W niniejszym protokole opisujemy produkcję, oczyszczanie i miareczkowanie wektorów lentiwirusowych. Przedstawiamy przykład dostarczania genów za pomocą wektora lentiwirusowego do pierwotnych hodowli neuronów i astrocytów. Nasze metody mogą mieć zastosowanie również do innych typów komórek in vitro oraz in vivo.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Produkcja wektorów lentiwirusem do transdukcji komórek ośrodkowego układu nerwowego
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Efektywne dostarczanie genów do ośrodkowego układu nerwowego (OUN) jest istotne w badaniu funkcji genów, modelowaniu chorób neurologicznych i opracowywaniu podejść terapeutycznych. Wektory lentiwirusowe są atrakcyjnymi narzędziami w transdukcji neuronów i innych typów komórek OUN, ponieważ transdukują zarówno komórki dzielące się, jak i niedzielące się, zapewniają trwałą ekspresję transgenów oraz charakteryzują się stosunkowo dużą pojemnością pakowania i niską toksycznością 1-3. Wektory lentiwirusowe zostały z powodzeniem zastosowane w transdukcji wielu typów komórek nerwowych in vitro 4-6 oraz u zwierząt 7-10.
Podjęto ogromne wysiłki w celu opracowania wektorów lentiwiralnych o poprawionym bezpieczeństwie biologicznym i wydajności dostarczania genów. Obecne wektory lentiwiralne trzeciej generacji, wadliwe replikacyjnie i samoinaktywujące się (SIN), przedstawiono na Rysunku 1. Elementy niezbędne do pakowania wektora są rozdzielone na cztery plazmidy. W transferowym plazmidzie lentiwiralnym region U3 w 5' długim powtórzeniu końcowym (LTR) został zastąpiony silnym promotorem z innego wirusa. Modyfikacja ta umożliwia transkrypcję sekwencji wektora niezależnie od białka HIV-1 Tat, które jest normalnie wymagane do ekspresji genów HIV 11. Sygnał pakowania (Ψ) jest niezbędny do enkapsydacji, a element responsywny dla Rev (RRE) jest wymagany do produkcji wektorów o wysokim mianie. Centralny trakt polipurynowy (cPPT) jest ważny dla importu jądrowego DNA wektora, co jest cechą niezbędną do transdukcji komórek niedzielących się 12. W 3' LTR sekwencje cis-regulacyjne zostały całkowicie usunięte z regionu U3. Delecja ta jest kopiowana do 5' LTR po odwrotnej transkrypcji, co prowadzi do inaktywacji transkrypcyjnej obu LTR. Plazmid pMDLg/pRRE zawiera geny HIV-1 gag/pol, które kodują białka strukturalne i odwrotną transkryptazę. pRSV-Rev koduje białko Rev, które wiąże się z RRE w celu wydajnego eksportu RNA z jądra. pCMV-G koduje glikoproteinę wirusa zapalenia jamy ustnej (VSV-G), która zastępuje białko Env HIV-1. VSV-G rozszerza tropizm wektorów i umożliwia ich zagęszczanie poprzez ultrawirowanie 13. Wszystkie geny kodujące białka akcesoryjne, w tym Vif, Vpr, Vpu i Nef, zostały wykluczone z systemu pakowania. Produkcja i manipulowanie wektorami lentiwiralnymi powinny być przeprowadzane zgodnie z wytycznymi NIH dotyczącymi badań z wykorzystaniem rekombinowanego DNA (http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf). Przed użyciem wektorów lentiwiralnych może być wymagana zgoda odpowiedniej Instytucjonalnej Komisji Bezpieczeństwa Biologicznego i Chemicznego. Wektory lentiwiralne są powszechnie produkowane poprzez kotransfekcję komórek 293T transferowym plazmidem lentiwiralnym oraz plazmidami pomocniczymi kodującymi białka niezbędne do pakowania wektora. Wiele transferowych plazmidów lentiwiralnych i plazmidów pomocniczych można pozyskać z Addgene, non-profitowego repozytorium plazmidów (http://www.addgene.org/). Opracowano niektóre stabilne linie komórkowe do pakowania, ale systemy te zapewniają mniejszą elastyczność, a ich wydajność pakowania zazwyczaj spada z czasem 14, 15. Komercyjnie dostępne zestawy do transfekcji mogą zapewniać wysoką wydajność transfekcji 16, ale mogą być bardzo kosztowne przy wielkoskalowych preparacjach wektorów. Metody wytrącania fosforanem wapnia zapewniają wysoką wydajność transfekcji komórek 293T, stanowiąc tym samym niezawodne i kosztowo efektywne podejście do produkcji wektorów lentiwiralnych.
W niniejszym protokole wytwarzamy wektory lentiwirusowe poprzez kotransfekcję komórek 293T czterema plazmidami w oparciu o zasadę wytrącania fosforanu wapnia, a następnie oczyszczamy i zagęszczamy je za pomocą ultrawirowania przez 20% poduszkę sacharozy. Miana wektorów są określane za pomocą analizy FACS (sortowania komórek aktywowanego fluorescencją) lub za pomocą qPCR w czasie rzeczywistym. Produkcja i miareczkowanie wektorów lentiwirusowych w tym protokole mogą zostać ukończone w ciągu 9 dni. Przedstawiamy przykład transdukcji tych wektorów do kultur nowokory neokortykalnej myszy zawierających zarówno neurony, jak i astrocyty. Wykazujemy, że wektory lentiwirusowe zapewniają wysoką wydajność transdukcji oraz specyficzną dla typu komórek ekspresję genów w pierwotnych kulturach komórek z OUN.
Protokół
1. Pakowanie wektorów lentiwirusowych
Wektory lentiwirusowe są wytwarzane poprzez kotransfekcję lentiwirusowego wektora transferowego oraz innych plazmidów niezbędnych do pakowania do komórek 293T metodą transfekcji fosforanem wapnia. W niniejszym protokole wykorzystujemy 10 szalek hodowlanych o średnicy 100 mm. Skalę procesu można zwiększyć lub zmniejszyć w zależności od zastosowania. Linia komórkowa 293T jest utrzymywana w pożywce DMEM (Dulbecco's modified Eagles medium) z wysoką zawartością glukozy (4500 mg/L), uzupełnionej o 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 100 jednostek/ml penicyliny oraz 100 μg/ml streptomycyny, w inkubatorze w tem....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W niniejszym protokole przedstawiliśmy produkcję wektorów lentiwirusowych oraz zastosowanie tych wektorów w kulturach nowokory). Wykazaliśmy efektywną i specyficzną dla typu komórek transdukcję za pomocą wektorów otrzymanych tymi metodami. Przy zastosowaniu promotora synapsyny ekspresja GFP jest ściśle specyficzna dla neuronów. Przy zastosowaniu promotora GFAP ekspresja GFP występuje wyłącznie w astrocytach. Jeśli nie jest wymagana ekspresja specyficzna dla typu komórek, można zastosować promotor powszechny. Stwierdziliś.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Praca ta była wspierana przez grant NIH Neuroscience Blueprint Core (P30 NS057105, BJS) przyznany Washington University, grant Program Project Grant NS032636 (BJS) oraz przez Hope Center for Neurological Disorders.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| MEM | Invitrogen | 11090-081 | |
| Płodowa surowica bydlęca | Hyclone | SV3001403 | |
| PBS | Mediatech, Inc. | 21-040-CM | |
| Trypsyna-EDTA | Sigma-Aldrich | T3924 | |
| Maślan sodu | Sigma-Aldrich | B5887 | |
| Bromek heksadymetryny (Polybrene) | Sigma-Aldrich | H9268 | |
| Komórki 293T | ATCC | CRL-11268 | |
| Komórki HT1080 | ATCC | CCL-121 | |
| Szalka do hodowli tkankowej Falcon 100 x 20 mm | BD Biosciences | 353003 | |
| Probówka do wirowania z polialom–eru 1 x 3 ½ cala | Beckman Coulter Inc. | 326823 | |
| Filtr strzykawkowy 0,2 µm | Corning | 431219 | |
| Zestaw QIAamp DNA Mini Kit | Qiagen | 51304 |
Bibliografia
- Naldini, L. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272, 263-267 (1996).
- Zufferey, R. Self-inactivating lentivirus vector for safe and efficient in vivo gene delivery. J. Virol.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
