System do hodowli ex vivo trzustki embrionalnej

Podsumowanie

W niniejszej pracy opisujemy metodę izolacji, hodowli i manipulacji embrionalną trzustką myszy. Stanowi ona doskonały system ex vivo do badania różnych aspektów rozwoju trzustki, w tym morfogenezy, różnicowania i wzrostu. Eksplanty pąka trzustki mogą być hodowane przez kilka dni i wykorzystywane w szerokim zakresie zastosowań, w tym w immunofluorescencji całych preparatów oraz obrazowaniu na żywo.

Streszczenie

Trzustka kontroluje życiowe funkcje naszego organizmu, w tym produkcję enzymów trawiennych i regulację poziomu cukru we krwi¹. Chociaż w ostatniej dekadzie wiele badań przyczyniło się do zbudowania solidnych podstaw zrozumienia organogenezy trzustki, w naszej wiedzy na temat wczesnego formowania się tego narządu wciąż istnieją istotne luki². Pełne zrozumienie tych wczesnych zdarzeń dostarczy wiedzy nie tylko na temat rozwoju tego organu, ale także na temat nieuleczalnych chorób atakujących trzustkę, takich jak cukrzyca czy rak trzustki. Wreszcie, informacje te posłużą jako wzorzec do opracowania terapii zastępczych komórek w kontekście cukrzycy.

Podczas embriogenezy trzustka powstaje z odrębnych embrionalnych wypustek endodermy przedjelita grzbietowej i brzusznej w 9,5 dniu embrionalnym (E) u zarodka myszy^3,4. Obie wypustki wyewaginują do otaczającego mezenchymy jako lite pąki nabłonkowe, które ulegają proliferacji, rozgałęzianiu i różnicowaniu, aby stworzyć w pełni dojrzały organ^2,5,6. Niedawne dowody sugerują, że wzrost i różnicowanie linii komórkowych trzustki, w tym produkujących insulinę komórek β, zależy od właściwej architektury tkankowej, przebudowy nabłonka oraz rozmieszczenia komórek w obrębie rozgałęziającego się nabłonka trzustki^7,8. Jednak sposób, w jaki przebiega morfogeneza rozgałęziania i jak jest ona koordynowana z proliferacją i różnicowaniem w trzustce, pozostaje w dużej mierze nieznany. Wynika to częściowo z faktu, że obecna wiedza na temat tych procesów rozwojowych opierała się niemal wyłącznie na analizie utrwalonych preparatów, podczas gdy zdarzenia morfogenetyczne są wysoce dynamiczne.

W niniejszej pracy przedstawiamy metodę wycinania i hodowli pączków trzustki zarodka myszy ex vivo na szalkach z szklanym dnem, co umożliwia bezpośrednią wizualizację rozwijającej się trzustki (Rysunek 1). System hodowli ten został zaprojektowany z myślą o konfokalnej mikroskopii skaningowej, a w szczególności o obrazowaniu żywych komórek. Eksplanty trzustki można przygotować nie tylko z embrionów myszy typu dzikiego, ale również ze szczepów myszy modyfikowanych genetycznie (np. transgenicznych lub knockout), co pozwala na badania fenotypów mutantów w czasie rzeczywistym. Co więcej, ten system hodowli ex vivo jest cenny w badaniu wpływu związków chemicznych na rozwój trzustki, umożliwiając uzyskanie ilościowych danych na temat proliferacji, wzrostu, wydłużania, rozgałęziania, tubulogenezy i różnicowania. Podsumowując, opracowanie metody hodowli eksplantów trzustki ex vivo w połączeniu z obrazowaniem o wysokiej rozdzielczości stanowi doskonałą platformę do obserwacji zdarzeń morfogenetycznych i różnicowania zachodzących w rozwijającym się zarodku myszy.

Protokół

Protokół opisany w niniejszym opracowaniu został dostosowany z techniki pierwotnie opisanej przez Percivala i Slacka⁹ oraz zoptymalizowany pod kątem mikroskopii konfokalnej.

1. Powlekanie szalek hodowlanych z szklanym dnem

Następujące kroki należy przeprowadzić w warunkach sterylnych, w komorze z laminarnym przepływem powietrza.

1. Wyizolowane fragmenty trzustki (eksplanty) hoduje się w szalkach Petriego o średnicy 35 mm z szklanym dnem z mikrootworem o średnicy 20 mm (np. MatTek Corporation). Należy używać jednej szalki z szklanym dnem na jedną kulturę eksplantów przez cały czas trwania hodowli. W dniu poprzedzającym sekcję i izolację pączków trzustki należy pokryć mikrootwory szklanego dna fibronektyną.
2. Sterylną fibronektynę rozcieńcza się w wodzie do hodowli komórkowych do stężenia końcowego 50 μg/ml, a następnie dodaje minimalną objętość (~150 μl) do 20-mm mikrootworu płytek MatTek, tak aby pokryć całą szklaną powierzchnię (Rysunek 1E). Szalki należy umieścić w lodówce w temperaturze 4 °C w celu inkubacji przez noc.
3. W dniu sekcji należy odessać fibronektynę, wypłukać mikrootwór wodą do hodowli komórkowych i dodać minimalną objętość 150 μl pożywki BME (Basal Medium Eagle) uzupełnionej o Pen/Strep (1%), glutaminę (1%) oraz gentamycynę w stężeniu 50 μg/ml [Pożywka do sekcji]. Pokryte szalki należy pozostawić w komorze z laminarnym przepływem powietrza do momentu wysiania eksplantów.

Jeśli nie wszystkie szalki pokryte fibronektyną zostaną wykorzystane, można je przechowywać do 1 tygodnia w temperaturze 4 °C. Nie należy dopuścić do wyschnięcia szalek; należy je wypełnić pożywką do sekcji (Dissection Medium) i umieścić w lodówce.

Oprócz fibronektyny, eksplanty trzustki były z sukcesem hodowane na różnych podłożach, takich jak laminina⁹, matrigel^10,11 lub membrany mikroporowe¹². Ze względu na jej wpływ na rozgałęzianie, jako podłoże stosujemy fibronektynę⁹.

2. Disekcja grzbietowego pąka trzustki z embrionów myszy w dniach E11.5 - E12.5

1. Zabija się ciążne myszy w 11,5 lub 12,5 dniu embrionalnym (E), a następnie pobiera embriony za pomocą narzędzi sekcyjnych uprzednio oczyszczonych 70% etanolem. Wypreparowaną macicę umieszcza się w płytkach 10-cm zawierających lodowaty PBS uzupełniony o 50 μg/ml gentamycyny.
2. Pod stereomikroskopem z oświetleniem górnym macicę rozdziela się na poszczególne segmenty embrionalne za pomocą małych nożyczek lub pęsety Dumont, delikatnie oddzielając mięsień macicy i usuwając poszczególne embriony otoczone błoną decalidualną. Stosuje się standardowe techniki sekcji embrionów¹³, aby odsłonić embriony oraz usunąć worek żółtkowy i błonę owodniową. Następnie usuwa się górną część ciała embrionu (powyżej wątroby) oraz region ogona. Pozwoli to na odsłonięcie organów wewnętrznych (Rysunek 1B). Środkową część ciała embrionów przenosi się do płytek 10-cm zawierających lodowate medium do sekcji BME.
3. Do wizualizacji i wypreparowania grzbietowego pąka trzustki pod stereomikroskopem stosuje się teraz wyłącznie oświetlenie prześwietlające od dołu. Delikatnie otwiera się środkową część ciała embrionu, wykonując pęsetą nacięcie boczne. Lokalizuje się żołądek i śledzionę. Grzbietowy pąk trzustki jest przytwierdzony bocznie do tylnej części żołądka (Rysunek 1C). Za pomocą pęsety Dumont wypreparowuje się grzbietowy pąk trzustki z sąsiednich struktur, takich jak żołądek i śledziona, pozostawiając niewielką ilość mezenchymy wokół nabłonka (Rysunek 1D). Za pomocą szklanej pipety Pasteura izolowany pąk przenosi się do szalki Petriego 35-mm zawierającej zimne medium do sekcji BME uzupełnione o 10% płodowej surowicy cielęcej [Medium hodowlane]. Kroki te powtarza się, aż wszystkie trzustki zostaną wyizolowane. W przypadku izolacji trzustek o różnych genotypach należy przechowywać je oddzielnie, używając płytek Nunc 4-dołkowych.

3. Wysiew i hodowla eksplantów trzustki

Ostateczne wysianie eksplantatów przeprowadza się w pomieszczeniu do kultur tkankowych i/lub w bezpośrednim sąsiedztwie inkubatora do kultur tkankowych, aby zminimalizować przemieszczanie kultur.

1. W warunkach sterylnych, w komorze z laminarnym przepływem powietrza, należy zastąpić podłoże do sekcji BME w naczyniach MatTek powlekonych fibronektyną ok. 150 μl podłoża hodowlanego BME uprzednio ogrzanego do 37 °C.
2. Przy użyciu szklanej pipety Pasteura ostrożnie przenieść eksplanty trzustki do powlekonych naczyń MatTek (jeden eksplant na naczynie) w celu długoterminowej hodowli. Aby zapewnić rozprzestrzenianie się tkanki podczas hodowli, w razie potrzeby można delikatnie naciąć mezenchymę otaczającą eksplanty za pomocą cienkiej igły.
3. Kultury należy delikatnie umieścić w inkubatorze do hodowli tkanek (37 °C; 5% CO₂) na kilka godzin, aby eksplanty przytwierdziły się do szklanego dna mikrowycieków. Po ich przytwierdzeniu należy dopełnić naczynia MatTek od 1,5 ml do 2 ml podłoża hodowlanego BME uprzednio ogrzanego do 37 °C. Dzień sekcji uznaje się za dzień 0.
4. Manipulacje z kulturami eksplantów trzustki przeprowadza się w warunkach sterylnych w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Podłoże hodowlane BME wymienia się co drugi dzień, chyba że wymagania eksperymentalne narzucają inny harmonogram (np. inkubacja eksplantów z czynnikami chemicznymi). Eksplanty można hodować w tych warunkach od 5 dni do jednego tygodnia.

4. Protokół barwienia immunofluorescencyjnego całych preparatów dla eksplantów trzustki

Wszystkie etapy protokołu immunofluorescencji (od utrwalania po obrazowanie) są wykonywane w tej samej szalce MatTek, co pozwala na uzyskanie lepszych obrazów niż w przypadku szalek z plastikowym dnem. Po utrwaleniu hodowle eksplantów trzustki nie muszą być utrzymywane w warunkach sterylnych.

1. Odssać pożywkę hodowlaną BME i wypłukać eksplant raz 2 ml 1X PBS.
2. W celu utrwalenia eksplantu zastąpić PBS 2 ml schłodzonego do 0 °C 4% paraformaldehydu (PFA) i pozostawić naczynie na lodzie na 20 min. Od czasu do czasu delikatnie zakręcić płytką, unikając jednak korzystania z platform kołyszących, aby eksplant nie oddzielił się od podłoża.
3. Usunąć PFA i wypłukać eksplant trzy razy 2 ml 1X PBS przez 10 min każdego płukania w temperaturze pokojowej (RT).
4. Zablokować wiązania niespecyficzne, stosując 2 ml roztworu blokującego (1X PBS + 0.1% Triton-X + 3% surowicy osła) przez co najmniej 30 min w RT.
5. Rozcieńczyć przeciwciało pierwotne w roztworze blokującym i dodać ~150 μl rozcieńczenia bezpośrednio do 20-milimetrowej studni płytki MatTek, tak aby pokryć całą powierzchnię eksplantu, i inkubować przez noc w 4 °C. Aby zminimalizować przemieszczanie próbek, przeciwciało pierwotne należy dodać do eksplantów bezpośrednio w pomieszczeniu chłodniczym (4 °C). Aby zapobiec odparowywaniu, przed dodaniem przeciwciał płytki MatTek należy umieścić w komorze wilgotnościowej.
6. Następnego dnia usunąć roztwór przeciwciał i wypłukać trzy razy 2 ml 1X PBS + 0.1 % Tween-20 (PBT) przez 30 min każdego płukania w RT.
7. Rozcieńczyć przeciwciało wtórne w roztworze blokującym [zgodnie z zaleceniami producenta; stosujemy przeciwciała wtórne z barwnikami Alexa Fluor pochodzenia osiołkowego w rozcieńczeniu 1:750] i dodać ~150 μl rozcieńczenia bezpośrednio do 20-milimetrowej studni płytki MatTek, pokrywając całą powierzchnię eksplantu, i inkubować przez 1-2 h w RT w ciemności. W celu kontrastowania jąder komórkowych dodać Hoechst wraz z rozcieńczeniem przeciwciał wtórnych. Aby zapobiec odparowywaniu, przed dodaniem przeciwciał płytki MatTek należy umieścić w komorze wilgotnościowej.
8. Wypłukać trzy razy 2 ml 1X PBS + 0.1 % Tween-20 (PBT) przez 30 min każdego płukania w RT.
9. Przed montowaniem wypłukać raz 1X PBS, aby usunąć Tween-20. Zamontować preparat, dodając jedną kroplę wodnego medium montującego (z anty-fadingiem) do 20-milimetrowej studni płytki MatTek. Delikatnie przykryć eksplant szkiełkiem podstawowym, unikając pęcherzyków powietrza.
10. Eksplanty na płytkach MatTek można oglądać za pomocą standardowej mikroskopii w kontraście fazowym lub mikroskopii konfokalnej, w zależności od celów eksperymentu. Do analizy mikroskopowej konfokalnej stosujemy odwrócony mikroskop Zeiss LSM 700. Należy ustawić odpowiednie lasery dla użytych fluoroforów. Wybrać obiektyw, który pozwoli obrazować pożądany obszar eksplantu trzustki. Obiektyw imersyjny wodny 10X jest odpowiedni do utrzymania całego eksplantu w polu widzenia. Obiektywy imersyjne wodne lub olejowe 40X są odpowiednie do obrazowania konkretnych regionów eksplantu trzustki z większą rozdzielczością. Eksplanty można poddać sekcjonowaniu optycznemu, a następnie zrekonstruować uzyskane stosy Z (Z-stacks) w 3D przy użyciu odpowiedniego oprogramowania.

5. Protokół obrazowania żywych komórek w eksplantach trzustki

1. Konfiguracja komory środowiskowej: należy użyć obudowy środowiskowej oraz małej komory inkubacyjnej [z kontrolą temperatury i poziomu CO₂] umieszczonej na stoliku mikroskopu. Prawidłowa hodowla embrionalnej trzustki wymaga stabilnej temperatury 37 °C oraz kontrolowanej atmosfery z uwilgotnionym 5% CO₂. Odpowiednie komory są dostępne u kilku dostawców (np. Zeiss, Nikon, Olympus). Zmontować moduł grzewczy i włączyć go co najmniej 1 hr przed rozpoczęciem obrazowania, aby sprzęt mógł się rozgrzać, a zawartość CO₂ ustabilizować na poziomie 5%.
2. Do obrazowania time-lapse kultur eksplantów trzustki używamy odwróconego mikroskopu Zeiss LSM 700. Dobór laserów i obiektywów opisano w punkcie 4.10.
3. Przed rozpoczęciem obrazowania na żywo należy odczekać, aż eksplant trzustki dobrze przywrze do szalki z szklanym dnem. [Obrazowanie na żywo zazwyczaj rozpoczynamy w Dniu 1].
   W komorze z laminarnym przepływem powietrza należy odessać pożywkę z eksplantem i zastąpić ją świeżą pożywką hodowlaną BME, aby zapewnić optymalne warunki odżywcze na starcie.
4. Ostrożnie przenieść eksplanty do pomieszczenia z mikroskopem i umieścić szalkę MatTek w komorze inkubacyjnej w uchwycie na preparaty mikroskopu konfokalnego.
5. Przygotować obiektyw (np. dodać olej lub medium wodne, zależnie od wybranego obiektywu imersyjnego) i ustawić ostrość na interesujący obszar w eksplantcie. Prawidłowo zamknąć komorę środowiskową. Aby zapobiec parowaniu podczas akwizycji time-lapse z użyciem obiektywów imersyjnych wodnych, zamiast wody zaleca się stosowanie dostępnych komercyjnie lepkich cieczy imersyjnych (np. Zeiss Immersol W).
6. Ustawić natężenie lasera, parametry akwizycji stosu Z oraz odstępy czasowe (patrz również sekcja Discussion w celu rozwiązywania problemów). Rozpocząć eksperyment.
7. Po obrazowaniu wyeksportować stosy Z oraz wszystkie punkty czasowe i przeanalizować je za pomocą odpowiedniego oprogramowania (np. ImageJ, Volocity, Imaris, Huygens).

6. Reprezentatywne wyniki

Grzbietowe pączki trzustki (wraz z otaczającym je mezenchymem) wypreparowano z embrionów myszy między 11,5 a 12,5 dniem rozwoju (E11.5–E12.5) i wysiano bezpośrednio na szalki hodowlane z dna szklanego (Rysunek 1). Naczynia krwionośne występują w mezenchymie otaczającej nabłonek i mogą zostać uwidocznione poprzez immunobarwienie z użyciem markera śródbłonka Pecam¹² (dane nie pokazano). Po dwóch dniach hodowli eksplantaty trzustki wykazaly znaczny wzrost i zaczely organizowac sie w rozgałęzione struktury nabłonkowe, których jądra były dodatnie pod kątem trzustkowego czynnika transkrypcyjnego Pdx1 (Rysunek 2A-C). Średnia grubość w osi z eksplantów trzustki w 3. dniu hodowli wynosi 60-80 μmPowierzchnię i objętość eksplantatów można zmierzyć przy użyciu odpowiedniego oprogramowania (np. Huygens). Analizy morfologiczne i immunofluorescencyjne wykazały, że eksplanty trzustki hodowane zgodnie z tym protokołem odtworzyły in vivo wczesna różnicowanie trzustki i zdarzenia morfogenetyczne^5,10,11,14 (Rycina 2). Eksplanty trzustki w 4. dniu hodowli uległy typowej segregacji nabłonka na obszary „wierzchołkowe i pniowe” (tip and trunk)⁸, z widocznymi komórkami progenitorowymi cpa1+ na końcach odgałęzień nabłonkowych (Rycina 2C) oraz zróżnicowane komórki insulinowe (insulin+) i glukagonowe (glucagon+), zorganizowane w klastry wewnątrz pnia (Rysunek 2D). Ponadto nabłonek trzustki w ex vivo hodowle wykazały prawidłową organizację cytoszkieletu i polaryzację komórek, z apikalną lokalizacją aktyny F (Rycina 2E, na zielono) oraz integrynę $\beta 1$ w błonach podstawnych (Rycina 2E, na czerwono).

Aby badać rozgałęzianie trzustki w czasie rzeczywistym, embrionalne eksplanty trzustki wyizolowano z dwukolorowej fluorescencyjnej linii reporterowej myszy membrane-Tomato/membrane-Green¹⁵ (mT/mG; linia myszy dostępna w Jackson Laboratory) (Rycina 3). Pojedyncze klatki z filmu time-lapse przedstawiającego eksplanty trzustki mT/mG hodowane in vitro pokazano na Rycynie 3. Lokalizacja białka fluorescencyjnego mT w strukturach błonowych zarysowuje morfologię komórek i pozwala na rozróżnienie drobnych wypustek komórkowych, co umożliwia śledzenie przebudowy i migracji komórek w czasie.

Po 12-godzinnym eksperymencie time-lapse sygnał fluorescencyjny mT pozostaje aktywny i wykrywalny, mimo że jego intensywność ulega zmniejszeniu, co najprawdopodobniej wynika z fotouszkodzeń (Rycina 3). Rozwiązania techniczne pozwalające uniknąć lub ograniczyć fotouszkodzenia i fototoksyczność omówiono w sekcji Dyskusja.

Rysunek 1. Schematyczna reprezentacja preparowania grzbietowego pączka trzustki z zarodka myszy w stadium E12.5. (A) Obraz w polu jasnym zarodka myszy E12.5. Górna część ciała zarodka (powyżej wątroby) oraz obszar ogona zostają usunięte, aby wyizolować środkową część ciała (B). Nacięcia zaznaczono czerwonymi liniami przerywanymi. (C) Dalsza dyssekcja prowadzi do odsłonięcia obszaru żołądka i dwunastnicy (zaznaczonego przerywaną ramką). Grzbietowy pączek trzustki (patrz czerwone przerywane koło) znajduje się u podstawy żołądka, obok primordium śledziony. Wypreparowany grzbietowy pączek trzustki (D) zostaje przeniesiony pipetą Pasteura do mikrododatka szalki z przeszklonym dnem zawierającej pożywkę hodowlaną BME (E, F). Skróty: sto (żołądek), sp (śledziona), dp (grzbietowy pączek trzustki), duo (dwunastnica). Paski skali, 1000 μm (A, C).

Rycina 2. Analiza immunofluorescencyjna całych preparatów (whole-mount) konfokalna kultur eksplantów trzustki. (A) Obrazy w polu jasnym eksplantów trzustki w 1. i 2. dniu hodowli ex vivo. Czerwona przerywana linia wskazuje początek rozgałęziania nabłonka. (B) Rekonstrukcja 3D całego preparatu po immunobarwieniu na Pdx1 w 3. dniu hodowli trzustki. Eksplanty trzustki wykazały obecność cewek komórek Pdx1+ ulegających intensywnemu rozgałęzianiu po 48 h hodowli. (C) Immunobarwienie całego preparatu eksplantu trzustki w 3. dniu z użyciem przeciwciał przeciwko markerowi błony podstawno-bocznej E-kadherynie (Ecad), markerowi progenitorów końcowych, karboksypeptydazie 1 (Cpa1) oraz fosfo-histonie H3 (pHH3). Większość aktywnych mitotycznie komórek pHH3+ kolokalizuje się na peryferyjnych końcówkach z komórkami Cpa1+. Linie przerywane wskazują końcówki gałęzi. (D) Immunobarwienie całego preparatu na markery linii endokrynnej, insulinę (Ins) i glukagon (Gluca) w 3. dniu. Żółte strzałki wskazują skupiska komórek Ins+ i Gluca+. Wstawka (D'), powiększenie jednego ze skupisk komórek endokrynnych. (E) Immunobarwienie całego preparatu eksplantu trzustki w 3. dniu na Pdx1, integrynę β1 (β1int) i F-aktynę (Fact). Komórki mezenchymalne (gwiazdki) przeplatające się z komórkami nabłonkowymi Pdx1-dodatnimi. Obrazy przedstawione w C, D i E są pojedynczymi konfokalnymi przekrojami optycznymi z serii Z. Paski skali, 100 μm (A, B); 50 μm (C-E).

Rycina 3. Reprezentatywne obrazowanie żywych komórek eksplantu trzustki hodowanego ex vivo. (A-D) Klatki z filmu poklatkowego eksplantu trzustki z zarodka transgenicznej myszy mT/mG. Czas obrazowania podano w godzinach:minutach. Obrazowanie eksplantu rozpoczęto w 1. dniu. Obrazy serii Z (Z-stack) pozyskiwano za pomocą obiektywu imersyjnego olejowego 40X co 12 min przez łącznie 15 hr. Linie przerywane wskazują końce rozgałęzień oraz granicę między nabłonkiem a mezenchymą. Pasek skali, 50 μm.

Dyskusja

Po określeniu losu trzustki, komórki progenitorowe trzustki przechodzą intensywną proliferację, różnicowanie i morfogenezę, aby ostatecznie utworzyć dojrzały i funkcjonalny organ^2,4. Obecnie w dużej mierze nie wiadomo, w jaki sposób zachodzi rozgałęzianie w trzustce i jak jest ono powiązane z proliferacją i różnicowaniem progenitorów. Hodowle eksplantów trzustki stanowią idealny system do wyjaśnienia tych procesów ex vivo^5,9,11. Dzięki połączeniu obrazowania żywych komórek z eksplantami

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Przeciwciała: Karboksypeptydaza E-kadheryna aktyna F Glukagon Insulina βintegrina 1 Pdx1 Pdx1 Fosfo-histona H3	AbD Serotec Invitrogen Sondy molekularne ImmunoStar Millipore Millipore Abcam Bank hybrydomów Sygnalizacja komórkowa	1810-0006 13-1900 A-12373 20076 4011-01 MAB1997 ab47267 F109-D12 9706
Podłoże podstawowe Eagle (BME)	Sigma	B1522-500ML	Przechowywane w warunkach sterylnych
Woda o jakości do hodowli komórkowych	PAA	S15-012	Przechowywane w warunkach sterylnych
Szalki hodowlane (z dnem szklanym), 35 mm	MatTek Corporation	P35G-0-20-C
surowica osła	Chemicon	S30-100 ml
Płódka cielęca Gold	PAA	A15-151	Przechowywane w warunkach sterylnych
Fibronektyna	Invitrogen	330100-8	Roztwór zapasowy 1 mg/ml w wodzie klasy do hodowli komórkowych
Gentamycyna	Invitrogen	15750-037	Przechowywać w warunkach sterylnych
Glutamina	Invitrogen	25030-024	Przechowywać w warunkach sterylnych
Multidyszki 4-dołkowe	Nunc	176740
Mikroskopy: Odwrócony mikroskop konfokalny (LSM 700) Stereomikroskop (Discovery V12)	Zeiss Zeiss		Cele: C-Apochromat 10X / 0,45 W M27 (odległość robocza 1,8 mm; głębokość obrazowania ~100 μm); C-Apochromat 40X / 1,2 W Corr M27 (odległość robocza 0,28 mm; głębokość obrazowania ~50 μm) μm) Transiluminacja od dołu i oświetlenie światłowodowe od góry
Paraformaldehyd	Roth	0335.3	Roztwór stokowy 20%
Pipeta Pasteura (szklana), 150 mm	VWR	HECH567/1
Penicylina/streptomycyna	PAA	P11-010	Przechowywać w warunkach sterylnych
Szalki Petriego, 60 mm	Greiner Bio-One	628102
Szalki Petriego, 35 mm	Greiner Bio-One	627161
1X PBS, pH 7,4	PAA	H15-002	Przechowywać w warunkach sterylnych
Nożyczki sprężynowe z zakrzywionym ostrzem 8 mm	Fine Science Tools	15023-10
Triton-X100	Roth	3051.3
Pęseta zegarmistrzowska Dumont #5	Roth	K342.1