Izolacja i charakterystyka komórek dendrytycznych i makrofagów z jelita myszy

Podsumowanie

Tutaj szczegółowo opisujemy metodologię szybkiej izolacji mysich komórek dendrytycznych jelit (DC) i makrofagów. Charakterystykę fenotypową jelitowych DC i makrofagów przeprowadza się za pomocą wielokolorowej analizy cytometrii przepływowej, podczas gdy wzbogacanie kulkami magnetycznymi, a następnie sortowanie komórek jest stosowane w celu uzyskania wysoce czystych populacji do badań funkcjonalnych.

Streszczenie

W jelicie znajdują się unikalne populacje wrodzonych i adaptacyjnych komórek odpornościowych, które są zaangażowane w promowanie tolerancji na florę komensalną i antygeny pokarmowe, jednocześnie pozostając w gotowości do narastania reakcji zapalnych na inwazyjne patogeny^1,2. Komórki prezentujące antygeny, w szczególności DC i makrofagi, odgrywają kluczową rolę w utrzymaniu homeostazy immunologicznej jelit poprzez ich zdolność do wyczuwania mikrobioty^3-14 i odpowiedniego reagowania na nią. Skuteczna izolacja jelitowych DC i makrofagów jest kluczowym krokiem w charakteryzowaniu fenotypu i funkcji tych komórek. Chociaż opisano wiele skutecznych metod izolowania jelitowych komórek odpornościowych, w tym DC i makrofagów,^6,10,15-24, wiele z nich opiera się na długim czasie trawienia, który może negatywnie wpływać na ekspresję antygenu na powierzchni komórki, żywotność komórek i / lub wydajność komórek. W tym miejscu szczegółowo opisujemy metodologię szybkiej izolacji dużej liczby żywotnych, jelitowych DC i makrofagów. Charakterystykę fenotypową jelitowych DC i makrofagów przeprowadza się poprzez bezpośrednie barwienie izolowanych komórek jelitowych specyficznymi przeciwciałami monoklonalnymi znakowanymi fluorescencyjnie do analizy wielokolorowej cytometrii przepływowej. Ponadto izoluje się populacje DC i makrofagów o wysokiej czystości do badań funkcjonalnych z wykorzystaniem aktywowanych magnetycznie kulek sortujących komórki CD11c i CD11b, a następnie sortowania komórek.

Protokół

1. Rozwarstwienie i dysocjacja komórek nabłonka jelitowego

Przygotowanie odczynników i sprzętu:

• Podgrzać Ca²⁺/Mg²⁺-free PBS (CMF PBS) do temperatury pokojowej.
• Ciepły HBSS wolny od Ca²⁺ / Mg²⁺ z 5% FBS (CMF HBSS/FBS) i 2mM EDTA do temperatury pokojowej.
• Ciepły wytrząsarka orbitalna do 37 °C.

Uwaga: Kroki od 1.1 do 1.7 muszą być wykonane tak szybko, jak to możliwe, aby zminimalizować zakres śmierci komórki i osiągnąć maksymalną wydajność komórki.

1. Poddaj myszy eutanazji w komorze CO₂ i spryskaj 70% etanolem brzuch i klatkę piersiową.
2. Wykonaj małe poziome nacięcie na środku brzucha nożyczkami i oderwij skórę, aby odsłonić otrzewną.
3. Przystąp do oddzielenia żołądka od górnego odcinka jelita cienkiego, przecinając zwieracz odźwiernika. Odkleić krezkę kleszczami i ponownie przeciąć zastawkę krętniczo-kątniczą, aby uwolnić całe jelito cienkie z jelita grubego. Wykonaj nacięcie na krawędzi odbytu i ponownie rozsuń krezkę, aż jelito grube będzie wolne.
4. Rozciąć okrężnicę wzdłużnie za pomocą nożyczek i zmyć zawartość kału i śluz ze światła jelita w CMF PBS w temperaturze pokojowej.
5. Użyj nożyczek i kleszczy, aby makroskopowo wyciąć plamy Peyera wzdłuż antykrezkowej powierzchni jelita cienkiego i rozciąć jelito cienkie wzdłużnie.
6. Przemyć światło jelita cienkiego z kału i śluzu w CMF PBS w temperaturze pokojowej.
7. Oddzielnie pokrój jelito cienkie/grube na około 1,5 cm kawałki i umieść w oddzielnych stożkowych probówkach o pojemności 50 ml zawierających 30 ml wstępnie podgrzanego CMF HBSS/FBS i 2mM EDTA. Nie dodawać więcej niż 1 jelita na 50 ml stożkowej probówki.
8. Umieścić poziomo każdą stożkową probówkę o pojemności 50 ml w wytrząsarce orbitalnej i wytrząsać z prędkością 250 obr./min przez 20 minut w temperaturze 37 °C.
9. Umieścić sitko z pojedynczej siatki drucianej nad wiadrem na odpady i przelać przez nie zawartość każdej stożkowej probówki o pojemności 50 ml, aby odzyskać 1,5 cm kawałki jelita i umieścić je w oddzielnych stożkowych probówkach o pojemności 50 ml zawierających 30 ml wstępnie podgrzanego CHBSS/FBS z 2 mM EDTA.
10. Powtórz czynności 1.8.

2. Trawienie tkanek i izolacja komórek jelitowych

Przygotowanie odczynników i sprzętu:

• Roztwór kolagenazy: 1,5 mg/ml Kolagenaza typu VIII rozpuszczona we wstępnie podgrzanym CMF HBSS/FBS z 40 μg/ml DNazy I.
• Wstępnie podgrzany CMF HBSS/FBS i 2mM EDTA.
• Wstępnie podgrzana wytrząsarka orbitalna w temperaturze 37 °C.
• Lodowaty CMF HBSS/FBS.

1. Po drugiej rundzie wstrząsania przelej zawartość każdej stożkowej probówki o pojemności 50 ml przez sitko i przenieś 1,5 cm kawałki jelita do małej plastikowej łódki wagowej po wytarciu nadmiaru pożywki ręcznikiem papierowym.
2. Szybko zmielić 1,5 cm kawałki jelita za pomocą nożyczek bezpośrednio w łodzi obciążeniowej i dodać zmielone jelito do 20 ml roztworu kolagenazy. Umieścić poziomo każdą stożkową probówkę o pojemności 50 ml w wytrząsarce orbitalnej i trawić z prędkością 200 obr./min przez 10-20 minut w temperaturze 37 °C. Zapoznaj się z poniższą dyskusją na temat optymalizacji.
3. Krótko przemieszać, aby zapewnić dokładną dysocjację pozostałej tkanki jelitowej i przefiltrować przez sitko do komórek 100 μm bezpośrednio do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
4. Uzupełnić każdą stożkową probówkę o pojemności 50 ml preparatem CMF HBSS/FBS i odwirować z prędkością 1500 obr./min przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Jeżeli po odwirowaniu nie zaobserwuje się stałego osadu w próbkach okrężnicy, próbki należy ponownie odwirować przez 3,5 minuty. Powtórz ten krok prania jeszcze raz.
5. Odlać supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w lodowatym CMF HBSS/FBS i umieścić próbki na lodzie.
6. Przejdź do sekcji 3 dotyczącej pozyskiwania/analizy FACS lub sekcji 4 dotyczącej wzbogacania kulek magnetycznych w celu szybkiego sortowania komórek.

3. Barwienie przeciwciał do wielokolorowej analizy cytometrycznej przepływowej DC i makrofagów

Przygotowanie odczynników i sprzętu:

• Lodowaty CMF PBS.
• Lodowaty bufor barwiący (CMF PBS + 5% FBS).
• Przygotować barwienie martwych komórek w lodowatym CMF PBS w rozcieńczeniu 1:1000 za pomocą zestawu LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit.
• Przygotować koktajl barwienia przeciwciał, dodając następujące przeciwciała monoklonalne znakowane fluorescencyjnie (mAb) do lodowatego buforu barwiącego: CD45-PerCP, CD103-PE, CD11c-APC, MHC-II (^{I-A b})-Alexa Fluor 700, CD11b-eFluor 450, F4/80-PE-Cy7.

1. Przenieść komórki do probówki z 5 ml polistyrenu okrągłodennego (FACS).
2. Umyj komórki dwukrotnie w lodowatym CMF PBS.
3. Inkubować próbki z barwieniem martwych komórek przez 15 minut na lodzie w ciemności.
4. Umyj komórki dwukrotnie w lodowatym CMF PBS.
5. Zablokuj komórki za pomocą 2.4G2 anty-FcγRIII/II w lodowatym buforze barwiącym na 10 minut na lodzie.
6. Umyj komórki w lodowatym buforze barwiącym.
7. Inkubować próbki z koktajlem barwiącym przeciwciała przez 20 minut na lodzie w ciemności.
8. Dwukrotnie umyć komórki lodowatym buforem barwiącym i ponownie zawiesić próbki w 400 μl lodowatego buforu barwiącego i przepuścić przez nasadkę filtracyjną 40 μm na probówkach FACS.
9. Pobrać próbki na cytometrze LSR II (BD) zgodnie z definicją strategii bramkowania w sekcji 5 i rysunku 1.

4. Wzbogacanie DC i makrofagów z jelita

Przygotowanie odczynników i sprzętu:

• Lodowaty bufor barwiący (CMF PBS + 5% FBS).

1. Zawiesinę jednokomórkową otrzymaną w kroku 2.5 inkubować z kulkami MACS CD11b i CD11c zgodnie z instrukcjami producenta.
2. Umyj komórki lodowatym buforem barwiącym, a następnie odwiruj.
3. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w 1 ml lodowatego buforu do barwienia i przepuścić przez sitko o wielkości 100 μm, a następnie przez sitko do komórek o średnicy 40 μm.
4. Wzbogacenie komórek z kulkami magnetycznymi przez selekcję pozytywną za pomocą kolumny magnetycznej MACS LS.
5. Powtórzyć krok 4.2 i odrzucić supernatant.
6. Inkubować komórki z markerami powierzchniowymi MAb zgodnie z opisem w kroku 3.7.
7. Umyj komórki wzbogacone kulkami magnetycznymi dwukrotnie lodowatym buforem barwiącym. Ponownie zawiesić granulki komórek w 500 μl lodowatego buforu barwiącego bez azydku sodu i przepuścić przez sitko komórkowe o średnicy 40 μm do probówki FACS.
8. Przejdź do sortowania FACS w sortowniku komórek BD ARIA II, aby posortować interesujące nas jelitowe podzbiory DC i/lub makrofagów.

5. Strategia bramkowania dla transporterów opancerzonych LP

Uwaga: Proszę zauważyć, że niebarwione komórki jelitowe mogą być wykorzystane jako kontrola negatywna, aby pomóc w prawidłowym rozmieszczeniu bramek do oddzielania populacji pozytywnych i negatywnych.

1. Jak pokazano na rysunku 1, utwórz wykres kropkowy i wyklucz komórki, które są dodatnie dla barwienia martwych komórek (ryc. 1A), a następnie wyklucz zdarzenia dubletowe (ryc. 1B i C). Następnie przesuń się na interesujące Cię komórki zgodnie z rozproszeniem do przodu i z boku, upewniając się, że nie ma żadnych zanieczyszczeń (rys. 1D).
2. Utwórz kolejny wykres punktowy i dalszą bramkę na komórkach CD45 ⁺ i I-A^{b +}, które fenotypowo charakteryzują APC (ryc. 1E).
3. Na osobnym wykresie kropkowym przeanalizuj ekspresję CD11b i CD11c, aby rozróżnić określone podzbiory DC i makrofagów (R1, R2 i R3; Rys. 1F). Komórki R1 to CD11c⁺ CD11b^{/ -}. Region R2 jest wyznaczony w taki sposób, że komórki te mają podobne poziomy ekspresji powierzchniowej dla CD11c, jak w komórkach R1, ale komórki R2 również wyrażają CD11b. Następnie region R3 jest przeznaczony dla komórek, które są CD11b⁺ i CD11c^matowe/-.
4. Analizuj regiony R1, R2 i R3 dalej pod kątem ekspresji F4/80 i CD103, aby zróżnicować odpowiednio populacje makrofagów i DC. Komórki CD11c⁺ CD11b^dull/- R1 wyrażają wysoki poziom integryny αE, CD103 i niski poziom F4 / 80 (ryc. 1G). Komórki CD11b ⁺ CD11c ⁺ R2 składają się zarówno z DC, jak i makrofagów w oparciu o ich dychotomiczną ekspresję CD103 i F4 / 80 (ryc. 1H). Wreszcie, CD11b ⁺ CD11c^{/ -} komórki R3 stanowią makrofagi oparte na profilu fenotypowym F4 / 80 ⁺ i CD103^- (ryc. 1I) ¹⁶.

6. Reprezentatywne wyniki

Rysunek 1. Strategia bramkowania dla jelitowych DC i makrofagów. Martwe komórki (A) i dublety (B i C) zostały najpierw wykluczone z analizy, a następnie komórki jelita cienkiego zostały bramkowane odpowiednio do rozproszenia do przodu i na boki (D), a APC zdefiniowano jako CD45 ⁺ I-A^{b +} (E). Makrofagi i DC zidentyfikowano na podstawie ekspresji CD11b i CD11c (F). Przeanalizowano ekspresję CD103 i F4/80 dla komórek wstępnie bramkowanych w populacjach R1 (G), R2 (H) i R3 (I).

Rysunek 2. Wydajność komórek i jakość barwienia przeciwciał zależy od czasu trawienia. Wzór barwienia CD11b i CD11c oraz całkowita wydajność komórek tkanki jelitowej niedostatecznie (A, D), optymalnie (B, E) lub nadmiernie strawionej (C, F).

Komórki jelitowe zostały wyizolowane z jelita cienkiego myszy C57BL/6, a DC i makrofagi zostały przeanalizowane przez FACS na BD LSR II. Napięcie i kompensację ustawiono za pomocą niebarwionych i pojedynczych splenocytów barwionych fluorochromem. Martwe komórki (ryc. 1A) i dublety (ryc. 1B i C) zostały najpierw wyłączone z analizy. Interesujące komórki zostały następnie przeanalizowane zgodnie z rozproszeniem do przodu i z boku (ryc. 1D), a następnie bramkowaniem na komórkach CD45 ⁺ i I-A^{b +} (ryc. 1E). Następnie oceniano ekspresję CD11b i CD11c wśród komórek CD45 ⁺ I-A^{b +} w celu wyznaczenia trzech regionów (R1, R2 i R3; Rys. 1F). Wyrażanie CD103 i F4/80 w trzech regionach oceniano w celu rozróżnienia odpowiednio między DC i makrofagami. Komórki CD11c⁺ CD11b^dull/- R1 wykazywały wysoki poziom integryny αE, CD103 i niski poziom F4 / 80 (ryc. 1G). Komórki CD11b ⁺ CD11c ⁺ R2 składały się zarówno z DC, jak i makrofagów w oparciu o ich dychotomiczną ekspresję CD103 i F4 / 80 (ryc. 1H), podczas gdy komórki CD11b ⁺ CD11c^{/ -} R3 stanowią makrofagi oparte na profilu fenotypowym F4 / 80 ⁺ i CD103^- (ryc. 1I)¹⁶. Makrofagi w bramce R2 i makrofagi w bramce R3 mają podobne właściwości rozpraszania do przodu i z boku i można je odróżnić po ekspresji CD11c. Funkcjonalna dychotomia tych podzbiorów pozostaje nie do końca zrozumiała.

Zależność między czasem trawienia tkanek a całkowitą wydajnością komórek a ekspresją CD11b i CD11c jest zilustrowana na rysunku 2. Tkanka jelitowa, która była trawiona przez 3 minuty (niedostateczne trawienie), dawała niską całkowitą liczbę komórek (ryc. 2D), a tym samym niewiele DC i makrofagów dostępnych do scharakteryzowania (ryc. 2A). Trawienie tkanek przez 11 minut dało solidny plon żywych komórek (ryc. 2E) z populacjami DC i makrofagów, które wyrażały wysokie poziomy CD11b i CD11c i były fenotypowo odmienne (ryc. 2C). W przeciwieństwie do tego, trawienie przez 50 minut (nadmierne trawienie) spowodowało podobną wydajność komórek w porównaniu ze zoptymalizowanym trawieniem (ryc. 2E i F), jednak wyznaczenie różnych populacji komórek za pomocą CD11b i CD11c stało się bardziej niejasne, ponieważ ekspresja CD11c zmniejszyła się (ryc. 2C) i wzrosła liczba martwych komórek (dane nie pokazane).

Dyskusja

Rysunek 3. Czynniki ważne dla optymalizacji wydajności komórek i powierzchniowej ekspresji antygenu . Na wydajność komórek i ekspresję antygenu powierzchniowego bezpośredni wpływ ma czas trawienia tkanek, specyficzne cechy kolagenazy, stopień rozdrobnienia tkanek oraz obecność lub brak stanu za...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1X PBS, Ca2+- i Mg2+ bez
zbilansowanego roztworu soli Hanka (HBSS) z czerwienią fenolową	Fisher Scientific	SH3001603
Wodorowęglan sodu	Sigma-Aldrich	S6014
1M HEPES w 0,85% NaCl	Lonza Inc.	17-737E
Płodowa surowica bydlęca (FBS)	Atlanta Biologicals	S11150H	Inaktywowany termicznie
0,5 M EDTA (pH 8,0)	Cellgro	46-034-CI
Kolagenaza typu VIII	Sigma-Aldrich	C2139
DNaza I	Grupa Roche	14785000	Roztwór podstawowy: 100 mg /
ml ŻYWY/MARTWY Zestaw do naprawy Aqua Dead Cell Stain Kit do wzbudzenia 405 nm	Invitrogen	L34957	Stosować w 1:1000
CD45-PerCP mAb (30F11)	BD Biosciences	557235	stosować w 1:100
CD103-PE mAb (M290)	BD Biosciences	557495	stosować w 1:100
Fcγ RIII/II mAb (2.4G2)	BD Biosciences	553141	Stosować w 1:200
CD11c-APC mAb (N418)	eBioscience	17-0114-82	stosować w 1:100
MHC-II (I-Ab)-Alexa Fluor 700 mAb	eBioscience	56-5321-82	Stosować w 1:100
CD11b-eFluor 450 mAb (M1/70)	eBioscience	48-0112-82	stosować w 1:200
F4/80-PE-CY7 mAb (BM8)	eBioscience	25-4801-82
Mikrokulki CD11b	Miltenyi Biotec	130-049-601
Mikrokulki CD11c	Miltenyi Biotec	130-052-001
Probówki stożkowe 50 ml	BD Biosciences	352098
Sitko druciane z pojedynczą siatką	Chefmate
Mała łódź do ważenia	Fisher Scientific	08-732-116
100 μ m sitko komórkowe	BD Biosciences	352360
40 μ m sitko komórkowe	BD Biosciences	352340
5 ml probówki okrągłodenne z polistyrenu	BD Biosciences	352235	Stosować w skali 1:100
Wytrząsarka orbitalna MaxQ 4450	Thermo Fisher Scientific, Inc.
Kolumna LS MACS	Miltenyi Biotec	130-042-401
LSR II	BD Biosciences
FACSAria II	BD Biosciences