Pomiar kinetyki progresji cyklu komórkowego z wykorzystaniem znakowania metabolicznego i cytometrii przepływowej

Podsumowanie

Śledzenie subtelnych zmian w progresji i kinetyce etapów cyklu komórkowego można przeprowadzić, stosując połączenie metabolicznego znakowania kwasów nukleinowych BrdU oraz barwienia całkowitej genomowej DNA jodeczkiem propidyny. Metoda ta eliminuje konieczność chemicznej synchronizacji dzielących się komórek, zapobiegając tym samym wprowadzaniu nieswoistych uszkodzeń DNA, które z kolei wpływają na przebieg cyklu komórkowego.

Streszczenie

Precyzyjna kontrola inicjacji i późniejszego przejścia przez poszczególne fazy cyklu komórkowego ma kluczowe znaczenie w komórkach proliferujących. Podział w cyklu komórkowym jest integralną częścią wzrostu i reprodukcji, a deregulacja kluczowych komponentów cyklu komórkowego jest wiązana z zdarzeniami inicjującymi kancerogenezę ^1,2. Środki molekularne stosowane w terapiach przeciwnowotworowych często celują w szlaki biologiczne odpowiedzialne za regulację i koordynację podziału w cyklu komórkowym ³. Chociaż kinetyka cyklu komórkowego wykazuje tendencję do różnicowania się w zależności od typu komórek, rozkład komórek pomiędzy cztery stadia cyklu komórkowego jest dość spójny w obrębie danej linii komórkowej ze względu na stały wzorzec ekspresji mitogenów i czynników wzrostu. Zdarzenia genotoksyczne i inne stresory komórkowe mogą prowadzić do tymczasowej blokady progresji cyklu komórkowego, co skutkuje zatrzymaniem lub tymczasową pauzą w konkretnej fazie cyklu w celu umożliwienia uruchomienia odpowiedniego mechanizmu odpowiedzi.

Możliwość eksperymentalnej obserwacji zachowania populacji komórek w odniesieniu do etapu ich cyklu komórkowego stanowi istotny postęp w biologii komórki. Do izolacji komórek w konkretnych fazach cyklu komórkowego stosuje się powszechne procedury, takie jak odrywanie mitotyczne (mitotic shake off), wirowanie różnicowe lub sortowanie metodą cytometrii przepływowej ^4-6. Tak ufrakcjonowane populacje, wzbogacone w komórki w określonej fazie cyklu, są następnie poddawane działaniom eksperymentalnym. Wydajność, czystość i żywotność oddzielonych frakcji mogą być często obniżone przy zastosowaniu tych fizycznych metod separacji. Ponadto odstęp czasu między separacją populacji komórek a rozpoczęciem zabiegu eksperymentalnego, podczas którego ufrakcjonowane komórki mogą przejść do kolejnego etapu cyklu komórkowego, może stanowić istotne wyzwanie dla pomyślnej realizacji i interpretacji tych eksperymentów.

Inne podejścia do badania etapów cyklu komórkowego obejmują stosowanie środków chemicznych w celu synchronizacji komórek. Traktowanie komórek chemicznymi inhibitorami kluczowych procesów metabolicznych dla każdego etapu cyklu komórkowego jest użyteczne w blokowaniu progresji cyklu do kolejnego etapu. Na przykład inhibitor reduktazy rybonukleotydowej, hydroksymocznik, zatrzymuje komórki na przejściu G1/S poprzez ograniczenie podaży deoksynukleotydów, będących budulcem DNA. Inne istotne środki chemiczne to afidikolina, inhibitor polimerazy alfa służący do zatrzymania w fazie G1, kolchicyna i nocodazol, które zakłócają tworzenie wrzeciona mitotycznego w celu zatrzymania komórek w fazie M, a wreszcie 5-fluorodeoksyrydyna, terminator łańcucha DNA, stosowany w celu zainicjowania zatrzymania w fazie S ^7-9. Traktowanie tymi substancjami chemicznymi jest skuteczną metodą synchronizacji całej populacji komórek w konkretnej fazie. Po usunięciu odczynnika chemicznego komórki jednocześnie powracają do cyklu komórkowego. Podanie badanego czynnika po uwolnieniu komórek z blokady chemicznej gwarantuje, że wywołana odpowiedź na lek pochodzi od jednorodnej populacji specyficznej dla danego etapu cyklu komórkowego. Jednakże, ponieważ wiele synchronizatorów chemicznych to znane związki genotoksyczne, oddzielenie udziału różnych szlaków odpowiedzi (na synchronizatory w porównaniu z badanymi czynnikami) jest trudne.

W niniejszej pracy opisujemy metodę znakowania metabolicznego służącą do śledzenia subpopulacji aktywnych komórek w trakcie ich przejścia z fazy replikacji DNA aż do podziału i separacji komórek potomnych. W połączeniu z ilościową analizą cytometryczną, protokół ten umożliwia pomiar kinetyki przebiegu cyklu komórkowego bez konieczności stosowania stresów komórkowych indukowanych mechanicznie lub chemicznie, które są powszechnie związane z innymi metodami synchronizacji cyklu komórkowego ¹⁰. W następnych sekcjach omówimy metodologię oraz niektóre z jej zastosowań w badaniach biomedycznych.

Protokół

1. Przygotowanie komórek

1. Wysiać komórki, aby uzyskać gęstość odpowiadającą około 60% konfluencji. W momenciey zbierania komórki muszą znajdować się w fazie logarytmicznej. W przypadku komórek mcf7 osiąga się to poprzez wysianie 5 x 10⁵ komórek / płytkę 10 cm w odpowiednim medium. Komórki HT29 i LS180 wysiewa się w zagęszczeniu 6 x 10⁵ komórek / płytkę 6 cm. Zastosowano medium DMEM uzupełnione o 10% FBS i 1x penicylinę/streptomycynę. Należy pamiętać o wysianiu płytek dla odpowiednich kontroli pozytywnych i negatywnych oprócz próbek badawczych. Obejmują one następujące elementy:

i	kontrolna próbka pozytywna	wyłącznie BrdU
ii	kontrolna próbka pozytywna	wyłącznie PI
iii	kontrola negatywna	BrdU-ujemne, PI-ujemne

(Należy zauważyć, że wstępny eksperyment z wieloma punktami czasowymi, taki jak opisany w niniejszym protokole, może zostać wykorzystany do zawężenia ram czasowych, w których należy przeprowadzić przyszłe zbiory.)

2. Posiane komórki inkubuje się w temperaturze 37 °C, przy 5% CO₂ przez 24-48 h, aby umożliwić ich regenerację i przytwierdzenie.
3. W celu pulsacyjnego znakowania komórek bromodeoksyurydyną (BrdU), DMEM zastępuje się świeżą pożywką zawierającą 10 μM BrdU. Komórki inkubuje się przez 1 h w temperaturze 37 °C, przy 5% CO₂, aby umożliwić wbudowanie BrdU do DNA. Należy pozostawić jedną płytkę niepoddaną działaniu związku, która posłuży jako kontrola negatywna.
4. Pożywkę do znakowania pulsacyjnego usuwa się, a komórki krótko płucze 1X PBS.
5. Dodaje się świeżą pożywkę wzrostową (bez BrdU) i inkubuje komórki w temperaturze 37 °C, przy 5% CO₂ aż do osiągnięcia odpowiedniego punktu czasowego dla zbioru materiału.

2. Zbieranie i utrwalanie

1. Nieleczone komórki z kroku 1.3 uznaje się za punkt czasowy zero. Próbkę tę można zebrać wraz z próbką z punktu czasowego 1 h, którą pobiera się bezpośrednio po traktowaniu BrdU.
2. Aby zebrać komórki, usuwa się medium, a płytki płucze się raz w 1X PBS.
3. Komórki poddaje się trypsynizacji, zbiera w medium hodowlanym, a następnie pelletuje przez wirowanie przy 1500 rpm przez 5 min. Nadpływ zostaje odlany.
4. Przemywa się 1-10 x 10⁶ komórek w 5 ml lodowatego 1X PBS. Wirować przy 1500 rpm przez 5 min. Nadpływ zostaje odlany.
5. Pellet komórkowy resuspendsuje się następnie w 100 μl lodowatego PBS/1% FBS. Dodatek 1% FBS do PBS pomaga zapobiec aglomeracji komórek.
6. Komórki dodaje się kroplami do 5 ml 70% etanolu o temperaturze -20 °C w celu ich utrwalenia.
7. Inkubować na lodzie przez 30 min lub przechowywać w temperaturze 4 °C przez noc. Jest to idealny moment na przerwanie zbierania próbek z poszczególnych punktów czasowych. Próbki mogą pozostać w etanolu przez kilka dni, co pozwala na ich jednoczesne przetwarzanie w pozostałych krokach protokołu.

3. Barwienie BrdU i PI

1. Wirować komórki przez 5 min przy 1500 rpm w celu uzyskania osadu.
2. Usunąć utrwalacz, pozostawiając ok. 50 μl, w których należy rozbić osad poprzez wstrząsanie w vorteksie.
3. W celu denaturacji DNA powoli dodawać po kropli 1 ml 2N HCL/Triton X-100 podczas wstrząsania w vorteksie. Inkubować próbki w temperaturze pokojowej przez 30 min.
4. Wirować próbki przez 5 min przy 1500 rpm w celu uzyskania osadu komórkowego. Odessać i usunąć nadsącz.
5. Resuspendować osad komórkowy w 1 ml 0,1M tetraboranu sodu o pH 8,5, aby zneutralizować etap denaturacji.
6. Wirować komórki przez 5 min przy 1500 rpm. Odessać i usunąć nadsącz.
7. Resuspendować osad komórkowy w 75 μl mieszaniny barwiącej BrdU (50 μl 0,5% tween 20/1% BSA/PBS + 20 μl przeciwciała anty-BrdU sprzężonego z FITC + 5 μl 10 mg/ml RNase).
8. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 45 min, chroniąc przed światłem.
9. W celu uzyskania osadu komórkowego wirować próbki przez 5 min przy 1500 rpm. Odessać i usunąć nadsącz.
10. Resuspendować osad komórkowy w 1 ml PBS zawierającego 5 μg/ml jodku propidyny.

4. Cytometria przepływowa

1. Do analizy komórek niezbędny jest cytometr przepływowy wyposażony w laser 488 nm oraz odpowiednie filtry. Do utworzenia wykresów przedstawionych poniżej wymagane jest oprogramowanie analityczne, takie jak CellQuest.
2. Podczas analizy próbki w cytometrze przepływowym należy utworzyć wykres rozrzutu bocznego (SSC-H) względem rozrzutu przedniego (FSC-H), aby upewnić się co do prawidłowego rozkładu wielkości komórek (Rycina 1A). Oba te parametry są przedstawione w skali liniowej.
3. Równocześnie należy wyświetlić wykres FL3-H (barwienie PI) względem FL2-W (Rycina 1B). Wykres ten służy do utworzenia bramki (R3) w celu wyizolowania frakcji komórek mieszczących się w normalnym wzorcu rozkładu cyklu komórkowego. Generalnie wzorzec ten charakteryzuje się dwiema grupami komórek o zawartości DNA 2N i 4N w barwieniu PI, reprezentującymi odpowiednio fazy G1 i G2 cyklu komórkowego. Pasmo komórek znajdujące się między tymi dwiema grupami reprezentuje trwającą replikację DNA, która zachodzi w fazie S cyklu komórkowego.
4. Należy utworzyć wykres przedstawiający komórki z bramki (R3) z punktu 4.3, z FL1-H (FITC, wykres logarytmiczny) na osi y i PI (wykres liniowy) na osi x (Rycina 1C). Wykres ten będzie służył do ustawienia pozostałych parametrów przy użyciu różnych kontroli opisanych w punkcie 1.1, a także do zbierania danych do analizy.
5. Należy wprowadzić do cytometru próbkę barwioną wyłącznie PI. Należy dostosować wzmocnienie (gain) tak, aby faza G1 znajdowała się na poziomie ~200 na osi x. Będzie to łatwiejsze do wizualizacji na histogramie barwienia PI.
6. Druga kontrola polega na analizie w cytometrze przepływowym próbki barwionej wyłącznie BrdU. Należy dostosować wzmocnienie tak, aby na wykresie pojawiły się dwie populacje komórek (BrdU dodatnie i BrdU ujemne). Idealnie komórki BrdU ujemne powinny znajdować się tuż poniżej 10^-1.
7. Ostatnią kontrolą jest próbka ujemna dla BrdU/PI. Należy przeprowadzić tę kontrolę ujemną, aby upewnić się, że komórki nie pojawiają się w żadnym z górnych lub prawych kwadrantów.
8. Po ustawieniu parametrów poszczególnych wykresów cytometr przepływowy jest skalibrowany i gotowy do analizy komórek barwionych BrdU i PI. Podczas każdego pomiaru należy odczytać minimum 10 000 komórek, które znajdują się w odpowiedniej bramce frakcji PI (patrz punkt 4.3).
9. Do analizy zebranych danych wykorzystuje się oprogramowanie takie jak FlowJo lub FacsDiva. Każdy z wyżej wymienionych wykresów można odtworzyć w tych programach, a następnie przeprowadzić analizę ilościową i statystyczną.
10. Etap końcowy analizy obejmuje kilka następujących po sobie kroków. Utworzenie wykresu FITC względem PI z komórkami wybranymi jako PI dodatnie z wykresu PI względem FL2-W pozwala wyróżnić populację komórek w cyklu. Na tym wykresie tworzy się drugą bramkę, izolując populację BrdU dodatnią. Przedstawienie tej charakterystycznej populacji na histogramie z PI na osi x pozwala śledzić przebieg progresji cyklu komórkowego w czasie. Można to dodatkowo zwizualizować, wykreślając liczbę komórek BrdU-dodatnich o zawartości G1 lub G2 jako funkcję czasu.

5. Reprezentatywne wyniki

Zwykle komórki w cyklu komórkowym barwione jodkiem propidyny wykazują wyraźne piki w fazach G1 i G2, odpowiadające odpowiednio komórkom o zawartości DNA 2N i 4N (Rysunek 2). Markerowanie pulsacyjne BrdU pozwala na selektywne znakowanie subpopulacji komórek aktywnie syntetyzujących DNA (tj. w fazie S). Krótko po usunięciu odczynnika BrdU wszystkie znakowane komórki znajdują się w fazie S (Rysunek 3). Ograniczenie znakowania do krótkiego impulsu pozwala śledzić tę teraz odrębną subpopulację komórek w wielu punktach czasowych podczas przechodzenia przez kolejne fazy cyklu komórkowego. Można to zaobserwować w punkcie czasowym 1 h na Rysunku 3 jako wyraźny brak pików G1 i G2.

Dodatkowych informacji można uzyskać z etapu znakowania BrdU. Można nie tylko zmierzyć odsetek aktywnie dzielących się komórek, ale także określić szacunkowy rozkład etapów cyklu komórkowego pomiędzy dwiema próbkami. Poprzez zbieranie komórek w równych odstępach czasu po usunięciu odczynnika BrdU, można śledzić komórki w trakcie dalszego przebiegu cyklu, przejścia do fazy G2 i ostatecznie do podziału komórek wyjściowych, w wyniku czego powstają BrdU-dodatnie komórki potomne z zawartością DNA charakterystyczną dla fazy G1 (Rycina 4). Przykład ilościowego oznaczenia faz cyklu komórkowego oraz analizy kinetycznej przedstawiono na Rycini 5.

Rycina 1. (A) Wykres rozproszenia przedniego (Forward Scatter) względem rozproszenia bocznego (Side Scatter) reprezentatywnej populacji komórek mcf7. (B) Wykres PI względem szerokości impulsu (FL-W) reprezentatywnej populacji komórek mcf7. Przedstawiono bramkowanie w celu wykluczenia dubletów komórek w analizie końcowej (R3). Dublety komórek charakteryzują się większą szerokością impulsu niż pojedyncze komórki, ponieważ potrzebują więcej czasu na przejście przez wiązkę lasera, a zatem mogą zostać wykluczone z analizy. (C) Wykres PI względem FITC (BrdU) reprezentatywnej populacji komórek mcf7. Przedstawiono bramkowanie w celu uwzględnienia wyłącznie komórek FITC (BrdU) dodatnich (R4).

Rysunek 2. Reprezentatywny wykres histogramu całkowitej populacji komórek w normalnym cyklu komórkowym.

Rysunek 3. Wykres histogramu komórek zebranych 1h po usunięciu impulsu BrdU, po bramkowaniu komórek FITC (BrdU)-dodatnich. Komórki BrdU-dodatnie w wczesnym punkcie czasowym po usunięciu znacznika wykazują profile PI odpowiadające próbkom z zawartością DNA zgodną z komórkami w fazie S cyklu komórkowego, co potwierdza pomyślne znakowanie komórek wyłącznie podczas syntezy DNA.

Rycina 4. Porównanie kinetyki progresji cyklu komórkowego między liniami komórkowymi nowotworu: jelita grubego HT29 (A) i LS180 (B) oraz raka piersi mcf7 (C). Komórki zbierano co godzinę przez 8 godzin po usunięciu impulsu BrdU. W tym eksperymencie zaobserwowano wyraźny profil przyspieszonej progresji cyklu komórkowego przez fazę G2 w linii komórkowej jelita grubego LS180. Porównując kinetykę dwóch profili komórek raka jelita grubego, w komórkach LS180 pojawienie się piku G1 jest widoczne w czasie T= 4h po BrdU, w przeciwieństwie do odpowiadającego punktu czasowego dla linii HT-29, w której brakuje tego piku. W porównaniu z obiema liniami komórkowymi jelita grubego, komórki mcf7 dzielą się w znacznie wolniejszym tempie. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą rycinię.

Rysunek 5. (A) Ilościowa analiza faz cyklu komórkowego komórek nowotworowych znakowanych BrdU. Algorytm Dean/Jett/Fox zastosowano dla linii HT29, LS180 oraz mcf7 (zaznaczone na zielono). Wynikowe rozkłady faz cyklu komórkowego z każdej próbki wyrażono jako % całkowitej liczby komórek BrdU-dodatnich dla każdej fazy. Przedstawiono jedynie wybrane punkty czasowe dla każdej linii komórkowej, ponieważ analizy dla niektórych wcześniejszych punktów czasowych dały nieważne wyniki. W tych wcześniejszych punktach czasowych wszystkie komórki BrdU-dodatnie znajdują się w fazie S, a zatem brakuje wyraźnych pików G1 i G2, które są niezbędne do zastosowania algorytmu. (B) Histogramy komórek nowotworowych pokazujące kinetykę przejścia przez fazy G2/M cyklu komórkowego. Przejście przez fazy G2/M jest najszybsze dla komórek LS180, następnie dla HT29 i mcf7. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek.

Rycina S1. Kontrole cytometrii przepływowej. Komórki mcf7 przedstawiono jako (A) kontrolę negatywną, w której komórki nie zostały zabarwione ani PI, ani BrdU. (B) Barwienie samym PI. (C) Próbki znakowane BrdU-FITC.

Rycina S2. Schematyczny rysunek przedstawiający relację między widmem emisji fluorescencyjnej PI a FITC (BrdU). Okna detekcji widma dla kanału fluorescencyjnego 1 (FL1, dla FITC) oraz kanału fluorescencyjnego 3 (FL3, dla PI) przedstawiono w odpowiednich polach. Między detekcją w kanałach FL1 a FL3 nie występuje nakładanie się widm fluoroforów. Oczywiście kompensacja fluorescencji nie jest konieczna, gdy dane eksperymentalne z komórek podwójnie znakowanych PI i FITC-BrdU są zbierane odpowiednio w kanałach FL1/FL3. Widma fluorescencji pobrano ze strony internetowej BD BioSciences: http://www.bdbiosciences.com/research/multicolor/spectrum_viewer. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą rycinę.

Dyskusja

Łącząc cytometrię przepływową z wbudowywaniem BrdU, zyskujemy niezbędne narzędzia do badania kinetyki cyklu komórkowego. Wyjątkowa właściwość BrdU, polegająca na pełnieniu funkcji analogu tymidyny, umożliwia ilościowe oznaczenie zawartości DNA w komórce cyklicznej. Wbudowywanie BrdU w rosnącą potomną nić DNA podczas fazy syntezy cyklu komórkowego pozwala na śledzenie subpopulacji komórek cyklicznych od momentu replikacji DNA w fazie S, poprzez okres wzrostu w fazie G2, aż do ostatecznego podziału komórki. Komórki potomne...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
bromodeoksyurydyna	BD Biosciences	55089
jodek propidyny	Sigma-Aldrich	287075	roztwór stokowy 1mg/ml
FITC przeciwko BrdU	BD Biosciences	347583
tetraboran sodu	Fisher Scientific	S80172	0.1M, pH 8.5
FACS Caliber	BD Biosciences