Mutageneza z użyciem pirosiarczynu jest złotym standardem analizy metylacji DNA. Nasz zmodyfikowany protokół umożliwia analizę metylacji DNA na poziomie pojedynczych komórek i został zaprojektowany specjalnie dla poszczególnych oocytów. Może być on również stosowany w przypadku embrionów w stadium przedziałowym.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Mutageneza z użyciem pirosiarczynu w pojedynczych oocytach
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Epigenetyka obejmuje wszystkie dziedziczne i odwracalne modyfikacje chromatyny, które zmieniają dostępność genów, a tym samym stanowią podstawowe mechanizmy regulacji transkrypcji genów1. Metylacja DNA jest modyfikacją epigenetyczną, która działa przede wszystkim jako znacznik represyjny. Poprzez kowalencyjne przyłączenie grupy metylowej do cytozyn w dinukleotydach CpG może ona rekrutować dodatkowe białka represyjne i modyfikacje histonów, aby zainicjować procesy odpowiedzialne za kondensację chromatyny i wyciszanie genów2. Metylacja DNA jest niezbędna dla prawidłowego rozwoju, ponieważ odgrywa kluczową rolę w programowaniu rozwojowym, różnicowaniu komórek, represji elementów retrowirusowych, inaktywacji chromosomu X oraz imprintingowi genomicznemu.
Jedną z najpotężniejszych metod analizy metylacji DNA jest mutageneza pirosiarczynowa. Pirosiarczyn sodu jest mutagenem DNA, który deaminuje cytozyny do uracyli. Po amplifikacji PCR i sekwencjonowaniu zdarzenia konwersji te są wykrywane jako tyminy. Metylowane cytozyny są chronione przed deaminacją i pozostają zatem cytozynami, co umożliwia identyfikację metylacji DNA na poziomie pojedynczych nukleotydów3. Rozwój testów mutagenezy pirosiarczynowej ewoluował od pierwotnie opisanych metod4-6 w stronę rozwiązań bardziej czułych i powtarzalnych7. Jednym z kluczowych usprawnień było osadzanie mniejszych ilości DNA w kuleczce agarozy, co chroni DNA przed drastyczną obróbką pirosiarczynem8. Umożliwiło to przeprowadzenie analizy metylacji na pulach oocytów i embrionów w stadium blastocysty9. Najbardziej zaawansowany do tej pory protokół mutagenezy pirosiarczynowej jest przeznaczony dla pojedynczych embrionów w stadium blastocysty10. Jednakże, ponieważ blastocysty mają średnio 64 komórki (zawierające 120-720 pg genomowego DNA), metoda ta nie jest skuteczna w badaniach metylacji pojedynczych oocytów lub embrionów w stadium podziału.
Czerpiąc z doświadczeń związanych z zatapianiem niewielkich ilości DNA w agarozie, w tym w przypadku oocytów11, przedstawiamy tutaj metodę, w której oocyty są bezpośrednio zatapiane w kuleczce z agarozy i roztworu lizującego niezwłocznie po ich pobraniu i usunięciu z oocytu strefy przejrzystej. Pozwala to nam uniknąć dwóch głównych problemów związanych z mutagenezą pirosiarczynową pojedynczego oocytu: ochrony minimalnej ilości DNA przed degradacją oraz późniejszej utraty materiału podczas licznych etapów protokołu. Co istotne, ponieważ dane pozyskiwane są z pojedynczych oocytów, wyeliminowano problem błędu PCR w obrębie pul materiału. Ponadto, nieumyślna kontaminacja komórkami cumulus jest wykrywalna za pomocą tej metody, gdyż każda próbka z więcej niż jednym wzorem metylacji może zostać wykluczona z analizy12. Niniejszy protokół stanowi ulepszoną metodę prowadzenia skutecznych i powtarzalnych analiz metylacji DNA na poziomie pojedynczej komórki i jest idealnie dostosowany do pojedynczych oocytów, jak również do embrionów w stadium podziału.
Protokół
DZIEŃ 1
Przygotuj następujące roztwory na świeżo w dniu pobierania oocytów, używając sterylnej wody destylowanej, takiej jak woda GIBCO. Aby zmniejszyć ryzyko kontaminacji DNA, często zmieniaj rękawiczki i używaj końcówek z filtrem. Podczas gdy probówki są otwarte, trzymaj je pod kątem, a gdy nie są używane, zakręcaj wszystkie probówki. Zalecamy przygotowanie roztworów w ilości n+1.
3% agaroza LMP
30 mg agarozy o niskiej temperaturze topnienia (LMP)
do 1 ml GIBCO H2O
rozpuścić w 70 °C
Bufor do lizy
8 μl buforu do lizy
1 μl proteinazy K
1 μl 10% IGEPAL
przechowywać w lodzie do momentu użycia
2:1 Agaroza:roztwór do lizy (10 μl na pojedynczy oocyt, ilość jest dla 3 oocytów)
20 μl 3% agarozy LMP
10 μl roztworu lizującego
mieszać w 70 °C
Bufor lizujący SDS (501 μl na pojedynczy oocyt)
| 1x TE pH 7,5 | 450 μl |
| 10% SDS | 50 μl |
| Proteinaza K | 1 μl |
| 501 μl |
1. Pobieranie oocytów
- Umieść wypreparowane jajowody mysie w pożywce M2 i przerwij błonę kątnic, aby wydobyć kompleks komórek cumulus.
- Oddziel oocyty od kompleksu komórek cumulus, używając roztworu hialuronidazy o stężeniu 0.3 mg/ml w 30 μl kropli pożywki M2. Trzymaj oocyty w roztworze tylko przez czas niezbędny do usunięcia komórek cumulus, ponieważ długotrwała ekspozycja może je uszkodzić. Przemyj oocyty 3x w 30 μl kropli pożywki M2, okresowo usuwając komórki cumulus.
- Usuń błonę przejrzystą (zona pellucida), stosując kwaśny roztwór Tyrode'a. Umieść oocyty najpierw w jednej 30 μl kropli roztworu, a następnie przenieś je do kolejnej 30 μl kropli, ponieważ każda przeniesiona ilość pożywki rozcieńczy kwas i zmniejszy jego skuteczność. Trzymaj oocyty w roztworze tylko przez czas niezbędny do usunięcia błony przejrzystej, gdyż długotrwała ekspozycja może im zaszkodzić. Uwaga: w przypadku próbek ludzkich można zastosować zwiększone stężenie kwaśnego roztworu Tyrode'a lub pronazy, ponieważ ludzka błona przejrzysta jest bardziej odporna na działanie kwaśnego roztworu Tyrode'a niż mysia.
- Przemyj oocyty jeszcze raz w 30 μl kropli pożywki M2.
2. Osadzanie w agarozie i lizy
- Aby przeprowadzić zatapianie w agarozie, umieść roztwór lizujący na bloku grzewczym o temperaturze 70 °C. Dodaj podgrzaną agarozę LMP do roztworu lizującego w stosunku 2:1 (agaroza:roztwór lizujący).
- Umieść pojedynczy oocyt na czystym szkiełku przedmiotowym w minimalnym medium M2. Pobierz 10 μl roztworu agaroza:roztwór lizujący do końcówki pipety i (pod mikroskopem) delikatnie wydmuchaj niewielką ilość (~1 μl lub mniej) na szkiełko, pozwalając na wymieszanie się z minimalnym medium. Delikatnie pobierz oocyt do końcówki pipety i przelej całe 10 μl do probówki Eppendorf z 300 μl oleju mineralnego, aby kuleczka utworzyła sferę.
Uwaga: proces ten musi być przeprowadzony dość szybko, ponieważ agaroza stężeje, jeśli temperatura spadnie choćby o 5 °C poniżej 70 °C. - Inkubuj probówkę na lodzie przez 10 minut. Aby przeprowadzić lizę, usuń 300 μl oleju mineralnego i dodaj 500 μl buforu lizującego SDS. Inkubuj przez noc w kąpieli wodnej o temperaturze 50 °C.
Uwaga: W tym celu można również zastosować roztwór lizujący (Tabela 1).
DZIEŃ 2
Przygotuj następujące roztwory na świeżo w dniu przeprowadzania mutagenezy z użyciem pirosiarczynu. Aby zmniejszyć ryzyko kontaminacji DNA, często zmieniaj rękawiczki i używaj końcówek z filtrem. Podczas gdy probówki są otwarte, trzymaj je pod kątem w stronę przeciwną do miejsca pracy i zakręcaj wszystkie probówki, gdy nie są używane. Zalecamy przygotowanie roztworów w ilości n+1.
| 3 M NaOH | 2,4 g NaOH w 20 ml autoklawowanej wody ddH2O |
| 0,1 M NaOH | 0,5 ml 3M w 14,5 ml autoklawowanej ddH2O |
| 0,3 M NaOH | 1,5 ml 3M w 13,5 ml autoklawowanej ddH2O |
2,5 M roztwór pirosiarczynu
- 3,8 g pirosiarczynu sodu
5,5 ml destylowanej wody H2O GIBCO
1 ml 3 M NaOH
rozpuścić w temperaturze pokojowej - 110 mg hydrochinonu
1 ml destylowanej wody H2O GIBCO
rozpuścić w temperaturze 90 °C (tylko przez czas niezbędny do rozpuszczenia, mieszając regularnie)
Po całkowitym rozpuszczeniu wymieszać roztwór (a) i (b)
*Przechowywać w ciemności*
3. Mutageneza z użyciem pirosiarczynu
- Całkowicie usunąć 500 μl buforu lizującego SDS i dodać 300 μl oleju mineralnego (~20 godzin). Każda pozostała ilość buforu lizującego rozcieńczy agarozę podczas podgrzewania, co zwiększy podatność kuleczki na rozpuszczanie w kolejnych krokach. Natychmiast przejść do mutagenezy pirosiarczynowej lub przechowywać w temperaturze -20 °C do 5 dni.
- Jeśli dotyczy, wyjąć oocyty z zamrażarki i pozwolić im odtajać (tylko do momentu, gdy kuleczka agarozowa stanie się względnie półprzezroczysta). Inkubować przez 2,5 minuty na bloku grzewczym o temperaturze 90 °C, a następnie inkubować w lodzie przez 10 minut.
Uwaga: Nie mieszać ani nie wstrząsać, nie przedłużać czasu inkubacji powyżej 2,5 minuty i nie dopuszczać do wahań temperatury. - Aby przeprowadzić denaturację, usunąć olej mineralny i dodać do każdej probówki 1 ml 0,1M NaOH, a następnie delikatnie opukać dno i odwrócić probówkę 5-6 razy.
- Inkubować przez 15 minut w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C, odwracając probówki co 3-4 minuty. Kuleczka powinna unosić się w NaOH.
- Aby przeprowadzić traktowanie pirosiarczynem, delikatnie odwirować probówkę, następnie usunąć NaOH i dodać 300 μl oleju mineralnego oraz 500 μl roztworu pirosiarczynu. Inkubować probówkę przez 3,5 godziny w kąpieli wodnej o temperaturze 50 °C. *Chronić przed światłem*
Uwaga: Czas inkubacji może wymagać empirycznego ustalenia dla badanego genu. - Aby przeprowadzić desulfonację, inkubować w lodzie przez 3 minuty, następnie usunąć olej mineralny oraz roztwór pirosiarczynu, delikatnie odwirować i dodać 1 ml 0,3 M NaOH. Opukać dno i odwrócić probówkę 5-6 razy.
- Inkubować przez 15 minut w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C, odwracając probówki co 3-4 minuty. Kuleczka powinna unosić się w NaOH.
- Przemyć próbki: najpierw delikatnie odwirować, następnie usunąć NaOH i dodać 1 ml 1x TE pH 7,5. Wstrząsać przez 5-10 minut w temperaturze pokojowej (na wytrząsarce). Ponownie delikatnie odwirować, a następnie usunąć 1x TE. Powtórzyć ten proces mycia dwukrotnie.
- Dodać 1 ml autoklawowanej wody ddH2O. Wstrząsać przez 5-10 minut w temperaturze pokojowej (na wytrząsarce). Delikatnie odwirować, a następnie usunąć H2O. Powtórzyć mycie ddH2O dwukrotnie.
- Sprawdzić pH supernatantu; powinno ono wynosić pH 5,0. Jeśli roztwór jest wciąż zbyt zasadowy, ponownie przemyć H2O. Usunąć cały supernatant, pozostawiając jedynie kuleczkę agarozową.
4. 1Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. oraz 2nd Runda amplifikacji PCR
- Przygotuj mieszaninę do PCR w 1st rundzie **podczas płukania**
| 10 μM Kapsułkowy starter zewnętrzny (Forward) | 0.5 μl |
| 10 μM Starter odwrotny zewnętrzny | 0.5 μl |
| 240 ng/ml tRNA | 1 μl |
| H2O | 13 μl |
Dodaj do kulek Illustra Ready-to-Go Hot Start PCR
Ostrożnie wsuń stałą kuleczkę agarozy do probówki PCR (~10 μl)
Podgrzej do 70 °C i wymieszaj
Dodaj 25 μl oleju mineralnego
Suma: 50 μl
- Przeprowadź amplifikację
Uwaga: Przykład warunków cyklicznych dla mysiego genu Snrpn obejmuje denaturację przez 2 minuty w 94 °C, a następnie 40 cykli składających się z 30 sekund w 94 °C, 1 minuty w 50 °C oraz 1 minuty w 68 °C; proces kończy etap elongacji trwający 10 minut w 68 °C. Temperatura przyłączania dla 1st rundy PCR dla mysich genów H19 i Peg3 wynosi 50 °C. - Przygotuj mieszaninę do 2nd rundy PCR
| 10 μM Starter Forward Inner | 0.5 μl |
| 10 μM Starter odwrotny wewnętrzny | 0.5 μl |
| H2O | 19 μl |
Dodać do kulek Illustra Ready-to-Go Hot Start PCR
Dodać 5 μl produktu z 1st rundy jako matrycę. Podgrzać produkt z 1st rundy do 70 °C przez 1 minutę, aby rozmiękczyć agarozę. Należy upewnić się, że pipetowanie odbywa się poniżej warstwy oleju mineralnego.
Dodać 25 μl oleju mineralnego
Suma: 50 μl
Uwaga: Sekwencje starterów zagnieżdżonych dla Snrpn, H19, i Peg3 można znaleźć w pracy Market-Velker et al10,12.
- Amplifikuj
Uwaga: Warunki cyklu dla myszy Snrpn denaturacja przez 2 minuty w temperaturze 94 °C, a następnie 40 cykli po 30 sekund w temperaturze 94 °C, 1 minuta w 50 °Coraz 1 minuta w temperaturze 68 °C; oraz końcowy 10-minutowy etap elongacji w temperaturze 68 °C10Myszy H19 i Peg3 wymaga a 50 °C temperatura przyłączania dla 2nd cykl PCR - W ramach testu diagnostycznego próbki z drugiej rundy można poddać trawieniu enzymem restrykcyjnym specyficznym dla metylacji lub szczepu.
| 2nd Produkt okrągły | 4 μl |
| Enzym restrykcyjny | 1 μl |
| Bufor | 1 μl |
| H2O | 4 μl |
- Produkty trawienia poddano elektroforezie na żelu akrylamidowym o stężeniu 8%. Wszelkie niejednorodne prążki wskazują na obecność więcej niż jednej sekwencji.
5. Klonowanie TA i PCR kolonii
- Aby sklonować produkt z 2nd rundy, najpierw podgrzej go do 70 °C przez 1 minutę w celu rozmiękczenia agarozy, a następnie przeprowadź ligację do wektora, korzystając z Promega pGEM-T Vector System (Fisher Scientific Cat#A1360).
| 2nd Cykliczna reakcja PCR | 1 μl |
| wektor pGEMT-EASY | 1 μl |
| Ligaza | 1 μl |
| H2O | 2 μl |
| Bufor do ligacji 2x | 5 μl |
Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C w termocyklerze.
- Rozmrozić kompetentne komórki E.coli na lodzie przez 15 minut (Zymo Research Corp Cat#T3009). Dodać 3 μl reakcji ligacji do 8 μl E.coli i inkubować mieszaninę ligacji na lodzie przez 15 minut.
- Przeprowadzić szok termiczny przez 40 sekund w kąpieli wodnej o temperaturze 42 °C, a następnie inkubować na lodzie przez 2 minuty. Dodać 60 μl pożywki S.O.C. i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę (w inkubatorze z wytrząsaniem).
- Przenieść całą mieszaninę reakcyjną na płytkę LB/Agar/IPTG/Xgal/Amp i inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez noc.
- Przygotować mieszaninę do colony PCR
| 20 μM Starter M13 Forward | 0.7 μl |
| 20 μM starter odwrotny M13 | 0.7 μl |
| Bufor 5X Green Go Taq | 7.0 μl |
| 10 mM dNTP | 0.7 μl |
| polimeraza DNA Taq | 0.28 μl |
| H2O | 25.62 μl |
| 35 μl Suma |
Do probówki do PCR dodaj 35 μl mieszaniny Colony PCR master mix. Za pomocą końcówki pipety pobierz białą kolonię bakterii z płytki i wymieszaj ją w reakcji PCR.
- Przeprowadzić amplifikację z denaturacją przez 10 minut w 94 °C, a następnie 30 cykli obejmujących 45 sekund w 94 °C, 30 sekund w 57 °C oraz 1 minutę w 72 °C, zakończonych końcowym etapem elongacji przez 10 minut w 72 °C. Próbkę o objętości 4 μl poddać elektroforezie na 1,5% żelu agarozowym. Ok. 30 μl produktu PCR przesłać do sekwencjonowania.
Uwaga: W przypadku oocytów sekwencjonuje się produkty PCR z 5 kolonii. - Po otrzymaniu wyników sekwencjonowania można odczytać wzorce metylacji. Każda pierwotna sekwencja CG, która pozostała jako CG, była zmetylowana, natomiast każda pierwotna sekwencja CG, która obecnie jest TG, nie była zmetylowana.
6. Reprezentatywne wyniki
W naszej pracy analizujemy metylację imprintową w pojedynczych oocytach i embrionach (Rycina 1). Po amplifikacji metodą nested PCR z użyciem starterów do konwersji bisulfitowej można potwierdzić prawidłowy przebieg konwersji poprzez wizualizację odpowiedniej wielkości fragmentu na żelu agarozowym (Rycina 2). Pojedynczy oocyt reprezentuje jeden allel rodzicielski i teoretycznie posiada jeden wzorzec metylacji imprintowej. W związku z tym produkty drugiej rundy PCR mogą być badane pod kątem niezamierzonej kontaminacji. Do trawienia produktu drugiej rundy PCR można użyć enzymu restrykcyjnego wrażliwego na metylację DNA (takiego jak HinfI lub DpnII), aby ocenić, czy zawiera on allel zmetylowany czy niezmetylowany (Rycina 3). Zmetylowana cytyzyna w sekwencji rozpoznawanej przez enzym jest rozcinana, natomiast niezmetylowana cytyzyna przekształcona w tyminę nie jest już rozpoznawana przez enzym i pozostaje nierozcięta. Każda próbka oocytu w stadium MII zawierająca zarówno allele zmetylowane, jak i niezmetylowane powinna zostać odrzucona, ponieważ świadczy to o kontaminacji komórkami cumulus (Rycina 3). Po ligacji i transformacji można zwizualizować pomyślną amplifikację koloni metodą PCR na żelu agarozowym, aby upewnić się, że do sekwencjonowania trafiły próbki o prawidłowej wielkości produktu (Rycina 4). Wreszcie, sekwencje pięciu pojedynczych klonów z oocytu MII powinny wykazać pięć identycznych wzorców metylacji oraz identyczny stopień konwersji nonCpG (Rycina 5a). Wszystkie próbki zawierające więcej niż jeden wzorzec powinny zostać odrzucone (Rycina 5b). Ponieważ owulowane oocyty MII posiadają dwie kopie chromosomów lub przylegające ciałko polarne, istnieje możliwość uzyskania dwóch podobnych wzorców sekwencji (Rycina 5c). Zalecamy odrzucenie danych z oocytów wykazujących bardzo odmienne wzorce metylacji, ponieważ nie można wykluczyć kontaminacji komórkami cumulus.
Rysunek 1. Schemat badania mutagenezy pirosiarczynowej pojedynczego oocytu.
Rycina 2. Reprezentatywne wyniki z 2nd cykle amplifikacji dla Snrpn z pojedynczego oocytu w stadium MII na żelu agarozowym o stężeniu 1,5%. Ścieżki 1-4 przedstawiają cztery pojedyncze oocyty w stadium MII, a ścieżka 5 stanowi kontrolę negatywną (brak oocytu). Spodziewana wielkość amplikonu dla Snrpn wynosi 420 bp. L, marker wielkości.
Rysunek 3. Reprezentatywne wyniki z 2nd jednorazowe trawienie restrykcyjne specyficzne dla metylacji dla Snrpn z pojedynczego oocytu w stadium MII na żelu z 8% akrylamidem. HinfI diagnostyczne trawienie restrykcyjne wykazuje niezmetylowane DNA, które posiada nukleotyd T znoszący miejsce restrykcyjne (420 bp, ścieżka 1), lub zmetylowane DNA, które zawiera nukleotyd C w obrębie miejsca rozpoznawania (cięcie, 262, 103 i 54 bp, ścieżka 2). Trawienie wykazujące zarówno zmetylowane, jak i niezmetylowane miejsca dla enzymu restrykcyjnego (cięcie & niepocięte prążki, ścieżka 3) wskazują na zanieczyszczenie komórkami obrąbka. L, drabinka.
Rysunek 4. Reprezentatywne wyniki amplifikacji metodą colony PCR dla Snrpn z pojedynczego oocyta w stadium MII na żelu agarozy 1,5%. Oczekiwany rozmiar amplikonu po ligacji Snrpn do wektora pGEM-T Easy i zastosowaniu starterów M13 forward i reverse wynosi 656 bp. Ścieżki 1-8: amplikony z klonów 1-8. Klon 5 ma nieprawidłowy rozmiar amplikonu i nie powinien zostać przekazany do sekwencjonowania.
Rycina 5. Reprezentatywne wyniki sekwencjonowania Snrpn z pojedynczego oocytu w stadium MII. Snrpn jest zmetylowany w oocytach. Czarne kółka oznaczają zmetylowane CpG. Białe kółka oznaczają niezmetylowane CpG. Numeracja i rozmieszczenie CpG są reprezentatywne dla samicy myszy szczepu B6. a) Oczekiwane wyniki sekwencjonowania Snrpn z pojedynczego oocytu MII. We wszystkich pięciu klonach powinna ulec amplifikacji tylko jedna nić DNA. Do analiz powinny zostać włączone oocyty z pojedynczym wzorcem metylacji i identycznym wzorcem konwersji poza-CpG (procent konwersji poza-CpG wskazany po prawej stronie został obliczony jako liczba cytozyn poza-CpG przekształconych w tyminę jako procent całkowitej liczby cytozyn poza-CpG). b) Wyniki sekwencjonowania Snrpn z pojedynczego oocytu MII z kontaminacją komórkami cumulus. Zwróć uwagę na różnice między stanami metylacji a wzorcami konwersji, co wskazuje na amplifikację wielu nici. c) Wyniki sekwencjonowania Snrpn z pojedynczego oocytu MII z obiema kopiami chromosomu lub włączeniem ciałka polarnego.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Niniejszy test pojedynczego oocyta składa się z wielu etapów, z których kilka jest krytycznych i wymaga szczególnej uwagi. Pierwszym z nich jest płukanie oocytów. Szczególnie ważne jest wielokrotne płukanie każdego oocytu w świeżych kroplach medium poyobróbce hialuronidazą, aby usunąć jak najwięcej komórek cumulus. Ponadto podczas przenoszenia oocytów do zakwaszonego roztworu Tyrode'a w celu usunięcia błony przejrzystej (zona pellucida), należy upewnić się, że w otaczającym medium nie ma komórek cumulus. Po usunięciu bło...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie zgłaszają żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Praca ta była wspierana przez University of Western Ontario, Departament Położnictwa i Ginekologii oraz grant ER06-02-188 z Ministerstwa Badań i Innowacji w ramach nagrody Early Researcher Award. MMD otrzymał wsparcie w ramach stypendium doktoranckiego CIHR Training Program in Reproduction, Early Development and the Impact on Health (REDIH).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Pozyskiwanie oocytów | |||
| Hialuronidaza | Sigma | H4272 | |
| Zakwaszony roztwór Tyrode'a | Sigma | T1788 | |
| Proteinaza K | Sigma | P5568 | |
| 10% IGEPAL | Bioshop | NON999.500 | |
| Bufor do lizy | |||
| Tris pH 7,5 | Bioshop | TRS001.5 | |
| LiCl | Sigma | L9650 | |
| EDTA pH 8,0 | Sigma | E5134 | |
| LiDS | Bioshop | LDS701.10 | |
| DTT | Invitrogen | P2325 | |
| Bufor lizujący SDS | |||
| TE pH 7,5 | Bioshop(Tris)Sigma (EDTA) | TRS001.5 E5134 | |
| 10% SDS | Bioshop | SDS001.500 | |
| Konwersja pirosiarczynowa | |||
| Wodorotlenek sodu | Sigma | S8045 | |
| Wodorosiarczyn sodu (pirosiarczyn sodu) | Sigma | 243973 | |
| Hydrochinon | Sigma | H9003 | |
| Agaroza niskotopliwa (LMP) | Sigma | A9414 | |
| Olej mineralny | Sigma | M8410 | |
| Pożywka M2 | Sigma | M7167 | |
| Woda destylowana GIBCO | Invitrogen | 15230-196 | |
| Autoklawowana woda podwójnie destylowana (dd) | |||
| PCR | |||
| Illustra Hot Start Mix RTG | GE Healthcare | 28-9006-54 | |
| 240 ng/ml tRNA drożdżowej | Invitrogen | 15401-011 | |
| Wewnętrzne i zewnętrzne primery zagnieżdżone | Sigma | ||
| Ligacja | |||
| Wektor Promega pGEM-T Easy | Fisher Scientific | A1360 | |
| Klonowanie TA | |||
| Kompetentne E. coli komórki | Zymo Research Corp. | T3009 | |
| Sprzęt | |||
| Mikroskop stereoskopowy | |||
| 70 °C i 90 °C Bloki grzejne | |||
| 37 °C i 50 °C Kąpiele wodne (42 °C dla transformacji) | |||
| Kolebka laboratoryjna | |||
| termocykler |
Bibliografia
- Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nat. Genet. 33, 245-254 (2003).
- Rodenhiser, D., Mann, M. Epigenetics and human disease: translating basic biology into clinical applications. CMAJ. 174, 341-348 (2006).
- Frommer, M. A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 1827-1831 (1992).
- Clark, S. J., Harrison, J., Paul, C. L., Frommer, M. High sensitivity mapping of methylated cytosines. Nucleic Acids Res. 22, 2990-2997 (1994).
- Feil, R., Charlton, J., Bird, A. P., Walter, J., Reik, W. Methylation analysis on individual chromosomes: improved protocol for bisulphite genomic sequencing. Nucleic Acids Res. 22, 695-696 (1994).
- Raizis, A. M., Schmitt, F., Jost, J. P. A bisulfite method of 5-methylcytosine mapping that minimizes template degradation. Anal. Biochem. 226, 161-166 (1995).
- Patterson, K., Molloy, L., Qu, W., Clark, S. DNA Methylation: Bisulphite Modification and Analysis. J. Vis. Exp. (56), e3170(2011).
- Olek, A., Oswald, J., Walter, J. A modified and improved method for bisulphite based cytosine methylation analysis. Nucleic Acids Res. 24, 5064-5066 (1996).
- Mann, M. R. Selective loss of imprinting in the placenta following preimplantation development in culture. Development. 131, 3727-3735 (2004).
- Market-Velker, B. A., Zhang, L., Magri, L. S., Bonvissuto, A. C., Mann, M. R. Dual effects of superovulation: loss of maternal and paternal imprinted methylation in a dose-dependent manner. Hum. Mol. Genet. 19, 36-51 (2010).
- Meng, L. H., Xiao, S. Q., Huang, X. F., Zhou, Y., Xu, B. S. A study on bisulfite sequencing method for methylation status of imprinted genes in single human oocytes. Zhonghua Yi Xue Yi Chuan Xue Za Zhi. 25, 289-292 (2008).
- Denomme, M. M., Zhang, L., Mann, M. R. Embryonic imprinting perturbations do not originate from superovulation-induced defects in DNA methylation acquisition. Fertil. Steril. 96, 734-738 (2011).
- Tahiliani, M. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324, 930-935 (2009).
- Hajj, N. E. l Limiting dilution bisulfite (pyro)sequencing reveals parent-specific methylation patterns in single early mouse embryos and bovine oocytes. Epigenetics. 6, 1176-1188 (2011).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
