Wysokoprzepustowe mapowanie fizyczne chromosomów z wykorzystaniem zautomatyzowanej hybrydyzacji in situ

Podsumowanie

Zespoły genomowe oparte na technologiach masowego równoległego sekwencjonowania DNA są zazwyczaj silnie pofragmentowane. Opracowanie fizycznych map chromosomowych może potencjalnie usprawnić składanie genomów. W niniejszej pracy prezentujemy innowacyjne podejścia do przygotowania chromosomów, fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ oraz obrazowania, które znacząco zwiększają wydajność tworzenia map fizycznych.

Streszczenie

Przewiduje się, że w ciągu najbliższych 5 lat zostaną zrealizowane projekty mające na celu uzyskanie sekwencji całych genomów dla 10 000 gatunków kręgowców¹ oraz 5 000 gatunków owadów i spokrewnionych stawonogów². Przykładowo, sekwencjonowanie genomów 15 gatunków komarów przenoszących malarię jest obecnie przeprowadzane z wykorzystaniem platformy Illumina^3,4. Ta grupa gatunków z rodzaju Anopheles obejmuje zarówno wektory, jak i gatunki niewektorowe malarii. Gdy złożenia genomów staną się dostępne, badacze zyskają wyjątkową możliwość przeprowadzenia analiz porównawczych w celu wnioskowania o zmianach ewolucyjnych istotnych dla zdolności wektorskich. Okazało się jednak trudne wykorzystanie odczytów z sekwencjonowania nowej generacji do generowania wysokiej jakości złożeń genomów de novo⁵. Co więcej, istniejące złożenia genomu dla Anopheles gambiae, mimo że zostały uzyskane metodą Sangera, posiadają luki lub są pofragmentowane^4,6.

Sukces analiz porównawczych genomów będzie ograniczony, jeśli badacze będą operować na licznych kontigach sekwencyjnych, a nie na zestawieniach genomów opartych na chromosomach. Pofragmentowane, niezmapowane sekwencje stwarzają problemy w analizach genomicznych, ponieważ: (i) niezidentyfikowane luki powodują błędną lub niepełną adnotację sekwencji genomicznych; (ii) niezmapowane sekwencje prowadzą do pomylenia genów paralogicznych z genami z różnych haplotypów; oraz (iii) brak przypisania do chromosomów i orientacji kontigów sekwencyjnych uniemożliwia rekonstrukcję filogenezy rearanżacji oraz badanie ewolucji chromosomów. Opracowanie wysokorozdzielczych map fizycznych dla gatunków z nowo zsekwencjonowanymi genomami jest aktualną i kosztowo efektywną inwestycją, która ułatwi adnotację genomu, analizy ewolucyjne oraz resekwencjonowanie pojedynczych genomów z populacji naturalnych^7,8.

W niniejszej pracy przedstawiamy innowacyjne podejścia do przygotowania chromosomów, fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) oraz obrazowania, które ułatwiają szybkie opracowywanie map fizycznych. Na przykładzie An. gambiae wykazujemy, że opracowanie fizycznych map chromosomowych może potencjalnie usprawnić składanie genomów, a tym samym podnieść jakość analiz genomicznych. Po pierwsze, stosujemy metodę wysokociśnieniową do przygotowania preparatów chromosomów politenicznych. Metoda ta, opracowana pierwotnie dla Drosophila⁹, pozwala na wizualizację większej liczby szczegółów na chromosomach niż standardowa technika rozgniatania¹⁰. Po drugie, do wysokoprzepustowego fizycznego mapowania genomu wykorzystuje się w pełni zautomatyzowany system front-end do FISH. Zautomatyzowany system barwienia szkiełek umożliwia jednoczesne przeprowadzanie wielu analiz i drastycznie skraca czas pracy manualnej¹¹. Po trzecie, automatyczny system obrazowania fluorescencyjnego, obejmujący zmotoryzowany stolik do szkiełek, automatycznie skanuje i fotografuje znakowane chromosomy po FISH¹². System ten jest szczególnie użyteczny przy identyfikacji i wizualizacji wielu preparatów chromosomowych na tym samym szkiełku. Dodatkowo proces skanowania pozwala na uzyskanie bardziej jednolitych wyników FISH. Podsumowując, zautomatyzowany protokół wysokoprzepustowego mapowania fizycznego jest bardziej wydajny niż standardowy protokół manualny.

Protokół

1. Przygotowanie politenicznych chromosomów z komórek pielęgnacyjnych jajnika metodą wysokociśnieniową

1. Przeprowadź sekcję samic Anopheles w połowie stanu gravidności 25 godzin po pobraniu krwi pod mikroskopem sekcyjnym i utrwal jajniki w świeżym zmodyfikowanym roztworze Carnoya z metanolem (100% metanol: kwas octowy lodowaty, 3:1). Na tym etapie jajniki znajdują się w III stadium rozwoju według Christophersa, w którym pęcherzyki mają kształt owalny, a przezroczysty obszar z komórkami pielęgnującymi wewnątrz pęcherzyków ma kształt okrągły¹³. Umieść jajniki z około pięciu samic w 500 μl zmodyfikowanego roztworu Carnoya w probówce Eppendorf 1,5 ml i przechowuj w temperaturze pokojowej przez 24 godziny. Przenieś jajniki do temperatury -20 °C w celu długoterminowego przechowywania.
2. Przygotuj zmodyfikowany roztwór Carnoya z etanolem (100% etanol: kwas octowy lodowaty, 3:1) oraz 50% kwas propionowy bezpośrednio przed przygotowaniem preparatów. Umieść jedną parę jajników na bezpyłowym szkiełku w jednej kropli zmodyfikowanego roztworu Carnoya. Podziel jajniki na około 6 sekcji za pomocą igieł sekcyjnych i umieść je w kroplach 50% kwasu propionowego na czystych szkiełkach pod stereomikroskopem MZ6 Leica. Użyj oddzielnego szkiełka dla każdej sekcji.
3. Oddziel pęcherzyki za pomocą igieł i usuń pozostałą tkankę papierem filtracyjnym lub ręcznikiem papierowym pod mikroskopem sekcyjnym. Dodaj nową kroplę 50% kwasu propionowego do pęcherzyków i pozostaw je na 3-5 minut w temperaturze pokojowej. Nałóż szkiełko nakrywkowe na kroplę 50% kwasu propionowego. Pozostaw preparat na około 1 minutę.
4. Owiń szkiełko papierem filtracyjnym i folią. Używając narzędzia rotacyjnego Dremel 200 z przystawką Flex-Shaft i miękką plastikową końcówką ustawioną na 3000-5000 RPM, rozgnieć pęcherzyki, wykonując okrężne ruchy końcówką i lekko naciskając szkiełko nakrywkowe, aby równomiernie rozprowadzić jądra. Ten krok powinien trwać około 1 minuty. Sprawdź jakość rozprzestrzenienia pod mikroskopem fazowym Olympus CX41 z obiektywem 20x.
5. Przygotuj tzw. kanapkę, kładąc dodatkowe szkiełko nakrywkowe obok szkiełka nakrywającego chromosomy, a następnie przykryj je drugim szkiełkiem przedmiotowym. Zmniejsza to ryzyko zmiażdżenia szkiełka w imadle. Owiń szkiełka folią plastikową (dołączaną do pojemników na szkiełka) i papierem filtracyjnym, aby utrzymać konstrukcję i chronić szkiełko przed porysowaniem przez imadło.
6. Wywrzyj nacisk na szkiełka za pomocą imadła mechanicznego. Wystarczający nacisk wynosi 85-120 inch-lbs i jest osiągany przy użyciu klucza dynamometrycznego. Krok ten jest niezbędny do maksymalnego spłaszczenia chromosomów.
7. Usuń drugie szkiełko przedmiotowe oraz dodatkowe szkiełko nakrywkowe. Podgrzej szkiełko z nakrywką chroniącą chromosomy do 55 °C w systemie do denaturacji/hybrydyzacji szkiełek przez 10-15 minut, aby dodatkowo spłaszczyć chromosomy. Zanurz szkiełko w ciekłym azocie na co najmniej 15 sekund, a gdy ustanie bulgotanie, szybko usuń szkiełko nakrywkowe za pomocą żyletki. Natychmiast umieść szkiełka w zimnym 50% etanolu na 5 minut. Odwodnij szkiełka w 70%, 90% i 100% etanolu przez 5 minut w każdym roztworze. Osusz szkiełka na powietrzu.

2. FISH przy użyciu zautomatyzowanego systemu barwienia preparatów

Program został skonfigurowany w automatycznym systemie barwienia preparatów Xmatrx w celu przeprowadzenia następujących etapów, z wyjątkiem znakowania sondy. Szczegółowy protokół znakowania metodą translacji nacięć (nick-translation) opisano w dokumentacji dołączonej do polimerazy DNA firmy Fermentas.

1. Przed przeprowadzeniem FISH należy przygotować sondy fluorescencyjne poprzez znakowanie genomowego DNA z BAC fluorochromem przy użyciu protokołu translacji nacięć (nick-translation). Wymieszać 1 μg DNA, po 0,05 mM nieznakowanych dATP, dCTP i dGTP oraz 0,015 mM dTTP, 1 μl Cy3- lub Cy5-dUTP, 0,05 mg/ml BSA, 5 μl 10x buforu do translacji nacięć, 20 jednostek polimerazy DNA I, 0,0012 jednostek DNazy I i uzupełnić wodą wolną od nukleaz do objętości 25 μl. Stosunek polimerazy DNA I do DNazy I dobiera się empirycznie, aby uzyskać sondy o wielkości od 300 do 500 bp. Mieszaninę inkubować w temperaturze 15 °C przez 1 godzinę.
2. Przełożyć preparaty i odczynniki do zautomatyzowanego systemu barwienia preparatów Xmatrx i uruchomić program w celu wykonania następujących kroków. Nanieść 800 μl 1x PBS na 20 min. Osuszyć preparaty strumieniem powietrza. Przeprowadzić fiksację formaliną, nanosząc 450 μl 4% formaliny w 1x PBS przez 1 min, a następnie przemyć 100% etanolem dwukrotnie przez 1 s i raz przez 2 min. Osuszyć preparaty strumieniem powietrza.
3. Podgrzać preparaty w temperaturze 45 °C przez 2 min, aby uniknąć powstawania pęcherzyków powietrza podczas nakładania sond. Nanieść 20 μl sond DNA, dodać krople oleju mineralnego, aby zapobiec odparowaniu roztworu hybrydyzacyjnego, i nałożyć szkiełko zakrywkowe. Zdenaturować chromosomy i sondy DNA, podgrzewając preparaty w temperaturze 90 °C przez 10 min.
4. W celu hybrydyzacji inkubować preparaty w temperaturze 42 °C przez 14 godzin z nałożonymi szkiełkami zakrywowymi. Roztwór hybrydyzacyjny składa się z 2x SSC, 100 mM fosforanu sodu, 1x roztworu Denhardta, 100 μg/ml azotku sodu i 10% siarczanu dekstranu w formamidzie.
5. W celu przeprowadzenia przemywań stringencyjnych podgrzać preparaty w temperaturze 42 °C przez 2 min, zdjąć szkiełka zakrywowe i przemyć preparaty w 2x SSC przez 1 s (4 razy). Osuszyć preparaty strumieniem powietrza. Nanieść 800 μl 0,4x SSC w temperaturze 42 °C przez 10 min (2 razy). Przemyć preparaty w 2x SSC w temperaturze 25 °C przez 10 min.
6. Przeprowadzić barwienie chromosomów, nanosząc 50 μl 1 μM YOYO-1 w 1x PBS. Dodać krople oleju mineralnego, aby zapobiec odparowaniu roztworu barwiącego, nałożyć szkiełka zakrywowe i inkubować w temperaturze 25 °C przez 10 min. Zdjąć szkiełka zakrywowe i przemyć preparaty w 2x SSC przez 1 s (4 razy). Osuszyć preparaty strumieniem powietrza. Nanieść 15 μl odczynnika antyblaknącego ProLong Gold. Nałożyć szkiełka zakrywowe.

3. Odczyt preparatów za pomocą automatycznego systemu obrazowania fluorescencyjnego

W tej sekcji szczegółowo opisano użytkowanie oprogramowania Duet, które jest standardowym elementem zautomatyzowanego systemu skanowania ACCORD PLUS. Instrukcje rozpoczynają się po włączeniu urządzeń w następującej kolejności: zasilacza Olympus U-RFL-T dla żarówki halogenowej, komputera Dell precision T3500 oraz mikroskopu Olympus BX61 z podłączoną kamerą Olympus U-CMAD3.

1. Aby skonfigurować wstępne skanowanie 10x (10x Pre-Scan), otwórz oprogramowanie Duet w zautomatyzowanym systemie skanowania ACCORD PLUS. Kliknij przycisk „Online”. Wprowadź nowy Case ID i przypisz Slide ID. Kliknij kropkę oznaczoną jako „BF” (opcja jasnego pola). Ustaw wybór skanowania na „10x Prescan”. Wybierz „2500x circle”, „10000x circle” lub „rectangle”. Kliknij „Set&run”, aby uruchomić 10x Pre-Scan.
2. Kliknij przycisk „OK”, aby rozpocząć 10x Pre-Scan. Postępuj zgodnie z instrukcjami, aby odpowiednio dostosować skanowanie. Kliknij „Finish”, aby rozpocząć skanowanie. Przejdź do karty „Main”, aby powrócić do ekranu głównego. Kliknij przycisk „Offline”. Znajdź przypisany Case ID oraz Slide ID i kliknij „Offline Scan”. W czarnym polu w lewym górnym obszarze kliknij strzałkę i wybierz „10x Prescan”. Używając strzałek (< || Δ >, czyli przycisków „wstecz”, „pauza”, „odtwarzaj”, „dalej”), przejrzyj zeskanowane obrazy.
3. Po znalezieniu interesującego obrazu dwukrotnie kliknij na ekranie w środku docelowego obszaru i naciśnij „Snap”. Pozwoli to wyznaczyć obraz do późniejszego przechwycenia. Po wybraniu wszystkich celów kliknij „Classify”. Wybierz „10x Prescan”. Kliknij prawym przyciskiem myszy na obraz, aby przejść do klasyfikacji obrazów. Wybierz „Polytene”.
4. Skonfiguruj wstępne skanowanie 40x w oprogramowaniu Duet. Kliknij „Main”, aby powrócić do menu głównego. Ponownie wybierz „Online”. Wybierz preparat. Zmień „BF” na „FL”. Zmień nazwę zadania na „Revisit-X40-RG”. Zmień sekcję znajdującą się bezpośrednio pod ostatnim ustawieniem na „Revisit-ALL”. Kliknij „Set&Run”. Naciśnij „OK”. Ponownie postępuj zgodnie z instrukcjami, aby skonfigurować automatyzację. Kliknij przycisk „Start matching views”, aby dopasować obrazy 10x i 40x. Kliknij „Finish”, aby rozpocząć skanowanie. Po zakończeniu kliknij „Classify” i przejrzyj obrazy.

4. Reprezentatywne wyniki

Rysunek 1 przedstawia graficznie schemat przygotowania chromosomów pod wysokim ciśnieniem. Krok ten obejmuje proces zgniatania i spłaszczania chromosomów przy użyciu narzędzia Dremel oraz imadła mechanicznego, a także wizualizację chromosomów za pomocą mikroskopu fazowo-kontrastowego. Rysunek 2 ilustruje hybrydyzację fluorescencyjnie znakowanej sondy z docelowym DNA na preparatach chromosomów na szkiełkach przy użyciu automatycznego systemu barwienia szkiełek, wykorzystanie automatycznego mikroskopu skanującego do wizualizacji i mapowania sond po eksperymencie FISH oraz rozmieszczanie i orientowanie rusztowań genomicznych na chromosomach.

Preparaty chromosomów politenicznych komórek pielęgnowych jajnika samic An. gambiae wykonano przy użyciu techniki wysokociśnieniowej. Metoda ta nie uszkadza ani nie zmienia większości struktury chromosomów (Rycina 3). Pozwala ona na spłaszczenie zgiętych chromosomów, a tym samym ujawnia ukryte, cienkie prążki, które nie są widoczne w standardowych preparatach (Rycina 4).

Sondy wykorzystane w tym protokole to genomowe klony DNA BAC pochodzące z biblioteki ND-TAM BAC wygenerowanej z DNA szczepu PEST An. gambiae. DNA genomowe do tej biblioteki zostało wyekstrahowane z nowo wyklutych larw pierwszego stadium obu płci. Rysunek 5 przedstawia wyniki FISH z użyciem klonów BAC hybrydyzowanych z chromosomami politenicznymi An. gambiae. Procedura ta została przeprowadzona przy użyciu zautomatyzowanego systemu barwienia preparatów Xmatrx. Korzystając z cytogenetycznej fotomapy dla An. gambiae¹⁰, dwa klony BAC, 102B24 (GenBank: BH372701, BH372694) oraz BAC 142O19 (GenBank: BH368703, BH368698), zostały zlokalizowane odpowiednio w podregionach 16C i 16D ramienia 2R. Jednakże wyszukiwanie BLAST w zestawieniu AgamP3 szczepu PEST An. gambiae ¹⁴ zidentyfikowało sekwencje homologiczne do 102B24 i 142O19 odpowiednio w podregionach 16B i 17A ramienia 2R (Tabela 1). W związku z tym odpowiedniość między współrzędnymi genomowymi a podregionami cytogenetycznymi może zostać teraz skorygowana zgodnie z naszymi danymi mapowania. Wyszukiwanie BLAST w zestawieniach genomów formy M i formy S An. gambiae wykazało, że dwa klony BAC znajdują się w różnych kontigach, ale w tych samych scaffoldach w obrębie każdej formy (Tabela 1). Zidentyfikowane kontigi można teraz powiązać z konkretnymi lokalizacjami chromosomowymi. Ponadto zidentyfikowane scaffoldy mogą zostać teraz prawidłowo zorientowane w obrębie podregionów cytologicznych 16CD. Co ciekawe, odległości między sekwencjami 102B24 a 142O19 w scaffoldach wynoszą odpowiednio 1 892 981 bp, 1 658 391 bp i 1 688 426 bp w zestawieniach genomów szczepu PEST, formy M i formy S. Ponieważ szczep PEST jest hybrydą form M i S, różnica ta wynika prawdopodobnie z błędnego zestawienia genomu PEST.

BAC (numer akcesyjny)	szczep PEST AgamP3 Współrzędne	forma M kontigi Współrzędne	forma M rusztowania Współrzędne	forma S kontigi Współrzędne	formularz S rusztowania Współrzędne
102B24 (BH372694)	2R:AAAB0100 8844_26 (16B) 43,681,342- 43,681,874	ABKP020247 53.1 32,513- 33,045	EQ090167.1 1,858,377- 1,858,909	ABKQ010123 32.1 4,299- 4,832	EQ099711.1 215,891- 216,424
102B24 (BH372701)	2R:AAAB0100 8844_28 (16B) 43,788,213- 43,788,969	ABKP020247 51.1 24,816- 25,575	EQ090167.1, 1,772,683- 1,773,442	ABKQ010123 35.1 27,782- 28,540	EQ099711.1, 305,514- 306,272
142O19 (BH368698)	2R:AAAB0100 8805_5 (17A) 45,428,580- 45,429,264	ABKP020247 01.1 2,499- 3,185	EQ090167.1 315,806- 316,492	ABKQ010123 76.1 49,242- 49,942	EQ099711.1 1,791,625- 1,792,325
142O19 (BH368703)	2R:AAAB0100 8805_8 (17A) 45,560,099- 45,574,323	ABKP020220 17.1 30,971- 32,469	EQ090167.1 200,518- 202,016	ABKQ010123 79.1 27,760- 28,508	EQ099711.1 1,903,569- 1,904,317

Tabela 1. Wyniki BLAST sekwencji końców BAC w odniesieniu do asemblacji genomu An. gambiae.

Rysunek 1. Schematyczne przedstawienie preparatyki chromosomów metodą wysokiego ciśnienia. Przedstawiono jajniki komara na odpowiednim etapie rozwoju.

Rycina 2. Schemat przedstawiający automatyczną technikę FISH, skanowanie preparatów oraz mapowanie chromosomowe rusztowań genomowych.

Rycina 3. Preparat chromosomu politenicznego 3 An. gambiae uzyskany za pomocą techniki wysokociśnieniowej. 3L i 3R oznaczają odpowiednio lewe i prawe ramię w obrębie telomerów. PH i IH wskazują odpowiednio na heterochromatynę pericentryczną i interkalarnej.

Rycina 4. Porównanie chromosomów politenicznych An. gambiae przygotowanych przy użyciu tradycyjnej (góra) i wysokociśnieniowej (dół) techniki. Obrazy obejmują podziały 29A-30E ramienia 3R (A) oraz 43D-46D ramienia 3L (B).

Rysunek 5. FISH klonów BAC na chromosomach politenicznych An. gambiae. A) Hybrydyzacja 102B24 (sygnał czerwony) z ramieniem 2R. B) Dwukolorowy FISH 102B24 (sygnał czerwony) i 142O19 (sygnał niebieski) odpowiednio do podziałów 16C i 16D rozciągniętego ramienia 2R. Strzałki wskazują sygnały hybrydyzacji klonów BAC znakowanych Cy3 (czerwony) i Cy5 (niebieski). C – region centromeryczny. a/+ oznacza heterozygotę dla inwersji 2La. Chromosomy przeciwbarwiono fluorophorem YOYO-1.

Dyskusja

Kluczowym etapem procedury wysokociśnieniowej jest prawidłowe rozgniecenie komórek pielęgnujących jajnika wyizolowanych w stadium III według Christophersa rozwoju jajnika¹³. Nieprawidłowe rozgniecenie może prowadzić do niewystarczającego rozprzestrzenienia chromosomów, co może powodować problemy podczas próby określenia lokalizacji sond po FISH. Jeśli chromosomy zostaną nadmiernie rozgniecione, mogą ulec pęknięciu lub wydłużeniu do stopnia, w którym wzory prążkowania zostaną utracone. Przygotowanie wielu szkiełek powinno prowadzić do uzyskania powtarzalności podczas rozgniatania preparatów za pomocą narzędzia Dremel, co zwiększy ogólną wydajność przygotowania szkiełek. Technika wysokociśnieniowa została opracowana pierwotnie dla świeżo wyizolowanych gruczołów ślinowych D. melanogaster⁹. Jednak jajniki komarów są rutynowo konserwowane w zmodyfikowanym roztworze utrwalającym Carnoy'a (3 części metanolu : 1 część lodowatego kwasu octowego objętościowo) przed użyciem ich do preparacji chromosomowych. Dlatego zmodyfikowaliśmy istniejący protokół wysokociśnieniowy, aby dostosować go do utrwalonych politenicznych chromosomów komórek pielęgnujących jajnika komara malarycznego An. gambiae. Ponieważ wysokie ciśnienie jest przykładane za pomocą precyzyjnego imadła posiadającego wysoce równoległą powierzchnię roboczą na całej długości szkiełka, przygotowanie rozgniecenia chromosomów zajmuje znacznie mniej czasu niż przy zastosowaniu tradycyjnej techniki opukiwania gumką ołówka.

Inne ważne kroki obejmują wystarczające namoczenie mieszków w 50% kwasie propionowym oraz podgrzanie szkiełka. Oba te etapy są niezbędne, aby pomóc w spłaszczeniu chromosomów. Jeśli zostaną pominięte, chromosomy mogą wydawać się błyszczące po odwodnieniu, co potencjalnie prowadzi do nadmiernego tła, które może zostać pomylone z sygnałem w FISH. Technika zgniatania pod wysokim ciśnieniem sprawdza się również przy użyciu tych samych roztworów podczas przygotowywania preparatów chromosomów mitotycznych. Dodatkowe rozprzestrzenianie i spłaszczanie pomaga w lepszym uwolnieniu chromosomów z jąder komórkowych. Przyłożenie równomiernego nacisku powinno odpowiednio je spłaszczyć, co umożliwi pomiary i potencjalnie lepszą rozdzielczość prążków widocznych po barwieniu. Szczegóły dotyczące izolacji chromosomów mitotycznych z komarów podano w innym opracowaniu¹⁵. Chociaż zwykłe preparaty zgniatane są wystarczające dla wielu celów, w tym dla FISH ¹⁶ i immunostainingu¹⁷, metoda wysokociśnieniowa nie tylko zmniejsza potencjalną zmienność między poszczególnymi szkiełkami, ale także zwiększa ogólną jakość chromosomów, co pozwala na uzyskanie większej szczegółowości podczas mapowania chromosomów. Procedurę tę można również wykorzystać do przygotowania szkiełek z błoną chromosomów politenicznych do mikrodissekcji laserowej.

Ograniczenia metody wysokociśnieniowej obejmują pękanie szkiełek oraz nadmierne rozciągnięcie chromosomów. Możliwe jest pęknięcie szkiełka spowodowane zbyt dużym naciskiem ścisku, jednak stosowanie ciśnień określonych w artykule ogranicza to ryzyko. W przypadku nadmiernego rozciągnięcia chromosomów, zbyt długie stosowanie narzędzia Dremel na szkiełku może doprowadzić do ich nadmiernego rozciągnięcia i utraty rozdzielczości. Można temu zaradzić, stosując narzędzie przez krótki czas, sprawdzając efekt pod mikroskopem i wydłużając czas pracy narzędziem Dremel, jeśli chromosomy nie są wystarczająco rozprzestrzenione.

Tradycyjny protokół FISH obejmuje szereg etapów płukania i inkubacji, które zazwyczaj trwają od 5 do 20 min i wymagają niemal pełnej uwagi badacza przez cały czas trwania eksperymentu. Co więcej, liczba preparatów, które można opracować ręcznie, jest zazwyczaj ograniczona do kilku slajdów w ramach jednego eksperymentu. W przeciwieństwie do tego, zautomatyzowany system barwienia preparatów wykonuje wszystkie kroki (w tym płukanie, inkubację, aplikację sondy, denaturację, hybrydyzację, nakładanie i usuwanie szkiełek zakrywek) automatycznie. Pozwala to badaczowi odzyskać do 6-8 godzin pracy podczas eksperymentu FISH. Ponadto zautomatyzowany system FISH może znacznie zwiększyć przepustowość. Na przykład system Xmatrx jest w stanie przetwarzać jednocześnie do 40 testów na slajdach z pojedynczym preparatem i do 80 testów na slajdach z podwójnym preparatem. Do ograniczeń tego systemu należy fakt, że nie jest on wydajny przy niewielkiej liczbie eksperymentów FISH, ponieważ wymaga przygotowania dużych objętości roztworów. Dodatkowo protokół FISH zaprogramowany w systemie może wymagać modyfikacji i dostosowań dla nowych zastosowań.

System skanowania preparatów jest zautomatyzowaną wersją mikroskopu fluorescencyjnego. Zautomatyzowany ruch stolika oraz prosty panel sterowania mikroskopem oszczędzają czas badacza i sprawiają, że obsługa urządzenia jest niezwykle prosta. Na przykład oprogramowanie w systemie skanowania ACCORD PLUS umożliwia łatwe rejestrowanie wielu kanałów fluorescencji oraz sprawne zarządzanie akwizycją obrazów. Przykładem jest funkcja rejestrowania stosu obrazów w osi z (z-stack) zamiast pojedynczego zdjęcia; oprogramowanie wykonuje konfigurowalny stos obrazów, aby zapewnić, że przynajmniej jedna z nich pozostanie w ostrości. Choć system ten jest przeznaczony przede wszystkim do akwizycji wielu obrazów (duża liczba komórek na jednym preparacie), wciąż znacznie ułatwia on lokalizowanie chromosomów na szkiełku w porównaniu z ręcznym przeszukiwaniem preparatu.

Zarówno zautomatyzowany system barwienia preparatów, jak i system skanujący są rutynowo wykorzystywane przez kliniki cytogenetyczne do diagnostyki FISH w kierunku nieprawidłowości chromosomowych w komórkach ludzkich. W niniejszym badaniu opracowaliśmy protokół, który wykorzystuje te zautomatyzowane systemy w zastosowaniach badawczych. Zautomatyzowany protokół wysokoprzepustowego mapowania fizycznego może ułatwić szybkie opracowanie fizycznych map chromosomów dla dowolnego gatunku. Choć w niniejszym raporcie do mapowania fizycznego wykorzystaliśmy chromosomy politeniczne, systemy te mogą być również stosowane do chromosomów mitotycznych. Dostosowanie protokołu do chromosomów mitotycznych byłoby przydatne, ponieważ większość organizmów nie wytwarza czytelnych chromosomów politenicznych. Jednakże chromosomy politeniczne, gdy są dostępne, mogą dostarczyć cennych informacji na temat odpowiedniości funkcjonalnych domen genomu do struktury chromosomu z najwyższą rozdzielczością. Zasady organizacji chromosomów politenicznych, takie jak wzory prążków i międzyprążków, zostały niedawno przyrównane do organizacji zwykłych chromosomów niepolitenicznych (interfazowych)¹⁸. W związku z tym szczegółowe mapowanie fizyczne przeprowadzone na preparatach chromosomów wysokociśnieniowych ma potencjał do powiązania sekwencji DNA z konkretnymi strukturami chromosomowymi, takimi jak prążki, międzyprążki, pufy, centromery, telomery i heterochromatyna, co pozwala na tworzenie asemblacji genomu w oparciu o chromosomy.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
szkiełka nakrywkowe do mikroskopu 22x22 mm	Fisher	12-544-10
szkiełka nakrywkowe do mikroskopu 18x18 mm	Fisher	12-553-402
Kwas octowy	Fisher	A491-212
Metanol	Fisher	A412-4
Kwas propionowy	Sigma-Aldrich	402907
narzędzie rotacyjne Dremel 200 z przystawką Flex-Shaft	Rand		3" Wielozadaniowa mini szlifierka stołowa (z ogranicznikiem prędkości)
Specjalnie zaprojektowane 200 μplastikowe końcówki (z koralikowymi krawędziami) do narzędzia Dremel	Pipetman	F171300	Odciąć i podgrzać końcówki końcówek pipetujących
Szybki imadło z powłoką cynową	Avenger Gold Toolmaker	MTC-200-1	Precyzyjnie szlifowany kątownik i klocki pomiarowe z dokładnością do 0,00025
Klucz dynamometryczny	Rzemieślnik	44593
System do denaturacji i hybrydyzacji szkiełek ThermoBrite	Abbott Molecular	30-144110
szkiełka z komorką 25 mm	Abbott Molecular	XT108-SL
szkiełka nakrywkowe 25 mm	Abbott Molecular	XT122-90X
Zautomatyzowany system barwienia preparatów Xmatrx	Abbott Molecular	08L46-001
stereomikroskop Leica MZ6	Leica	VA-OM-E194-354	Można użyć innego stereomikroskopu
mikroskop fazowy Olympus CX41	Olympus	CX41RF-5	Można użyć innego mikroskopu fazowego
Zautomatyzowany system skanowania ACCORD PLUS	BioView (USA)	BV-5000-ACCP
10x PBS	Invitrogen	P5493
10% NBF (neutralnie buforowana formalina)	Sigma-Aldrich	HT501128
99% formamid	Fisher Scientific	BP227500
Siarczan dekstranu sodowy	Sigma	D8906
bufor 20x SSC	Invitrogen	AM9765
Fosforan sodu	Sigma-Aldrich	S3264
50-krotny roztwór Denhardta	Sigma-Aldrich	D2532
Azotek sodu	Sigma-Aldrich	S2002
roztwór 1 mM jodku YOYO-1 (491/509) w DMSO	Invitrogen	Y3601
odczyn antyblaknący ProLong Gold	Invitrogen	P36930
dATP, dCTP, dGTP, dTTP	Fermentas	R0141, R0151, R0161, R0171
Cy3-dUTP, Cy5-dUTP	GE Healthcare	PA53022, PA55022
BSA	Sigma	A3294
Polimeraza DNA I	Fermentas	EP0041
DNaza I	Fermentas	EN0521