W niniejszym opracowaniu opisano zrobotyzowane podejście do wysokoprzepustowej krystalizacji białek błonowych w mezofazach lipidowych, przeznaczone do wyznaczania struktur za pomocą makromolekularnej krystalografii rentgenowskiej. Przedstawiono trzy roboty zdolne do pracy z lepką i kleistą mezofazą zawierającą białka, która jest nieodzownym elementem tej metody.
Artykuł metodologiczny
Wykorzystanie robota do wysokoprzepustowej krystalizacji białek błonowych w mezofazach lipidowych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Badania nad strukturą i funkcją białek błonowych w znacznym stopniu korzystają z dostępności trójwymiarowych struktur o wysokiej rozdzielczości, takich jak te uzyskiwane za pomocą makromolekularnej krystalografii rentgenowskiej (MX). Niezbędnym elementem MX jest stały dopływ kryształów o idealnej jakości dyfrakcyjnej. Metoda in meso lub metoda lipidowej fazy sześciennej (LCP) krystalizacji białek błonowych jest jedną z kilku dostępnych metod krystalizacji białek błonowych. Wykorzystuje ona bikontinuum mezofazy do wzrostu kryształów. Jako metoda odniosła ostatnio spektakularne sukcesy i przyciągnęła znaczną uwagę, a wiele grup badawczych jest obecnie zainteresowanych jej zastosowaniem. Jednym z wyzwań związanych z tą metodą jest fakt, że mezofaza gospodarza jest niezwykle lepka i kleista, co przypomina gęstą pastę do zębów. W związku z tym ręczne dozowanie niewielkich objętości do studzienek krystalizacyjnych w sposób powtarzalny wymaga umiejętności, cierpliwości i pewnej ręki. Protokół służący właśnie do tego celu został opracowany w Grupie Biologii Strukturalnej i Funkcjonalnej Błon (MS&FB)1-3. Dostępne są artykuły wideo JoVE opisujące tę metodę1,4.
Manualne podejście do przygotowania prób krystalizacji in meso posiada wyraźne zalety w specjalistycznych zastosowaniach, takich jak optymalizacja kryształów i pochodnowanie. Metoda ta charakteryzuje się jednak niską przepustowością. W niniejszej pracy przedstawiamy protokół zautomatyzowanego przeprowadzania prób krystalizacji in meso z wykorzystaniem robota. Zastosowanie robota zapewnia korzyści w postaci szybkości, dokładności, precyzji oraz miniaturyzacji, a także możliwości ciągłej pracy przez dłuższy czas w warunkach, które można uznać za niekorzystne, takich jak ciemność, atmosfera redukująca lub niskie i wysokie temperatury. Odpowiednio wykorzystany robot do krystalizacji in meso może znacznie zwiększyć wydajność badań nad strukturą i funkcją białek błonowych poprzez ułatwienie krystalizacji, która jest jednym z najwolniejszych etapów w całym procesie wyznaczania struktury.
W tym artykule wideo demonstrujemy zastosowanie trzech dostępnych komercyjnie robotów, które potrafią dozować lepki i klejący mezofazowy materiał niezbędny do krystalogenezy in meso. Pierwszy robot został opracowany w grupie MS&FB5,6. Pozostałe dwa stały się niedawno dostępne i zostały tutaj uwzględnione dla pełnego obrazu.
Przegląd protokołu opisanego w niniejszym artykule przedstawiono na Rysunku 1. Wszystkie czynności przeprowadzono w temperaturze pokojowej (~20 °C) w warunkach otoczenia.
Protokół
1. Przygotowanie płytki do krystalizacji
Przygotowanie do robotycznego przeprowadzenia próby krystalizacji rozpoczyna się od przygotowania płyty bazowej szklanego zestawu krystalizacyjnego w układzie kanapkowym (Rysunek 2), co zostało szczegółowo opisane w Publikacji 2. Płyta bazowa musi zostać najpierw poddana silanizacji, a następnie do płyty należy przykleić perforowany dwustronny dystans tworzący studzienki. Materiały i odczynniki niezbędne do tego procesu wyszczególniono w sekcji Materiały.
- Położyć płytkę na ręczniku papierowym, nanieść kilka kropel roztworu silanizującego i rozprowadzić go równomiernie po powierzchni płytki za pomocą chusteczki papierowej.
- Usunąć nadmiar roztworu silanizującego poprzez zanurzenie płytki w zlewce z wodą.
- Wyjąć płytkę ze zlewki, położyć ją na suchym ręczniku papierowym stroną silanizowaną do góry i osuszyć odsłoniętą powierzchnię, delikatnie przecierając ją ręcznikiem papierowym.
- Odkleić warstwę ochronną z perforowanego, dwustronnie klejącego dystansera i przyłożyć dystanser stroną klejącą do suchej, silanizowanej powierzchni szklanej płytki. Należy upewnić się, że dystanser jest prawidłowo rozmieszczony na płytce podstawowej, tak aby jego górny lewy róg oraz dwa przyległe boki pokrywały się z krawędziami płytki.
- Użyć wałka lub brayera, aby docisnąć dystanser do płytki podstawowej i zapewnić szczelne połączenie między nimi.
Gotowe płytki są dostępne w sprzedaży (HR3-151, Hampton Research; MD11-55-100, Molecular Dimensions; oraz LCP96T-UVP70U, Swissci). Ze względów kosztowych preferujemy samodzielne przygotowanie płytek zgodnie z powyższym protokołem.
2. Robot In Meso 1
Pierwszym robotem in meso, który zostanie zaprezentowany w tym artykule wideo, jest urządzenie obecnie używane w Grupie MS&FB (Rysunek 3). Pełne szczegóły dotyczące robota znajdują się w sekcji Materiały oraz w sekcji Literatura5. Materiały i sprzęt niezbędne do przygotowania próby krystalizacji przy użyciu robota wyszczególniono w sekcji Materiały.
- Umieść płytkę podstawową z dystansem przygotowanym w Sekcji 1 na pokładzie robota. Płytka ta posiada własną platformę z zaznaczonymi pozycjami dołków w celu wyrównania płytki podstawowej. Płytkę należy opisać w celu identyfikacji.
- Zamocuj 96-dołkowy blok z wytrącaczem na dedykowanej platformie na pokładzie robota, obok płytki do krystalizacji.
- Ostrożnie otwórz blok, odrywając plastikową pokrywę uszczelniającą.
- Włącz nawilżacz i skieruj strumień wilgotnego powietrza nad i w poprzek płytki podstawowej na pokładzie robota. Wykazano, że nawilżacz zmniejsza parowanie roztworu wytrącacza i poprawia powtarzalność w obrębie płytki do krystalizacji5. Można go włączyć przed konfiguracją, aby wstępnie nawilżyć obszar w przypadku niskiej względnej wilgotności otoczenia, lub w przeciwnym razie tuż przed rozpoczęciem dozowania mezofazy.
- Zainicjuj robota zgodnie z instrukcjami producenta. Szczegółowe instrukcje specyficzne dla instrumentu nie zostaną tutaj opisane, ponieważ dokładne procedury zmieniają się w czasie. W istocie podczas inicjalizacji ramię dozujące mezofazę w robocie otrzymuje pozycje referencyjne w trzech ortogonalnych kierunkach X, Y i Z.
- Zamocuj mezofazę z białkiem w strzykawce Hamiltona, wraz z igłą dozującą, do Ramienia 1 robota (Rycina 3). Pełne szczegóły dotyczące przygotowania mezofazy i sposobu jej załadowania do strzykawki zostały opisane w Literaturze 3,7-10.
- Zdejmij górną osłonę ochronną z dystansu na krystalizacyjnej płytce podstawowej i wyrównaj dołki na płytce z punktami referencyjnymi na platformie płytki podstawowej. Uwaga: na potrzeby tego filmu osłona ochronna została pozostawiona na miejscu, aby pomóc widzowi podczas etapu wyrównywania.
- Wyrównaj końcówkę igły strzykawki dozującej z dnem najwyższego dołka w lewym górnym rogu płytki do krystalizacji (dołek A1). Odbywa się to poprzez regulację wysokości lub współrzędnej Z ramienia dozującego na oko, obserwując, jak blisko dna dołka znajduje się końcówka igły. To, czy końcówka styka się z dnem dołka, można ocenić, przesuwając płytkę z boku na bok na platformie przy jednoczesnej minimalnej regulacji wysokości ramienia dozującego.
- Wprowadź do komputera współrzędną Z ramienia dozującego, przy której końcówka styka się z płytką. Dozowanie jest zaprogramowane tak, aby odbywało się z końcówką igły 80 µm od tej referencyjnej pozycji Z, co odpowiada powierzchni płytki podstawowej.
- Ustaw na oko końcówkę igły w centrum dołka A1. Zapisz w sterującym komputerze referencyjną współrzędną X, Y ramienia dozującego, przy której końcówka jest wycentrowana. Współrzędna ta służy do zdefiniowania centrów pozostałych dołków na płytce.
- Przepłucz strzykawkę za pomocą odpowiedniej komendy w komputerze robota, aby upewnić się, że świeża mezofaza wypełnia igłę dozującą i że pierwszy oraz kolejne dołki otrzymają pełną dawkę mezofazy. Zetrzyj wyduszoną mezofazę z końcówki igły za pomocą chusteczki.
- Uruchom program Run Robot (X-AP), aby zainicjować serię kroków płukania, podczas których końcówki dozujące wytrącacz na Ramieniu 2 robota są myte i przygotowywane do aspiracji roztworów z bloku z wytrącaczem.
- Aktywuj funkcję dozowania w robocie, aby uruchomić sekwencyjne napełnianie dołków najpierw mezofazą z białkiem (zwykle 50 nl), po jednym słupku ośmiu dołków naraz, a następnie roztworami wytrącacza (zwykle 800 nl). Między napełnianiem słupków ramię dozujące mezofazę wraca do pozycji parkingowej, gdzie końcówka igły jest umieszczana w zwilżonej gąbce, aby zapobiec wysychaniu mezofazy na końcówce. Proces dozowania mezofazy i wytrącacza jest powtarzany 11 razy w obrębie płytki, aż zostanie ona całkowicie wypełniona. Napełnianie płytki 96-dołkowej mezofazą i wytrącaczem trwa 5 min.
- Gdy tylko płytka zostanie wypełniona, a ramiona robota wrócą do pozycji parkingowych, zdejmij płytkę z pokładu robota i umieść ją na płaskiej, stabilnej powierzchni.
- Natychmiast zabezpiecz płytkę szkiełkiem nakrywką, aby zminimalizować zależne od czasu zmiany w składzie dołków. Ważne jest, aby upewnić się, że wszystkie 96 dołków jest całkowicie przykrytych, że szkiełko nakrywka jest wyrównane prostopadle do płytki podstawowej i że żadna część szkiełka nie wystaje poza obrys płytki podstawowej. Do stworzenia szczelnego i jednorodnego uszczelnienia między szkiełkiem nakrywką a dystansem używa się rolki lub brayera.
- Sprawdzisz płytkę, aby upewnić się, że konfiguracja przebiegła prawidłowo. Należy szukać wyglądu przypominającego „sadzone jajko na patelni” w każdym dołku. Żółtko sadzonego jajka odpowiada mezofazie. Białko jajka to roztwór wytrącacza, a krawędź patelni to obwód dołka krystalizacyjnego. W idealnym przypadku te trzy elementy są koncentryczne.
- Umieść płytkę w obszarze przechowywania z kontrolowaną temperaturą w celu wzrostu kryształów.
- Jeśli nie planuje się konfigurowania kolejnych płytek, wyjmij blok z wytrącaczem z pokładu robota, szczelnie go zamknij i odłóż do miejsca przechowywania.
- Zdejmij strzykawkę zawierającą mezofazę z ramienia dozującego robota, rozmontuj ją i ostrożnie umyj jej części, w tym igłę dozującą i tulejkę, metanolem, a następnie wysusz w celu przygotowania do następnego użycia.
3. Robot In Meso 2. LCP dla komarów
Robot Mosquito LCP (Rysunek 4) posiada dozownik mezofazy podobny do tego, który jest zastosowany w Robocie 1. W przeciwieństwie do Robota 1, dozuje on czynnik wytrącający za pomocą jednorazowych końcówek. Oprogramowanie programistyczne służy do konfiguracji urządzenia do pracy z konkretnymi płytkami krystalizacyjnymi i blokami czynnika wytrącającego, a także do dozowania określonych przez użytkownika objętości mezofazy i czynnika wytrącającego w заданной sekwencji. Takie szczegóły są dostarczane przez producenta i nie będą tutaj opisane.
- Przygotować strzykawkę Hamiltona wraz z igłą, wypełnioną mezofazą zawierającą białko, zgodnie z opisem powyżej w sekcji Robot 1 oraz w artykule JoVE 17121.
- Z clampować strzykawkę w odpowiedniej pozycji na ramieniu dozującym robota.
- Użyć zamontowanego na pokładzie czujnika laserowego, aby ustalić współrzędne X i Y igły w strzykawce dozującej. Jest to istotny krok niezbędny do zapewnienia precyzyjnego dozowania mezofazy w centrum każdego dołka na płytce.
- Za pomocą przycisku na panelu sterowania przeprowadzić odpowietrzanie strzykawki, aby wypchnąć mezofazę z igły. Usunąć wyduszoną mezofazę z końcówki igły za pomocą chusteczki, przygotowując robota do napełniania dołków.
- Przed umieszczeniem płytki krystalizacyjnej na pokładzie robota zwilżyć powierzchnię platformy kilkoma kroplami wody, aby pomóc w utrzymaniu płytki na miejscu dzięki siłom kapilarnym.
- Zdjąć osłonę ochronną z dystansera na szklanej płytce podstawowej i mocno umieścić go na platformie, aby zapewnić dobre przyleganie. Użyć trzech punktów referencyjnych na platformie do wyrównania trzech narożnych dołków, zapewniając tym samym prawidłowe ustawienie dołków na płytce względem końcówki igły dozującej. Następnie wydać instrumentowi polecenie rozpoczęcia cyklu dozowania.
- Cykl rozpoczyna się od drugiego etapu odpowietrzania, podczas którego mezofaza jest dozowana na małą szklaną płytkę bezpośrednio przed przejściem do napełniania dołków świeżą mezofazą. Robot najpierw napełnia mezofazą pionową kolumnę 8 dołków na płytce, a następnie używa jednorazowych końcówek do dozowania roztworu precypitantu na wierzch bolusa mezofazy. Proces ten jest powtarzany 11 razy wzdłuż płytki, aż wszystkie dołki zostaną wypełnione. Cały proces trwa około 5 min.
- Zdjąć wypełnioną płytkę z platformy robota i uszczelnić ją szkiełkiem podstawowym, zgodnie z opisem powyżej w sekcji Robot 1.
- Umieścić prawidłowo opisaną płytkę w środowisku o kontrolowanej temperaturze w celu wzrostu kryształów.
4. Robot In Meso 3. Gryphon LCP
Robot Gryphon LCP (Rycina 5) posiada system dozowania mezofazy podobny do tego opisanego powyżej dla Robotów 1 i 2. Tym, co odróżnia go od dwóch pozostałych, jest fakt, że wszystkie 96 roztworów precypitantu jest dozowanych jednocześnie.
- Przygotować mezofazę z białkiem i pobrać ją do strzykawki dozującej, zgodnie z opisem powyżej w sekcjach Robot 1 i 2 oraz w artykule JoVE 17121.
- Z clampować strzykawkę w odpowiedniej pozycji na ramieniu dozującym robota.
- Umieścić blok z roztworami precypitanta oraz płytkę krystalizacyjną na platformie robota.
- Napełnić głowicę 96-konkCzikową roztworami precypitantów. Przewidziano zdefiniowany przez użytkownika czas opóźnienia, aby ułatwić aspirację lepkich precypitantów.
- Uruchomić cykl dozowania w urządzeniu. Cykl rozpoczyna się od sekwencyjnego dozowania mezofazy do 96 studzienek, co zajmuje około 1 min. Następnie głowica 96-konkCzikowa dozuje jednocześnie wszystkie 96 roztworów precypitantów na bolusy mezofazy w studzienkach krystalizacyjnych. Cały proces napełniania płytki kończy się w ciągu 2 min.
- Zdjąć napełnioną płytkę z platformy robota i zabezpieczyć ją szkiełkiem przykrywkowym, zgodnie z opisem powyżej w sekcji Robot 1.
- Umieścić odpowiednio opisaną płytkę w środowisku o kontrolowanej temperaturze w celu wzrostu kryształów.
5. Reprezentatywne wyniki
Celem niniejszego artykułu wideo jest zaprezentowanie sposobu automatycznego przygotowania testów krystalizacji z użyciem lepkej mezofazy zawierającej białka błonowe w szklanych kanapkowych płytkach krystalizacyjnych z 96 dołkami. Nacisk położono na automatyzację z wykorzystaniem wyspecjalizowanych robotów, które wymagają minimalnej ingerencji manualnej. Zastosowanie robota pozwala na uzyskanie wysokiej powtarzalności i precyzji w zakresie dozowanych objętości mezofazy oraz precypitantu, a także ich rozmieszczenia w dołku. Jest to istotne z punktu widzenia efektywnego przesiewania warunków sprzyjających krystalogenezie. Parametry te są również krytyczne dla kolejnego etapu analizy, którym jest ocena wzrostu kryształów, często przeprowadzana za pomocą sprzętu obrazującego. Lokalizacja kropli lub bolusa jest kluczowa dla procesu obrazowania, a nieregularne i niewłaściwe rozmieszczenie bolusa w dołku zazwyczaj wymaga korekty przez użytkownika, co jest czasochłonne. W celach ilustracyjnych przykłady prawidłowo i nieprawidłowo napełnionych płytek przedstawiono na Rysunku 6.
Rysunek 1. Schemat blokowy podsumowujący etapy produkcji, zbioru i schładzania kriogenicznego kryształów białek błonowych hodowanych in meso. Kroki otoczone czerwoną przerywaną linią stanowią główny przedmiot tego artykułu JoVE. W krokach 29-32 do dozowania roztworów mezofazy i precypitantu wykorzystano roboty. Z literatury 3. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy rysunek.
Rycina 2. Całkowicie wypełniona i uszczelniona szklana płytka krystalizacyjna typu sandwich z 96 dołkami. Każdy dołek zawiera 50 nl fazy kubicznej i 1 μl roztworu precypitanta. Dla przejrzystości faza kubiczna została zabarwiona czerwienią Sudan Red, a roztwór precypitanta zawiera błękit metylenowy. Z literatury 5.
Rysunek 3. Robot in meso (Robot 1). Robot posiada dwa ramiona. Ramie 1 dozuje lipidową mezofazę zawierającą białko. Ramie 2 dozuje roztwory precypitantu. Podczas napełniania płytka 96-dołkowa pozostaje nieruchoma na platformie robota, która sama jest stacjonarna. Dwa ramiona poruszają się, aby dostarczyć mezofazę i roztwory precypitantu. Z Odniesienia 3.
Rysunek 4. Robot Mosquito LCP (Robot 2). W przeciwieństwie do Robota 1, platforma robota Mosquito LCP, na której znajdują się płytka 96-dołkowa oraz blok z roztworem precypitatem, porusza się poziomo podczas napełniania.
Rycina 5. Robot LCP Gryphon (Robot 3). Podczas konfiguracji dyspenser fazy kubicznej lipidów przemieszcza się, aby nanieść mezofazę z białkiem na płytkę 96-dołkową. Następnie platforma przesuwa się poziomo, aby ustawić płytkę pod głowicą z końcówkami do roztworów precypitanta. Wszystkie 96 roztworów precypitanta jest dozowanych jednocześnie. Zdjęcie pochodzi od producenta (http://www.artrobbins.com/) i zostało opisane.
Rysunek 6. W pełni załadowana i uszczelniona szklana płytka typu sandwich z 96 dołkami (A) oraz dołki wypełnione prawidłowo (B) i nieprawidłowo (C, D) przy użyciu robota in meso (Robot 1). Etykieta z kodem kreskowym na płytce w panelu A służy do śledzenia płytki w inkubatorze do płytek/urządzeniu obrazującym. W panelach B-D roztwór precypitantu i mezofaza są oznaczone odpowiednio jako P i M. Oczekiwany wygląd dołka w B, przypominający „jajko sadzone na patelni”, jest charakterystyczny dla prawidłowo załadowanego i uszczelnionego dołka. W panelu C precypitant został dozowany do dołka nieprawidłowo, poza centrum, i wszedł w kontakt z dystanserem. W panelu C wydaje się również, że objętość mezofazy jest mniejsza niż powinna. Przykład niepełnego załadowania roztworu precypitantu pokazano w panelu D. Dla skali: średnica wszystkich dołków wynosi 6 mm.
Dyskusja
W niniejszym artykule wideo zademonstrowaliśmy, jak wykorzystać robota do automatycznego przygotowania prób krystalizacji in meso w szklanych płytkach kanapkowych z 96 dołkami, przy użyciu lipidowej mezofazy zawierającej białko. Roboty użyte w tej pracy zostały specjalnie zaprojektowane tak, aby zawierały szklaną strzykawkę o dodatnim przemieszczeniu, co zapewnia dokładne i powtarzalne dozowanie nanolitrowych objętości lepki i kleistej mezofazy, zgodnie z pierwotnym opisem7.
Dokładność i precyzja są istotnymi cechami robota. Jednakże cechy te zależą od stopnia i regularności oceny wydajności robota oraz przeprowadzanej kalibracji. Oczywiste jest, że wydajność robota powinna być oceniana podczas przygotowywania poszczególnych płytek. Nie należy zakładać, że robot będzie funkcjonował bezbłędnie i pozostawiać go do pracy bez nadzoru. Uważny i spostrzegawczy operator powinien być w stanie zauważyć po dźwięku lub wyglądzie, kiedy coś nie działa prawidłowo i natychmiast to skorygować. Ponadto każda płytka powinna zostać dokładnie sprawdzona wzrokowo pod kątem jednolitości zawartości dołków natychmiast po uszczelnieniu płytki i przed odłożeniem jej do prób krystalizacji. Powinno to zająć jedynie kilka sekund i może zostać wykonane podczas ładowania kolejnej płytki. Zauważenie na przykład, że konkretne dołki nie są prawidłowo wypełnione, może wskazać na fakt, że końcówka dozująca określony precypitant uległa awarii. W przypadku stwierdzenia nierównomiernego dostarczania mezofazy, odpowiedni wadliwy element musi zostać niezwłocznie naprawiony. Zauważenie tych problemów i wprowadzenie stosownych korekt podczas przygotowania pozwoli zaoszczędzić czas i materiały, w tym cenne lipidy i białka błonowe. Jeśli do śledzenia wzrostu kryształów używany jest imager, dokładność i precyzję można monitorować również podczas obrazowania. Na przykład systematyczne problemy z lokalizacją kropli lub bolusa przez imager wskazują, że coś jest nieprawidłowe i konieczne jest podjęcie działań korygujących na wcześniejszym etapie protokołu.
W celu zapewnienia niezawodnego działania robot musi być kalibrowany regularnie oraz w razie potrzeby. Kalibracja powinna obejmować objętość dozowanego precypitantu i mezofazy, a także precyzyjne rozmieszczenie bolusa i precypitantu w dołku. Oczywiście, wszędzie tam, gdzie jest to możliwe, kalibracji należy dokonywać przy użyciu objętości i materiałów zbliżonych do tych, które będą wykorzystywane w próbach przeprowadzanych w okresie objętym procedurą kontroli jakości.
Równie istotna co kalibracja jest dbałość o odpowiedni zapas części zamiennych i materiałów eksploatacyjnych do robota. Katastrofalne i nieprzewidziane awarie, zatory oraz kolizje mogą wystąpić i zdarzają się w praktyce. W takim przypadku dostępność zapasowej końcówki do dozowania precypitantu może sprawić, że niezwykle cenny preparat białka błonowego zostanie wykorzystany zgodnie z przeznaczeniem i nie zostanie zmarnowany.
Do zalet robotów należy fakt, że mogą one pracować praktycznie w sposób ciągły i nie ulegają zmęczeniu. Robot może być również wykorzystywany w warunkach uznawanych za nieprzyjazne dla człowieka, takich jak ciemność, kontrolowane oświetlenie i warunki środowiskowe oraz ekstremalne temperatury. Roboty zaprezentowane w niniejszym artykule były wszystkie używane w warunkach otoczenia przy ~20 °C. Istnieją jednak białka i projekty wymagające temperatur innych niż temperatura otoczenia, kontrolowanego światła11,12 oraz środowiska utleniającego lub redukującego13. Wszystkie te wymagania można z względną łatwością spełnić, stosując robota do krystalizacji.
W poprzednim artykule wideo JoVE zademonstrowaliśmy, w jaki sposób ręcznie przygotowuje się próby krystalizacji metodą in meso 1. Minimalna objętość mezofazy, którą można niezawodnie odmierzyć ręcznie, jest ograniczona przez ostrość widzenia i stabilność dłoni osoby przygotowującej próby. Z naszego doświadczenia wynika, że objętości mezofazy rzędu 100 nl są łatwe do obsłużenia. Wiemy o jednym laboratorium, w którym standardowa objętość odmierzana ręcznie wynosi około 40 nl. Jednak z użyciem robota możliwe jest dozowanie znacznie mniejszych objętości. W oddzielnej pracy wykazaliśmy, że za pomocą robota można dozować objętości mezofazy wynoszące nawet 550 picoliters14. Z tych badań jasno wynikało, że dalsza miniaturyzacja za pomocą robota jest możliwa, co w przypadku wdrożenia doprowadziłoby do znacznej redukcji ilości cennych białek błonowych potrzebnych do przeprowadzenia próby krystalizacji.
W niniejszym artykule wideo wykorzystano trzy dostępne komercyjnie roboty, aby zademonstrować wysokoprzepustową krystalizację białek błonowych z wykorzystaniem mezofaz lipidowych. Pierwszy z nich został opracowany w Grupie MS&FB w oparciu o nasze doświadczenie w manualnym przygotowywaniu prób, zgodnie z opisem w JoVE 17121. Jest to urządzenie, z którym jesteśmy najbardziej zaznajomieni, dlatego większość niniejszego artykułu poświęcono jego zastosowaniu. Pozostałe dwa roboty znajdowały się w Grupie MS&FB w celach demonstracyjnych w czasie pisania artykułu, a odpowiednie nagrania zostały tutaj dołączone dla zachowania kompletności. Wszystkie trzy roboty wykorzystują niemal identyczny system dozowania mezofazy, którego kluczowym elementem jest szklana strzykawka wyporowa5,7. Różnią się one przede wszystkim sposobem podawania precypitantu. Robot 1 i 2 mogą dozować precypitant jednocześnie do 8 dołków, czyli do jednej kolumny na płytce krystalizacyjnej w jednym cyklu. Z kolei Robot 3 dozuje wszystkie 96 roztworów precypitantu w jednej operacji. Robot 2 jest jedynym urządzeniem wyposażonym w jednorazowe końcówki do dozowania precypitantu. Różne instrumenty mają swoje zalety i wady, zależnie od konkretnego zastosowania; nie będą one tutaj szczegółowo omawiane. Wystarczy stwierdzić, że wszystkie trzy działają i pozwoliły na uzyskanie kryształów białek błonowych metodą in meso.
Kolejnymi krokami w ogólnym procesie wyznaczania struktury metodą krystalografii makromolekularnej są pobranie i mrożenie w kriogenie kryształów z płytek przygotowanych zgodnie z opisem w tym artykule wideo, a następnie rejestracja i przetwarzanie dyfrakcji promieni rentgenowskich z tych kryształów. Tematy te są omówione w osobnych artykułach JoVE w tej serii1,15.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Wiele osób przyczyniło się do powstania tej pracy, w większości byli to członkowie grupy Membrane Structural and Functional Biology Group, zarówno obecni, jak i byli. Wszystkim im składamy serdeczne podziękowania i wyrazy uznania. Praca ta była częściowo finansowana z grantów Science Foundation Ireland (07/IN.1/B1836), National Institutes of Health (GM75915, P50GM073210 oraz U54GM094599) oraz FP7 COST Action CM0902.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Wałek (brayer) | Fisher Scientific | 50820937 | Narzędzie |
| Strzykawki szczelne gazowo | Hamilton | 81030 | Narzędzie |
| Szklane laminki | Marienfeld | 01029990911 | Jednorazowe |
| Płytki szklane | Marienfeld | 1527127092 | Jednorazowe |
| Robot Gryphon LCP | Art Robbins | NA | Narzędzie |
| In meso robot | Anachem/Gilson | NA | Narzędzie |
| Notatnik laboratoryjny | Różne | NA | Narzędzie |
| Robot Mosquito LCP | TTP Labtech | NA | Narzędzie |
| Perforowana dwustronna taśma dystansowa | Saunders Corporation (wybijana) | customized | Jednorazowe |
| Roztwory precypitantów | Różne | Różne | Odczynnik |
| Woda oczyszczona | Millipore | NA | Odczynnik |
| Rain-X | Shell Car Care | 80199200 | Odczynnik |
| Końcówki do strzykawek | Hamilton | 7770-020 (gauge 22) | Narzędzie |
| Chusteczki | Różne | Różne | Jednorazowe |
| Butelka na wodę | różne | NA | Odczynnik |
Bibliografia
- Caffrey, M., Porter, C. Crystallizing membrane proteins for structure determination using lipidic mesophases. J. Vis. Exp. (45), e1712(2010).
- Cherezov, V., Caffrey, M. Nano-volume plates with excellent optical properties for fast, inexpensive crystallization screening of membrane proteins. J. Appl. Crystallogr. 36, 1372-1377 (2003).
- Caffrey, M., Cherezov, V. Crystallizing membrane proteins using lipidic mesophases. Nat. Protocols. 4, 706-731 (2009).
- Liu, W., Cherezov, V. Crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases. J. Vis. Exp. (49), e2501(2011).
- Cherezov, V., Peddi, A., Muthusubramaniam, L., Zheng, Y. F., Caffrey, M. A robotic system for crystallizing membrane and soluble proteins in lipidic mesophases. Acta Crystallogr. D Bio.l Crystallogr. 60, 1795-1807 (2004).
- Peddi, A. High-throughput automated system for crystallizing membrane proteins in lipidic mesophases. IEEE Trans. Autom. Sci. Eng. 4, 129-140 (2007).
- Cheng, A., Hummel, B., Qiu, H., Caffrey, M. A simple mechanical mixer for small viscous lipid-containing samples. Chem. Phys. Lipids. 95, 11-21 (1998).
- Caffrey, M. Crystallizing membrane proteins for structure-function studies using lipidic mesophases. Biochem. Soc. Trans. 39, 725-732 (2011).
- Caffrey, M. Crystallizing membrane proteins for structure determination: use of lipidic mesophases. Annu. Rev. Biophys. 38, 29-51 (2009).
- Caffrey, M. Membrane protein crystallization. J. Struct. Biol. 142, 108-132 (2003).
- Gushchin, I., Reshetnyak, A., Borshchevskiy, V., Ishchenko, A., Round, E., Grudinin, S., Engelhard, M., Buldt, G., Gordeliy, V. Active State of Sensory Rhodopsin II: Structural Determinants for Signal Transfer and Proton Pumping. J. Mol. Biol. 412, 591-600 (2011).
- Jordan, P., Fromme, P., Witt, H. T., Klukas, O., Saenger, W., Krauss, N. Three-dimensional structure of cyanobacterial photosystem I at 2.5 angstrom resolution. Nature. 411, 909-917 (2001).
- Grawert, T., Span, I., Eisenreich, W., Rohdich, F., Eppinger, J., Bacher, A., Groll, M. Probing the reaction mechanism of IspH protein by x-ray structure analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 1077-1081 (2010).
- Cherezov, V., Caffrey, M. Picolitre-scale crystallization of membrane proteins. J. Appl. Crystallogr. 39, 604-606 (2006).
- Li, D., Boland, C., Aragao, D., Walsh, K., Caffrey, M. Harvesting and cryo-cooling crystals of membrane proteins grown in lipidic mesophases for structure determination by macromolecular crystallography. J. Vis. Exp. (67), e4001(2012).
Przedruki i uprawnienia
