Półilościowe podejście do oceny tworzenia biofilmu z wykorzystaniem rozwoju pomarszczonych kolonii

Podsumowanie

Przedstawiamy prostą, półilościową metodę badania tworzenia się biofilmu in vitro. Metoda ta wykorzystuje stereomikroskop Zeiss stemi 2000-C (z dołączoną kamerą) do monitorowania czasu oraz wzorca tworzenia się biofilmu, ocenianego na podstawie rozwoju pomarszczonych kolonii.

Streszczenie

Biofilmy, czyli przytwierdzone do powierzchni społeczności komórek zamknięte w macierzy zewnątrzkomórkowej, stanowią powszechny sposób bytowania wielu bakterii. W obrębie biofilmu komórki bakteryjne często wykazują zmienioną fizjologię, w tym zwiększoną oporność na antybiotyki i inne stresy środowiskowe ¹. Ponadto biofilmy mogą odgrywać istotną rolę w interakcjach między gospodarzem a mikroorganizmami. Biofilmy powstają, gdy bakterie przechodzą ze stanu pojedynczych komórek planktonicznych do formowania złożonych, wielokomórkowych społeczności ². W warunkach laboratoryjnych biofilmy bada się poprzez ocenę rozwoju specyficznych fenotypów biofilmowych. Typowym fenotypem biofilmowym jest tworzenie pomarszczonych lub rugoznych kolonii bakteryjnych na stałych pożywkach agarowych ³. Tworzenie pomarszczonych kolonii stanowi szczególnie prosty i użyteczny sposób identyfikacji i charakteryzacji szczepów bakteryjnych wykazujących zmienione fenotypy biofilmowe oraz badania warunków środowiskowych wpływających na tworzenie biofilmu. Tworzenie pomarszczonych kolonii służy jako wskaźnik formowania biofilmu u wielu rodzajów bakterii, w tym zarówno bakterii Gram-dodatnich, takich jak Bacillus subtilis ⁴, jak i bakterii Gram-ujemnych, takich jak Vibrio cholerae ⁵, Vibrio parahaemolyticus ⁶, Pseudomonas aeruginosa ⁷ oraz Vibrio fischeri ⁸.

Morska bakteria V. fischeri stała się modelem tworzenia biofilmu ze względu na krytyczną rolę biofilmów podczas kolonizacji gospodarza: biofilmy produkowane przez V. fischeri wspomagają kolonizację mątwy hawajskiej Euprymna scolopes ^8-10. Co istotne, fenotypy biofilmu obserwowane in vitro korelują ze zdolnością komórek V. fischeri do efektywnej kolonizacji zwierząt gospodarzy: szczepy z upośledzonym tworzeniem biofilmu in vitro wykazują defekt kolonizacji ^9,11, natomiast szczepy wykazujące zwiększone fenotypy biofilmu charakteryzują się wzmocnioną kolonizacją ^8,12. V. fischeri stanowi zatem prosty system modelowy do oceny mechanizmów, za pomocą których bakterie regulują tworzenie biofilmu oraz tego, jak biofilmy wpływają na kolonizację gospodarza.

W niniejszym raporcie opisujemy półilościową metodę oceny tworzenia biofilmu z wykorzystaniem V. fischeri jako systemu modelowego. Metoda ta polega na precyzyjnym naniesieniu kropel kultur bakteryjnych o określonych stężeniach i objętościach na stałe podłoża agarowe; naniesiona w ten sposób kultura jest analogiczna do pojedynczej kolonii bakteryjnej. Technika „naniesionych kropel” może być wykorzystana do porównania ogólnych fenotypów biofilmu w pojedynczych, określonych punktach czasowych (analizy końcowe) lub do identyfikacji i charakterystyki subtelnych fenotypów biofilmu poprzez analizy przebiegu czasowego rozwoju biofilmu oraz pomiary średnicy kolonii, na którą wpływa proces tworzenia biofilmu. Tym samym technika ta umożliwia półilościową analizę tworzenia biofilmu, pozwalając na ocenę czasu i wzorca rozwoju pomarszczonych kolonii oraz względnej wielkości rozwijającej się struktury, co stanowi charakterystykę wykraczającą poza prostą morfologię ogólną.

Protokół

1. Wstępna charakterystyka i uwagi

1. Tworzenie biofilmu jest zazwyczaj zależne od gęstości komórek i szybkości wzrostu. Dlatego konieczne jest określenie szybkości wzrostu (wzrostu gęstości optycznej (OD) w czasie) oraz wydajności (końcowej liczby komórek) badanych szczepów poprzez przeprowadzenie prostych testów krzywej wzrostu i wysiewu komórek na płytki. Zaburzenia wzrostu lub brak korelacji między OD a liczbą komórek muszą być uwzględnione podczas interpretacji wyników eksperymentów z nanoszeniem kropel (spotting).
2. Podczas oceny tworzenia zmarszczonych kolonii na tej samej płytce należy uwzględnić odpowiednie kontrole pozytywne i negatywne, ponieważ niewielkie różnice między płytkami mogą wpływać na rozwój biofilmu.
3. Należy zidentyfikować optymalne warunki do nanoszenia kropel, czyli takie, które wykazują najbardziej wyraźne różnice między kontrolą a badanym mutantem lub mutantami. Przed nanoszeniem kropel szczepy należy hodować w kulturze płynnej w różnych warunkach, np. na różnych pożywkach lub w różnych temperaturach, oraz do różnych faz wzrostu (faza wykładnicza lub stacjonarna). Należy nanieść 10 μl kultury o różnych gęstościach komórkowych na odpowiednie pożywki i inkubować w pożądanej temperaturze do momentu pojawienia się morfologii kolonii.
4. Analiza punktu końcowego polega na ocenie tworzenia zmarszczonych kolonii w określonym punkcie czasowym po naniesieniu kropel (np. po 48 godzinach). Taka ocena jest przydatna w przypadku szczepów wykazujących (lub których zakłada się, że wykazują) poważne defekty w tworzeniu biofilmu.
5. Analiza przebiegu czasowego ocenia tworzenie zmarszczonych kolonii w określonych odstępach czasu (np. co godzinę) po naniesieniu kropel. Analiza ta umożliwia półilościową ocenę tworzenia biofilmu poprzez wyznaczenie momentu rozpoczęcia tworzenia zmarszczonych kolonii oraz rozwoju wzoru w czasie. Czas trwania eksperymentu i liczba punktów pomiarowych dla danego przebiegu czasowego powinny zostać określone w badaniach wstępnych.
6. Aby łatwo kontrolować czas po naniesieniu kropel, należy ustawić stoper w trybie licznika wznoszącego.

2. Mikroskopowa ocena pomarszczonej morfologii kolonii V. fischeri

1. Zaszczep komórki V. fischeri do 5 ml pożywki LB-Salt (LBS) ¹³ (1% [w/v] tryptony, 0,5% [w/v] ekstraktu drożdżowego, 2% [w/v] chlorku sodu, 50 mM Tris-HCl [pH 7,5]) zawierającej niezbędne antybiotyki i inkubuj z wytrząsaniem przez noc w temperaturze 28 °C. Rano wykonaj pasaż komórek w rozcieńczeniu 1:100 do 5 ml świeżej pożywki LBS i inkubuj w tych samych warunkach, aż komórki osiągną pożądaną wartość OD₆₀₀ (np. OD₆₀₀=0,2 lub 0,5).
2. Pipetuj 1 ml hodowli do probówki do mikrowirówki i wiruj w mikrowirówce z maksymalną prędkością przez jedną minutę. Usuń nadsącz poprzez aspirację. Przemyj komórki, aby usunąć pozostałości pożywki i komponenty zewnątrzkomórkowe, resuspendując osad w 1 ml sterylnej 70% sztucznej wody morskiej (ASW) (35 mM MgSO₄-7H₂O, 7 mM CaCl₂-2H₂O, 210 mM NaCl, 7 mM KCl) i powtarzając wirowanie. Resuspenduj przemyty osad w 1 ml 70% ASW.
3. Upewnij się, że każda próbka zawiera taką samą liczbę komórek, oszacowaną na podstawie OD przy 600 nm. Wprowadź niezbędne korekty, rozcieńczając bardziej stężone próbki dodatkową ilością 70% ASW. W eksperymentach wstępnych nanieś kropkowo hodowle o różnych początkowych wartościach OD, aby wyznaczyć optymalną wartość OD startową dla danego zestawu szczepów lub warunków. Najlepsze wyniki dla V. fischeri uzyskuje się, gdy kropki są generowane z hodowli o OD około 0,2.
4. Nanieś kropkowo 10 μl przemytych komórek na płytki LBS zawierające niezbędne antybiotyki. Podczas nanoszenia hodowli na płytkę upewnij się, że pipeta jest stabilna (przytrzymaj ją palcem) tuż nad powierzchnią agaru. Nanosić pionowo, nie pod kątem, i wypuszczaj ciecz powoli, aby uzyskać jednorodne rozłożenie kropki. Zazwyczaj każdy szczep jest nanoszony raz na płytkę (do 6 kropek na płytkę), przy użyciu wielu płytek (2-3) na eksperyment.
5. Aby upewnić się, że naniesiona hodowla pozostaje równomiernie rozłożona, pozwól kropce wyschnąć przed przeniesieniem płytki do inkubatora. Odwróć płytki i inkubuj je w temperaturze 28 °C.
6. Monitoruj morfologię rosnącej kropki co godzinę, zaczynając od 12-15 godzin po inokulacji. Do obserwacji i dokumentacji morfologii kolonii oraz oceny początku i postępu tworzenia się pomarszczonych kolonii używamy stereomikroskopu (Zeiss stemi 2000-C) z przystawką kamerową (ProgRES C10^PLUS) oraz programów komputerowych ProgRes CapturePro i ImageJ.
7. W przypadku konfiguracji opisanej w kroku 2.5 kropki są oświetlane od dołu przez przezroczysty szklany stolik za pomocą zimnego źródła światła CL 1500 EC, natomiast obrazy są rejestrowane z góry. Taka konfiguracja jest optymalna do obrazowania rozwoju pomarszczonych kolonii, ponieważ kolonie (kropki) V. fischeri są półprzezroczyste.
8. W przypadku braku specjalistycznego sprzętu wymienionego w kroku 2.5 monitoruj morfologię pomarszczonych kolonii za pomocą dowolnego stereomikroskopu, który pozwala na pełny podgląd kolonii i posiada regulowane źródło światła oraz, idealnie, dołączoną kamerę. W razie potrzeby można również wykorzystać aparat cyfrowy w przypadku braku dołączonej kamery, ale nie jest to rozwiązanie optymalne.
9. Aby najlepiej zwizualizować rozwój pomarszczonych kolonii, konieczne jest dostosowanie zarówno natężenia oświetlenia, jak i kąta odbicia pod koloniami bakteryjnymi w taki sposób, aby można było rozpoznać trójwymiarową morfologię rozwijających się biofilmów. Wyznacz optymalne warunki oświetlenia, które zapewnią najsilniejszy kontrast między naniesioną kolonią a otaczającym tłem agaru, tak aby architektura (zmarszczki) kolonii była wyraźnie rozróżnialna.
10. W niektórych przypadkach należy wziąć pod uwagę również kolor naniesionej kolonii, ponieważ podczas tworzenia biofilmu mogą wystąpić zmiany w kolorze kolonii. Dostosuj natężenie i kąt źródła światła, aby ujawnić te subtelne zmiany w barwie. Po uzyskaniu odpowiednich ustawień zachowaj je przez cały czas trwania eksperymentu.
11. Zanotuj, ile czasu upływa od momentu inokulacji do chwili, w której rozpoczyna się tworzenie pomarszczonej kolonii dla każdego szczepu lub warunku. Zdefiniuj początek tworzenia pomarszczonej kolonii jako punkt czasowy, w którym po raz pierwszy widoczne jest tworzenie się wzorów i struktur 3D (tzn. prążkowania formujące się na zewnętrznej krawędzi lub „zmarszczki” występujące w centrum). Komórki mutantów mogą wykazywać skrócony lub wydłużony czas do rozpoczęcia tworzenia pomarszczonej kolonii (np. Rys. 2).
12. Dokumentuj początek i rozwój tworzenia pomarszczonej kolonii poprzez rejestrowanie odpowiednich obrazów cyfrowych. Ważne jest stosowanie tego samego powiększenia podczas zbierania obrazów w trakcie całego eksperymentu. Przełącz widok z okularu mikroskopu na ekran komputera za pomocą dźwigni znajdującej się z tyłu kamery. Podczas przełączania między widokiem przez okular a ekranem komputera odpowiednio dostosuj widok i ostrość.
13. Przed obrazowaniem naniesionych hodowli zazwyczaj zdejmuje się pokrywkę płytki Petri, aby uzyskać najczystszy obraz. Jest to jednak krok opcjonalny, ponieważ hodowle można obrazować przez pokrywkę, korzystając z konfiguracji opisanej w krokach 2.5 i 2.6.
14. W każdym punkcie czasowym po rozpoczęciu tworzenia pomarszczonej kolonii zanotuj wzór rozwoju pomarszczonej kolonii. Architektura może rozwijać się od środka na zewnątrz lub od zewnątrz do środka. Ocena ta pozwala odróżnić biofilmy tworzone przez różne szczepy lub w różnych warunkach.
15. Mierz średnicę rozwijającej się kolonii w każdym punkcie czasowym. Można to zrobić ręcznie lub cyfrowo za pomocą powiązanego programu komputerowego. W przypadku pomiaru cyfrowego użyj programu ProgRes CapturePro i najpierw skalibruj pasek skali do konkretnego powiększenia zastosowanego w eksperymencie. Dołącz pasek skali do każdego zarejestrowanego obrazu.
16. Aby obliczyć średnicę kolonii za pomocą programu ImageJ, otwórz każdy plik obrazu. Zestandaryzuj pasek skali w następujący sposób: Wybierz opcję „Straight line” z paska narzędzi. Nałóż linię prostą o tej samej długości i szerokości na dołączony pasek skali. Wybierz „Set Scale” z karty oznaczonej jako „Analyze”. W polu „known distance” wpisz odpowiednią długość (wyznaczoną z oryginalnego paska skali; np. 2 mm) i wybierz „OK”.
17. Użyj opcji „Straight line”, aby wstawić linię poziomą przez kropkę. W karcie Analyze wybierz „Measure”. W nowym oknie wyników (Results) pojawi się obliczona długość. Wykonaj drugi pomiar, wstawiając linię prostopadłą przez kropkę. Ponownie oblicz średnicę. Zapisz średnią z dwóch pomiarów. Przedstaw średnią średnicę dla każdej kropki w każdym punkcie czasowym na wykresie, korzystając z programu takiego jak Excel.
18. Eksperyment kończy się w określonym punkcie czasowym lub gdy nie następuje już dalszy rozwój biofilmu. Po zakończeniu połącz obrazy w jedną lub kilka rycin, aby zwizualizować rozwój wzoru w czasie, korzystając z programu takiego jak Powerpoint.

3. Reprezentatywne wyniki

W niniejszych eksperymentach wykorzystaliśmy V. fischeri jako organizm modelowy do badania tworzenia biofilmu poprzez ocenę rozwoju pomarszczonych kolonii na stałej powierzchni agarowej. Szczepy V. fischeri wytwarzające biofilm tworzą kolonie o rozbudowanej architekturze 3D w ciągu 40 h (Ryc. 1) ^8,9,14. Analiza w czasie pokazuje, że formowanie pomarszczonych kolonii przez szczep kontrolny rozpoczyna się już około 12 h po inokulacji (w zależności od konkretnych warunków) (Ryc. 2) ⁹. W przeciwieństwie do tego, tworzenie biofilmu przez reprezentatywny mutant jest opóźnione o około 4 h i nie rozpoczyna się aż do około 16 h po inokulacji ⁹. Powtórzenia tych eksperymentów sugerowały, że czas ten był stosunkowo spójny, co czyni tę ocenę półilościową ⁹. Druga półilościowa miara tworzenia biofilmu wykorzystuje zmianę średnicy rozwijającej się kolonii w czasie. Jak pokazano na Ryc. 3A, reprezentatywny szczep zdolny do tworzenia biofilmu formuje kolonie, których złożoność i średnica zwiększają się w porównaniu do reprezentatywnego szczepu, który nie tworzy biofilmu. Dokładne pomiary średnic kolonii utworzonych przez te dwa szczepy w czasie wykazały, że rozmiar kolonii zdolnych do tworzenia biofilmu zwiększał się w szybszym tempie niż w przypadku kolonii niezdolnych do tworzenia biofilmu, a w końcowym punkcie czasowym różnica między nimi była niemal dwukrotna (Ryc 3B). Zatem, choć w literaturze często przedstawiane są obrazy reprezentatywnej morfologii kolonii w późnym punkcie czasowym lub "punkcie końcowym", można zebrać dodatkowe dane półilościowe, które pozwolą na lepsze zrozumienie defektu biofilmu.

Rycina 1. Analiza punktu końcowego. Rycina ta przedstawia przykład analizy punktu końcowego z wykorzystaniem reprezentatywnych szczepów V. fischeri nietworzących biofilmu (lewa strona) i tworzących biofilm (prawa strona). Obrazy te zostały wykonane 40 h po naniesieniu kropli. Obrazy zostały wygenerowane z wykorzystaniem szczepów typu dzikiego V. fischeri zawierających kontrolny wektor (nietworzące biofilmu) lub plazmid nadekspresyjny rscS (tworzące biofilm) i stanowiły część zestawu danych zebranych dla Morris et al., 2011.

Rycina 2. Analiza przebiegu czasowego. Górny panel zawiera reprezentatywne obrazy tworzenia biofilmu przez szczep kontrolny V. fischeri zdolny do tworzenia biofilmu w wybranym przebiegu czasowym. Rozpoczęcie tworzenia biofilmu jest widoczne w 12 h. Dolny panel zawiera reprezentatywne obrazy szczepu mutanta V. fischeri, który wykazuje opóźnienie (4 h) w rozpoczęciu tworzenia pomarszczonych kolonii w czasie, przy czym tworzenie biofilmu rozpoczyna się w 16 h po inokulacji. Należy zauważyć, że w 40 godzinie szczepy wyglądają podobnie pod względem intensywności i wzorca tworzenia biofilmu, podczas gdy subtelne różnice między tymi szczepami są obserwowane jedynie we wcześniejszych punktach czasowych. Obrazy te zostały wygenerowane z komórek V. fischeri typu dzikiego z nadekspresją rscS oraz mutantów sypE i stanowiły część zestawu danych zebranych dla Morris et al., 2011.

Rysunek 3. Średnica kolonii jako półilościowa analiza tworzenia biofilmu. (A) Przebieg czasowy tworzenia biofilmu przez reprezentatywne szczepy V. fischeri tworzące biofilm (panel górny) i nietworzące biofilmu (panel dolny). Zauważalny jest większy przyrost średnicy w czasie w przypadku szczepu tworzącego biofilm w porównaniu do szczepu nietworzącego biofilmu. Obrazy te uzyskano z dzikiego typu V. fischeri zawierającego plazmid nadekspresujący rscS (tworzący biofilm) lub kontrolny wektor (nietworzący biofilmu) i stanowiły one część zestawu danych zebranych dla Morris et al., 2011. (B) Przedstawienie graficzne przyrostu średnicy kolonii w czasie dla dwóch szczepów z panelu A. Dane te wygenerowano przy użyciu oprogramowania ImageJ i Excel zgodnie z opisem w protokole.

Dyskusja

W niniejszej pracy opisujemy półilościową metodę oceny tworzenia biofilmu z wykorzystaniem V. fischeri jako organizmu modelowego. W szczególności wykorzystujemy stereomikroskop z dołączoną kamerą do monitorowania tworzenia i rozwoju biofilmu w postaci formowania się pomarszczonych kolonii w czasie na stałej powierzchni agarowej. W niniejszym protokole przedstawiamy dwa konkretne rodzaje metod, których powszechnie używamy do oceny formowania się pomarszczonych kolonii. Pierwszą z nich jest test końcowy (end-point assay), który pozwala na obserwację ostatecznej, ogólnej architektury 3D, wzorowania i średnicy naniesionej kultury w wybranym „końcowym” punkcie czasowym. Podejście to jest najbardziej użyteczne przy ocenie szczepów mutantów lub warunków prowadzących do drastycznych defektów w tworzeniu biofilmu. Jednak metoda ta nie pozwala na rozróżnienie bardziej subtelnych różnic występujących w punktach czasowych poprzedzających wybrany punkt końcowy. Aby dokładniej monitorować formowanie się pomarszczonych kolonii, stosujemy analizę przebiegu czasowego (time course assay), która pozwala zidentyfikować moment rozpoczęcia tworzenia pomarszczonej kolonii i obserwować jej rozwój w czasie. Dzięki temu podejściu można zidentyfikować subtelniejsze różnice w czasie formowania się pomarszczonych kolonii, ich architekturze 3D oraz wzorowaniu. Wykorzystaliśmy tę analizę przebiegu czasowego do opracowania dwóch półilościowych testów tworzenia biofilmu. Po pierwsze, czas, w którym szczep zaczyna rozwijać architekturę 3D, można porównać z czasem dla szczepów kontrolnych. Stwierdziliśmy, że opóźnienie w tworzeniu biofilmu u konkretnego mutanta w tych samych warunkach jest dość spójne ⁹. Na przykład w danych przedstawionych na Rys. 2 mutant konsekwentnie wykazywał około 4 h opóźnienia w inicjowaniu tworzenia biofilmu. Drugą półilościową miarą tworzenia biofilmu jest zmiana średnicy pomarszczonej kolonii (plamki). Zaobserwowaliśmy, że średnica pomarszczonych kolonii stopniowo różni się od średnicy kolonii nietworzących biofilmu, osiągając około 2-krotną różnicę w końcowym punkcie czasowym (Rys. 3) (Morris i Visick, dane niepublikowane). Do tej pory nie zaobserwowaliśmy jednego fenotypu bez drugiego (tzn. tworzenia biofilmu bez zwiększenia średnicy kolonii) (dane niepublikowane), choć nadal możliwe jest, że niektóre mutanty będą zachowywać się inaczej. Rzeczywiście, w przypadku V. cholerae zgłaszano, że niektóre pomarszczone kolonie prowadzą do znacznego zwiększenia średnicy kolonii, podczas gdy inne nie ¹⁵. Mimo to, ocena zmiany średnicy w czasie mogłaby pomóc w charakterystyce potencjalnych mutantów biofilmu i/lub dostarczyć dodatkowej miary ilościowej dla mutantów z opóźnieniem w rozwoju. Z dwóch miar tworzenia biofilmu (czas i średnica), wyznaczenie momentu rozpoczęcia formowania się pomarszczonej kolonii jest bardziej czułe, ale także bardziej subiektywne niż wyznaczenie średnicy plamki. Niemniej jednak obie miary zapewniają półilościową ocenę fenotypu, który jest niezwykle użyteczny dla badaczy biofilmu, ale nie poddaje się łatwej kwantyfikacji.

Podczas przeprowadzania testów z nakropieniem kultur ważne jest uwzględnienie warunków środowiskowych, w których hodowane są nakropione szczepy. Tworzenie pomarszczonych kolonii jest często zależne od różnych czynników środowiskowych, w tym dostępności składników odżywczych, temperatury i wilgotności. Aby zmniejszyć zmienność między eksperymentami, pomocne jest maksymalne ustandaryzowanie tych warunków (np. standaryzacja objętości pożywki na płytkach agarowych i hodowanie nakropionych szczepów w kontrolowanej temperaturze). W celu dalszego ograniczenia zmienności między eksperymentami z nakropieniem, ważne jest uwzględnienie odpowiednich szczepów kontrolnych w każdym zestawie badań. Wreszcie, przy interpretacji danych z tych testów, konieczne jest powtórzenie każdego eksperymentu wielokrotnie (3+), zwłaszcza przy ocenie subtelnych różnic w tworzeniu pomarszczonych kolonii (np. opóźnienia w tworzeniu biofilmu lub różnic w jego wzorze). Niektóre ograniczenia tego protokołu to: 1) trudność w określeniu, czy komórki mają defekt wzrostu: wzrost komórek w kulturze płynnej może nie odzwierciedlać dokładnie tempa wzrostu na pożywkach stałych, a dokładne określenie wzrostu komórek tworzących biofilm, które mogą się ze sobą sklejać, może być niemożliwe; 2) analiza szczepów z defektami wzrostu będzie problematyczna; 3) może nie być możliwe rozróżnienie różnic w średnicy między szczepami o subtelnych fenotypach biofilmu; 4) w przypadku szczepów, które nie rosną w formie koncentrycznego pierścienia, może nie być możliwe dokładne zmierzenie zmian średnicy; 5) choć podczas tworzenia biofilmu można obserwować wzorowanie, nie ma sposobu na ilościowe określenie wzoru powstałego biofilmu; oraz 6) w tej konfiguracji eksperymentalnej nie ma możliwości zmierzenia wymiaru Z biofilmu. Pomimo tych ograniczeń, protokół ten dostarcza jednak sposobu na uzyskanie danych liczbowych pomagających w ocenie tworzenia pomarszczonych kolonii.

W niniejszym protokole wykorzystujemy specjalistyczny system obrazowania (tj. mikroskop stereoskopowy Zeiss oraz oprogramowanie do obrazowania ProgRes CapturePro) w celu obserwacji i oceny tworzenia się pomarszczonych kolonii. Opisany tutaj system obrazowania jest bardzo wydajny: możliwość wykrycia początku tworzenia się pomarszczonych kolonii, a tym samym oceny rozwoju w podejściu czasowym, jest znacznie zwiększona dzięki zastosowaniu mikroskopu stereoskopowego. Jeśli jednak technologia ta jest niedostępna, protokół można dostosować do użytku z innym sprzętem, w tym z prostym aparatem cyfrowym z zoomem. Chociaż niniejszy protokół koncentruje się na ocenie rozwoju pomarszczonych kolonii, można go również zmodyfikować w celu oceny tworzenia się pelikuli, formy biofilmu, która rozwija się, gdy komórki rosną statycznie w hodowli płynnej. Protokół ten może być również przydatny w ocenie innych wskaźników tworzenia biofilmu, w tym włączania specyficznych barwników do naniesionych kolonii podczas rozwoju biofilmu. Należą do nich, między innymi, barwniki takie jak czerwień kongijska i kalkofluor, które mogą wiązać się z celulozą, częstym składnikiem bakteryjnych biofilmów ¹⁶. Ponadto protokół ten, choć opracowany do użytku z V. fischeri, nie ogranicza się do tego organizmu, lecz może zostać uogólniony na badanie tworzenia biofilmu u wielu różnych organizmów, takich jak Bacillus subtilis ⁴, Vibrio cholerae ⁵, Vibrio parahaemolyticus ⁶ oraz Pseudomonas aeruginosa ⁷, z których wszystkie wykazują tworzenie pomarszczonych kolonii. Wreszcie, można go również dostosować do badania innych morfologii kolonii posiadających wzorzec rozwojowy, takich jak potencjalnie wzorowanie zachodzące podczas wzrostu Myxococcus xanthus ¹⁷ oraz rozwój struktur powietrznych u Pseudomonas aeruginosa ¹⁸. Niniejszy protokół znajduje zatem ogólne zastosowanie w badaniach mikrobiologicznych oraz badaniach nad biofilmem.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Stereomikroskop Zeiss stemi 2000-C	Carl Zeiss, Inc.	45505300000000000	(nabyty poprzez Lukas Microscope)
ProgRes C10PLUS	JENOPTIK Optical Systems GmbH	017953-602-26	Adapter kamery (nabyty poprzez Lukas Microscope)
Zimne źródło światła CL 1500 EC	Carl Zeiss, Inc.	4355400000000000	(nabyty poprzez Lukas Microscope)
ProgRes CapturePro	JENOPTIK Optical Systems GmbH	Bezpłatne oprogramowanie do zarejestrowanej kamery	Program komputerowy do przechwytywania obrazu
Image J	National Institutes of Health	Bezpłatne oprogramowanie ze strony: http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html	Program komputerowy do pomiarów średnicy