Wysokoprzepustowe mapowanie fizyczne chromosomów przy użyciu zautomatyzowanej hybrydyzacji in situ

Podsumowanie

Zespoły genomu oparte na technologiach sekwencjonowania DNA są zazwyczaj bardzo rozdrobnione. Opracowanie fizycznych map chromosomów może potencjalnie poprawić składanie genomu. W tym miejscu demonstrujemy innowacyjne podejścia do przygotowania chromosomów, fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ i obrazowania, które znacznie zwiększają przepustowość opracowywania map fizycznych.

Streszczenie

Projekty mające na celu uzyskanie sekwencji całego genomu dla 10 000 gatunków kręgowców¹ oraz dla 5 000 gatunków owadów i pokrewnych stawonogów² mają się odbyć w ciągu najbliższych 5 lat. Na przykład sekwencjonowanie genomów 15 gatunków komarów malarii jest obecnie wykonywane przy użyciu platformy Illumina^3,4. To skupisko gatunków Anopheles obejmuje zarówno wektory, jak i niewektory malarii. Gdy zestawy genomu staną się dostępne, naukowcy będą mieli wyjątkową okazję do przeprowadzenia analizy porównawczej w celu wywnioskowania zmian ewolucyjnych istotnych dla zdolności wektora. Okazało się jednak, że trudno jest wykorzystać odczyty sekwencjonowania nowej generacji do generowania wysokiej jakości zestawów genomu de novo ⁵. Co więcej, istniejące zespoły genomów Anopheles gambiae, mimo że uzyskane przy użyciu metody Sangera, są popękane lub rozdrobnione^4,6.

Sukces porównawczych analiz genomowych będzie ograniczony, jeśli badacze będą zajmować się licznymi sekwencjonowaniami, a nie zespołami genomowymi opartymi na chromosomach. Pofragmentowane, niezmapowane sekwencje stwarzają problemy w analizach genomowych, ponieważ: (i) niezidentyfikowane luki powodują nieprawidłową lub niekompletną adnotację sekwencji genomowych; (ii) niezmapowane sekwencje prowadzą do pomylenia genów paralogicznych z genami z różnych haplotypów; oraz (iii) brak przypisania chromosomów i orientacji kontigów sekwencjonowania nie pozwala na rekonstrukcję filogenezy rearanżacji i badanie ewolucji chromosomów. Opracowanie map fizycznych o wysokiej rozdzielczości dla gatunków z nowo zsekwencjonowanymi genomami jest szybką i opłacalną inwestycją, która ułatwi adnotację genomu, analizę ewolucyjną i ponowne sekwencjonowanie poszczególnych genomów z naturalnych populacji^7,8.

Tutaj prezentujemy innowacyjne podejścia do preparacji chromosomów, fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) i obrazowania, które ułatwiają szybki rozwój map fizycznych. Na przykładzie An. gambiae wykazaliśmy, że opracowanie fizycznych map chromosomów może potencjalnie poprawić zespoły genomu, a tym samym jakość analiz genomowych. Najpierw stosujemy metodę wysokociśnieniową do przygotowania rozkładów chromosomów politenowych. Ta metoda, pierwotnie opracowana dla Drosophila⁹, pozwala użytkownikowi na wizualizację większej liczby szczegółów na chromosomach niż zwykła technika zgniatania¹⁰. Po drugie, w pełni zautomatyzowany system front-end dla FISH jest używany do wysokoprzepustowego fizycznego mapowania genomu. Zautomatyzowany system barwienia preparatów przeprowadza wiele testów jednocześnie i znacznie skraca czas pracy¹¹. Po trzecie, automatyczny system obrazowania fluorescencyjnego, który zawiera zmotoryzowany stolik do szkiełka, automatycznie skanuje i fotografuje chromosomy oznaczone po FISH¹². System ten jest szczególnie przydatny do identyfikacji i wizualizacji wielu płytek chromosomowych na tym samym szkiełku. Ponadto proces skanowania pozwala uzyskać bardziej jednolity wynik FISH. Ogólnie rzecz biorąc, zautomatyzowany protokół mapowania fizycznego o wysokiej przepustowości jest bardziej wydajny niż standardowy protokół ręczny.

Protokół

1. Wysokociśnieniowe przygotowanie chromosomów polietylenowych z komórek pielęgniarskich jajników

1. Wypreparuj na wpół gravide samice Anopheles po 25 godzinach od podania krwi pod mikroskopem preparacyjnym i utrwal jajniki w świeżo zmodyfikowanym roztworze Carnoya z metanolem (100% metanol: lodowaty kwas octowy, 3:1). Na tym etapie jajniki znajdują się w III etapie rozwoju Christophersa, kiedy pęcherzyki mają owalny kształt, a przezroczysty obszar z komórkami pielęgniarskimi w pęcherzykach ma okrągły kształt¹³. Umieść jajniki od około pięciu samic w 500 μl zmodyfikowanego roztworu Carnoya w 1,5 ml probówce Eppendorfa i trzymaj je w temperaturze pokojowej przez 24 godziny. Przenieść jajniki do temperatury -20 °C w celu długotrwałego przechowywania.
2. Przygotuj zmodyfikowany roztwór Carnoya z etanolem (100% etanol: lodowaty kwas octowy, 3:1) i 50% kwasem propionowym tuż przed wykonaniem szkiełek. Umieść jedną parę jajników na bezpyłowym szkiełku w jednej kropli zmodyfikowanego roztworu Carnoya. Podziel jajniki na około 6 sekcji za pomocą igieł preparacyjnych i umieść je w kroplach 50% kwasu propionowego na czystych szkiełkach pod mikroskopem stereoskopowym MZ6 Leica. Użyj osobnego slajdu dla każdej sekcji.
3. Oddziel mieszki włosowe podczas preparowania za pomocą igieł i wytrzyj pozostałą tkankę bibułą filtracyjną lub ręcznikiem papierowym pod mikroskopem preparacyjnym. Dodaj nową kroplę 50% kwasu propionowego do mieszków włosowych i pozostaw je na 3-5 minut w temperaturze pokojowej. Umieść szkiełko nakrywkowe na kropli 50% kwasu propionowego. Odstaw szkiełko na około 1 minutę.
4. Owiń szkiełko bibułą filtracyjną i plastikiem. Za pomocą narzędzia obrotowego Dremel 200 z nasadką Flex-Shaft i końcówką z miękkiego tworzywa sztucznego ustawioną w zakresie 3000–5000 obr./min, odciągnij mieszki włosowe, obracając końcówkę w kółko i lekko dociskając szkiełko nakrywkowe, aby równomiernie rozprowadzić jądra. Ten krok powinien zająć około 1 minuty. Sprawdź jakość rozsiewu za pomocą mikroskopu fazowego Olympus CX41 z obiektywem 20x.
5. Przygotuj kanapkę, umieszczając dodatkowe szkiełko nakrywkowe obok szkiełka nakrywkowego zakrywającego chromosomy i przykryj je drugim szkiełkiem mikroskopowym. Zmniejsza to ryzyko zgniecenia suwaka w imadle. Owiń szkiełka plastikowym arkuszem, który jest dostarczany w szklanych pojemnikach na szkiełka i bibułą filtracyjną, aby utrzymać kanapkę i chronić szkiełko przed zarysowaniem przez imadło.
6. Dociśnij suwaki za pomocą imadła mechanicznego. Ciśnienie 85-120 cali-funtów jest wystarczające i osiąga się je za pomocą klucza dynamometrycznego. Ten krok jest konieczny do maksymalnego spłaszczenia chromosomów.
7. Wyjąć drugie szkiełko mikroskopowe i dodatkowe szkiełko nakrywkowe. Podgrzej szkiełko z szkiełkiem nakrywkowym pokrywającym chromosomy do 55 °C w systemie denaturacji/hybrydyzacji szkiełka przez 10-15 minut, aby jeszcze bardziej spłaszczyć chromosomy. Zanurz szkiełko w ciekłym azocie na co najmniej 15 sekund, a gdy bulgotanie ustanie, przystąp do szybkiego usuwania szkiełka nakrywkowego za pomocą żyletki. Natychmiast umieść szkiełka w zimnym 50% etanolu na 5 minut. Odwodnić szkiełka w 70%, 90%, 100% etanolu przez 5 minut każdy. Szkiełka suche na powietrzu.

2. FISH Korzystanie z automatycznego systemu barwienia szkiełek

Program jest skonfigurowany z automatycznym systemem barwienia preparatów Xmatrx, aby wykonywać następujące kroki, z wyjątkiem etykietowania sondą. Szczegółowy protokół znakowania tłumaczenia nicków jest opisany w dokumentacji dostarczonej z polimerazą DNA firmy Fermentas.

1. Przed FISH należy przygotować sondy fluorescencyjne, znakując genomowe DNA BAC fluorochromem przy użyciu protokołu translacji nicków. Wymieszać 1 μg DNA, po 0,05 mM nieznakowanych dATP, dCTP i dGTP oraz 0,015 mM dTTP, 1 μl Cy3- lub Cy5-dUTP, 0,05 mg/ml BSA, 5 μl 10-krotnego buforu translacyjnego, 20 jednostek polimerazy DNA I, 0,0012 jednostki DNazy I i wodę wolną od nukleaz do 25 μl. Stosunek polimerazy DNA I/DNazy I dobiera się empirycznie w celu uzyskania sond o zakresie wielkości od 300 do 500 pz. Inkubować mieszaninę w temperaturze 15 °C przez 1 godzinę.
2. Umieść szkiełka i odczynniki w automatycznym systemie barwienia szkiełek Xmatrx i uruchom program, aby uruchomić następujące kroki. Stosować 800 μl 1x PBS przez 20 min. Przedmuchaj szkiełka powietrzem. Utrwalanie formaliny należy wykonać, nakładając 450 μl 4% formaliny w 1x PBS przez 1 minutę, a następnie przemyć 100% etanolem przez 1 sekundę dwa razy i raz przez 2 minuty. Przedmuchaj szkiełka powietrzem.
3. Podgrzewaj szkiełka w temperaturze 45 °C przez 2 minuty, aby uniknąć bulgotania podczas nakładania sond. Zastosuj 20 μl sond DNA, dodaj krople oleju mineralnego, aby uniknąć parowania roztworu hybrydyzacyjnego, a na wierzchu umieść szkiełko nakrywkowe. Denaturyzacja chromosomów i sond DNA poprzez podgrzewanie szkiełek podstawowych w temperaturze 90 °C przez 10 minut.
4. W celu hybrydyzacji inkubować szkiełka podstawowe w temperaturze 42 °C przez 14 godzin z założonymi szkiełkami nakrywkowymi. Roztwór hybrydyzacyjny składa się z 2x SSC, 100 mM fosforanu sodu, 1x roztworu Denhardta, 100 μg/ml azydku sodu i 10% siarczanu dekstranu w formamidzie.
5. W przypadku prania rygorystycznego podgrzewać szkiełka w temperaturze 42 °C przez 2 minuty, usuwać szkiełka nakrywkowe, myć szkiełka w 2x SSC przez 1 sekundę 4 razy. Przedmuchaj szkiełka powietrzem. Nałożyć 800 μl 0,4x SSC w temperaturze 42 °C przez 10 minut 2 razy. Myć szkiełka w 2x SSC w temperaturze 25 °C przez 10 min.
6. Wykonaj barwienie chromosomów, nakładając 50 μl 1 μM YOYO-1 w 1x PBS. Nanieść krople oleju mineralnego, aby uniknąć parowania roztworu barwiącego, założyć szkiełka nakrywkowe i inkubować w temperaturze 25 °C przez 10 minut. Usuń szkiełka nakrywkowe, umyj szkiełka w 2x SSC przez 1 sekundę 4 razy. Przedmuchaj szkiełka powietrzem. Nałożyć 15 μl odczynnika zapobiegającego blaknięciu ProLong Gold. Załóż szkiełka nakrywkowe.

3. Odczyt slajdów za pomocą automatycznego systemu obrazowania fluorescencyjnego

Ta sekcja szczegółowo opisuje korzystanie z oprogramowania Duet, które jest standardowo dostarczane z automatycznym systemem skanowania ACCORD PLUS. Instrukcja zaczyna się po włączeniu w następującej kolejności: Olympus U-RFL-T zasilacz do żarówki halogenowej, komputer Dell Precision T3500, mikroskop Olympus BX61 z podłączoną kamerą Olympus U-CMAD3.

1. Aby skonfigurować 10-krotne skanowanie wstępne, otwórz oprogramowanie Duet w systemie automatycznego skanowania ACCORD PLUS. Kliknij przycisk "Online". Wprowadź nowy identyfikator sprawy i przypisz identyfikator slajdu. Kliknij kropkę oznaczoną "BF". Jest to opcja jasnego pola. Ustaw opcję skanowania na "10x Skanowanie wstępne". Użyj "koła 2500x", "koła 10000x" lub "prostokąta". Kliknij "Ustaw i uruchom", aby wyświetlić 10-krotne skanowanie wstępne.
2. Kliknij przycisk "OK", aby uruchomić 10-krotne skanowanie wstępne. Postępuj zgodnie z instrukcjami, aby prawidłowo dostosować skanowanie. Kliknij "Zakończ", aby rozpocząć skanowanie. Naciśnij zakładkę "Główny", aby wrócić do ekranu głównego. Kliknij przycisk "Offline". Znajdź przypisany identyfikator sprawy i identyfikator slajdu, a następnie kliknij "Skanowanie offline". W czarnym polu w lewym górnym rogu kliknij strzałkę i wybierz "10x Prescan". Za pomocą strzałek (< || Δ > czyli przycisków "wstecz", "pauza", "odtwarzaj", "do przodu"), przejdź przez zeskanowane obrazy.
3. Po znalezieniu interesującego obrazu kliknij dwukrotnie na ekranie środek obszaru docelowego i naciśnij "Snap". Spowoduje to ukierunkowanie obrazu do późniejszego przechwycenia. Po wybraniu wszystkich celów kliknij "Klasyfikuj". Wybierz opcję "10x Skanowanie wstępne". Kliknij obraz prawym przyciskiem myszy i uzyskaj szansę sklasyfikowania obrazów. Wybierz "Polietylen".
4. Skonfiguruj 40x Pre-Scan w oprogramowaniu Duet. Kliknij "Główne", aby wrócić do menu głównego. Ponownie wybierz "Online". Zaznacz slajd. Zmień "BF" na "FL". Zmień nazwę zadania na "Revisit-X40-RG". Zmień sekcję tuż pod ostatnim ustawieniem na "Revisit-ALL". Kliknij "Ustaw i uruchom". Naciśnij "OK". Postępuj zgodnie z instrukcjami, aby ponownie skonfigurować automatyzację. Kliknij przycisk "Rozpocznij dopasowywanie widoków", aby dopasować obrazy 10x i 40x. Kliknij "Zakończ", aby rozpocząć skanowanie. Po zakończeniu kliknij "Klasyfikuj" i spójrz na obrazy.

4. Reprezentatywne wyniki

Rysunek 1 graficznie przedstawia schemat przygotowania chromosomów pod wysokim ciśnieniem. Ten etap obejmuje proces zgniatania i spłaszczania chromosomów za pomocą narzędzia Dremel i imadła mechanicznego, a także wizualizację chromosomów za pomocą mikroskopu z kontrastem fazowym. Rysunek 2 ilustruje hybrydyzację znakowanej fluorescencyjnie sondy w celu celowania w DNA na preparatach szkiełek chromosomowych przy użyciu zautomatyzowanego systemu barwienia szkiełek, użycie zautomatyzowanego mikroskopu skaningowego do wizualizacji i mapowania sond po eksperymencie FISH oraz umieszczanie i orientowanie rusztowań genomowych na chromosomach.

Preparaty chromosomów politenowych komórek pielęgniarskich jajnika od samic An. gambiae zostały wykonane przy użyciu techniki wysokiego ciśnienia. Metoda ta nie uszkadza ani nie zmienia większości struktury chromosomów (ryc. 3). Spłaszcza wygięte chromosomy, a tym samym odsłania ukryte drobne prążki, które nie są widoczne w regularnych preparatach (ryc. 4).

Sondy używane w tym protokole to genomowe klony DNA BAC uzyskane z biblioteki ND-TAM BAC wygenerowanej z DNA szczepu PEST An. gambiae. Genomowe DNA dla tej biblioteki zostało wyekstrahowane z nowo wyklutych larw pierwszego stadium rozwojowego obu płci. Rycina 5 przedstawia wyniki badania FISH przy użyciu klonów BAC zhybrydyzowanych z chromosomami politenowymi An. gambiae. Zabieg ten został wykonany przy użyciu automatycznego systemu barwienia szkiełek firmy Xmatrx. Korzystając ze zdjęcia cytogenetycznego An. gambiae¹⁰, dwa klony BAC, 102B24 (GenBank: BH372701, BH372694) i BAC 142O19 (GenBank: BH368703, BH368698), zostały zlokalizowane odpowiednio w podrejonach 16C i 16D ramienia 2R. Jednak wyszukiwanie BLAST w stosunku do szczepu AgamP3 An. gambiae PEST ¹⁴ zidentyfikowało sekwencje homologiczne do 102B24 i 142O19 w podrejonach 16B i 17A odpowiednio ramienia 2R (Tabela 1). W związku z tym zgodność między współrzędnymi genomu a podpodziałami cytogenetycznymi można teraz dostosować zgodnie z naszymi danymi mapowania. Wyszukiwanie BLAST w zespołach genomów formy M i formy S An. gambiae wykazało, że dwa klony BAC znajdują się w różnych kontigach, ale w tych samych rusztowaniach w każdej formie (Tabela 1). Zidentyfikowane kontigi można teraz powiązać z określonymi lokalizacjami chromosomalnymi. Co więcej, zidentyfikowane rusztowania mogą być teraz prawidłowo zorientowane w obrębie podpodziałów cytologicznych 16CD. Co ciekawe, odległości między sekwencjami 102B24 i 142O19 w rusztowaniach wynoszą odpowiednio 1 892 981 pz, 1 658 391 pz i 1 688 426 pz w zespołach genomów szczepu PEST, formy M i formy S. Ponieważ szczep PEST jest hybrydą między formami M i S, różnica ta jest prawdopodobnie spowodowana nieprawidłowym złożeniem genomu PEST.

BAC
(przystąpienie) Szczep PEST
AgamP3

Współrzędne Formularz M
contigs

Współrzędne Formularz M
Rusztowania

Współrzędne Formularz S
contigs

Współrzędne Formularz S
Rusztowania

Współrzędne 102B24
(BH372694) 2R:AAAB0100
8844_26 (16B)

43 681 342-
43 681 874 osób ABKP020247
53.1

32,513-
33 045 osób EQ090167.1

1 858 377-
1 858 909 osób ABKQ010123
32.1

4,299-
4 832 TGL EQ099711.1

215,891-
216 424 TGL 102B24
(BH372701) 2R:AAAB0100
8844_28 (16B)

43,788,213-
43 788 969 osób ABKP020247
51.1

24,816-
25 575 osób EQ090167.1,

1 772 683-
1 773 442 TGL ABKQ010123
35.1

27,782-
28 540 osób EQ099711.1,

305,514-
306 272 TGL 142O19
(BH368698) 2R:AAAB0100

8805_5 (17A)
45,428,580-
45 429 264 osób ABKP020247
01.1

2,499-
3 185 osób EQ090167.1

315,806-
316 492 jedn. ABKQ010123
76.1

49,242-
49 942 TGL EQ099711.1

1 791 625-
1 792 325 osób 142O19
(BH368703) 2R:AAAB0100
8805_8 (17A)

45,560,099-
45 574 323 osób ABKP020220
17.1

30,971-
32 469 osób EQ090167.1
200,518-
202 016 TGL ABKQ010123
79.1

27,760-
28 508 osób EQ099711.1

1 903 569-
1 904 317 osób

Tabela 1. Wyniki BLAST sekwencji końca BAC w stosunku do zespołów genomu An. gambiae.

Rysunek 1. Schematyczne przedstawienie preparatyki chromosomów pod wysokim ciśnieniem. Jajniki komarów są pokazane na prawidłowym etapie rozwoju.

Rysunek 2. Schemat przedstawiający zautomatyzowane FISH, skanowanie slajdów i mapowanie chromosomów rusztowań genomowych.

Rysunek 3. Rozprzestrzenianie się chromosomu 3 polietylenu An. gambiae uzyskanego przy użyciu techniki wysokociśnieniowej. 3L i 3R oznaczają lewe i prawe ramię na ich telomerach. PH i IH wskazują odpowiednio heterochromatynę perycentryczną i interkalarną.

Rysunek 4. Porównanie chromosomów politenów An. gambiae przygotowanych techniką tradycyjną (góra) i wysokociśnieniową (dół). Obrazy obejmują podrejony 29A-30E ramienia 3R (A) i 43D-46D ramienia 3L (B).

Rysunek 5. RYBA klonów BAC do chromosomów politenowych An. gambiae. A) Hybrydyzacja 102B24 (sygnał czerwony) z ramieniem 2R. B) Dwukolorowe FISH 102B24 (sygnał czerwony) i 142O19 (sygnał niebieski) do podpodziałów 16C i 16D odpowiednio rozciągniętego ramienia 2R. Strzałki wskazują sygnały hybrydyzacji klonów BAC oznaczonych Cy3 (czerwony) i Cy5 (niebieski). C - region centromerowy. a/+ pokazuje heterozygotę inwersję 2La. Chromosomy podbarwiono przeciwwagowo za pomocą fluoroforu YOYO-1.

Dyskusja

Najważniejszym etapem procedury wysokociśnieniowej jest prawidłowe zgniecenie komórek pielęgniarskich jajnika wyizolowanych w III etapie rozwoju jajnika Christophersa¹³. Niewłaściwe zgniatanie może prowadzić do niewystarczająco rozsianych chromosomów, co może powodować problemy podczas próby określenia lokalizacji sondy po FISH. Jeśli chromosomy są nadmiernie zgniecione, mogą zostać złamane lub wydłużone do punktu, w którym wzory prążków zostaną utracone. Produkcja wielu slajdów powinna prowadzić do spójności przy próbie zgniecenia slajdów za pomocą narzędzia Dremel, co zwiększy ogólną wydajność produkcji slajdów. Technika wysokiego ciśnienia została po raz pierwszy opracowana dla świeżo wyizolowanych gruczołów ślinowych D. melanogaster⁹. Jednak jajniki komarów są rutynowo konserwowane w zmodyfikowanym roztworze utrwalającym Carnoya (3 metanol: 1 lodowaty kwas octowy objętościowo) przed użyciem ich do preparatów chromosomowych. Dlatego zmodyfikowaliśmy istniejący protokół wysokociśnieniowy, aby był odpowiedni dla stałych chromosomów politenowych komórek pielęgniarskich jajnika komara An. gambiae. Ponieważ wysokie ciśnienie jest wywierane za pomocą precyzyjnego imadła o bardzo równoległej powierzchni roboczej całego szkiełka, przygotowanie zgniatania chromosomowego zajmuje znacznie mniej czasu niż przy użyciu tradycyjnej techniki stukania gumką ołówka.

Inne ważne kroki obejmują wystarczające namoczenie mieszków włosowych w 50% kwasie propionowym i podgrzanie szkiełka. Oba te kroki są niezbędne, aby pomóc w spłaszczeniu chromosomów. Jeśli zostaną zaniedbane, chromosomy mogą wydawać się błyszczące po odwodnieniu, co potencjalnie prowadzi do nadmiaru tła, które można pomylić z sygnałem w FISH. Technika zgniatania pod wysokim ciśnieniem również dobrze sprawdza się przy użyciu tych samych roztworów podczas wytwarzania preparatów chromosomów mitotycznych. Dodatkowe rozprzestrzenianie się i spłaszczanie pomaga w lepszej ekspresji chromosomów z ich jąder. Dodanie równomiernego nacisku powinno je odpowiednio spłaszczyć, aby umożliwić pomiary i potencjalnie lepszą rozdzielczość pasm widocznych po barwieniu. Szczegóły dotyczące izolowania chromosomów mitotycznych od komarów podano w innym miejscu¹⁵. Chociaż regularne preparaty do squasha są wystarczające do wielu celów, w tym FISH ¹⁶ i barwienia immunologicznego¹⁷, metoda wysokociśnieniowa nie tylko obniża potencjalną wariancję z jednego szkiełka na drugi, ale także zwiększa ogólną jakość chromosomów, prowadząc do większej szczegółowości podczas mapowania chromosomów. Procedura ta może być również stosowana do przygotowania preparatów błony chromosomu polietylenowego do mikrodysekcji laserowej.

Ograniczenia metody wysokociśnieniowej obejmują pękanie szkiełka i nadmierne rozciąganie chromosomów. Pęknięcie suwaka spowodowane zbyt dużym naciskiem na suwak za pomocą imadła jest możliwe, ale jest ograniczone przez zastosowanie nacisków podanych w artykule. W przypadku nadmiernego rozciągania chromosomów, jeśli narzędzie Dremel jest stosowane do szkiełka przez dłuższy czas, istnieje możliwość, że chromosomy mogą stać się zbyt rozciągnięte i stracić rozdzielczość. Można temu zaradzić, stosując narzędzie przez krótki czas, sprawdzając pod mikroskopem i wydłużając czas za pomocą narzędzia Dremel, jeśli chromosomy są niewystarczająco rozłożone.

Tradycyjny protokół FISH obejmuje szereg etapów mycia i inkubacji, które zwykle trwają 5-20 minut i wymagają prawie pełnej uwagi badacza przez cały czas trwania eksperymentu. Co więcej, liczba slajdów, które można obsłużyć ręcznie, jest zwykle ograniczona do kilku slajdów w danym eksperymencie. W przeciwieństwie do tego, zautomatyzowany system barwienia szkiełek wykonuje wszystkie etapy (w tym mycie, inkubację, aplikację sondy, denaturację, hybrydyzację, nakładanie i usuwanie szkiełek nakrywkowych) automatycznie. Uwalnia to do 6-8 godzin pracy dla badacza w eksperymencie FISH. Co więcej, zautomatyzowany system FISH może znacznie zwiększyć przepustowość. Na przykład system Xmatrx jest w stanie jednocześnie przetwarzać do 40 testów na pojedynczych szkiełkach przygotowawczych i do 80 testów na podwójnych preparatach. Jednym z ograniczeń tego systemu jest to, że nie jest on skuteczny w przypadku małej liczby eksperymentów FISH, ponieważ wymaga przygotowania dużych ilości roztworów. Dodatkowo zaprogramowany w systemie protokół FISH może wymagać modyfikacji i dostosowań dla nowych aplikacji.

System skanowania szkiełek jest zautomatyzowaną wersją mikroskopu fluorescencyjnego. Zautomatyzowane przesuwanie stolika i prosty panel sterowania mikroskopem uwalniają czas badacza i sprawiają, że obsługa mikroskopu jest niezwykle prosta. Na przykład oprogramowanie w systemie skanowania ACCORD PLUS pozwala na łatwe przechwytywanie wielu kanałów fluorescencji i łatwe zarządzanie akwizycją obrazu. Przykładem tego jest włączenie przechwytywania z-stack, zamiast robienia pojedynczego obrazu; Oprogramowanie przechwytuje konfigurowalny stos obrazów Z, aby zapewnić, że co najmniej jeden obraz pozostaje ostry. Chociaż ten system jest bardziej przystosowany do akwizycji wielu obrazów (wiele komórek na jednym slajdzie), nadal sprawia, że znajdowanie chromosomów na slajdzie jest znacznie łatwiejsze niż ręczne poruszanie się po slajdzie.

Zarówno zautomatyzowany system barwienia szkiełek, jak i system skanowania są rutynowo stosowane w diagnostyce FISH nieprawidłowości chromosomowych w komórkach ludzkich przez kliniki cytogenetyczne. W tym badaniu opracowaliśmy protokół, który wykorzystuje te zautomatyzowane systemy do podstawowej aplikacji badawczej. Zautomatyzowany protokół mapowania fizycznego o wysokiej przepustowości może ułatwić szybkie opracowanie map chromosomów fizycznych dla dowolnego gatunku będącego przedmiotem zainteresowania. Chociaż w tym raporcie użyliśmy chromosomów politenowych do mapowania fizycznego, chromosomy mitotyczne mogą być również wykorzystywane w tych systemach. Korzystne byłoby, aby protokół został dostosowany do chromosomów mitotycznych, ponieważ większość organizmów nie rozwija czytelnych chromosomów politenowych. Jednak chromosomy politenowe, jeśli są dostępne, mogą dostarczyć użytecznych informacji na temat zgodności funkcjonalnych domen genomu ze strukturą chromosomów w najwyższej rozdzielczości. Zasady organizacyjne chromosomów politenowych, takie jak wzory prążków i międzypasm, zostały ostatnio porównane do zasad regularnych chromosomów niepolitenowych (interfazowych)¹⁸. W związku z tym szczegółowe mapowanie fizyczne przeprowadzone na preparatach chromosomowych pod wysokim ciśnieniem może potencjalnie połączyć sekwencje DNA z określonymi strukturami chromosomowymi, takimi jak prążki, prążki, zaciągnięcia, centromery, telomery i heterochromatyna; w ten sposób tworząc zespoły genomu oparte na chromosomach.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Szkiełka nakrywkowe mikroskopowe 22x22 mm	Fisher	12-544-10
Szkiełka nakrywkowe mikroskopowe 18x18 mm	Fisher	12-553-402
Kwas octowy	Metanol Fisher	A491-212
			Kwas
propionowy	Sigma-Aldrich	402907
Narzędzie obrotowe Dremel 200 z wałkiem elastycznym przystawka	Rand		3-calowa wielofunkcyjna mini szlifierka stołowa (z ogranicznikiem prędkości)
Specjalnie zaprojektowana 200 μ l Plastikowe końcówki (plastikowe krawędzie z koralikami) do narzędzia Dremel	Pipetman	F171300	Wytnij i podgrzej tłuszcz końcówki pipet
Powlekane cyną szybkie imadło	Avenger Gold Toolmaker	MTC-200-1	Precyzyjnie szlifowany kwadrat i równolegle do 0,00025
Klucz dynamometryczny	Craftsman	44593
System denaturacji/hybrydyzacji suwaka ThermoBrite	Abbott Molecular	30-144110
Szkiełka barierowe 25 mm	Abbott Molecular	XT108-SL
Szkiełka nakrywkowe 25 mm	Abbott Molecular	XT122-90X
Xmatrx Automatyczny system barwienia szkiełek	Abbott Molecular	08L46-001
MZ6 Leica Leica		VA-OM-E194-354	Można użyć innego mikroskopu stereoskopowego
Olympus CX41 Mikroskop fazowy	Olympus	CX41RF-5	Można użyć mikroskopu innego typu ACCORD
PLUS Zautomatyzowany system skanujący	BioView (USA)	BV-5000-ACCP
10x PBS	Invitrogen	P5493
10% NBF (neutralna buforowana formalina)	Sigma-Aldrich	HT501128
99% formamid	Fisher Scientific	BP227500
Sól sodowa siarczanu dekstranu	Sigma	D8906
20x Bufor SSC	Invitrogen	AM9765
Fosforan sodu	Sigma-Aldrich	S3264
50x roztwór Denhardta	Sigma-Aldrich	D2532
Azydek sodu	Sigma-Aldrich	S2002
1 mM roztwór jodku YOYO-1 (491/509) w DMSO	Invitrogen	Y3601
Odczynnik przeciwblakowy ProLong Gold	Invitrogen	P36930
dATP, dCTP, dGTP, dTTP	Fermentas	R0141, R0151, R0161, R0171
Cy3-dUTP, Cy5-dUTP	GE Healthcare	PA53022, PA55022
BSA	Sigma	A3294
Polimeraza DNA I	Fermentas	EP0041
DNase I	Fermentas	EN0521