Zastosowanie robota do wysokoprzepustowej krystalizacji białek błonowych w mezofazach lipidowych

Summary

Tutaj opisano robotyczne podejście do wysokoprzepustowej krystalizacji białek błonowych w mezofazach lipidowych do wykorzystania w określaniu struktury za pomocą makromolekularnej krystalografii rentgenowskiej. Wprowadzono trzy roboty zdolne do obsługi lepkiej i lepkiej mezofazy obciążonej białkiem, integralnej części metody.

Abstract

Badania strukturalno-funkcjonalne białek błonowych czerpią ogromne korzyści z dostępności struktur 3D o wysokiej rozdzielczości, takich jak te, które zapewnia makromolekularna krystalografia rentgenowska (MX). Niezbędnym składnikiem MX jest stały dopływ kryształów o idealnie dyfrakcyjnej jakości. Metoda krystalizacji białek błonowych w mezo lub lipidowej fazie sześciennej (LCP) jest jedną z kilku dostępnych metod krystalizacji białek błonowych. Wykorzystuje dwuciągłą mezofazę, w której rosną kryształy. Jako metoda odniosła ostatnio kilka spektakularnych sukcesów i przyciągnęła wiele uwagi, a wiele grup badawczych jest obecnie zainteresowanych jej stosowaniem. Jednym z wyzwań związanych z tą metodą jest to, że mezofaza gospodarza jest niezwykle lepka i lepka, przypominająca gęstą pastę do zębów. Tak więc ręczne i powtarzalne dozowanie go w małych ilościach do studzienek krystalizacyjnych wymaga umiejętności, cierpliwości i pewnej ręki. Protokół umożliwiający to osiągnięcie został opracowany w grupie^1-3 Biologii Strukturalnej i Funkcjonalnej Błon (MS&FB). Artykuły wideo JoVE opisujące metodę są dostępne^1,4.

Ręczne podejście do ustawiania w próbach mezo ma wyraźne zalety w specjalistycznych zastosowaniach, takich jak optymalizacja kryształów i derywatyzacja. Cierpi jednak z powodu tego, że jest to metoda o niskiej przepustowości. W tym miejscu demonstrujemy protokół wykonywania prób krystalizacji mezo w sposób zrobotyzowany. Robot oferuje zalety szybkości, dokładności, precyzji, miniaturyzacji i zdolności do ciągłej pracy przez dłuższy czas w warunkach, które można uznać za nieprzyjazne, takich jak ciemność, w atmosferze obniżającej temperaturę lub w niskich lub wysokich temperaturach. Robot in mezo, jeśli jest właściwie używany, może znacznie poprawić wydajność badań nad strukturą i funkcją białek błonowych, ułatwiając krystalizację, która jest jednym z powolnych kroków w ogólnym procesie określania struktury.

W tym artykule wideo pokazujemy użycie trzech dostępnych na rynku robotów, które mogą dozować lepką i lepką mezofazę integralną z mezokrystalogenezą. Pierwszy robot został opracowany w Grupie MS&FB^5,6. Pozostałe dwa stały się niedawno dostępne i zostały zamieszczone tutaj dla kompletności.

Przegląd protokołu opisanego w tym artykule jest przedstawiony na rysunku 1. Wszystkie manipulacje przeprowadzono w temperaturze pokojowej (~20 °C) w warunkach otoczenia.

Protocol

1. Przygotowanie płytki krystalizacyjnej

Przygotowanie do przeprowadzenia próby krystalizacji metodą robotyczną rozpoczyna się od przygotowania płytki bazowej szklanej płytki krystalizacyjnej typu sandwich (Rysunek 2), opisanej szczegółowo w Odnośniku 2. Płyta podstawy musi być najpierw silanizowana, a perforowana przekładka z podwójnym patyczkiem, która tworzy dołki, musi zostać nałożona na płytę. Potrzebne do tego materiały i materiały eksploatacyjne są wyszczególnione w sekcji Materiały.

1. Umieść płytkę na ręczniku papierowym, nałóż kilka kropel roztworu silanizującego i rozprowadź go równomiernie po powierzchni talerza za pomocą chusteczki papierowej.
2. Usuń nadmiar roztworu silanizującego, zanurzając płytkę w zlewce z wodą.
3. Wyjmij talerz ze zlewki, połóż go na suchym ręczniku papierowym silanizowaną stroną do góry i osusz jego odsłoniętą powierzchnię, lekko wycierając ręcznikiem papierowym.
4. Zdejmij osłonę ochronną z perforowanej, podwójnie przyklejonej przekładki i przyłóż przekładkę lepką stroną do dołu na suchą, silanizowaną powierzchnię szklanej płyty. Upewnij się, że podkładka dystansowa jest prawidłowo umieszczona na płycie podstawy, tak aby lewy górny róg i dwie sąsiednie strony przekładki i płyty pokrywały się.
5. Użyj wałka lub frezarki, aby spłaszczyć przekładkę na płycie podstawy i stworzyć między nimi szczelne uszczelnienie.

Wstępnie zmontowane płyty są dostępne na rynku (HR3-151, Hampton Research; MD11-55-100, Wymiary molekularne; oraz LCP96T-UVP70U, Szwajcaria). Ze względu na koszty preferujemy montaż własnych płyt zgodnie z powyższym protokołem.

2. W Meso Robot 1

Pierwszym robotem w mezo, który zostanie zademonstrowany w tym artykule wideo, jest ten, który jest obecnie używany w Grupie MS&FB (Rysunek 3). Szczegółowe informacje na temat robota można znaleźć w zakładce Materiały oraz w sekcji Referencje⁵. Materiały i sprzęt wymagane do przeprowadzenia próby krystalizacji przy użyciu robota są wyszczególnione w sekcji Materiały.

1. Umieść płytę bazową z przekładką przygotowaną w sekcji 1 na pokładzie robota. Posiada własną platformę oznaczoną pozycjami studni w celu wyrównania płyty podstawy. Tabliczka powinna być oznakowana w celu identyfikacji.
2. Zabezpiecz 96-dołkowy blok strącający na własnej platformie na pokładzie robota obok płyty krystalizacyjnej.
3. Ostrożnie otwórz blok, odklejając plastikową nasadkę uszczelniającą.
4. Włącz nawilżacz i skieruj strumień wilgotnego powietrza na płytę podstawy na pokładzie robota. Wykazano, że nawilżacz zmniejsza parowanie roztworu strącającego i zwiększa odtwarzalność na płycie krystalizacyjnej⁵. Można go włączyć przed konfiguracją, aby wstępnie nawilżyć obszar, gdy wilgotność względna otoczenia jest niska lub w inny sposób, tuż przed rozpoczęciem dozowania mezofazy.
5. Zainicjuj robota zgodnie z instrukcjami producenta. Instrukcje dotyczące poszczególnych instrumentów nie będą tutaj szczegółowo opisane, ponieważ dokładne procedury będą się zmieniać w czasie. Zasadniczo podczas inicjalizacji ramię dozujące mezofazę w robocie jest wyposażone w pozycje odniesienia w trzech ortogonalnych kierunkach X, Y i Z.
6. Podłącz mezofazę obciążoną białkiem w strzykawce Hamiltona, w komplecie z igłą dozującą, do ramienia 1 robota (rysunek 3). Szczegółowe informacje o tym, jak przygotować mezofazę i jak załadować ją do strzykawki, zostały opisane w piśmiennictwie 3,7-10.
7. Zdejmij górną osłonę ochronną z przekładki na płycie podstawy krystalizacji i wyrównaj studzienki na płycie z powiernikami na platformie płyty podstawy. Zwróć uwagę, że na potrzeby tego filmu osłona ochronna została pozostawiona na miejscu, aby pomóc przeglądarce podczas etapu wyrównywania.
8. Wyrównać końcówkę igły strzykawki dozującej z dnem najwyższej studzienki w lewym rogu płytki krystalizacyjnej (basenik A1). Odbywa się to poprzez regulację wzrokową wysokości lub współrzędnej Z ramienia dozującego, obserwując, jak blisko dna studzienki dochodzi końcówka igły. To, że końcówka dotyka tylko dna studzienki, można ocenić, przesuwając talerz z boku na bok na platformie, jednocześnie nieznacznie regulując wysokość ramienia dozującego.
9. Wprowadź do komputera współrzędną Z ramienia dozującego, w którym końcówka styka się z płytką. Dozowanie jest zaprogramowane tak, aby odbywało się z końcówką igły w odległości 80 mikrometrów od tej referencyjnej pozycji Z, która odpowiada powierzchni płytki podstawy.
10. Umieścić na oko końcówkę igły w środku studzienki A1. Przechowywać w komputerze sterującym współrzędne referencyjne X, Y ramienia dozującego, w którym końcówka jest wyśrodkowana. Ta współrzędna służy do definiowania środka pozostałych studzienek na płycie.
11. Zalać strzykawkę za pomocą odpowiedniego polecenia na komputerze robota, aby upewnić się, że świeża mezofaza wypełni igłę dozującą i że pierwsza i kolejne studzienki otrzymają pełną liczbę mezofazy. Wytrzyj wytłaczaną mezofazę na końcówce igły chusteczką.
12. Uruchom program Run Robot (X-AP), aby zainicjować rundę etapów płukania, w których końcówki dozujące środek strącający na ramieniu 2 robota są myte i przygotowywane do zasysania roztworów z bloku strącającego.
13. Aktywuj funkcję dozowania w robocie, aby uruchomić sekwencyjne ładowanie studzienek mezofazą obciążoną białkiem (zwykle 50 nl), najpierw kolumną ośmiu dołków na raz, a następnie roztworami strącającymi (zwykle 800 nl). Pomiędzy kolumnami załadowczymi, ramię dozujące mezofazę powraca do pozycji parkowania, w której koniec igły jest umieszczony w zwilżonej gąbce, aby zapobiec wysychaniu mezofazy na końcówce. Proces dozowania mezofazy i środka strącającego powtarza się 11 razy na płytce, aż do napełnienia płytki. Ładowanie 96-dołkowej płytki mezofazą i środkiem strącającym trwa 5 minut.
14. Gdy tylko płyta zostanie napełniona, a ramiona robota powrócą do pozycji parkowania, zdejmij płytę z pokładu robota i umieść ją na płaskiej, twardej powierzchni.
15. Natychmiast uszczelnij płytkę szkłem nakrywkowym, aby zminimalizować zależne od czasu zmiany w składzie studni. Ważne jest, aby upewnić się, że wszystkie 96 studzienek jest całkowicie zakrytych, że szkło nakrywkowe jest wyrównane prostopadle z płytą podstawy i że żadna ze szklanych pokryw nie wystaje poza powierzchnię płyty podstawowej. Wałek lub brayer służy do stworzenia szczelnego i jednolitego uszczelnienia między szkłem nakrywkowym a przekładką.
16. Sprawdź płytę, aby upewnić się, że konfiguracja przebiegła tak, jak powinna. To, czego się szuka, to pojawienie się "jajka sadzonego na patelni" w każdej studzience. Żółtko jajka sadzonego odpowiada mezofazie. Białko jaja jest roztworem strącającym, a krawędź patelni jest obwodem studni krystalizacyjnej. Idealnie, te trzy są koncentryczne.
17. Umieść płytkę w miejscu do przechowywania o kontrolowanej temperaturze w celu wzrostu kryształów.
18. Jeśli nie ma potrzeby ustawiania więcej płyt, usuń blok strącający z pokładu robota, szczelnie go zamknij i włóż z powrotem do przechowywania.
19. Wyjmij strzykawkę zawierającą mezofazę z ramienia dozującego robota, zdemontuj ją i umyj jej części, w tym igłę dozującą i skuwkę, ostrożnie metanolem i wysusz w ramach przygotowań do następnego użycia.

3. W Meso Robot 2. Komar LCP

Robot LCP Mosquito (Rysunek 4) zawiera podobny dozownik mezofazy do tego używanego przez Robota 1. W przeciwieństwie do Robota 1 dozuje środek strącający za pomocą jednorazowych końcówek. Oprogramowanie do programowania służy do ustawiania przyrządu do pracy z określonymi płytkami krystalizacyjnymi i blokami strącającymi oraz do dozowania zdefiniowanych przez użytkownika objętości mezofazy i środka strącającego w określonej kolejności. Takie szczegóły są dostarczane przez producenta i nie będą tutaj opisywane.

1. Przygotować strzykawkę Hamiltona, w komplecie z igłą i wypełnioną mezofazą z białkiem, jak opisano powyżej w Robot 1 i w artykule JoVE^{1712 1}.
2. Zacisnąć strzykawkę na miejscu na ramieniu dozującym robota.
3. Użyj czujnika laserowego zamontowanego na pokładzie, aby ustalić współrzędne X i Y igły na strzykawce dozującej. Jest to ważny krok wymagany, aby zapewnić, że mezofaza jest dokładnie dozowana w środku każdej studzienki na płytce.
4. Za naciśnięciem przycisku na panelu sterowania zalać strzykawkę, aby usunąć mezofazę z igły. Usuń wytłaczaną mezofazę z końcówki igły za pomocą chusteczki w celu przygotowania do użycia robota do załadunku studni.
5. Przed umieszczeniem płytki krystalizacyjnej na pokładzie robota zwilż powierzchnię platformy kilkoma kroplami wody, aby pomóc utrzymać płytkę na miejscu poprzez kapilarność.
6. Zdejmij osłonę ochronną z przekładki na szklanej płycie podstawy i mocno umieść ją na platformie, aby zapewnić dobre przyleganie. Użyj trzech otworów powierniczych na platformie, aby wyrównać 3 dołki narożne, zapewniając w ten sposób prawidłowe ustawienie dołków na płytce w stosunku do końcówki igły dozującej. Przyrząd otrzymuje teraz polecenie przejścia w cykl dozowania.
7. Cykl rozpoczyna się od drugiego etapu zalewania, w którym mezofaza jest dozowana na małą szklaną płytkę bezpośrednio przed przejściem do załadowania studzienek świeżą mezofazą. Robot najpierw ładuje mezofazą pionową kolumnę z 8 dołkami na płytkę, a następnie wykorzystuje jednorazowe końcówki do dozowania roztworu strącającego na bolus mezofazowy. Proces powtarza się 11 razy na całej długości płytki, aż wszystkie studzienki zostaną wypełnione. Cały proces trwa około 5 minut.
8. Wyjmij napełnioną płytkę z platformy robota i zamknij ją szkłem nakrywkowym, jak opisano powyżej w części Robot 1.
9. Umieść płytkę, odpowiednio oznakowaną, w środowisku o kontrolowanej temperaturze w celu wzrostu kryształów.

4. W Meso Robot 3. Gryf LCP

Robot LCP Gryphon (Rysunek 5) zawiera podobny system dozowania mezofaz do opisanego powyżej dla Robotów 1 i 2. To, co odróżnia go od dwóch pozostałych, to fakt, że wszystkie 96 roztworów strącających jest dozowanych jednocześnie.

1. Przygotować mezofazę obciążoną białkiem i załadować ją do strzykawki dozującej, jak opisano powyżej, w Robotach 1 i 2 oraz w artykule JoVE^{1712 1}.
2. Zacisnąć strzykawkę na miejscu na ramieniu dozującym robota.
3. Umieść blok roztworu strącającego i płytkę krystalizacyjną na pokładzie robota.
4. Załaduj głowicę z 96 końcówkami roztworami strącającymi. Zdefiniowany przez użytkownika czas opóźnienia jest zapewniony w celu ułatwienia zasysania lepkich środków strącających.
5. Wydaj przyrządowi polecenie, aby wszedł w cykl dozowania. Cykl rozpoczyna się od sekwencyjnego dozowania mezofazy do 96 dołków w procesie, który trwa około 1 minuty. Głowica z 96 końcówkami dozuje następnie wszystkie 96 roztworów strącających jednocześnie na bolusy mezofazowe w studzienkach krystalizacyjnych. Cały proces ładowania płyty kończy się w 2 minuty.
6. Wyjmij napełnioną płytkę z platformy robota i zamknij ją szkłem nakrywkowym, jak opisano powyżej w części Robot 1.
7. Umieść płytkę, odpowiednio oznakowaną, w środowisku o kontrolowanej temperaturze w celu wzrostu kryształów.

5. Reprezentatywne wyniki

Celem tego artykułu wideo jest pokazanie, jak ustawić automatyczne próby krystalizacji za pomocą lepkiej, membranowej mezofazy obciążonej białkiem w szklanych płytkach krystalizacyjnych typu sandwich 96. Nacisk kładziony jest na automatyzację poprzez zastosowanie specjalistycznych robotów, które wymagają minimalnej ingerencji manualnej. Powtarzalność i precyzja pod względem objętości dozowanej mezofazy i środka strącającego oraz umieszczenia ich w studni są oczekiwane w przypadku korzystania z robota. Są one istotne z punktu widzenia skutecznego badania przesiewowego schorzeń wspomagających krystalogenezę. Mają one również kluczowe znaczenie dla kolejnego kroku w procesie analizy, którym jest ocena wzrostu kryształów, często wykonywanego za pomocą sprzętu do obrazowania. Lokalizacja kropli lub bolusa ma kluczowe znaczenie dla procesu obrazowania, a nieregularne i niewłaściwe umieszczenie bolusa w studzience zwykle wymaga interwencji użytkownika w celu skorygowania i wymaga czasu. Dla celów ilustracyjnych przykłady prawidłowo i nieprawidłowo załadowanych płyt przedstawiono na rysunku 6.

Rysunek 1. Schemat blokowy podsumowuje etapy związane z produkcją, zbiorem i kriochłodzeniem kryształów białek błonowych hodowanych w mezo. Stopnie otoczone przerywaną czerwoną linią są głównym tematem tego artykułu JoVE. Roboty zostały użyte do dozowania roztworów mezofazowych i strącających w krokach 29-32. Z odnośnika 3. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

Rysunek 2. W pełni załadowana i szczelnie zamknięta 96-dołkowa szklana płytka krystalizacyjna typu sandwich. Każda studzienka zawiera 50 nl fazy sześciennej i 1 μl roztworu strącającego. Dla jasności, faza sześcienna została zabarwiona czerwienią Sudan Red, a roztwór strącający zawiera błękit metylenowy. Z odnośnika 5.

Rysunek 3. Robot w mezo (Robot 1). Robot posiada dwa ramiona. Ramię 1 dozuje mezofazę lipidową obciążoną białkami. Ramię 2 dozuje roztwory strącające. Podczas napełniania płytka 96-dołkowa pozostaje nieruchoma na swoim miejscu na pokładzie robota. Dwa ramiona poruszają się, aby dostarczyć roztwory mezofazowe i strącające. Z odnośnika 3.

Rysunek 4. Robot Mosquito LCP (Robot 2). W przeciwieństwie do Robota 1, pokład Mosquito LCP, na którym znajduje się 96-dołkowa płytka i blok roztworu strącającego, porusza się poziomo podczas napełniania.

Rysunek 5. Robot Gryphon LCP (Robot 3). Podczas ustawiania dozownik lipidowej fazy sześciennej porusza się, aby dostarczyć mezofazę obciążoną białkiem na 96-dołkową płytkę. Pokład następnie przesuwa się poziomo, aby umieścić płytkę pod głowicą końcówki roztworu strącającego. Wszystkie 96 roztworów strącających jest dozowanych jednocześnie. Zdjęcie pochodzi od producenta (http://www.artrobbins.com/) i oznaczone.

Rysunek 6. W pełni załadowana i uszczelniona 96-dołkowa szklana płyta warstwowa (A) i studzienki prawidłowo (B) i nieprawidłowo (C, D) napełnione za pomocą robota w mezo (Robot 1). Etykieta z kodem kreskowym na płytce w A służy do śledzenia płytki w inkubatorze płytkowym/urządzeniu do obrazowania. W panelach B-D roztwór strącający i mezofaza są oznaczone odpowiednio P i M. Oczekiwany wygląd studni w B jak "jajko sadzone na patelni" jest charakterystyczny dla prawidłowo załadowanej i uszczelnionej studni. W C środek strącający został nieprawidłowo dozowany do studzienki w pozycji przesuniętej centralnie i wszedł w kontakt z przekładką. W C również wydaje się, że objętość mezofazy jest mniejsza niż powinna. Przykład niepełnego obciążenia roztworem strącającym pokazano w D. W przypadku skali średnica wszystkich studzienek wynosi 6 mm.

Discussion

W tym artykule wideo pokazaliśmy, jak używać robota do automatycznego ustawiania się w próbach krystalizacji mezo na 96-dołkowych szklanych płytkach warstwowych przy użyciu mezofazy lipidowej obciążonej białkiem. Roboty użyte w tej pracy zostały specjalnie zaprojektowane tak, aby zawierały szklaną strzykawkę wyporową do dokładnego i powtarzalnego dostarczania nanolitrowych objętości lepkiej i lepkiej mezofazy, jak pierwotnie opisano⁷.

Dokładność i precyzja to ważne cechy robota. Cechy te są jednak tylko tak dobre, jak stopień i regularność, z jaką oceniana jest wydajność robota i przeprowadzana jest kalibracja. Jest rzeczą oczywistą, że wydajność robota powinna być oceniana podczas ustawiania poszczególnych płyt. Nie należy zakładać, że robot będzie działał bez zarzutu i pozostawić robota bez nadzoru. Uważny i uważny operator powinien być w stanie zauważyć po dźwięku lub pojawieniu się, że coś nie działa prawidłowo i natychmiast to poprawić. Dodatkowo, każda płytka powinna być dokładnie sprawdzona wzrokowo pod kątem jednorodności zawartości studzienki zaraz po zamknięciu płytki i przed odłożeniem jej do prób krystalizacji. Powinno to zająć tylko kilka sekund i można to zrobić podczas ładowania następnej płyty. Zauważenie, na przykład, że poszczególne studzienki nie są prawidłowo wypełnione, może zwrócić uwagę na fakt, że pewna końcówka dozująca strącacz działa nieprawidłowo. Jeśli okaże się, że dostarczanie mezofazy jest nieprawidłowe, dany wadliwy element będzie musiał zostać natychmiast poprawiony. Zwrócenie uwagi na te problemy i dokonanie odpowiednich korekt podczas konfiguracji pozwoli zaoszczędzić czas i materiały, w tym cenne lipidy i białka błonowe. Jeśli do śledzenia wzrostu kryształów używany jest imager, dokładność i precyzja mogą być również monitorowane podczas obrazowania. Na przykład systematyczne problemy z lokalizacją kropli lub bolusa przez kamerę wskazują, że coś jest nie tak i że potrzebne są działania naprawcze gdzieś wcześniej w protokole.

W trosce o niezawodne działanie robot musi być kalibrowany zgodnie z harmonogramem i w razie potrzeby. Kalibracje powinny obejmować objętość dostarczonego środka strącającego i mezofazę, a także umieszczenie bolusa i środka strącającego w studni. Oczywiście, tam, gdzie jest to możliwe, kalibracja powinna być wykonywana przy użyciu objętości i materiałów podobnych do tych, które będą używane w próbach prowadzonych w okresie objętym kontrolą jakości.

Równie ważne jak kalibracja jest również posiadanie w magazynie odpowiedniego zapasu części i materiałów eksploatacyjnych do robotów. Katastrofalne i nieoczekiwane awarie, blokady i awarie mogą się zdarzyć i zdarzają. W takim przypadku posiadanie na przykład zamiennej końcówki doprowadzającej środek strącający może oznaczać, że niezwykle wartościowy preparat białka błonowego jest stosowany tak, jak powinien i nie jest marnowany.

Do zalet robota należy zaliczyć fakt, że będzie on pracował w zasadzie bez przerwy i nie odczuwa zmęczenia ani nie "skarży się" na nie. Robot może być również używany w warunkach, które nie są uważane za przyjazne dla człowieka, na przykład w ciemności, w kontrolowanych warunkach oświetleniowych i środowiskowych oraz w ekstremalnych temperaturach. Wszystkie roboty przedstawione w tym artykule były używane w warunkach otoczenia w temperaturze ~20 °C. Istnieją jednak białka i projekty, które wymagają temperatur innych niż temperatura otoczenia, kontrolowanego światła^11,12 oraz środowiska utleniającego lub redukującego¹³. Wszystkie te elementy można stosunkowo łatwo zaspokoić, gdy używany jest robot krystalizujący.

We wcześniejszym artykule wideo JoVE pokazaliśmy, jak próby krystalizacji metodą in meso są ustawiane ręcznie ¹. Minimalna objętość mezofazy, która może być niezawodnie dozowana ręcznie, jest ograniczona przez ostrość wzroku i pewną rękę osoby organizującej próby. Z naszego doświadczenia wynika, że objętości mezofazy tak niskie jak 100 nl są łatwo obsługiwane. Znamy jedno laboratorium, w którym domyślna objętość dozowana ręcznie wynosi około 40 nl. Jednak przy użyciu robota możliwe są znacznie mniejsze objętości. Oddzielnie wykazaliśmy, że objętości mezofazy tak małe jak 550 pikolitrów mogą być dozowane automatycznie¹⁴. Z tych prac jasno wynikało, że możliwa jest dalsza miniaturyzacja za pomocą robota, która, jeśli zostanie wdrożona, doprowadzi do znacznego zmniejszenia ilości cennego białka błonowego potrzebnego do przeprowadzenia próby krystalizacji.

W tym artykule wideo wykorzystano trzy dostępne na rynku roboty do zademonstrowania wysokoprzepustowej krystalizacji białek błonowych przy użyciu mezofaz lipidowych. Pierwszy z nich został opracowany w Grupie MS&FB w oparciu o nasze doświadczenie w ręcznym konfigurowaniu prób, zgodnie z opisem w JoVE 1712¹. Jest to instrument, z którym jesteśmy najbardziej zaznajomieni i większość obecnego artykułu poświęcona jest jego użyciu. Pozostałe dwa roboty były prezentowane w Grupie MS&FB w momencie pisania artykułu, a odpowiedni materiał filmowy został tutaj zamieszczony w celu zapewnienia kompletności. Wszystkie trzy roboty wykorzystują ten sam system dozowania mezofazy, którego zasadniczą cechą jest szklana strzykawka^{wyporowa 5,7}. Różnią się one najbardziej pod względem dostarczania środków strącających. Roboty 1 i 2 mogą dozować środek strącający jednocześnie do 8 studzienek, po jednej kolumnie na płycie krystalizacyjnej na raz. Natomiast Robot 3 dozuje wszystkie 96 roztworów strącających w jednym ruchu. Robot 2 jest jedynym urządzeniem wyposażonym w jednorazowe końcówki dozujące środki strącające. Istnieją plusy i minusy związane z różnymi instrumentami, które zależą od konkretnego zastosowania; Nie będą one tutaj rozwijane. Wystarczy powiedzieć, że wszystkie trzy działają i wytworzyły kryształy białek błonowych metodą in mezo .

Kolejnymi krokami w ogólnym procesie określania struktury za pomocą krystalografii makromolekularnej jest zbieranie i kriochłodzenie kryształów z płytek ustawionych zgodnie z opisem w tym artykule wideo oraz rejestrowanie i przetwarzanie dyfrakcji promieniowania rentgenowskiego z nich. Tematy te są omówione w osobnych artykułach JoVE w tej serii^1,15.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Brayer (wałek)	Fisher Scientific	50820937	Tool
Strzykawki gazoszczelne	Hamilton	81030	Tool
Szkiełka nakrywkowe	szklane Marienfeld	01029990911	Jednorazowe
talerze szklane	Marienfeld	1527127092
Jednorazowy robot Gryphon LCP	Art Robbins	NA	Tool
W robotach mezo	Anachem/Gilson		NA Tool
Lab notebook	Różne	narzędzia	NA
Mosquito LCP Robot	TTP Labtech	NA	Tool
Perforowana taśma dystansowa z podwójnym patyczkiem	Saunders Corporation (dziurkowana)	dostosowane	Jednorazowe
roztwory strącające	Różne	różne odczynniki
Oczyszczona woda	Millipore		NA Odczynnik
Rain-X	Shell Car Care	80199200	Końcówki
strzykawek	Hamilton	7770-020 (wskaźnik 22)	Chusteczki narzędziowe
	Różne		różne jednorazowe
butelki na wodę	różne	odczynniki	NA