Opisujemy szybką metodologię izolacji i hodowli neuronów hipokampa i kory mózgowej z embrionów gryzoni. Protokół ten umożliwia przeprowadzanie eksperymentów wymagających niemal czystych kultur neuronalnych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Izolacja i hodowla embrionalnych komórek neuronalnych szczura: szybki protokół
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Opisujemy szybką metodę dysocjacji i hodowli neuronów hipokampa lub kory z embrionów szczura w dniach E15-17. Procedurę tę można z sukcesem zastosować do izolacji pierwotnych neuronów i progenitorów neuronalnych myszy oraz człowieka. Zdysocjowane neurony utrzymuje się w medium bezsurowiczym przez okres do kilku tygodni. Hodowle te mogą być wykorzystywane do nukleofekcji, immunocytochemii, przygotowania kwasów nukleinowych, a także do badań elektrofizjologicznych. Starsze hodowle neuronalne można również transfekować z dobrą wydajnością za pomocą transdukcji lentiwirusowej lub, mniej wydajnie, za pomocą fosforanu wapnia bądź metod opartych na lipidach, takich jak lipofektamina.
Protokół
1. Poli-D-lizyna (PDL): Przygotowanie
- Dodaj 5 ml sterylnej ddH2O do 5 mg PDL, aby otrzymać roztwór zapasowy o stężeniu 1 mg/ml.
- Wymieszaj roztwór zapasowy, pipetując go kilka razy.
- Użyj natychmiast lub przechowuj roztwór poli-D-lizyny w temperaturze 2-8 °C.
2. Poli-D-lizyna (PDL): Powlekanie plastikowych naczyń do hodowli komórek
- Rozcieńczyć roztwór stokowy PDL sterylną wodą ddH2O do stężenia końcowego 10 μg/ml.
- Do szalki 60 mm pipetować taką ilość roztworu, aby pokryła powierzchnię hodowlaną (3 ml dla szalki 60 mm).
- Delikatnie kołysać szalką, aby zapewnić równomierne pokrycie powierzchni hodowlanej.
- Inkubować pokryte szalki w temperaturze pokojowej (RT) przez noc.
- Następnego dnia, zazwyczaj w dniu sekcji, usunąć roztwór poli-D-lizyny poprzez aspirację i krótko przemyć 3 ml sterylnej wody ddH2O. Powtórzyć ten krok. Po drugim przemyciu całkowicie usunąć wodę przez aspirację.
- Szalki można przechowywać w temperaturze 4 °C do trzech tygodni.
3. Poli-D-lizyna (PDL) i laminina: Przygotowanie i powlekanie szklanych szkiełek dwukomorowych
- Wymieszać roztwory stokowe PDL (1 mg/ml) i lamininy (1 mg/ml) w sterylnej wodzie ddH2O do końcowych stężeń odpowiednio 10 i 5 μg/ml.
- Napipetować do dołków szklanego szkiełka dwukomorowego ilość roztworu wystarczającą do pokrycia powierzchni hodowli (1 ml do każdego dołka szklanego szkiełka dwukomorowego).
- Delikatnie kołysać, aby zapewnić równomierne pokrycie powierzchni hodowli.
- Inkubować pokryte płytki w temperaturze pokojowej (RT) przez noc.
- Następnego dnia usunąć roztwór powlekający Poly-D-Lysine-Laminin poprzez aspirację i krótko przemyć dwukrotnie 1 ml sterylnej wody ddH2O. Po drugim płukaniu całkowicie usunąć wodę za pomocą aspiratora.
- Szkiełka komorowe można przechowywać w temperaturze 4 °C do trzech tygodni.
Uwaga: Każdy szklany preparat z komorą można pokryć zgodnie z tym protokołem. Często stosujemy preparaty dwukomorowe, ponieważ każdy z nich umożliwia jednoczesne ustawienie grupy kontrolnej i badawczej (np. nieleczone względem leczonych, nietransfekowane względem transfekowanych).
4. Disekcja i hodowla neuronów
- Podgrzej następujące odczynniki w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C:
- TrypLE Express w oryginalnej butelce 100 ml.
- Pełne pożywka Neurobasal/B27 (patrz tabela I). Objętość podgrzewanego roztworu zależy od liczby płytek do wysiania (np. 30 ml dla dziesięciu płytek 60 mm).
- Dodaj 3 ml zimnego roztworu Hibernate E do czterech płytek hodowlanych 60 mm oraz 13 ml do 15 ml polipropylenowej stożkowej probówki BD Falcon high clarity.
- Dodaj 25-30 ml zimnej pożywki do sekcji (patrz tabela II, Dr. Olimpia Meucci, komunikacja osobista) do każdej z trzech płytek hodowlanych 100 mm. Płytki te, zawierające dużą objętość pożywki, będą służyć do płukania embrionów natychmiast po ich wyjęciu z pęcherzyków owodniowych (kroki 4.7 i 4.8).
- Uśmierć ciężarną szczurzycę w 17. dniu ciąży (E17) za pomocą CO2 zgodnie z Polityką Public Health Services dotyczącą humanitarnej opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych oraz zgodnie z zatwierdzonym przez instytucję protokołem opieki i wykorzystania zwierząt.
- Spryskaj dolną część brzucha 70% EtOH i przetnij pośrodku skórę oraz mięśnie nożyczkami, odsłaniając macicę i embriony.
- Wyjmij wszystkie płody i umieść je w sterylnej płytce 100 mm zawierającej nadmiar zimnej pożywki do sekcji (25-30 ml, patrz krok 4.3).
- Wytnij embriony z pęcherzyków owodniowych za pomocą małych nożyczek i umieść je w drugiej płytce 100 mm zawierającej zimną pożywkę do sekcji.
- Przepłucz embriony w temperaturze pokojowej, delikatnie przechylając płytkę 100 mm przez 5-10 sekund. Następnie przenieś wypłukane embriony do trzeciej płytki 100 mm zawierającej pożywkę do sekcji. Dwa płukania w nadmiarze pożywki są zazwyczaj wystarczające do usunięcia wszystkich śladów krwi. Jeśli jednak jest to konieczne, wypłucz je jeszcze raz, używając nowej płytki 100 mm zawierającej 25-30 ml zimnej pożywki do sekcji.
- Używając stereomikroskopu i zakrzywionej pęsety, wyizoluj mózg każdego embrionu szczura, usuwając skórę i czaszkę. Umieść cały mózg w jednej z płytek 60 mm (zazwyczaj nie więcej niż 5 mózgów na płytkę) z zimnym roztworem Hibernate E. Przechowuj płytki na lodzie.
- Bierz po jednej płytce i pod mikroskopem sekcyjnym rozdziel półkule oraz wyizoluj korę mózgową, usuwając śródmózgowie i opony mózgowe.
- Opcjonalnie: przetnij mózgi wzdłuż linii środkowej, wyizoluj hipokampy i postępuj zgodnie z poniższą procedurą izolacji neuronów hipokampa.
- Zbierz wszystkie wysekcjonowane fragmenty kory do przezroczystej probówki stożkowej 15 ml zawierającej 13 ml zimnego roztworu Hibernate E. Pozostaw korę mózgową na lodzie do czasu zakończenia wszystkich sekcji. Ze względu na niewielki rozmiar, wysekcjonowane hipokampy można zbierać w probówce Eppendorf 1,5 ml zamiast w probówce 15 ml. Jeśli zajdzie taka potrzeba, na tym etapie korę lub hipokampy można umieścić w krio probówce zawierającej 1 ml Hibernate E + 2% B27+ Gentamicyna (50 μg/ml) + Fungizone (250 ng/ml) w proporcji 2-4 fragmentów kory lub 2-4 hipokampów na probówkę. Tkankę mózgową można przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności do jednego tygodnia (dłuższe okresy nie zostały jeszcze przetestowane). W razie potrzeby użyj precyzyjnej pęsety, aby przenieść tkankę mózgową do probówki 15 ml zawierającej Hibernate E, a następnie postępuj zgodnie z poniższym protokołem izolacji neuronów.
- Przenieś probówkę do komory z laminarnym przepływem powietrza. Pozostaw korę, aby osiadła na dnie probówki, a następnie ostrożnie usuń nadsącz.
- Dodaj 13 ml świeżego roztworu Hibernate E do probówki stożkowej 15 ml, pozwól korze osiąść na dnie probówki i ostrożnie usuń nadsącz. Powtórz ten krok jeszcze 2 razy, a po ostatnim płukaniu ostrożnie usuń całą pożywkę.
- Przeprowadź trawienie enzymatyczne kory mózgowej, dodając 1-2 ml (zależnie od liczby fragmentów kory; w przypadku izolacji hipokampów użyj mniejszej ilości) ciepłego roztworu TrypLE Express. Zamknij korek probówki Parafilmem i inkubuj probówkę w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C przez 10 minut.
- Spryskaj probówkę 70% etanolem przed otwarciem korka i dodaj 10 ml roztworu Hibernate E. Pozostaw korę, aby osiadła na dnie probówki, i usuń nadsącz. Powtórz ten krok trzy razy, aby wypłukać TrypLE Express. W ostatnim kroku ostrożnie usuń całą pożywkę.
- Delikatnie rozbij (trituracja 4-5 razy) fragmenty kory w 2 ml pełnej pożywki Neurobasal/B27, używając wypalanej szklanej pipety Pasteura (o średnicy około 1 mm). Należy uważać, aby nie dopuścić do powstania pęcherzyków powietrza.
- Powtórz czynność 4-5 razy, używając sterylnej szklanej pipety Pasteura o mniejszej średnicy (tj. pipety o średnicy około 1/2-3/4 mm). Nie używaj pipety Pasteura o mniejszej średnicy, ponieważ zniszczy ona komórki.
- Pozostaw pozostałe fragmenty tkanki (zazwyczaj bardzo nieliczne lub żadne), aby osiadły.
- Przenieś górną zawiesinę pojedynczych komórek do nowej probówki 15 ml, pozostawiając osiadłe fragmenty tkanki. Dalszo rozcieńcz zawiesinę komórek do objętości 10-12 ml pełną pożywką Neurobasal/B27.
- Wymieszaj dokładnie i rozcieńcz komórki do zliczenia, dodając 10 μl zawiesiny komórek do 490 μl 50x roztworu do zliczania (patrz tabela III) w probówce Eppendorf 1,5 ml.
- Wysiej komórki na płytkach pokrytych PDL z gęstością 5,0 x 104/cm2. Jeśli planowana jest nuklefekcja, zalecamy wysiewanie komórek w wyższym stężeniu (8-10 x 104/cm2).
- Zazwyczaj sekcjonujemy 9-10 płodów na eksperyment, ponieważ z każdego płodu E17 uzyskuje się około 13 x 106 neuronów. Jeśli potrzeba więcej embrionów, należy dopilnować, aby cała procedura nie trwała dłużej niż dwie godziny.
- Jeśli jest to pożądane, 24 godziny po izolacji do każdej płytki można dodać 10 μM cytozyny-β-D-arabinofuranozydy (AraC), aby zapobiec proliferacji gleju. Krok ten nie jest jednak wymagany, ponieważ pożywka Neurobasal/B27 hamuje proliferację gleju, zgodnie z zaleceniami producenta (Invitrogen/Gibco).
- Neurony można wykorzystać do eksperymentów po 4-5 dniach in vitro, choć dokładny czas zależy od pożądanego stopnia różnicowania. Hodowaliśmy neurony do 4 tygodni bez znaczącego spadku przeżywalności (Rysunek 1).
- W przypadku przedłużonej hodowli wymieniaj pożywkę co tydzień na świeżo przygotowaną pełną pożywkę Neurobasal/B27.
5. Reprezentatywne wyniki
Neurony hodowane na szkiełkach z komorą mogą być poddane immunocytochemii. Rysunek 1 przedstawia typowy obraz neuronu korowego utrwalonego po pięciu dniach hodowli i znakowanego immunochemicznie przeciwciałem anty-MAP-2 w celu uwidocznienia wypustek neuronalnych.
Rysunek 2 przedstawia reprezentatywny obraz neuronu hipokampa szczura po 3 tygodniach hodowli. Morfologia neuronalna w pełni zróżnicowanej komórki została uwydatniona za pomocą immunoznakowania MAP-2 (marker neuronalny MAP-2, mysie przeciwciało monoklonalne klon AP-20, Gene Tex, Irvine, CA), zgodnie ze standardową procedurą opisaną wcześniej1. Obrazy wizualizowano za pomocą pionowego mikroskopu fluorescencyjnego Nikon Eclipse E400 wyposażonego w kamerę EXI aqua (Qimaging), zmotoryzowaną oś Z oraz oprogramowanie do akwizycji i dekonwolucji SlideBook5 (Intelligent Imaging Innovations, Inc., Denver, CO). Seria obrazów trójwymiarowych dla każdego zdjęcia została poddana dekonwolucji do jednego obrazu dwuwymiarowego i przetworzona poprzez dostosowanie odcięcia sygnału do poziomu bliskiego maksymalnej intensywności w celu zwiększenia rozdzielczości.
Rysunek 3 przedstawia czystość kultur neuronalnych. Lizaty białek uzyskano z kultur neuronalnych szczura (ctx) w 7. dniu in vitro (DIV7) oraz z przypadku ludzkiego glejaka wielopostaciowego (GBM). Zgodnie z oczekiwaniami, lizat neuronalny wykazuje silną reakcję dodatnią w kierunku białka neuronalnego MAP-2 i reakcję ujemną dla markera astrocytarnego GFAP, natomiast lizat białek GBM wykazuje reakcję ujemną dla MAP-2 i reakcję dodatnią dla GFAP.
Choć w naszym protokole od kilku lat stosujemy Hibernate E jako medium do sekcji i płukania, ostatnio zbadaliśmy jego dodatkowe i bardzo praktyczne zastosowanie w celu konserwacji tkanek mózgowych do późniejszego wykorzystania. Rysunek 4 przedstawia hodowlę neuronów korowych szczura w 5. dniu in vitro (DIV5), wyizolowanych z kory przechowywanej przez tydzień w temperaturze 4 °C w Hibernate E + B27 po pierwotnej sekcji embrionów. Neurony wysiano na szklane szkiełko dwukomorowe pokryte PDL i lamininą, zgodnie z wcześniejszym opisem. Uzyskany obraz został poddany dekonwolucji przy użyciu oprogramowania do akwizycji i dekonwolucji SlideBook5, jak opisano powyżej (Rysunek 2).
Rycina 1. Reprezentatywny obraz neuronu korowego poddanego nukleofekcji pmaxGFP (Amaxa, Lonza, Walkersville, MD) i immunoznakowania przeciwciałem MAP-2, zaznaczonym kolorem czerwonym. Powiększenie oryginalne 100x.
Rycina 2. Reprezentatywny obraz przedstawiający immunoznakowanie MAP-2 (kolor czerwony) w neuronach hipokampa po 3 tygodniach hodowli. Barwienie DAPI (kolor niebieski) wykazuje jądra komórkowe. Powiększenie oryginalne 40x.
Rycina 3. Western blot wykazujący czystość kultur komórek neuronalnych. 30 μg lizatów białkowych z neuronów szczura i GBM człowieka rozdzielono za pomocą elektroforezy i poddano analizie Western blot zgodnie ze standardowymi procedurami1. Przeciwciało anty-MAP-2 było poliklonalnym przeciwciałem króliczym z Cell Signaling (Danvers, MA), przeciwciało anty-GFAP było monoklonalnym przeciwciałem mysim z Chemicon (Millipore, Billerica, MA), a monoklonalne przeciwciało mysie anty-GRB2 pochodziło z BD Transduction Laboratories (Sparks, MD). GRB2 służyło jako kontrola załadunku.
Rysunek 4. Reprezentatywne zdjęcia neuronów korowych szczura w 5. dniu hodowli in vitro (DIV5), uzyskanych z kory pozostawionej w Hibernate E + B27 w temperaturze 4 °C przez jeden tydzień po wycięciu. A) Kontrast fazowy neuronów hodowanych na szklanym szkiełku dwukomorowym. Powiększenie oryginalne 20X. B) Immunofluorescencja wykazująca ekspresję MAP-2 w wypustkach neuronalnych, kolor zielony; kultura była negatywna pod kątem astrocytarnego markera GFAP. Barwienie DAPI, kolor niebieski, wskazuje jądra komórkowe. Powiększenie oryginalne 40x.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opisana tutaj metoda sekcji i hodowli neuronów hipokampa oraz kory szczura pozwala na przeprowadzanie eksperymentów z wykorzystaniem niemal czystych kultur neuronalnych hodowanych w podłożu chemicznie zdefiniowanym (Rysunek 3). Chociaż protokoły hodowli niemal czystych neuronów w podłożach bezsurowiczych były opisane wcześniej2,3,4, w naszej metodzie wprowadzono istotne zmiany. W przeciwieństwie do tradycyjnych protokołów (np. Bankera i wsp.)5, zastąpiliśmy trypsynę enzymem TrypLE E...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Dziękujemy Jonnie Ellis za pomoc redakcyjną. Opisany projekt był wspierany przez grant o numerze R01MH079751 (PI: F. Peruzzi) z National Institute of Mental Health. Treść opracowania jest wyłączną odpowiedzialnością autorów i niekoniecznie odzwierciedla oficjalne stanowisko National Institute of Mental Health lub National Institutes of Health.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Neurobasal | 98% | ||
| B27 | 2% | ||
| Glutamax | 0,5 mM | ||
| Tabela I. Kompletna pożywka Neurobasal/B27. | |||
| Glukoza | 16 mM | ||
| Sacharoza | 22 mM | ||
| HEPES | 10 mM | ||
| NaCl | 160 mM | ||
| KCl | 5 mM | ||
| Na2HPO4 | 1 mM | ||
| KH2PO2 | 0,22 mM | ||
| Gentamycyna | 50 μg/ml | ||
| Fungizone | 250 ng/ml | ||
| pH | 7.4 | ||
| Osmolarność | 320-330 mOsm | ||
| Tabela II. Pożywka do sekcji. | |||
| kompletne pożywka Neurobasal/B27 | 240 | ||
| Barwienie błękitem trypanu 0,4% | 250 | ||
| Suma | 490 | ||
| Tabela III. 50-krotny roztwór do liczenia. | |||
| Hibernacja E | Brainbits | 767171 | |
| Neurobasal | GIBCO, by Life Technologies | 21103-049 | |
| B27 | GIBCO, by Life Technologies | 17504-044 | |
| Fungizone | GIBCO, by Life Technologies | 15290-018 | |
| Siarczan gentamycyny | Sigma-Aldrich | G1264 | |
| Glutamax 200 mM | GIBCO, by Life Technologies | 35050 | |
| TrypLE Express bez czerwieni fenolowej | GIBCO, by Life Technologies | 12604 | |
| Cytozyna-βchlorowodorek $\alpha$-D-arabinofuranosydowy | Sigma Aldrich | C6645 | |
| poli-D-lizyna | Sigma Aldrich | P6407 | |
| Laminina 1 mg/ml | EMD Millipore | CC095 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Barwienie błękitem trypanu 0,4% | GIBCO, by Life Technologies | 15250 | |
| Tabela IV. Odczynniki specyficzne. | |||
| Mikroskop stereoskopowy | Olympus Corporation | SZ61 | |
| Duże pincety | Fine Science Tools | 11022-14 | |
| Pęseta z cienkimi końcówkami | Moria | MC40B | |
| Mikropincety z bardzo cienkimi końcówkami | Moria | MC31 | |
| Bardzo ostre nożyczki | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-6820 | |
| Nożyczki do mikrosekcji | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Zakrzywione nożyczki do mikrosekcji | Fine Science Tools | 14067-11 | |
| Szkiełka przedmiotowe dwukomorowe | Lab-Tek | 154461 | |
| szalki 60 mm | BD Biosciences | 353002 | |
| szalki 100 mm | Corning | 430167 | |
| probówki 15 ml | BD Biosciences | 352099 | |
| probówka kriogeniczna 1,5 ml | Nalge Nunc International | 375353 | |
| Tabela V. Specjalistyczny sprzęt. |
Bibliografia
- Aprea, S. Tubulin-mediated binding of human immunodeficiency virus-1 Tat to the cytoskeleton causes proteasomal-dependent degradation of microtubule-associated protein 2 and neuronal damage. J. Neurosci. 26, 4054-4062 (2006).
- Kivell, B. M., McDonald, F. J., Miller, J. H. Serum-free culture of rat post-natal and fetal brainstem neurons. Brain Res. Dev. Brain Res. 120, 199-210 (2000).
- Kivell, B. M., McDonald, F. J., Miller, J. H. Method for serum-free culture of late fetal and early postnatal rat brainstem neurons. Brain Res. Brain Res. Protoc. 6, 91-99 (2001).
- Brewer, G. J. Serum-free B27/neurobasal medium supports differentiated growth of neurons from the striatum, substantia nigra, septum, cerebral cortex, cerebellum, and dentate gyrus. J. Neurosci. Res. 42, 674-683 (1995).
- Banker, G., Goslin, K. Culturing nerve cells. , The MIT Press. Cambridge. (1998).
- Eletto, D. Inhibition of SNAP25 expression by HIV-1 Tat involves the activity of mir-128a. J. Cell Physiol. 216, 764-770 (2008).
- Gualco, E. IGF-IR-dependent expression of Survivin is required for T-antigen-mediated protection from apoptosis and proliferation of neural progenitors. Cell Death Differ. 17, 439-451 (2010).
- Gage, F. H. Survival and differentiation of adult neuronal progenitor cells transplanted to the adult brain. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 11879-11883 (1995).
- Keyser, D. O., Pellmar, T. C. Synaptic transmission in the hippocampus: critical role for glial cells. Glia. 10, 237-243 (1994).
- Pfrieger, F. W., Barres, B. A. Synaptic efficacy enhanced by glial cells in vitro. Science. 277, 1684-1687 (1997).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
