Pomiar kinetyki progresji cyklu komórkowego za pomocą znakowania metabolicznego i cytometrii przepływowej

Podsumowanie

Śledzenie subtelnych zmian w postępie i kinetyce etapów cyklu komórkowego można osiągnąć za pomocą kombinacji metabolicznego znakowania kwasów nukleinowych za pomocą BrdU i barwienia całkowitego genomowego DNA za pomocą jodku propidy. Metoda ta pozwala uniknąć konieczności chemicznej synchronizacji komórek cyklicznych, zapobiegając w ten sposób wprowadzeniu niespecyficznych uszkodzeń DNA, co z kolei wpływa na postęp cyklu komórkowego.

Streszczenie

Precyzyjna kontrola inicjacji i późniejszej progresji przez różne fazy cyklu komórkowego ma ogromne znaczenie w proliferacji komórek. Podział cyklu komórkowego jest integralną częścią wzrostu i reprodukcji, a deregulacja kluczowych składników cyklu komórkowego jest zaangażowana w zdarzenia przyspieszające rakotwórczość ^1,2. Czynniki molekularne w terapiach przeciwnowotworowych często celują w szlaki biologiczne odpowiedzialne za regulację i koordynację podziału cyklu komórkowego ³. Chociaż kinetyka cyklu komórkowego ma tendencję do różnic w zależności od typu komórki, rozmieszczenie komórek między czterema etapami cyklu komórkowego jest raczej spójne w obrębie określonej linii komórkowej ze względu na spójny wzorzec ekspresji mitogenu i czynnika wzrostu. Zdarzenia genotoksyczne i inne stresory komórkowe mogą powodować tymczasową blokadę progresji cyklu komórkowego, powodującą zatrzymanie lub tymczasową pauzę w określonej fazie cyklu komórkowego, aby umożliwić zainicjowanie odpowiedniego mechanizmu odpowiedzi.

Możliwość eksperymentalnego obserwowania zachowania populacji komórek w odniesieniu do etapu progresji ich cyklu komórkowego jest ważnym postępem w biologii komórki. Typowe procedury, takie jak mitotyczne wytrząsanie, wirowanie różnicowe lub sortowanie oparte na cytometrii przepływowej, są stosowane do izolowania komórek na określonych etapach cyklu komórkowego ^4-6. Te frakcjonowane, wzbogacone w fazę cyklu komórkowego populacje są następnie poddawane eksperymentalnym zabiegom. Wydajność, czystość i żywotność oddzielonych frakcji mogą być często zagrożone przy użyciu tych metod separacji fizycznej. Również upływ czasu między separacją populacji komórek a rozpoczęciem eksperymentalnego leczenia, w którym frakcjonowane komórki mogą przejść od wybranego etapu cyklu komórkowego, może stanowić poważne wyzwanie dla pomyślnego wdrożenia i interpretacji tych eksperymentów.

Inne podejścia do badania etapów cyklu komórkowego obejmują użycie substancji chemicznych do synchronizacji komórek. Leczenie komórek chemicznymi inhibitorami kluczowych procesów metabolicznych dla każdego etapu cyklu komórkowego jest przydatne w blokowaniu postępu cyklu komórkowego do następnego etapu. Na przykład inhibitor reduktazy rybonukleotydowej, hydroksymocznik, zatrzymuje komórki na styku G1 / S, ograniczając dopływ deoxynukleotydów, elementów budulcowych DNA. Inne godne uwagi chemikalia obejmują leczenie afidikoliną, inhibitorem polimerazy alfa do zatrzymania G1, leczenie kolchicyną i nokodazolem, z których oba zakłócają tworzenie wrzeciona mitotycznego w celu zatrzymania komórek w fazie M i wreszcie leczenie terminatorem łańcucha DNA 5-fluorodeoksyrydyną w celu zainicjowania zatrzymania fazy S ^7-9. Leczenie tymi chemikaliami jest skutecznym sposobem synchronizacji całej populacji komórek w określonej fazie. Wraz z usunięciem substancji chemicznej komórki zgodnie dołączają do cyklu komórkowego. Poddanie działaniu czynnika badanego po uwolnieniu z substancji chemicznej blokującej cykl komórkowy zapewnia, że wywołana odpowiedź na lek pochodzi z jednolitej, specyficznej dla danego etapu cyklu komórkowego populacji. Ponieważ jednak wiele z synchronizatorów chemicznych jest znanymi związkami genotoksycznymi, wyodrębnienie udziału różnych szlaków odpowiedzi (do synchronizatorów i czynników testowych) jest trudne.

Tutaj opisujemy metodę etykietowania metabolicznego, która umożliwia śledzenie subpopulacji aktywnie cyklicznych komórek przez ich postęp od fazy replikacji DNA, aż do podziału i separacji ich komórek potomnych. W połączeniu z kwantyfikacją za pomocą cytometrii przepływowej, protokół ten umożliwia pomiar kinetycznej progresji cyklu komórkowego przy braku mechanicznie lub chemicznie wywołanych naprężeń komórkowych, powszechnie związanych z innymi metodologiami synchronizacji cyklu komórkowego ¹⁰. W kolejnych rozdziałach omówimy metodologię, a także niektóre z jej zastosowań w badaniach biomedycznych.

Protokół

1. Przygotowanie komórek

1. Płytki komórki, aby osiągnąć gęstość około 60% zbieżności. Komórki muszą znajdować się w fazie logarytmicznej w momencie pobierania. W przypadku komórek mcf7 osiąga się to poprzez wysiew na płytce 5 x 10^{5 komórek} / 10 cm w odpowiednim podłożu. Komórki HT29 i LS180 wysiewa się na płytce 6 x 10⁵ komórek / 6 cm. Stosowaliśmy pożywki DMEM uzupełnione o 10% FBS i 1x penicylinę/streptomycynę. Upewnij się, że oprócz próbek testowych masz na płytkach wysiewowych odpowiednie kontrole dodatnie i ujemne. Należą do nich:

ja Kontrola pozytywna Tylko BrdU Ii Kontrola pozytywna Tylko PI Iii Kontrola ujemna BrdU ujemny, PI ujemny

(Należy zauważyć, że wstępny eksperyment z wieloma punktami czasowymi, takimi jak ten opisany w tym protokole, może być wykorzystany do zawężenia ram czasowych, podczas których należy przeprowadzić przyszłe kolekcje.)

2. Posiane komórki inkubuje się w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ przez 24-48 godzin, umożliwiając w ten sposób regenerację i przyczepienie się komórek.
3. Aby znakować komórki pulsacyjnie bromodeoksyurydyną (BrdU), DMEM zastępuje się świeżą pożywką zawierającą 10 μM BrdU. Komórki inkubuje się przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C, 5% CO_{2 ,} aby umożliwić włączenie BrdU do DNA. Należy pamiętać, aby pozostawić jedną płytkę niepoddawaną działaniu substancji kontrolnej.
4. Pożywka do znakowania impulsowego jest usuwana, a komórki są krótko płukane 1X PBS.
5. Dodaje się świeże podłoże wzrostowe (bez BrdU) i pozostawia się komórkom dalszą inkubację w temperaturze 37 °C, 5 % CO_{2 ,} aż do osiągnięcia odpowiedniego punktu czasowego dla zbioru.

2. Zbiór i utrwalanie

1. Nieleczone komórki z kroku 1.3 są uważane za zerowy punkt czasowy. Próbka ta może być pobrana razem z 1-godzinnym punktem czasowym, który jest pobierany natychmiast po zabiegu BrdU.
2. Aby zebrać komórki, pożywka jest usuwana, a płytki są jednokrotnie płukane 1X PBS.
3. Komórki są trypsynizowane, zbierane w pożywkach hodowlanych, a następnie granulowane przez wirowanie przy 1500 obr./min przez 5 minut. Supernatant jest odrzucany.
4. Wypłucz 1-10 x 10⁶ komórek w 5 ml lodowatego lodu 1X PBS. Wirować przy 1500 obr./min przez 5 min Supernatant jest odrzucany.
5. Osad komórkowy jest następnie ponownie zawieszany w 100 μl lodowatego PBS/1% FBS. Dodatek 1% FBS do PBS pomaga w zapobieganiu zlepianiu się komórek.
6. Dodawaj te komórki kropla po kropli do 5 ml -20 °C, 70% etanolu, aby utrwalić komórki.
7. Inkubować na lodzie przez 30 minut lub przechowywać w temperaturze 4 °C przez noc. Jest to idealny krok, aby zatrzymać pobieranie próbek z różnych punktów czasowych. Próbki można pozostawić w etanolu na kilka dni, co pozwala na ich jednoczesne przetwarzanie przez pozostałą część protokołu.

3. Barwienie BrdU i PI

1. Komórki peletowe przez odwirowanie przez 5 minut przy 1500 obr./min.
2. Usuń utrwalacz, ale pozostaw ~50 μl, w którym należy poluzować granulkę przez wirowanie.
3. Aby zdenaturować DNA, powoli dodawaj kroplami 1 ml 2N HCL/Triton X-100 podczas wirowania. Próbki inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
4. Komórki w postaci peletów przez odwirowanie próbek przez 5 minut przy prędkości 1500 obr./min. Odessać i wyrzucić supernatant.
5. Zawiesić osad komórkowy w 1 ml 0,1 M tetraboranu sodu o pH 8,5, aby zneutralizować etap denaturacji.
6. Wirować komórki przez 5 minut przy 1500 obr./min. Odessać i wyrzucić supernatant.
7. Zawiesić osad komórkowy w 75 μl mieszanki barwiącej BrdU (50 μl 0,5% tween 20/1% BSA/PBS + 20 μl FITC sprzężonego anty-BrdU + 5 μl 10 mg/ml RNazy).
8. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 45 minut, chroniąc przed światłem.
9. Aby uzyskać granulki, należy odwirować próbki przez 5 minut przy 1500 obr./min. Odessać i wyrzucić supernatant.
10. Zawiesić osad komórkowy w 1 ml PBS zawierającym 5 μg/ml jodku propidyny.

4. Cytometria przepływowa

1. Do analizy komórek niezbędny jest cytometr przepływowy wyposażony w laser o długości fali 488 nm oraz odpowiednie filtry. Oprogramowanie analityczne, takie jak CellQuest, jest niezbędne do stworzenia wykresów opisanych poniżej.
2. Przepuszczając próbkę przez cytometr przepływowy, utwórz wykres rozproszenia do przodu (SSC-H) w funkcji rozproszenia bocznego (FSC-H), aby zapewnić prawidłowy rozkład wielkości komórek (rysunek 1A). Oba te parametry są wykreślane na skali liniowej.
3. Jednocześnie wyświetl wykres FL3-H (barwienie PI) w porównaniu z FL2-W (Rysunek 1B). Ten wykres służy do tworzenia bramki (R3) w celu wyizolowania frakcji komórek, które mieszczą się w normalnym wzorcu rozkładu cyklu komórkowego. Ogólnie rzecz biorąc, ten wzorzec dystrybucji charakteryzuje się dwoma klastrami komórek z zawartości DNA 2N i 4N w barwieniu PI reprezentującymi odpowiednio fazy G1 i G2 cyklu komórkowego. Ciąg komórek znajdujących się między tymi 2 klastrami jest reprezentatywny dla trwającej replikacji DNA, która zachodzi w fazie S cyklu komórkowego.
4. Utwórz wykres przedstawiający bramkowane komórki (R3) z kroku 4.3, z FL1-H (FITC, wykres logarytmiczny) na osi y i PI (wykres liniowy) na osi x (rysunek 1C). Wykres ten zostanie wykorzystany do ustawienia pozostałych parametrów przy użyciu różnych elementów sterujących opisanych w punkcie 1.1, a także do zebrania danych do analizy.
5. Umieścić na cytometrze próbkę wybarwioną tylko PI. Dostosuj wzmocnienie, aby umieścić G1 na ~200 na osi x. Będzie to łatwiejsze do zobrazowania na wykresie histogramu barwienia PI.
6. Druga kontrola polega na przeprowadzeniu próbki tylko z BrdU na cytometrze przepływowym. Dostosuj wzmocnienie tak, aby na wykresie pojawiły się 2 populacje komórek (BrdU dodatnie i BrdU ujemne). Idealnie, ujemne komórki BrdU są ustawione tak, aby pojawiały się nieco poniżej ^10-1.
7. Końcową kontrolą jest próbka ujemna BrdU/PI. Uruchom tę kontrolę negatywną, aby upewnić się, że komórki nie pojawiają się w żadnym z górnych lub prawych kwadrantów.
8. Po ustawieniu parametrów różnych wykresów, cytometr przepływowy jest kalibrowany i gotowy do przetwarzania komórek barwionych BrdU i PI. Na każdą kolekcję należy odczytać co najmniej 10 000 komórek, które są bramkowane w odpowiedniej frakcji PI (patrz krok 4.3).
9. Do analizy zebranych danych wykorzystywane jest oprogramowanie takie jak FlowJo lub FacsDiva. Każdy z wyżej wymienionych wykresów można odtworzyć w tych programach i przeprowadzić analizę ilościową i statystyczną.
10. Punkt końcowy analizy składa się z kilku następujących po sobie kroków. Utworzenie wykresu FITC w stosunku do PI z komórkami bramkowanymi jako PI dodatnie od wykresu PI w stosunku do FL2-W pozwala na rozróżnienie populacji cyklicznej. Druga brama jest tworzona z tej działki poprzez izolację populacji BrdU dodatniej. Wyrażenie tej charakterystycznej populacji na wykresie histogramu z liczbą PI na osi x pozwala śledzić przebieg w czasie postępu cyklu komórkowego. Można to dodatkowo zwizualizować, wykreślając liczbę komórek BrdU-dodatnich z zawartością G1 lub G2 w funkcji czasu.

5. Reprezentatywne wyniki

Normalnie cykliczne komórki barwione jodkiem propidyny mają wyraźne piki w G1 i G2, odpowiadające komórkom zawierającym odpowiednio zawartość DNA 2N i 4N (Rysunek 2). Znakowanie impulsowe za pomocą BrdU pozwala na selektywne znakowanie subpopulacji komórek, które aktywnie syntetyzują DNA (tj. faza S). Wkrótce po usunięciu odczynnika BrdU wszystkie znakowane komórki znajdują się w fazie S (ryc. 3). Ograniczając znakowanie do krótkiego impulsu, można śledzić tę odrębną subpopulację komórek w wielu punktach czasowych, gdy przechodzą one przez kolejne fazy cyklu komórkowego. Można to zwizualizować w punkcie czasowym 1 godziny na rysunku 3 jako wyraźny brak pików G1 i G2.

Dodatkowe informacje można uzyskać z etapu etykietowania BrdU. Można nie tylko zmierzyć proporcję aktywnie dzielących się komórek, ale także oszacować rozkład etapów cyklu komórkowego między dwiema próbkami. Zbierając komórki w równych odstępach czasu po usunięciu odczynnika BrdU, można śledzić komórki, które kontynuują cykl, przechodzą do G2 i ostatecznie przechodzą do podziału komórek oryginalnych komórek, ostatecznie wyłaniając się jako BrdU-dodatnie komórki potomne z zawartością DNA G1 (Figura 4). Przykład kwantyfikacji faz cyklu komórkowego i analizy kinetycznej przedstawiono na rysunku 5.

Rysunek 1. (A) Wykres rozproszenia do przodu a wykres punktowy boczny reprezentatywnej populacji komórek mcf7. (B) PI w funkcji szerokości (FL-W) Wykres reprezentatywnej populacji komórek mcf7. Wykazano, że bramkowanie wyklucza dublety komórek w analizie końcowej (R3). Dublety ogniw będą miały większą szerokość impulsu niż pojedyncze ogniwo, ponieważ potrzebują więcej czasu, aby przejść przez wiązkę laserową i dlatego można je wykluczyć z analizy. (C) PI w porównaniu z FITC (BrdU) Wykres reprezentatywnej populacji komórek mcf7. Wykazano, że bramkowanie obejmuje tylko komórki dodatnie FITC (BrdU) (R4).

Rysunek 2. Reprezentatywny wykres histogramu całkowitej populacji komórek pracujących w normalnych cyklach.

Rysunek 3. Wykres histogramu komórek, które zostały zebrane 1 godzinę po usunięciu impulsu BrdU, po bramkowaniu dla komórek FITC (BrdU)-dodatnich. Komórki BrdU-dodatnie we wczesnym punkcie czasowym po usunięciu znacznika wykazują profile PI, które odpowiadają próbkom wykazującym zawartość DNA zgodną z komórkami znajdującymi się w fazie S cyklu komórkowego, potwierdzając pomyślne znakowanie komórek tylko podczas syntezy DNA.

Rysunek 4. Porównanie kinetyki progresji cyklu komórkowego między liniami komórek nowotworowych, rakiem jelita grubego HT29 (A) i LS180 (B), a także rakiem piersi mcf7 (C). Komórki pobierano co godzinę przez 8 godzin, po usunięciu impulsu BrdU. W tym eksperymencie zaobserwowaliśmy wyraźny profil przyspieszonej progresji cyklu komórkowego przez fazę G2 cyklu komórkowego w linii komórek jelita grubego LS180. Porównując kinetykę między dwoma profilami komórek raka jelita grubego, pojawienie się piku G1 jest widoczne w T = 4 godziny po BrdU w komórkach LS180, w porównaniu z odpowiednim punktem czasowym dla linii komórkowej HT-29, w której ten pik nie występuje. W porównaniu z jedną z dwóch linii komórkowych jelita grubego, komórki mcf7 zmieniają się w znacznie zmniejszonym tempie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

Rysunek 5. (A) Ilościowa analiza faz cyklu komórkowego komórek nowotworowych znakowanych BrdU. Algorytm Dean/Jett/Fox został zastosowany do HT29, LS180 i mcf7 (zilustrowanych na zielono). Wynikowy rozkład faz cyklu komórkowego z każdej próbki jest wyrażony jako % całkowitych komórek BrdU-dodatnich dla każdej fazy. Wyświetlane są tylko wybrane punkty czasowe dla każdej linii komórkowej, ponieważ analizy dla niektórych wcześniejszych punktów czasowych dały nieprawidłowe wyniki. W tych wcześniejszych punktach czasowych wszystkie komórki BrdU-dodatnie są w fazie S i dlatego nie mają wyraźnych pików G1 i G2, które są niezbędne do zastosowania algorytmu. (B) Histogramy komórek nowotworowych pokazujące kinetykę progresji przez fazy G2/M cyklu komórkowego. Progresja przez fazy G2/M jest najszybsza dla komórek LS180, a następnie HT29 i mcf7. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

Rysunek S1. Kontrole cytometrii przepływowej. Komórki mcf7 są pokazane jako (A) kontrola negatywna, w której komórki nie są barwione ani PI, ani BrdU. (B) PI tylko barwione. (C) Próbki oznaczone znakiem BrdU-FITC.

Rysunek S2. Schematyczna ilustracja przedstawiająca zależność między widmem emisji fluorescencyjnej PI a FITC (BrdU). Okna zbierania widma dla kanału fluorescencyjnego 1 (FL1, dla FITC) i kanału fluorescencyjnego 3 (FL3, dla PI) są pokazane w odpowiednich polach. Nie ma nakładania się widm fluoroforów między detekcją FL1 i FL3. Najwyraźniej kompensacja fluorescencji nie jest konieczna, gdy dane eksperymentalne z komórek znakowanych PI i FITC-BrdU są zbierane odpowiednio w kanałach FL1 / FL3. Widma fluorescencji uzyskano ze strony internetowej BD BioSciences: http://www.bdbiosciences.com/research/multicolor/spectrum_viewer. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

Dyskusja

Łącząc cytometrię przepływową z inkorporacją BrdU, dysponujemy narzędziami niezbędnymi do badania kinetyki cyklu komórkowego. Charakterystyczna właściwość BrdU polegająca na funkcjonowaniu jako analog tymidyny pozwala na ilościowe określenie zawartości DNA w komórce cyklicznej. Włączenie BrdU do rosnącej potomnej nici DNA podczas fazy syntezy cyklu komórkowego pozwala śledzić subpopulację komórek cyklicznych przez replikację DNA w fazie S, do okresu wzrostu w G2 i ostatecznie do podziału komórki. Komórki potomne BrdU-...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
bromodeoksyurydyna	BD Biosciences	55089
jodek propidyny	Sigma-Aldrich	287075	1 mg / ml zapas
FITC anty-BrdU	BD Biosciences	347583
tetraboran sodu	Fisher Scientific	S80172	0,1 M, pH 8,5
FACS Kaliber	BD Biosciences