Mutageneza wodorosiarczynu pojedynczego oocytu

Podsumowanie

Mutageneza wodorosiarczynowa jest złotym standardem w analizie metylacji DNA. Nasz zmodyfikowany protokół pozwala na analizę metylacji DNA na poziomie pojedynczej komórki i został specjalnie zaprojektowany dla poszczególnych oocytów. Może być również stosowany do zarodków w fazie rozszczepienia.

Streszczenie

Epigenetyka obejmuje wszystkie dziedziczne i odwracalne modyfikacje chromatyny, które zmieniają dostępność genów, a zatem są głównymi mechanizmami regulacji transkrypcji genów¹. Metylacja DNA jest modyfikacją epigenetyczną, która działa głównie jako znak represyjny. Poprzez kowalencyjne dodanie grupy metylowej do cytozyn w dinukleotydach CpG, może rekrutować dodatkowe białka represyjne i modyfikacje histonów w celu zainicjowania procesów związanych z kondensacją chromatyny i wyciszaniem genów². Metylacja DNA jest niezbędna do prawidłowego rozwoju, ponieważ odgrywa kluczową rolę w programowaniu rozwojowym, różnicowaniu komórek, represji elementów retrowirusowych, inaktywacji chromosomu X i imprintingu genomu.

Jedną z najpotężniejszych metod analizy metylacji DNA jest mutageneza wodorosiarczynowa. Wodorosiarczyn sodu jest mutagenem DNA, który deaminuje cytozyny do uracyli. Po amplifikacji i sekwencjonowaniu PCR te zdarzenia konwersji są wykrywane jako tyminy. Metylowane cytozyny są chronione przed deaminacją i tym samym pozostają jako cytozyny, umożliwiając identyfikację metylacji DNA na poziomie poszczególnych nukleotydów³. Rozwój testu mutagenezy wodorosiarczynowej posunął się naprzód od pierwotnie zgłoszonych^4-6 do tych, które są bardziej czułe i powtarzalne⁷. Jednym z kluczowych postępów było osadzenie mniejszych ilości DNA w kulce agarozy, chroniąc w ten sposób DNA przed ostrym traktowaniem wodorosiarczynem⁸. Umożliwiło to przeprowadzenie analizy metylacji na pulach oocytów i zarodków w stadium blastocysty⁹. Najbardziej zaawansowany jak dotąd protokół mutagenezy wodorosiarczynowej dotyczy pojedynczych zarodków w stadium blastocysty¹⁰. Ponieważ jednak blastocysty mają średnio 64 komórki (zawierające 120-720 pg genomowego DNA), metoda ta nie jest skuteczna w badaniach metylacji na pojedynczych oocytach lub zarodkach w fazie rozszczepienia.

Biorąc pod uwagę wskazówki dotyczące osadzania w agarozie niewielkich ilości DNA, w tym oocytów¹¹, tutaj prezentujemy metodę, dzięki której oocyty są bezpośrednio zanurzane w kulce agarozy i roztworu do lizy natychmiast po pobraniu i usunięciu osłonki przejrzystej z oocytu. Dzięki temu możemy ominąć dwa główne wyzwania związane z mutagenezą wodorosiarczynów pojedynczego oocytu: ochronę niewielkiej ilości DNA przed degradacją i późniejszą utratę podczas licznych etapów protokołu. Co ważne, ponieważ dane są uzyskiwane z pojedynczych oocytów, eliminowany jest problem błędu systematycznego PCR w obrębie pul. Ponadto za pomocą tej metody można wykryć niezamierzone zanieczyszczenie komórkami wzgórka, ponieważ każda próbka z więcej niż jednym wzorcem metylacji może zostać wyłączona z analizy¹². Protokół ten zapewnia ulepszoną metodę udanych i powtarzalnych analiz metylacji DNA na poziomie pojedynczej komórki i idealnie nadaje się do pojedynczych oocytów, a także zarodków w fazie rozszczepienia.

Protokół

DZIEŃ 1

Przygotuj następujące roztwory świeże w dniu pobrania oocytów za pomocą sterylnej, destylowanej wody, takiej jak woda GIBCO. Aby zmniejszyć ryzyko zanieczyszczenia DNA, często zmieniaj rękawiczki i używaj końcówek filtrujących. Trzymaj rurki pod kątem, gdy są otwarte, i zakryj wszystkie rurki, gdy nie są używane. Zalecamy, aby rozwiązania były wykonywane jako n+1.

3% LMP Agaroza

30 mg Agaroza
do 1 ml GIBCO H₂O
rozpuścić @ 70 °C

Roztwór do lizy

8 μl buforu do lizy
1 μl proteinazy K
1 μl 10% IGEPAL
Umieść na lodzie, aż będzie gotowy do użycia

2:1 Agaroza:Roztwór do lizy (10 μl na pojedynczy oocyt, ilość dotyczy 3 oocytów)

20 μl 3% LMP agaroza
10 μl roztworu do lizy
mieszać @ 70 °C

Bufor do lizy SDS (501 μl na pojedynczy oocyt)

1x TE pH 7,5 450 μl 10% SDS 50 μl Proteinaza K 1 μl   501 μl

1. Kolekcja oocytów

1. Umieść wypreparowane jajowody myszy w pożywce M2 i rozerwij bańki, aby wyodrębnić kompleks komórek wzgórka.
2. Oddzielić oocyty od kompleksu komórek wzgórka za pomocą 0,3 mg/ml roztworu hialuronidazy w kropli 30 μl pożywki M2. Przechowuj oocyty w roztworze tylko tak długo, jak jest to potrzebne do usunięcia komórek wzgórka, ponieważ długotrwała ekspozycja może je uszkodzić. Przemyj oocyty 3x w 30 μl kropli pożywki M2, okresowo usuwając komórki wzgórka.
3. Usunąć osłonę przejrzystą za pomocą kwaśnego roztworu tyrode. Najpierw umieść oocyty w jednej kropli roztworu o objętości 30 μl, a następnie przenieś do kolejnej kropli o objętości 30 μl, ponieważ każde przenoszone ze sobą podłoże rozcieńczy kwas i zmniejszy jego wydajność. Utrzymuj oocyty w roztworze tylko tak długo, jak jest to potrzebne do usunięcia strefy, ponieważ długotrwała ekspozycja może je uszkodzić. Uwaga: w przypadku próbek ludzkich można zastosować zwiększone stężenie kwaśnego roztworu tyrody lub pronazy, ponieważ ludzka osłonka przejrzysta jest bardziej odporna na traktowanie kwaśnym roztworem tyrodu niż mysz.
4. Ponownie umyj oocyty w 30 μl kropli pożywki M2.

2. Osadzanie agarozy i liza

1. Aby wykonać zatapianie agarozy, umieść roztwór do lizy na bloku grzewczym o temperaturze 70 °C. Dodaj podgrzaną agarozę LMP do roztworu do lizy, tworząc roztwór do lizy agarozy w stosunku 2:1.
2. Umieść pojedynczy oocyt na czystym szkiełku podstawowym w minimalnej ilości M2. Pobrać 10 μl roztworu agarozy: do lizy na końcówkę pipety i (pod mikroskopem) delikatnie wylać niewielką ilość (~1 μl lub mniej) na szkiełko podstawowe, pozwalając na zmieszanie z minimalną ilością podłoża. Delikatnie nabierz oocyt do końcówki pipety i umieść wszystkie 10 μl w probówce Eppendorf z 300 μl oleju mineralnego, tak aby kulka utworzyła kulę.
   Uwaga: proces ten należy przeprowadzić dość szybko, ponieważ agaroza stwardnieje, jeśli temperatura spadnie zaledwie o 5 °C poniżej 70 °C.
3. Inkubować probówkę na lodzie przez 10 minut. Aby przeprowadzić lizę, usuń 300 μl oleju mineralnego i dodaj 500 μl buforu do lizy SDS. Inkubować przez noc w łaźni wodnej o temperaturze 50 °C.
   Uwaga: W tym celu można również użyć roztworu do lizy (tabela 1).

DZIEŃ 2

Przygotuj następujące roztwory świeże w dniu mutagenezy wodorosiarczynowej. Aby zmniejszyć ryzyko zanieczyszczenia DNA, często zmieniaj rękawiczki i używaj końcówek filtrujących. Trzymaj rurki pod kątem, gdy są otwarte, i zakryj wszystkie rurki, gdy nie są używane. Zalecamy, aby rozwiązania były wykonywane jako n+1.

3 M NaOH 2,4 g NaOH w 20 ml autoklawizowanego ddH₂O 0,1 mln NaOH 0,5 ml 3M w 14,5 ml autoklawizowanego ddH₂O 0,3 mln NaOH 1,5 ml 3M w 13,5 ml autoklawizowanego ddH₂O

2.5 M roztwór wodorosiarczynu

1. 3,8 g wodorosiarczynu sodu
   5,5 ml GIBCO destylowany H₂O
   1 ml 3 M NaOH
   rozpuścić @ temperatura pokojowa
2. 110 mg hydrochinonu
   1 ml GIBCO destylowany H₂O
   rozpuścić @ 90 °C (tylko tak długo, jak długo trwa rozpuszczenie, regularnie mieszać)

Po całkowitym rozpuszczeniu, wymieszaj roztwór (a) i (b)
*Trzymać z dala od światła*

3. Mutageneza wodorosiarczynowa

1. Całkowicie usuń 500 μl buforu do lizy SDS i dodaj 300 μl oleju mineralnego (~20 godzin). Pozostały bufor do lizy rozcieńczy agarozę po podgrzaniu, a kulka będzie bardziej podatna na rozpuszczenie w kolejnych etapach. Natychmiast należy przeprowadzić mutagenezę wodorosiarczynową lub przechowywać w temperaturze -20 °C do 5 dni.
2. W razie potrzeby wyjmij oocyty z zamrażarki i pozostaw do rozmrożenia (tylko do momentu, gdy kulka agarozy stanie się stosunkowo przezroczysta). Inkubować przez 2,5 minuty w bloku grzewczym o temperaturze 90 °C, a następnie inkubować na lodzie przez 10 minut.
   Uwaga: Nie mieszaj ani nie mieszaj, nie przedłużaj dłużej niż 2.5 minuty ani nie zmieniaj temperatury.
3. Aby przeprowadzić denaturację, usuń olej mineralny i dodaj 1 ml 0,1 M NaOH do każdej probówki, przesuń i odwróć 5-6 razy.
4. Inkubować przez 15 minut w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, odwracając co 3-4 minuty. Koralik powinien unosić się w NaOH.
5. Aby przeprowadzić obróbkę wodorosiarczynem, delikatnie obrócić probówkę, a następnie usunąć NaOH i dodać 300 μl oleju mineralnego i 500 μl roztworu wodorosiarczynu. Inkubować probówkę przez 3,5 godziny w łaźni wodnej o temperaturze 50 °C. *Przechowywać z dala od światła*
   Uwaga: Długość inkubacji może wymagać empirycznego określenia dla genu będącego przedmiotem zainteresowania.
6. Aby przeprowadzić odsiarczanie, inkubować na lodzie przez 3 minuty, następnie usunąć olej mineralny i roztwór wodorosiarczynu, delikatnie odwirować i dodać 1 ml 0,3 M NaOH. Przesuń i odwróć 5-6 razy.
7. Inkubować przez 15 minut w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, odwracając co 3-4 minuty. Koralik powinien unosić się w NaOH.
8. Umyć próbki, najpierw delikatnie obracając, a następnie usunąć NaOH i dodać 1 ml 1x TE pH 7,5. Wstrząsaj przez 5-10 minut w temperaturze pokojowej (na shakerze). Ponownie delikatnie zakręć, a następnie wyjmij 1x TE. Powtórz ten proces prania dwukrotnie.
9. Dodaj 1 ml autoklawizowanego ddH₂O. Wstrząsaj przez 5-10 minut w temperaturze pokojowej (na shakerze). Delikatnie odwiruj, a następnie wyjmij H₂O. Powtórz dwukrotne mycie ddH₂O.
10. Sprawdzić pH supernatantu; powinno ono wynosić 5,0. Jeśli nadal jest zbyt podstawowy, przemyj ponownie za pomocą_H2O. Usuń cały supernatant, pozostawiając tylko kulkę agarozy.

4. 1ⁱ 2 runda amplifikacji PCR

1. Przygotuj 1. rundę mieszanki PCR **podczas mycia**

10 μM Podkład do przodu zewnętrzny 0,5 μl 10 μM Podkład Odwrotny Zewnętrzny 0,5 μl 240 ng/ml tRNA 1 μl H₂O 13 μl

Dodaj do Illustra Gotowe do użycia koraliki do PCR na gorąco
Ostrożnie wsuń stały koralik agarozy do probówki PCR (~10 μl)
Podgrzać do temperatury 70 °C i wymieszać
Dodać 25 μl oleju mineralnego
Razem: 50 μl

2. Amplify
   Uwaga: Przykładowe warunki cykliczne dla mysiego Snrpn to denaturacja trwająca 2 minuty w temperaturze 94 °C, a następnie 40 cykli po 30 sekund w temperaturze 94 °C, 1 minuta w temperaturze 50 °C i 1 minuta w temperaturze 68 °C; i końcowy 10-minutowy etap wydłużania w temperaturze 68 °C. Temperatura wyżarzania dla 1. rundy PCR dla myszy H19 i Peg3 wynosi 50 °C.
3. Przygotuj 2. rundę mieszanki PCR

10 μM Podkład do przodu wewnętrzny 0,5 μl 10 μM Podkład odwrócony wewnętrzny 0,5 μl H₂O 19 μl

Dodaj do Illustra Gotowe do użycia koraliki do PCR na gorąco
Dodaj 5 μl 1 okrągłego produktu jako szablon. Podgrzej 1^{. rundę} produktu do 70 °C przez 1 minutę, aby zmiękczyć agarozę. Pamiętaj, aby pipetować poniżej warstwy oleju mineralnego.
Dodać 25 μl oleju mineralnego
Razem: 50 μl

Uwaga: Zagnieżdżone sekwencje starterów dla Snrpn, H19 i Peg3 można znaleźć w Market-Velker et al^10,12.

4. Amplify
   Uwaga: Warunki cykliczne dla mysiego Snrpn to denaturacja przez 2 minuty w temperaturze 94 °C, a następnie 40 cykli po 30 sekund w temperaturze 94 °C, 1 minuta w temperaturze 50 °C i 1 minuta w temperaturze 68 °C; i końcowy 10-minutowy etap wydłużania w temperaturze 68 °C¹⁰. Mysz H19 i Peg3 wymagają temperatury wyżarzania 50 °C dla 2^rundy PCR.
5. Jako test diagnostyczny, próbki drugiej rundy mogą być cięte za pomocą enzymu restrykcyjnego, który jest specyficzny dla metylacji lub szczepu.

2. okrągły produkt 4 μl Enzym restrykcyjny 1 μl bufor 1 μl H₂O 4 μl

6. Elektroforezę produktów trawienia na 8% żelu akrylowym. Dowolne pasma heterogeniczne reprezentują więcej niż jedną sekwencję.

5. Klonowanie TA i PCR kolonii

1. Aby sklonować produkt z drugiej rundy, najpierw podgrzej do 70 °C przez 1 minutę, aby zmiękczyć agarozę, a następnie podwiąż do wektora za pomocą systemu wektorowego Promega pGEM-T (Fisher Scientific Cat#A1360).

2^runda PCR 1 μl Grafika wektorowa pGEMT-EASY 1 μl Ligaza 1 μl H₂O 2 μl 2x bufor podwiązania 5 μl

Inkubować przez noc @ 4 °C w maszynie do PCR.

2. Rozmrażaj kompetentne komórki E. coli na lodzie przez 15 minut (Zymo Research Corp Cat#T3009). Dodać 3 μl reakcji ligacji do 8 μl E.coli i inkubować ligację na lodzie przez 15 minut.
3. Szok termiczny przez 40 sekund w łaźni wodnej o temperaturze 42 °C i inkubować na lodzie przez 2 minuty. Dodać 60 μl pożywki S.O.C. i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę (w shakerze).
4. Umieścić całą mieszaninę reakcyjną na płytce LB/Agar/IPTG/Xgal/Amp i inkubować na płytce w temperaturze 37 °C przez noc.
5. Przygotuj mieszankę PCR kolonii

20 μM M13 Podkład do przodu 0,7 μl 20 μM M13 Podkład odwrotny 0,7 μl 5X Bufor Green Go Taq 7,0 μl 10 mM dNTP 0,7 μl Polimeraza DNA Taq 0,28 μl H₂O 25,62 μl   35 μl Łącznie

Dodaj 35 μl głównej mieszanki Colony PCR do probówki PCR. Za pomocą końcówki pipety wybierz białą kolonię bakterii z płytki i zamieszaj ją w reakcji PCR.

6. Amplifikować z denaturacją przez 10 minut w temperaturze 94 °C, następnie 30 cykli po 45 sekund w temperaturze 94 °C, 30 sekund w temperaturze 57 °C i 1 minutę w temperaturze 72 °C, a następnie końcowy 10-minutowy etap wydłużania w temperaturze 72 °C. Elektroforeza 4 μl w 1,5% żelu agarozowym. Wyślij ~30 μl produktu PCR do sekwencjonowania.
   Uwaga: W przypadku oocytów sekwencjonuje się 5 produktów PCR kolonii.
7. Po uzyskaniu wyników sekwencjonowania można odczytać wzorce metylacji. Każdy oryginalny CG, który pozostał jako CG, został zmetylowany, a każdy oryginalny CG, który jest teraz TG, był niemetylowany.

6. Reprezentatywne wyniki

W naszej pracy badamy wdrukowaną metylację w poszczególnych oocytach i zarodkach (Rysunek 1). Po zagnieżdżonej amplifikacji PCR przy użyciu starterów przekształconych w wodorosiarczyn, możliwe jest potwierdzenie udanej konwersji poprzez wizualizację prawidłowego rozmiaru fragmentu na żelu agarozowym (ryc. 2). Pojedynczy oocyt reprezentuje jeden allel rodzicielski i teoretycznie ma jeden wdrukowany wzór metylacji. W związku z tym produkty drugiej rundy PCR mogą być testowane pod kątem niezamierzonego zanieczyszczenia. Enzym restrykcyjny wrażliwy na metylację DNA (taki jak HinfI lub DpnII) może być użyty do trawienia produktu drugiej rundy PCR w celu oceny, czy zawiera on allel metylowany czy niemetylowany (ryc. 3). Metylowany C w sekwencji rozpoznawania enzymu jest rozszczepiany, podczas gdy niemetylowany C, który jest przekształcany w T, nie jest już rozpoznawany przez enzym i jest niecięty. Każda próbka oocytów MII zawierająca zarówno allele metylowane, jak i niemetylowane powinna zostać odrzucona, ponieważ wskazuje to na zanieczyszczenie komórek wzgórka (ryc. 3). Po podwiązaniu i transformacji, udana amplifikacja PCR kolonii może być wizualizowana na żelu agarozowym, aby upewnić się, że próbki o odpowiedniej wielkości produktu są wysyłane do sekwencjonowania (Figura 4). Wreszcie, sekwencja pięciu pojedynczych klonów z oocytu MII powinna wytworzyć pięć identycznych wzorców metylacji i identyczne współczynniki konwersji nieCpG (Figura 5a). Wszelkie próbki, które zawierają więcej niż jeden wzór, należy odrzucić (rysunek 5b). Ponieważ owulowane oocyty MII mają dwie kopie chromosomów lub dołączone ciało biegunowe, istnieje możliwość uzyskania dwóch podobnych wzorców sekwencji (ryc. 5c). Zalecamy odrzucenie danych z oocytów, które mają bardzo różne wzorce metylacji, ponieważ nie można wykluczyć zanieczyszczenia komórek wzgórka.

Rysunek 1. Schemat testu mutagenezy wodorosiarczynowej pojedynczego oocytu.

Rysunek 2. Reprezentatywne wyniki amplifikacji Snrpn w 2^{. rundzie z} pojedynczego oocytu MII na 1,5% żelu agarozowym. Pasy 1-4 to cztery pojedyncze oocyty MII, a tor 5 to kontrola ujemna (brak oocytu). Oczekiwany rozmiar amplikonu dla Snrpn to 420 bp. L, drabina.

Rysunek 3. Reprezentatywne wyniki trawienia restrykcyjnego specyficznego dla metylacji w^{drugiej rundzie} dla Snrpn z pojedynczego oocytu MII na 8% żelu akrylamidowym. Diagnostyczne trawienie restrykcyjne HinfI pokazuje niemetylowane DNA, które zawiera T, które znosi miejsce restrykcyjne (420 pz, ścieżka 1) lub metylowane DNA, które zawiera C w miejscu rozpoznawania (cięcie, 262, 103 i 54 pz, pasmo 2). Trawienie wykazujące zarówno metylowane, jak i niemetylowane miejsca enzymów restrykcyjnych (pasma cięte i nieprzecięte, ścieżka 3) wskazują na zanieczyszczenie komórek wzgórka. L, drabina.

Rysunek 4. Reprezentatywne wyniki amplifikacji PCR kolonii w kierunku Snrpn z pojedynczego oocytu MII na 1,5% żelu agarozowym. Oczekiwana wielkość amplikonu po ligacji Snrpn do wektora pGEM-T Easy i użyciu starterów M13 do przodu i do tyłu wynosi 656 pz. Pas 1-8, amplikony z klonów 1-8. Klon 5 ma nieprawidłowy rozmiar amplikonu i nie powinien być wysyłany do sekwencjonowania.

Rysunek 5. Reprezentatywne wyniki sekwencjonowania dla Snrpn z pojedynczego oocytu MII. Snrpn jest metylowany w oocytach. Czarne kółka oznaczają metylowane CpG. Białe kółka oznaczają niemetylowane CpG. Liczba i umiejscowienie CpG są reprezentatywne dla samicy myszy szczepu B6. a) Oczekiwane wyniki sekwencjonowania Snrpn z pojedynczego oocytu MII. Tylko pojedyncza nić DNA powinna amplifikować się we wszystkich pięciu klonach. W analizach należy uwzględnić oocyty z pojedynczym wzorcem metylacji i identycznym wzorcem konwersji nie-CpG (procentową konwersję nie-CpG wskazanych po prawej stronie obliczono jako liczbę cytozyn nie-CpG przekształconych w tyminę jako procent całkowitych cytozyn nie-CpG). b) Wyniki sekwencjonowania dla Snrpn z pojedynczego oocytu MII z zanieczyszczeniem komórkami wzgórka. Zwróć uwagę na różnicę między stanami metylacji a wzorcami konwersji wskazującymi na amplifikację wieloniciową. c) Wyniki sekwencjonowania Snrpn z pojedynczego oocytu MII z obiema kopiami chromosomów lub włączeniem do ciała polarnego.

Dyskusja

Ten pojedynczy test oocytów składa się z wielu etapów, z których wiele jest krytycznych i wymaga szczególnej ostrożności. Pierwszym z nich jest mycie komórek jajowych. Szczególnie ważne jest, aby po leczeniu hialuronidazą wielokrotnie przemyć każdy oocyt w świeżych kroplach pożywki, aby usunąć jak najwięcej komórek wzgórka. Ponadto, przenosząc oocyty do kwaśnego roztworu tyrode w celu usunięcia osłonki przejrzystej, upewnij się, że otaczające podłoże jest wolne od komórek wzgórka. Oocyt jest bardzo lepki po usunięciu zon...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Oocyte Collection
Hyaluronidase	Sigma	H4272
Acidic Tyrode	Sigma	T1788
Proteinaza K	Sigma	P5568
10% IGEPAL	Bioshop	NON999.500
Roztwór do lizy
Tris pH 7.5	Bioshop	TRS001.5
LiCl	Sigma	L9650
EDTA pH 8.0	Sigma	E5134
LiDS	Bioshop	LDS701.10
DTT	Invitrogen	P2325
SDS Bufor do lizy
TE pH 7.5	Bioshop(Tris)Sigma (EDTA)	TRS001.5 E5134
10% SDS	Bioshop	SDS001.500
Bisulfit Konwersja
Wodorotlenek sodu	Sigma	S8045
Wodorosiarczyn sodu (wodorosiarczyn sodu)	Sigma	243973
Hydrochinon	Sigma	H9003
Niska temperatura topnienia (LMP) Agaroza	Sigma	A9414
Olej mineralny	Sigma	M8410
M2 Średnia	Sigma	M7167
GIBCO Woda destylowana	Invitrogen	15230-196
Autoklawowana woda podwójnie destylowana (dd) <
strong>PCR
Illustra Hot Start Mix RTG	GE Healthcare	28-9006-54
240 ng/ml drożdżowe tRNA	Invitrogen	15401-011
Wewnętrzne i zewnętrzne zagnieżdżone podkłady	Sigma
Ligation
Promega pGEM-T Easy Vector	Fisher Scientific	A1360
TA Klonowanie
kompetentne komórki E.coli	Zymo Research Corp.	T3009
Sprzęt
Mikroskop
70 ° C oraz 90 ° C Bloki
37 ° C oraz 50 ° C Kąpiele wodne (42 ° C jak transformacje)
Maszyna
Rocker