Liofilizacja jest często łatwym i wygodnym sposobem pozyskiwania suchych produktów zawierających żywe komórki bakteryjne. Kluczowym problemem w tym procesie jest przeżywalność komórek. Opisujemy tutaj procedurę pozwalającą zbadać, w jaki sposób przeżywalność komórek podczas liofilizacji jest kształtowana przez właściwości zastosowanej formulacji.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Składy do liofilizacji bakterii i ich wpływ na przeżywalność komórek
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Wodę komórkową można usunąć, aby odwracalnie dezaktywować mikroorganizmy w celu ułatwienia ich przechowywania. Jedną z takich metod usuwania wody jest liofilizacja, uważana za łagodną metodę odwadniania. Aby zwiększyć przeżywalność komórek podczas suszenia, są one często poddawane wcześniejszemu formułowaniu. Formuła tworzy matrycę, w której osadzone są komórki, co chroni je przed różnymi szkodliwymi stresami wywołanymi podczas mrożenia i suszenia. Przedstawiamy tutaj ogólną metodę oceny przeżywalności komórek po liofilizacji i ilustrujemy ją, porównując wyniki uzyskane dla czterech różnych formuł: disacharydu sacharozy, polimeru pochodnego sacharozy Ficoll PM400 oraz odpowiednich polisacharydów: hydroksyetylocelulozy (HEC) i hydroksypropylometylocelulozy (HPMC), na dwóch szczepach bakterii, P. putida KT2440 i A. chlorophenolicus A6. W niniejszej pracy ilustrujemy, jak przygotować formuły do liofilizacji oraz jak badać mechanizmy przeżywalności komórek po rehydratacji poprzez charakterystykę formuły z wykorzystaniem różnicowej kalorymetrii skaningowej (DSC), pomiarów napięcia powierzchniowego, analizy rentgenowskiej i mikroskopii elektronowej oraz odnoszenie tych danych do wskaźników przeżywalności. Polimery wybrano tak, aby struktura monomerów poszczególnych polisacharydów w różnym stopniu przypominała sacharozę. Korzystając z tej konfiguracji metody, wykazaliśmy, że polimery mogą wspierać przeżywalność komórek równie skutecznie jak disacharydy, pod warunkiem kontrolowania określonych właściwości fizycznych formuły1.
Protokół
1. Hodowla i pozyskiwanie P. putida
- Przygotować kulturę startową Pseudomonas putida, szczepiąc 100 ml bulionu sojowo-kazeinowego (TSB) kolonią komórek P. putida hodowanych na agarze z bulionem sojowo-kazeinowym (TSA). Hodowlę inkubować w temperaturze 30 °C na inkubatorze wytrząsowym ustawionym na 130 rpm.
- Po 7 hr przenieść do świeżego medium TSB alikwot z kultury startowej odpowiadający 1/10 końcowej objętości kultury głównej. Komórki inkubować w temperaturze 30 °C na inkubatorze wytrząsowym przy 130 rpm przez 16 hr.
- Po 16 hr wzrostu zebrać komórki poprzez wirowanie kultury przy 1,500 x g przez 20 min w RT. Od....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Tabela 1 przedstawia dane dotyczące składu formulacji, zdarzeń termicznych zarejestrowanych metodą DSC podczas ogrzewania zamrożonych formulacji, struktury próbek suchych oraz napięcia powierzchniowego roztworów formulacji. Wartość Tg' sacharozy została określona na -40 °C 2, 3 i może być trudna do wykrycia przy stężeniach sacharozy poniżej 20% w/w. Zdarzenie termiczne przy -35 °C prawdopodobnie wiąże się z początkiem rozpuszczania lodu2. Struktura krystaliczna w.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Celem niniejszego badania było zbadanie niektórych właściwości formulacji, które mogą mieć znaczenie dla przeżywalności komórek podczas liofilizacji. Chociaż wewnętrzna tolerancja na suszenie różni się w zależności od gatunku, co zilustrowano na Ryc. 1A, trend dotyczący tego, jak dobrze różne formulacje wspierają przeżywalność komórek, jest podobny. Warto rozpocząć od porównania sacharozy i Ficollu. Uważa się, że kluczowym czynnikiem warunkującym wsparcie przeżywalności komórek przez formulację jest zdol.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Praca została sfinansowana przez Szwedzką Fundację Strategicznych Badań nad Środowiskiem (MISTRA) w ramach programu DOM oraz z grantu 211684 (BACSIN) z programu ramowego FP7 Wspólnoty Europejskiej. Dziękujemy J. Engstrand za pomoc w filmowaniu analizy rentgenowskiej oraz L. Tang za pomoc w opracowaniu koncepcji narracyjnej.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Ficoll PM 400 | GE-healthcare | 17-0300-10 | |
| HEC (Natrosol-M stopień farmaceutyczny) | Ashland | Dar od firmy Ashland | |
| HPMC (Methocel F4M) | Dow | Dar od Wydziału Farmacji Uniwersytetu w Uppsali | |
| Sacharoza | Sigma-Aldrich | S2395 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71376 | |
| Pożywka Tryptic Soy broth | Merck | 105459 | |
| Agar Tryptic Soy | Merck | 105458 | |
| Lyostar II | FTS Kinetics | N.A. | |
| Pyris Diamond DSC | Perkin-Elmer | N.A. | |
| Dyfraktometr Bruker AXS SMART CCD 1k | Bruker | N.A | |
| Dwuwiązkowy FEI Strata DB235 FIB/SEM | FEI | N.A | |
| Tensiometr edukacyjny Krüss | Krüss | N.A. |
Bibliografia
- Wessman, P., Mahlin, D., et al. Impact of matrix properties on the survival of freeze-dried bacteria. J. Sci. Food Agric. 91 (14), 2518-2528 (2011).
- Ablett, S., Izzard, M. J., et al. Differential Scanning....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
