór, pipetując (kilkakrotnie pipetując roztwór w górę i w dół).
3. Dodać 1 μl ATP (100 mM; MBI Fermentas) i wymieszać pipetując.
4. Dodać 0,5 μl kinazy polinukleotydowej T4 (PNK; 10 jednostek/μL; MBI Fermentas) i wymieszać pipetując. Mieszaniny reakcyjne inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Pamiętaj, aby przykryć probówki folią aluminiową, aby zminimalizować fotowybielanie fluoroforu.
5. Ugasić reakcję przez ogrzewanie w temperaturze 90 °C przez 5 minut. Schłodzić mieszaniny reakcyjne w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
6. Dodać 5 μl roztworu podstawowego EC1 i SS1 odpowiednio do probówki 1 i probówki 2.
7. Dodać 5 μl roztworu podstawowego LT1 do każdej probówki, wymieszać pipetując. Podgrzewać mieszaniny reakcyjne w temperaturze 90 °C przez 1 minutę i schładzać do temperatury pokojowej przez 10 minut.
8. Dodać 118 μl ddH₂O, a następnie 20 μl 10× buforu ligazy DNA T4 (MBI Fermentas), który zawiera 400 mM Tris-HCl (pH 7,8 w 25 °C), 100 mM MgCl₂, 100 mM DTT i 5 mM ATP. Wymieszać roztwór, pipetując.
9. Dodać 2 μl ligazy DNA T4 (5 jednostek/μl; MBI Fermentas) i wymieszać pipetując. Mieszaniny reakcyjne inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
10. Dodać 20 μl 3 M NaOAc (pH 7,0) do każdej probówki, odwirować i odwirować. Do każdej probówki dodać 500 μl zimnego 100% etanolu, wymieszać roztwór przez wirowanie i umieścić probówki w zamrażarce o temperaturze -20 °C na 30 minut.
11. Odwirować mieszaniny w temperaturze 11 000 g przez 20 minut w temperaturze 4 °C w wirówce z chłodzeniem (Allegra X22-R, Beckman Coulter) i ostrożnie usunąć supernatant przez pipetowanie.
12. Suszyć osad DNA za pomocą koncentratora DNA (Savant DNA Speedvac, Thermo Scientific) przez 10 minut.
13. Zawiesić granulki DNA w 30 μl 1× żelowego buforu ładującego (GLB), na krótko odwirować i odwirować za pomocą wirówki stołowej (miniwirówka, VWR Scientific). Zligowane próbki DNA są gotowe do załadowania na 10% żel dPAGE.

3. Przygotowanie 10% żelu dPAGE

Poniższe kroki krótko opisują aparaturę do elektroforezy żelowej i jej ustawienie. Aby uzyskać więcej informacji na temat urządzenia, ustawień i obsługi, zapoznaj się z naszymi poprzednio opublikowanymi protokołami. ^30,31

1. Umyj i wysusz dwie szklane płytki, dwie przekładki 0,75 mm i 16-dołkowy grzebień. Zamontuj szklane płytki i przekładki za pomocą klipsów i połóż poziomo na płaskiej powierzchni z karbowaną szklaną płytką skierowaną do góry.
2. Przenieść 40 ml 10% mieszanki dPAGE do zlewki o pojemności 150 ml. Dodać 40 μl tetrametyloetylenodiaminy (TEMED; Bioshop Canada), 400 μl 10% APS i wymieszać mieszając za pomocą pipetora.
3. Ostrożnie wlej mieszaninę między talerze i natychmiast włóż grzebień. Pozostaw mieszaninę do polimeryzacji przez 10 do 20 minut. Polimeryzację można potwierdzić, sprawdzając pozostałą mieszaninę żelu pozostałą w zlewce.
4. Po polimeryzacji delikatnie wyjmij grzebień i przepłucz studzienki ddH₂O, aby usunąć resztki roztworu żelu z dołków.
5. Zamontuj płytki na aparacie do elektroforezy żelowej z prostokątną płytką bez karbu skierowaną na zewnątrz i umieść metalową płytkę za płytką z karbem. Zastosowanie metalowej płytki pomaga zapobiegać przegrzaniu, które może spowodować pęknięcie szklanych płyt.
6. Dodać 1× TBE do górnej i dolnej komory aparatu. Sprawdź, czy studzienki są wypełnione buforem, a dolna krawędź żelu jest zanurzona w buforze.
7. Zastosuj prąd o natężeniu 40 mA (lub 750 V) i uruchom przez 10 do 15 minut.

4. Oczyszczanie ligowanego RFD-EC1 i RFSS1 przez 10% żel dPAGE

1. Postępując zgodnie z krokiem 3.7, przepłukać studzienki 1× TBE za pomocą strzykawki i igły.
2. Załaduj mieszaninę ligacyjną RFD-EC1 i RFSS1 (od 2.13) do 2 dołków (po jednym dla każdego) za pomocą pipetora i końcówek ładujących żel (Diamed). Zastosuj prąd o natężeniu 40 mA (750 V) do momentu, gdy dolny barwnik (błękit bromofenolowy) znajdzie się około 5 cm powyżej dolnej krawędzi płytek.
3. Wyjmij szklane płytki z urządzenia do biegania z żelem, połóż się na płaskim blacie i ostrożnie usuń przekładki.
4. Ostrożnie wyjmij górne szklane płytki z żelu i owiń żel folią spożywczą (staraj się unikać zagnieceń i fałdowania okładów na żelu).
5. Ligowane produkty można wizualizować za pomocą cieniowania UV (260 nm) lub przez transoświetlenie (360 nm), co spowoduje powstanie widocznego pasma DNA kilka centymetrów powyżej EC1 lub SS1 (100 pmol EC1 lub SS1 można użyć jako markera i załadować do studzienki w kroku 4.2). Zaznacz żądane prążki DNA markerem.
6. Odetnij pasmo DNA za pomocą sterylnych żyletek, pokrój żel na małe kawałki i przenieś do świeżej probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.
7. Zmiażdżyć kawałki żelu w probówce mikrowirówki za pomocą sterylnej końcówki do pipet (końcówka o pojemności 200 μl).
8. Dodaj 500 μl buforu elucyjnego DNA do każdej probówki i przykryj je folią aluminiową, aby chronić fluorofory przed światłem. Wirować próbki przez 10 minut.
9. Odwirować próbki o masie 11 000 g przez 4 minuty w temperaturze 4 °C w wirówce z chłodzeniem (Allegra X22-R, Beckman Coulter) i ostrożnie przenieść 350 μl supernatantu do świeżej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml (w razie potrzeby drugą elucję można przeprowadzić za pomocą 350 μl świeżego buforu elucyjnego przez kolejne 10 minut).
10. Dodać 35 μl (0,1× objętości próbki) 3 M octanu sodu (NaOAc, pH 7,0) do każdej probówki, wymieszać przez wirowanie i odwirować. Dodaj 900 μl zimnego 100% etanolu do każdej probówki. Wymieszaj każdą próbkę, potrząsając ręcznie probówką przez kilka sekund. Umieścić probówki w temperaturze -20 °C na co najmniej 1 godzinę.
11. Odwirować próbki o masie 11 000 g przez 20 minut w temperaturze 4 °C w wirówce z chłodzeniem i ostrożnie usunąć supernatant przez pipetowanie.
12. Dodaj 100 μl zimnego 70% etanolu i delikatnie przepłucz nim całą wewnętrzną ściankę tuby. Ponownie odwirować przy 11 000 g przez 7 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant i suszyć osad za pomocą koncentratora DNA przez 10 minut.
13. Rozpuść granulki DNA w 100 μl ddH₂O i zawiruj. Określić stężenie DNA na podstawie absorbancji promieniowania UV przy 260 nm. Próbki należy przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu użycia.

5. Przygotowanie bakterii

1. Docelowy szczep bakteryjny E. coli K12 (MG1655) i odpowiednie szczepy kontrolne są najpierw siane na płytkach agarowych LB z zapasów glicerolu. Pod płomieniem lub w komorze bezpieczeństwa biologicznego dotknąć bakteryjnego wywaru glicerolowego sterylną końcówką pipety i delikatnie rozprowadzić smugi na powierzchni płytki, aby uniknąć uszkodzenia agaru LB.
2. Odwrócić prążkowane płytki i inkubować w temperaturze 37 °C przez 14 godzin. Po inkubacji uszczelnić cały obwód płytek preparatem Parafilm (opakowanie z tworzywa sztucznego Pechiney) i przechowywać w temperaturze 4 °C. Płytki te można przechowywać maksymalnie przez 4 tygodnie.

6. Przygotowanie surowych mieszanek zewnątrzkomórkowych (CEM)

1. Dozować 2 ml LB do sterylnych probówek hodowlanych o pojemności 14 ml (BD Falcon) za pomocą pistoletu do pipet (Corning).
2. Używając sterylnej końcówki pipety, pobrać pojedynczą kolonię z płytki agarowej przygotowanej w kroku 5.2 i włożyć ją do probówki hodowlanej. Umieścić probówki w inkubatorze (New Brunswick Scientific) ustawionym na 37 °C i wstrząsać z prędkością 250 obr./min przez 14 godzin.
3. 1% kultura ponownego inokulacji: Dozować 2 ml świeżego LB do 14 ml probówek hodowlanych i dodać 20 μl kultur bakteryjnych przygotowanych w kroku 6.2. Inkubować probówki w temperaturze 37 °C, wytrząsając z prędkością 250 obr./min, aż każdy roztwór bakteryjny osiągnie OD₆₀₀ (gęstość optyczna mierzona przy 600 nm) około 1. Aby zmierzyć OD₆₀₀, przenieś 1 ml każdej kultury do jednorazowej kuwety i zmierz absorbancję przy 600 nm za pomocą spektrofotometru UV (Genesys UV 10, Thermo Scientific).
4. Przenieś 1 ml każdej kultury do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i komórek osadu przez odwirowanie przy 11 000 g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
5. Przenieść klarowny sklarowany sklarowany sklarent do świeżej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C, jeśli nie zostanie natychmiast użyty.

7. Wykrywanie za pomocą spektrofotometru fluorescencyjnego

1. Włącz spektrofotometr fluorescencyjny (Cary Eclipse, Varian Inc) i ustaw parametry akwizycji danych ze wzbudzeniem przy 488 nm i emisją przy 520 nm. Odczyty można wykonywać co minutę przez 1 godzinę.
2. Umyj 3 kuwety z kryształu kwarcu (Varian Cary) ddH₂O, a następnie 100% etanolem. Wysuszyć kuwety, rozpylając gazowy azot. Oznacz kuwety C1 (kontrola 1), C2 (kontrola 2) i T (próba).
3. Przenieść 24 μl ddH₂O do C1 i 24 μl CEM-EC do C2 i T. Dodać 25 μl 2× RB do każdej kuwety i umieścić je w spektrofotometrze fluorescencyjnym. Rozpocznij zbieranie danych fluorescencyjnych przez pierwsze 5 minut.
4. Dodać 1 μl RFSS1 (z roztworu podstawowego 5 μM) do C2 i 1 μl RFD-EC1 (z roztworu podstawowego 5 μM) do T i C1. Wymieszać każdy roztwór, pipetując. Należy to ostrożnie zainicjować, aby odczyty fluorescencji nie zostały przerwane. Pozwól, aby reakcja trwała przez pozostałą część 1 godzinnego czasu akwizycji.
5. Zapisz dane w formacie pliku Excel, przenieś dane do komputera osobistego i przetwórz dane, aby utworzyć obraz graficzny.

8. Wykrywanie za pomocą elektroforezy żelowej

Te same mieszaniny reakcyjne przygotowane w kroku 7.4 mogą być użyte do analizy za pomocą elektroforezy żelowej; alternatywnie nowe reakcje mogą być przygotowane podobnie i inkubowane w 1,5 ml probówkach do mikrowirówek. W każdym z tych przypadków:

1. Reakcje hartowania (po 1 godzinie) należy dodać 5 μl 3 M NaOAc i 125 μl 100% etanolu. Wymieszaj każdy roztwór przez wirowanie i umieść probówki w zamrażarce w temperaturze -20 °C na 1 godzinę.
2. Odwirować mieszaniny reakcyjne o stężeniu 11 000 g przez 20 minut w temperaturze 4 °C i ostrożnie usunąć supernatant przez pipetowanie.
3. Suszyć granulki za pomocą koncentratora DNA przez 10 minut.
4. Zawiesić granulki w 20 μl 1× GLB przez krótkie wirowanie. Bardzo krótkie odkręcanie probówek za pomocą wirówki stołowej (miniwirówka, VWR Scientific). Próbki te są gotowe do załadowania do żelu dPAGE.
5. Przygotować 10% żel dPAGE zgodnie z opisem w ppkt 3.1-3.7. Załadować próbki reakcyjne (z kroku 8.4) do studzienek za pomocą pipetora i końcówek do ładowania żelem (Diamed). Zastosuj prąd o natężeniu 40 mA (750 V) do momentu, gdy dolny barwnik (błękit bromofenolowy) znajdzie się około 5 cm powyżej dolnej krawędzi płytek.
6. Usuń szklane płytki i dokładnie umyj je wodą z kranu, aby usunąć wszelkie kawałki żelu. Przetrzyj płytki chusteczką kimwipe (Kimberly-Clark Professional).
7. Zeskanuj płytkę żelową pod kątem fluorescencji za pomocą skanera Typhoon (Typhoon 9200, tryb zmienny, GE Healthcare). Analizuj dane za pomocą oprogramowania ImageQuant (dynamika molekularna).

9. Specyfika wykrywania

1. W celu zbadania swoistości bakteryjnej te same procedury, które opisano powyżej dla hodowli E. coli, przygotowania jej CEM i przeprowadzenia testu reakcji rozszczepienia, można przeprowadzić dla wielu różnych szczepów bakterii, takich jak B. subtilis, P. peli, Y. ruckeri, L. planturum, P. acidilactici (pokazane na ryc. 3A).

10. Wykrywanie pojedynczych komórek

Przygotuj 1 ml glicerolu E. coli o zawartości 2 CFU/ml (CFU: jednostka tworząca kolonie) przez seryjne rozcieńczanie i potwierdź stężenie CFU przez posiew. ⁵ Ten wywar powinien zawierać 0,2 jtk/100 μl. Przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia.

1. Przygotuj 10 probówek hodowlanych zawierających 2 ml LB.
2. Zaszczepić każdą kulturę 100 μl glicerolu o stężeniu 2 jtk/ml i inkubować w temperaturze 37 °C, wytrząsając przy 250 obr./min. Użycie całego zapasu glicerolu (1 ml) powinno dać 10 kultur.
3. Zbierz 300 μl z każdej zaszczepionej probówki hodowlanej w następujących punktach czasowych: 4, 8, 12, 16 i 24 godziny. Pozostaw pozostałą kulturę do wzrostu na 24 godziny.
4. Zmierzyć OD₆₀₀ i wytrącić komórki przez odwirowanie przy 11 000 g przez 5 minut.
5. Przenieść CEM-y do świeżych probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia.
   Uwaga: Ponieważ dla próbek pobranych w punktach czasowych 4, 8 i 12 może nie być wykrywalny OD₆₀₀, należy pozwolić pozostałej kulturze rosnąć przez 24 godziny w celu zidentyfikowania kultur zawierających bakterie (określonych na podstawie pomiaru zmętnienia i OD). Tylko jedna lub dwie z 10 kultur mogą zawierać E. coli po inokulacji, a pozostałe probówki nie będą zawierały żadnych komórek.
6. Użyć CEM-ów odzyskanych z dodatnich kultur (przechowywanych w temperaturze -20 °C) w wyznaczonych punktach czasowych w celu przygotowania reakcji rozszczepienia z RFD-EC1, a następnie przeanalizować mieszaniny reakcyjne przy użyciu elektroforezy żelowej dPAGE, jak opisano w sekcji 8.

11. Koncepcja i reprezentatywne wyniki

Koncepcja wykorzystania fluorescencyjnego DNAzymu (RFD) do wykrywania bakterii jest zilustrowana na Rys. 1. RFD rozszczepia chimeryczny substrat DNA/RNA w samotnym wiązaniu RNA (niebieskie R) otoczone dwoma nukleotydami znakowanymi odpowiednio fluoroforem (F) i wygaszaczem (Q). Gdy interesująca bakteria (taka jak E. coli) rośnie w pożywce, pozostawia po sobie surową mieszaninę zewnątrzkomórkową (CEM). Ten CEM jako całość jest następnie wykorzystywany w eksperymencie selekcyjnym in vitro w celu uzyskania RFD, który reaguje specyficznie na CEM; przypuszczalnie RFD oddziałuje ze specyficzną cząsteczką (fioletową gwiazdą) w CEM, która jest cząsteczką sygnaturową bakterii. Gdy CEM jest dodawany do roztworu reakcyjnego zawierającego RFD, wyzwala aktywność RFD polegającą na rozszczepianiu RNA. Zdarzenie rozszczepienia oddziela F od Q, w wyniku czego powstaje sygnał fluorescencyjny, który można wykryć za pomocą fluorymetru lub elektroforezy żelowej.

Eksperymentalna walidacja powyższej koncepcji została przeprowadzona z użyciem CEM z E. coli (CEM-EC). Uzyskaliśmy 3 cząsteczki RFD poprzez selekcję in vitro, a najbardziej wydajna z nich została oznaczona jako RFD-EC1 (ryc. 2A). ⁵ Przetestowaliśmy aktywność rozszczepienia RFD-EC1 (wraz ze zmutowaną sekwencją o nazwie RFSS1) w odpowiedzi na CEM-EC. Zarówno RFD-EC1, jak i RFSS1 otrzymano przez enzymatyczną ligację porcji DNAzymu do substratu FS1 (wszystkie sekwencje pokazano na ryc. 2A). W eksperymencie pomiaru fluorescencji (ryc. 2B) CEM-EC inkubowano samodzielnie przez 5 minut, następnie dodano RFD-EC1 lub RFSS1 i kontynuowano inkubację przez kolejne 55 minut. Intensywność fluorescencji roztworu odczytywano w sposób ciągły co minutę, a dane wykorzystano do obliczenia fluorescencji względnej (RF; obliczana jako stosunek intensywności fluorescencji w czasie t do intensywności fluorescencji w czasie 0). Wartości RF w funkcji czasu inkubacji są wykreślone jako rys. 2B. Stwierdzono, że RFD-EC1 wytwarzał wysoki poziom sygnału fluorescencji po dodaniu CEM-EC; w przeciwieństwie do tego, RFSS1 nie wytwarzał silnego sygnału fluorescencji. W związku z tym funkcja wytwarzania fluorescencji RFD-EC1 po kontakcie z CEM-EC jest specyficzna dla sekwencji.

Aby sprawdzić, czy obserwowany wzrost fluorescencji jest spowodowany rozszczepieniem wiązania RNA, przeanalizowaliśmy mieszaniny reakcyjne za pomocą dPAGE. Oczekuje się, że rozszczepienie RFD-EC1 wygeneruje dwa fragmenty DNA, fragment 5' zatrzymujący fluorofor i fragment 3' zatrzymujący wygaszacz. Tylko nierozdwojony RFD-EC1 (unclv) i fragment 5′ (clv) można było wykryć za pomocą obrazowania fluorescencyjnego. Wynik dPAGE pokazany na rys. 2C pokazuje, że mieszanina reakcyjna RFD-EC1 i CEM-EC rzeczywiście wytworzyła oczekiwany produkt rozszczepienia, podczas gdy mieszanina RFSS1/CEM-EC nie.

Specyficzność RFD-EC1 została zbadana za pomocą CEM-ów pobranych od kilku innych bakterii Gram-ujemnych i Gram-dodatnich, a dane są pokazane na Rys. 3A. Tylko próbka zawierająca CEM-EC (niebieska krzywa) spowodowała wzrost fluorescencji. Brak reaktywności krzyżowej z CEM-ami innych bakterii wskazuje, że RFD-EC1 jest wysoce selektywny wobec E. coli.

Zbadaliśmy również czas potrzebny do wyhodowania pojedynczej komórki E. coli, aby wytworzyć wystarczającą ilość CEM, która może wywołać rozszczepienie RFD-EC1. W tym eksperymencie próbka E. coli zawierająca zdefiniowane jednostki tworzące kolonie została odpowiednio rozcieńczona, aby osiągnąć stężenie 1 CFU/ml. Następnie zmieszano 100 μl rozcieńczonej próbki bakteryjnej z pożywką wzrostową i hodowano ją przez 4, 8, 12, 16 i 24 godziny. Następnie pobrano CEM dla każdego punktu czasowego i przetestowano pod kątem indukcji aktywności rozszczepienia RFD-EC1. Wynik dPAGE pokazany na rys. 3B wskazuje, że potrzebny jest czas hodowli wynoszący 12 godzin.

Ważne jest, aby zauważyć, że początkowy niewielki wzrost sygnału obserwowany w pomiarach fluorescencji po dodaniu sekwencji RFSS1 (jako kontroli negatywnej) do CEM-EC (Rys. 2B; czerwona krzywa) lub RFD-EC1 do innych bakteryjnych CEM-ów (Rys. 3B; wszystkie krzywe z wyjątkiem niebieskiej) jest przypisywany wewnętrznej fluorescencji modułu FRQ (z powodu niepełnego wygaszania F przez Q). W związku z tym oczekuje się, że dodanie sekwencji znakowanych F i Q spowoduje początkowy wzrost fluorescencji. Jednak tylko mieszaniny RFD-EC1/CEM-EC są w stanie wytworzyć wysoki poziom fluorescencji w czasie.

Rysunek 1. Schematyczna ilustracja sondy fluorescencyjnej DNAzyme (RFD) do rozszczepiania RNA, która fluoryzuje w kontakcie z surową mieszaniną zewnątrzkomórkową (CEM) wytwarzaną przez określone komórki bakteryjne będące przedmiotem zainteresowania. RFD rozszczepia chimeryczny substrat DNA/RNA w samotnym wiązaniu RNA (niebieskie R) otoczone dwoma nukleotydami znakowanymi odpowiednio fluoroforem (F) i wygaszaczem (Q). Przed reakcją rozszczepienia poziom fluorescencji RFD jest minimalny ze względu na bliskie sąsiedztwo F i Q. Po rozszczepieniu Q odchodzi od F; W rezultacie wytwarzany jest silny sygnał fluorescencyjny.

Rysunek 2. RFD wykrywający E. coli. (A) RFD-EC1 to sonda DNAzyme, która może być aktywowana przez CEM-EC. RFSS1 to zaszyfrowana sekwencja RFD-EC1 używana jako kontrolka. RFD-EC1 i RFSS1 zostały wytworzone przez ligowanie FS1 odpowiednio z EC1 i SS1 w obecności LT1 jako szablonu. F: deoksytymidyna modyfikowana fluoresceiną. Q: Deoksytymidyna modyfikowana dabcylem. R: rybonukleotyd adeninowy. (B) Profile sygnalizacji fluorescencyjnej RFD-EC1 i RFSS1 w obecności CEM-EC. (C) analiza dPAGE mieszanin reakcyjnych rozszczepienia w B (czas reakcji: 60 min). Na zdjęciu obraz fluorescencyjny żelu dPAGE uzyskany za pomocą skanera Typhoon. Tor NC: RFD-EC1 lub RFSS1 w samym buforze reakcyjnym; Pas CEM-EC: RFD-EC1 lub RFSS1 w buforze reakcyjnym zawierającym CEM-EC. Marker: RFD-CE1 traktowany 0,25 N NaOH, procedura znana z tego, że powoduje pełne rozszczepienie RNA. unclv: nieszczelny RFD-EC1. CLV: Fragment łupliwości zawierający fluorofor.

Rysunek 3. (A) Profil sygnalizacji fluorescencyjnej RFD-EC1 w CEM-ach przygotowanych z różnych komórek bakteryjnych. EC: Escherichia coli-K12; PP: Pseudomonas peli; BD: Brevundimonas diminuta; HA: Hafnia alvei; YR: Yersinia ruckeri; OG: Ochrobactrum grignonese; AX: Achromobacter xylosoxidans; MO: Moraxella osloensis; Sztuczna inteligencja: Acinetobacter lwoffi; SF: Serratia fonticola; BS: Bacillus subtilis; LM: Leuconostoc mesenteroides; LP: Lactobacillus planturum; PA: Pediococcus acidilactici; AO: Actinomyces orientalis. Każdą próbkę CEM inkubowano przez 5 minut, a następnie dodano RFD-EC1. (B) analiza dPAGE mieszanin RFD-EC1/CEM-EC po 60-minutowej reakcji. Pas NC1: RFD-EC1 w samym buforze reakcyjnym. Pas NC2: RFD-EC1 w buforze reakcyjnym zawierającym CEM-BS (CEM przygotowany z Bacillus subtilis). Pasy oznaczone numerami 4, 8, 12, 16 i 24: RFD-EC1 w buforze reakcyjnym zawierającym CEM-EC pobranym z kultury bakteryjnej zawierającej pojedynczą komórkę E. coli po okresie wzrostu wynoszącym odpowiednio 4, 8, 12, 16 i 24 godziny.

Discussion

Większość popularnych obecnie metod wykrywania bakterii jest albo powolna (klasyczna mikrobiologiczna), albo wymagająca technicznie (przeciwciała, PCR). Dlatego uważamy, że następna generacja narzędzi do wykrywania powinna dążyć do szybkości i prostoty. W tym celu stworzyliśmy DNAzyme rozszczepiający i sygnalizujący fluorescencję RNA, który można wykorzystać do opracowania prostych testów informujących o obecności bakterii poprzez generowanie sygnału fluorescencyjnego. Przedstawiona sonda DNAzyme, RFD-EC1, jest aktywowana przez CEM wytwarzany podczas wzrostu E. coli w pożywkach hodowlanych. Ponieważ nasza metoda wykorzystuje surowe zewnątrzkomórkowe mieszaniny bakterii jako cel wykrywania i omija pracochłonne etapy ekstrakcji i amplifikacji celu, może być wykorzystana do skonfigurowania bardzo prostych testów typu "mix-and-read" do wykrywania bakterii. Zastosowanie naszego DNAzyme nie ogranicza się do metody detekcji opartej na fluorescencji. Na przykład detekcję kolorymetryczną przy użyciu tego samego testu systemu DNAzyme można zaprojektować przy użyciu wcześniej opisanej metody, która wykorzystuje amplifikację toczącego się koła w połączeniu z barwnikiem organicznym. ³² Przewidujemy, że wykorzystanie DNAzymes do wykrywania bakterii będzie atrakcyjną drogą do generowania nowych bioczujników bakteryjnych o większej prostocie operacyjnej.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	BioShop Canada	AGR003
Nadsiarczan amonu (APS)	BioShop Canada	AMP001
Akrylamid/Bis-akryloamid (40%, 29:1)	BioShop Canada	ACR004
Kwas borowy	BioShop Kanada	BOR001
Błękit bromofenolowy	Sigma-Aldrich	B8026
EDTA	Electron Mikroskopia Nauki	EXO539-1
HCl	Sigma-Aldrich	38281
HEPES	BioShop Kanada	HEP001
LB bulion	Sigma-Aldrich	L3022
MgCl2	EMD Millipore	B10149-34
NaCl	BioShop Kanada	SOD002
NaOAc	EMD Millipore	SXO255-1
NaOH	EMD Millipore	SXO590-1
	SDS BioShop Canada	SDS001
TEMED	BioShop Kanada	TEM001
Tris-base	BioShop Canada	BST666
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416
Mocznik	BioShop Canada	URE001
Xylenecyanol FF	Sigma-Aldrich	X4126
Koncentrator DNA	Thermo Fisher Scientific, Inc.	Savant DNA SpeedVac 120
Millex	EMD Millipore	SLGP033RS
Końcówki do ładowania żelu	Diamed	TEC200EX-K
ImageQuant	Dynamika molekularna	wersja 5.0
Kimwipes	Kimberly-Clark Corporation	34705
Mini Vortexer	VWR international	58816-121
Parafilm	Pechiney Opakowania plastikowe	PM996
Szalki Petriego	Fisher Scientific	Fisherbrand 08-757-12
Stripettor Plus (pistolet do pipet)	Corning	07764714
Kuwety kwarcowe	Varian Inc., Agilent	66-100216-00
Wytrząsarka/inkubator	New Brunswick Scientific	Classic Series C24
Skaner tajfunów	GE Healthcare	9200 Wirówka zmiennomodalna
	Beckman Coulter Inc.	UV Allegra X22-R
	Thermo Fisher Scientific, Inc.	GenesysUV 10
	Varian Inc., Agilent	Cary Eclipse