Składy do liofilizacji bakterii i ich wpływ na przeżywalność komórek

Podsumowanie

Liofilizacja jest często łatwym i wygodnym sposobem pozyskiwania suchych produktów zawierających żywe komórki bakteryjne. Kluczowym problemem w tym procesie jest przeżywalność komórek. Opisujemy tutaj procedurę pozwalającą zbadać, w jaki sposób przeżywalność komórek podczas liofilizacji jest kształtowana przez właściwości zastosowanej formulacji.

Streszczenie

Wodę komórkową można usunąć, aby odwracalnie dezaktywować mikroorganizmy w celu ułatwienia ich przechowywania. Jedną z takich metod usuwania wody jest liofilizacja, uważana za łagodną metodę odwadniania. Aby zwiększyć przeżywalność komórek podczas suszenia, są one często poddawane wcześniejszemu formułowaniu. Formuła tworzy matrycę, w której osadzone są komórki, co chroni je przed różnymi szkodliwymi stresami wywołanymi podczas mrożenia i suszenia. Przedstawiamy tutaj ogólną metodę oceny przeżywalności komórek po liofilizacji i ilustrujemy ją, porównując wyniki uzyskane dla czterech różnych formuł: disacharydu sacharozy, polimeru pochodnego sacharozy Ficoll PM400 oraz odpowiednich polisacharydów: hydroksyetylocelulozy (HEC) i hydroksypropylometylocelulozy (HPMC), na dwóch szczepach bakterii, P. putida KT2440 i A. chlorophenolicus A6. W niniejszej pracy ilustrujemy, jak przygotować formuły do liofilizacji oraz jak badać mechanizmy przeżywalności komórek po rehydratacji poprzez charakterystykę formuły z wykorzystaniem różnicowej kalorymetrii skaningowej (DSC), pomiarów napięcia powierzchniowego, analizy rentgenowskiej i mikroskopii elektronowej oraz odnoszenie tych danych do wskaźników przeżywalności. Polimery wybrano tak, aby struktura monomerów poszczególnych polisacharydów w różnym stopniu przypominała sacharozę. Korzystając z tej konfiguracji metody, wykazaliśmy, że polimery mogą wspierać przeżywalność komórek równie skutecznie jak disacharydy, pod warunkiem kontrolowania określonych właściwości fizycznych formuły¹.

Protokół

1. Hodowla i pozyskiwanie P. putida

1. Przygotować kulturę startową Pseudomonas putida, szczepiąc 100 ml bulionu sojowo-kazeinowego (TSB) kolonią komórek P. putida hodowanych na agarze z bulionem sojowo-kazeinowym (TSA). Hodowlę inkubować w temperaturze 30 °C na inkubatorze wytrząsowym ustawionym na 130 rpm.
2. Po 7 hr przenieść do świeżego medium TSB alikwot z kultury startowej odpowiadający 1/10 końcowej objętości kultury głównej. Komórki inkubować w temperaturze 30 °C na inkubatorze wytrząsowym przy 130 rpm przez 16 hr.
3. Po 16 hr wzrostu zebrać komórki poprzez wirowanie kultury przy 1,500 x g przez 20 min w RT. Odlać nadsącz i przemyć komórki, resuspendując osad komórkowy w roztworze NaCl izotonicznym względem medium wzrostowego. W tym przypadku zastosowano roztwór 150 mM NaCl. Następnie komórki ponownie odwirować i odlać nadsącz przed resuspensją komórek w medium formulacyjnym, patrz krok 3.2.

2. Hodowla innych gatunków

1. Aby dostosować protokół do innych gatunków bakterii, procedury hodowli i zbioru należy zmienić zgodnie z wymaganiami danego gatunku. Aby uniknąć szoku osmotycznego podczas manipulacji komórkami w trakcie zbioru i etapów płukania, osmolalność roztworów musi odpowiadać osmolalności pożywki w momencie zbioru.

3. Formułowanie komórek

1. Przygotować roztwory formulacji, odważając odpowiednie składniki matrycy i rozpuszczając je w wodzie. Aby uzyskać warunki izotoniczne, należy skorygować ilość substancji pomocniczej lub dodać NaCl bądź inny kompatybilny z komórkami rozpuszczalnik, aby osiągnąć pożądaną osmolalność. W przypadku substancji o niskiej masie cząsteczkowej, takich jak disacharydy, ilości można łatwo dostosować w celu uzyskania warunków izotonicznych. W przypadku substancji o wysokiej masie cząsteczkowej, takich jak polimery, toniczność należy skorygować za pomocą kompatybilnych z komórkami substancji rozpuszczalnych, np. NaCl lub disacharydów. Należy pamiętać, że dodanie jakiejkolwiek substancji wpłynie na właściwości fizyczne formulacji, co z kolei może wpłynąć na przebieg liofilizacji i przeżywalność komórek.
2. Odlać roztwór piorący (w tym przypadku NaCl) i ponownie zawiesić komórki w odpowiednich mediach formulacyjnych.
3. Upewnić się, że komórki są homogenicznie rozproszone. Formulacje o niskiej lepkości poddaje się mieszaniu w wortexie, natomiast formulacje o wyższej lepkości miesza się, dodając np. magnesy mieszające i wstrząsając pojemnikiem do momentu uzyskania homogenicznego zmieszania.
4. Rozdzielić formulacje do fiolek do liofilizatora. Fiolki należy zważyć przed napełnieniem, z próbką przed liofilizacją oraz po liofilizacji, aby obliczyć ilość wody usuniętej podczas procesu.
5. Założyć gumowe korki do fiolek, jeżeli mają one zostać zamknięte wewnątrz liofilizatora (patrz krok 4.3).
6. Policzyć komórki w każdej formulacji przed liofilizacją (patrz krok 6).

4. Liofilizacja

1. Warunki liofilizacji muszą być dostosowane do właściwości fizycznych formulacji. Najważniejszym parametrem jest w tym przypadku temperatura przejścia szklistego, Tg, formulacji, oznaczana jako Tg' dla próbki zamrożonej w procesie koncentracji, aby wskazać na obecność wody. Tg' formulacji zamrożonej w procesie koncentracji można łatwo zmierzyć za pomocą różnicowej kalorymetrii skaningowej (DSC), patrz krok 7.
2. Należy dostosować parametry procesu liofilizacji w taki sposób, aby temperatura próbki była zawsze niższa od jej temperatury przejścia szklistego (Tg), a ciśnienie w komorze umożliwiało szybką sublimację lodu.tj. suszenie pierwotne oraz pozostała zawartość wody w formulacji, t. j. suszenie wtórne. Jeśli podczas procesu suszenia temperatura próbki przekroczy wartość Tg', istnieje duże ryzyko zapadnięcia się struktury próbki, co może znacząco obniżyć przeżywalność komórek.
3. Aby chronić produkty suche po liofilizacji, należy kontrolować atmosferę w próbkach. Jeśli to możliwe, należy zamknąć szczelnie próbki w liofilizatorze przed zwolnieniem próżni pod koniec cyklu liofilizacji. Alternatywnie fiolki można napełnić wybraną atmosferą. Ważne jest, aby unikać wystawiania próbek na warunki otoczenia, ponieważ każda wilgoć lub tlen obecny w atmosferze przechowywania wpłynie na przeżywalność komórek.
4. Zważ fiolki.

5. Rehydratacja

1. Rehydratuj próbki za pomocą sterylnej wody dejonizowanej. Ilość dodanej wody powinna być taka sama, jak ilość usuniętej podczas liofilizacji; oblicza się ją na podstawie masy pustej fiolki oraz tej samej fiolki z próbką przed i po liofilizacji. Próbki należy mieszać w wortexie w odstępach czasu, aż roztwory staną się jednorodne.

6. Wyliczanie

1. Pobrać 100 μl z każdej próbki i przygotować dziesięciokrotne rozcieńczenia seryjne. Z wybranych rozcieńczeń 100 μl nanosi się na płytki TSA. Płytki inkubuje się w wymaganej temperaturze i czasie.

7. Charakterystyka zachowania podczas zamrażania sformułowania

1. Odważ niewielką ilość próbki, 5 - 10 mg, i umieść ją w aluminiowym tyglu do DSC z pokrywką. Przygotuj pusty tygiel jako referencję.
2. Ustaw program skanowania temperatury w DSC. Program chłodzenia należy ustawić tak, aby odwzorowywał etap zamrażania w programie liofilizacji. Jest to konieczne, ponieważ kinetyka chłodzenia może wpływać na Tg' uwodnionych formulacji. Przed rozpoczęciem skanowania grzewczego obniż temperaturę znacznie poniżej oczekiwanego Tg' badanych formulacji, zazwyczaj do -100 °C.
3. Wybierz odpowiednią szybkość grzania; zazwyczaj stosuje się szybkość grzania od 5 - 40 °C/min. Rejestrowany sygnał przepływu ciepła wyrażony jest w watach i zależy od szybkości grzania. Wyższa szybkość grzania spowoduje uzyskanie wyraźniejszego sygnału Tg'.
4. Ustaw zakres temperatury tak, aby obejmował zarówno Tg', jak i topnienie formulacji.

8. Pomiary napięcia powierzchniowego uwodnionych formulacji

1. Układ doświadczalny wykorzystany w tym eksperymencie jest zgodny z metodą du Noüya do pomiaru napięcia powierzchniowego.
2. Należy starannie oczyścić pierścień platynowy oraz naczynie pomiarowe. Naczynie płucze się acetonem, wyciera tkanką beztkankową, a następnie wypala od wewnątrz bezbarwnym płomieniem. Pierścień rozgrzewa się do czerwoności w bezbarwnym płomieniu.
3. Naczynie należy napełnić roztworem i odczekać do ustabilizowania się powierzchni przed przystąpieniem do pomiaru. W przypadku roztworów, w których stan równowagi jest osiągany dopiero po długim czasie, np. polimerów, zastosowany tutaj prosty układ dostarczy danych jakościowych.
4. W przypadku formulacji o wysokiej lepkości, np. roztworów 2% (w/w) HEC lub HPMC, napięcie powierzchniowe należy zmierzyć dla roztworów o niższych stężeniach, a następnie dokonać ekstrapolacji. Można to zrobić, korzystając z faktu, że spadek napięcia powierzchniowego stabilizuje się przy stężeniach poniżej 0,5% (w/w).

9. Analiza rentgenowska preparatów w formie suchej

1. Pobrać niewielką ilość matrycy/bakterii i umieścić ją w uchwycie na próbkę.
2. Zamontować uchwyt z próbką w dyfraktometrze rentgenowskim.
3. W celu analizy obecnych w próbce faz krystalicznych można wykorzystać pakiet programistyczny EVA firmy Bruker.

10. Mikroskopia elektronowa

1. Pobierz niewielką ilość matrycy/bakterii z probówek i przymocuj ją do podstawka SEM.
2. Umieść uchwyt SEM w napylaczu (w niniejszej pracy użyto Thermo VGScientific Polaron SC7640) i pokryj próbkę kilkoma nm Au/Pd lub Pt. W tych eksperymentach parametry napylania wynosiły: 1 900 V, 20 mA oraz 20 s, co pozwoliło uzyskać powłokę Au/Pd o grubości ~ 5 - 10 nm. Powłoka ta ogranicza ładowanie elektryczne podczas akwizycji obrazu. Zaleca się rozpoczęcie od cienkiej powłoki; jeśli ładowanie nadal występuje i powoduje artefakty obrazu, próbkę należy napylić ponownie.
3. Wprowadź uchwyt SEM do komory SEM. Dobierz odpowiednie parametry obrazowania. Dla urządzenia użytego na Rysunku 2 (FEI Strata DB235) zastosowano napięcie przyspieszające 5 kV, rozmiar plamki (spotsize) 3, odległość roboczą 5 mm oraz detektor elektronów wtórnych.
4. Opcjonalnie można wykorzystać skupioną wiązkę jonów (FIB) do wykonania przekrojów bakterii zatopionych w polimerze w celu ujawnienia dalszych szczegółów.

Wyniki

Tabela 1 przedstawia dane dotyczące składu formulacji, zdarzeń termicznych zarejestrowanych metodą DSC podczas ogrzewania zamrożonych formulacji, struktury próbek suchych oraz napięcia powierzchniowego roztworów formulacji. Wartość T_g' sacharozy została określona na -40 °C ^{2, 3} i może być trudna do wykrycia przy stężeniach sacharozy poniżej 20% w/w. Zdarzenie termiczne przy -35 °C prawdopodobnie wiąże się z początkiem rozpuszczania lodu². Struktura krystaliczna w...

Dyskusja

Celem niniejszego badania było zbadanie niektórych właściwości formulacji, które mogą mieć znaczenie dla przeżywalności komórek podczas liofilizacji. Chociaż wewnętrzna tolerancja na suszenie różni się w zależności od gatunku, co zilustrowano na Ryc. 1A, trend dotyczący tego, jak dobrze różne formulacje wspierają przeżywalność komórek, jest podobny. Warto rozpocząć od porównania sacharozy i Ficollu. Uważa się, że kluczowym czynnikiem warunkującym wsparcie przeżywalności komórek przez formulację jest zdol...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Ficoll PM 400	GE-healthcare	17-0300-10
HEC (Natrosol-M stopień farmaceutyczny)	Ashland		Dar od firmy Ashland
HPMC (Methocel F4M)	Dow		Dar od Wydziału Farmacji Uniwersytetu w Uppsali
Sacharoza	Sigma-Aldrich	S2395
NaCl	Sigma-Aldrich	71376
Pożywka Tryptic Soy broth	Merck	105459
Agar Tryptic Soy	Merck	105458
Lyostar II	FTS Kinetics	N.A.
Pyris Diamond DSC	Perkin-Elmer	N.A.
Dyfraktometr Bruker AXS SMART CCD 1k	Bruker	N.A
Dwuwiązkowy FEI Strata DB235 FIB/SEM	FEI	N.A
Tensiometr edukacyjny Krüss	Krüss	N.A.