Czujnik oparty na pustych mikroiğłach do multipleksowego transdermalanego detekcji elektrochemicznej

Podsumowanie

Niniejszy artykuł szczegółowo opisuje konstrukcję multipleksowego czujnika opartego na mikroiigłach. Urządzenie to jest opracowywane w celu prowadzenia pobierania próbek in situ oraz analizy elektrochemicznej wielu analitów w sposób szybki i selektywny. Przewidujemy zastosowanie tych czujników opartych na mikroigłach w medycynie klinicznej oraz badaniach biomedycznych.

Streszczenie

Opracowanie małoinwazyjnego, multipleksowego systemu monitorowania do szybkiej analizy cząsteczek istotnych biologicznie mogłoby umożliwić osobom cierpiącym na przewlekłe schorzenia łatwą ocenę ich aktualnego stanu fizjologicznego. Ponadto mogłoby ono służyć jako narzędzie badawcze do analizy złożonych, wieloczynnikowych stanów chorobowych. Aby taki czujnik wieloanalityczny mógł zostać zrealizowany, musi on być małoinwazyjny, pobieranie płynu śródmiąższowego musi odbywać się bez bólu i szkody dla użytkownika, a analiza musi być szybka oraz selektywna.

Mikroigły, początkowo opracowane w celu bezbolesnego podawania leków, były wykorzystywane do dostarczania szczepionek oraz czynników farmakologicznych (np. insuliny) przez skórę.^1-2 Ponieważ urządzenia te mają dostęp do przestrzeni śródmiąższowej, mikroigły zintegrowane z mikroelektrodami mogą służyć jako transdermalne czujniki elektrochemiczne. Wykazano możliwość selektywnej detekcji glukozy, glutaminianu, mleczanu, nadtlenku wodoru oraz kwasu askorbinowego przy użyciu zintegrowanych urządzeń typu mikroigła-elektroda, w których elementami przetwarzającymi były włókna węglowe, zmodyfikowane pasty węglowe oraz polimerowe mikroigły powlekane platyną.^3-7,8

Ta technologia sensorów z mikroigłami umożliwiła zastosowanie nowatorskiego i zaawansowanego podejścia analitycznego do jednoczesnej detekcji wielu analitów in situ. Multipleksowanie stwarza możliwość monitorowania złożonych mikrośrodowisk, które w przeciwnym razie byłyby trudne do szybkiej i małoinwazyjnej charakterystyki. Przykładowo, technologia ta mogłaby zostać wykorzystana do jednoczesnego monitorowania pozakomórkowych poziomów glukozy, mleczanów i pH,⁹ które są istotnymi wskaźnikami metabolicznymi stanów chorobowych^7,10-14 (np. proliferacji nowotworowej) oraz kwasicy wysiłkowej.¹⁵

Protokół

1. Wytwarzanie mikroił

1. Za pomocą oprogramowania do modelowania trójwymiarowego Solidworks (Dassault Systemes SA, Velizy, Francja) zaprojektuj macierz pustych mikroigieł o kształcie piramidalnym (Rysunek 1).^3-5
2. Zaprojektuj strukturę wsporczą dla macierzy mikroigieł przy użyciu oprogramowania Magics RP 13 (Materialise NV, Leuven, Belgia). Struktura wsporcza umożliwia odpływ żywicy z urządzenia podczas wytwarzania i stanowi podstawę, na której budowane są mikroigły. Przykład struktury wsporczej przedstawiono na Rysunku 1.
3. Powiązane pliki struktury wsporczej i macierzy mikroigieł zostają przesłane do oprogramowania Perfactory RP (EnvisionTEC GmbH, Gladbeck, Niemcy), które steruje procesem wytwarzania. W tym pakiecie oprogramowania wybierz liczbę macierzy mikroigieł do wykonania i określ rozmieszczenie urządzeń na platformie produkcyjnej.
4. Przeprowadź kalibrację w trybie ultrafioletowym przy 180 mW dla systemu szybkiego prototypowania Perfactory i zweryfikuj, czy odchyłka energii mieści się w granicach ±2 mW.
5. Po zakończeniu procesu wytwarzania usuń macierze mikroigieł z płyty podstawowej i wywołaj w izopropanolu przez 15 minut. Osusz macierze sprężonym powietrzem, a następnie utwardź mikroigły w temperaturze pokojowej przez 50 sekund w systemie do dotwardzania Otoflash Postcuring System (EnvisionTEC GmbH, Gladbeck, Niemcy), aby zapewnić pełną polimeryzację.
6. Zwaliduj proces wytwarzania mikroigieł za pomocą mikroskopii i sprawdź, czy otwór każdej mikroigły jest pusty i drożny. W pełni wytworzone mikroigły przedstawiono na Rysunku 2.

2. Wytwarzanie macierzy elektrod z pasty węglowej

1. Użyj systemu laserowego rastrowo-wektorowego CO₂ Model 6.75 o mocy 60 W (Universal Laser Systems, Inc., Scottsdale, AZ), aby wyciąć otwory i odsłonić znajdujące się pod nimi, indywidualnie adresowalne miedziane przewody łączące w płaskiej taśmie elastycznej (21039-0249), pozyskanej z komercyjnego źródła (Molex Connector Corp., Lisle, IL) (Rycina 3 (A i B)). Umieść płaskie taśmy elastyczne w uchwycie, aby prawidłowo wyrównać je na płycie do ablacji laserowej. Zastosuj metodę rastrowania w celu utworzenia wnęk o średnicy 500 μm w części izolacyjnej taśmy elastycznej. Wzory ablacji są tworzone w programie CorelDraw (Corel, Ottawa, Ontario) i przesyłane do systemu laserowego.
2. Oczyść zmodyfikowane płaskie taśmy elastyczne za pomocą aerografu rozpylającego aceton pod ciśnieniem 40 psi. Zakończ czyszczenie, płucząc je izopropanolem i wodą dejonizowaną. Zweryfikuj pod mikroskopem, czy nad odsłoniętymi miedzianymi paskami nie pozostała warstwa izolacyjna.
3. Kolejnym krokiem jest utworzenie wnęki utrzymującej do wypełnienia pastami węglowymi. Taśma Melinex (grubość 0.002", jednostronnie powlekana akrylowym klejem wrażliwym na nacisk) jest poddawana ablacji zgodnie z tym samym wzorem co paski elektrod, orientowana nad ablowanymi paskami elektrod i ściskana pod ciśnieniem 3000 psi przez 2 minuty, aby zapewnić prawidłowe połączenie. W tym przypadku średnica wnęki wynosi 750 μm.
4. Dodatkowa warstwa taśmy Melinex (grubość 0.004", dwustronnie powlekana akrylowym klejem wrażliwym na nacisk) jest następnie poddawana ablacji według tego samego wzoru co taśma jednostronnie klejąca i używana po wyrównaniu do połączenia matryc mikroigieł z matrycami elektrod z pasty węglowej.

3. Synteza funkcjonalnych past węglowych i wypełnianie wgłębień elektrod

1. Pasta węglowa czuła na glukozę została przygotowana na podstawie wcześniejszej receptury poprzez mieszanie 10 mg oksydazy glukozowej i 2,2 mg poli(etyleniminy) aż do uzyskania homogenicznej mieszaniny.¹⁶ Do mieszaniny tej dodaje się 60 mg proszku rodu na węglu (ładowanie 5%). Następnie dodaje się 40 mg oleju mineralnego i miesza. Pasty przechowuje się w temperaturze 4 °C do momentu użycia; można ich używać do jednego tygodnia po przygotowaniu.
2. Pastę węglową czułą na pH otrzymuje się poprzez zmieszanie 30% (m/m) oleju mineralnego i 70% (m/m) proszku grafitowego. Pastę należy wprowadzić do otworu elektrody zgodnie z opisem w sekcji 3.4. Przygotowuje się roztwór 10 mM soli diazoniowej Fast Blue RR (chlorek 4-benzoylamino-2,5-dimetoksybenzenodiazoniowy półchlorek cynku) w 0,5 M kwasie fosforowym.¹⁷ Kroplę 20 μl tego roztworu nanosi się na elektrodę z wprowadzoną pastą i pozostawia na 30 minut w celu spontanicznej chemisorpcji soli diazoniowej Fast Blue PR. Następnie płucze się wodą dejonizowaną i przechowuje w buforze lub wodzie dejonizowanej, gdy elektroda nie jest używana.
3. Pasta węglowa czuła na mleczan została przygotowana na podstawie wcześniejszej receptury poprzez zmieszanie 2,5 mg proszku rodu na węglu i 2,5 mg oksydazy mleczanowej, naprzemiennie stosując 5 minut sonikacji i 5 minut mieszania w vorteksie przez pięć cykli.¹⁸
4. Wprowadzanie zmodyfikowanych past do przygotowanej płaskiej taśmy elastycznej odbywa się poprzez nakładanie odpowiednich past na otwory elektrod. Do wygładzenia pasty używa się cienkiego kawałka plastiku (np. krawędzi plastikowej łódki wagowej), ubijając pastę aż do uzyskania gładkiej powierzchni. Czynność powtarza się z drugą, czystą łódką wagową, aż do usunięcia nadmiaru pasty. Następnie płucze się wodą dejonizowaną. Schemat przedstawiający ablację laserową w celu stworzenia otworów, wprowadzanie past węglowych oraz integrację mikroił dożylnych (opisane w sekcjach 2 i 3) znajduje się na Ryc. 3.

4. Detekcja i kalibracja czujnika

1. Wykrywanie mleczanu odbywa się poprzez pomiar odpowiedzi chronoamperometrycznej czujnika przy -0.15 V i zapisanie natężenia prądu po 15 sekundach w 0.1 M buforze fosforanowym (pH=7.5). Rysunek 4(a) przedstawia schemat reakcji elektrokatalitycznej służącej do wykrywania mleczanu.
2. Wykrywanie glukozy przeprowadza się w podobny sposób, mierząc odpowiedź chronoamperometryczną czujnika przy -0.05 V i zapisując natężenie prądu po 15 sekundach w 0.1 M buforze fosforanowym (pH 7.0). Rysunek 4(b) przedstawia schemat reakcji elektrokatalitycznej służącej do wykrywania glukozy.
3. Wartość pH monitoruje się poprzez przeprowadzanie skanów woltamperometrii cyklicznej w zakresie od -0.7 V do 0.8 V przy prędkości 100 mV/s i zapisywanie pozycji potencjału piku utleniania. Schemat reakcji redoks dla pomiaru pH przedstawiono na Rysunku 5.
4. Krzywe kalibracyjne dla czujników glukozy i mleczanu można stworzyć poprzez sukcesywne dodawanie odpowiedniego anality; pomiary chronoamperometryczne wykonuje się po każdym dodaniu analitytu, zgodnie z opisem w sekcjach 5.1 i 5.2. Alternatywnie, pomiary chronoamperometryczne przy stałym potencjale można przeprowadzić podczas mieszania, pozostawiając wystarczający czas (~10-100 sekund) między kolejnymi dodaniami analitytu w celu stabilizacji prądu.
5. Krzywe kalibracyjne pH można stworzyć poprzez pomiar pozycji potencjału piku utleniania w serii znanych wartości pH od 5 do 8 w odstępach 1.0 jednostki pH i zapisywanie woltamperogramów cyklicznych zgodnie z opisem w sekcji 5.3.

5. Reprezentatywne wyniki

Podczas pozyskiwania krzywych chronoamperometrycznych (np. w celu detekcji glukozy lub mleczanu) w niezmąconych roztworach przy użyciu mikronigieł wypełnionych zmodyfikowaną pastą węglową, natężenie prądu natychmiast spadnie po przyłożeniu odpowiedniego potencjału detekcji. Ostatecznie prąd ten zmaleje do wartości stanu stacjonarnego. Reprezentatywny wynik przedstawiono na Rysunku 6; wynik ten uzyskano po dodaniu 2 mM mleczanu i rejestracji za pomocą mikronigły do mleczanu. Po każdym dodaniu mleczanu roztwór należy krótko zamieszać. Natężenie prądu po 15 sekundach wzrasta wraz ze zwiększeniem stężenia mleczanu; odpowiedź prądową można następnie wykorzystać do oznaczenia stężenia mleczanu w nieznanym roztworze. Alternatywnie można zastosować ciągłe monitorowanie w zamieszanym roztworze (lub w przepływie), co zademonstrowano dla roztworu o rosnącym stężeniu glukozy (Rysunek 5). Ponownie, wzrost natężenia prądu przy zwiększaniu stężenia glukozy może służyć do standaryzacji odpowiedzi na glukozę w nieznanym roztworze. Po każdym skoku stężenia należy odczekać odpowiedni czas, aby umożliwić stabilizację roztworu. Woltamperogramy cykliczne zarejestrowane mikronigłą czułą na pH w 0,1 M buforze fosforanowym dla czterech różnych roztworów o pH od 5 do 8 w odstępach 1 jednostki pH przedstawiono na Rysunku 6. Potencjał piku utleniania przesuwa się wraz ze wzrostem pH; zjawisko to jest wykorzystywane jako wskaźnik wartości pH.

Rysunek 1. Obrazy pliku STL macierzy mikroił oraz stworzonej w Solidworks (A) oraz zrzut ekranu przedstawiający strukturę wsporczą (B).

Rysunek 2. Mikrografie elektronowe skaningowe macierzy mikroił (A) oraz pojedynczej mikroigły w obrębie tej macierzy (B).

Rycina 3. Schemat montażu elastycznego płaskiego kabla. Przedstawione etapy obejmują modyfikację elastycznego płaskiego kabla (A), ablację wzorowanych kół (B), dodanie wstępnie poddanej ablacji warstwy Melinex wypełnionej pastą węglową (C) oraz dodanie drugiej poddanej ablacji warstwy Melinex i połączenie z matrycą mikroiłek (D). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinę.

Rysunek 4. Kalibracja pasty czułej na mleczan z wykorzystaniem 15-sekundowych pomiarów chronoamperometrycznych przy -0.15 V w 0.1 M buforze fosforanowym (pH=7.5). Każdy wzrost natężenia prądu odpowiada dodaniu 2 mM mleczanu.

Rysunek 5. Kalibracja elektrody pastowej czułej na glukozę podczas skanów chronoamperometrycznych przy -0.05 V. Każdy spadek odpowiedzi odpowiada dodaniu 2 mM glukozy. Podczas kalibracji mieszano 0.1 M roztwór buforu fosforanowego (pH=7.0). W badaniu zastosowano zewnętrzne elektrody referencyjną Ag/AgCl i pomocniczą Pt.

Rysunek 6. Woltamperogram cykliczny (CV) pasty węglowej wrażliwej na pH w 0,1 M buforze fosforanowym w zakresie pH 5-8 z krokiem 1 jednostki pH (turkusowy=pH 8,0, zielony=pH 7,0, fioletowy=pH 6,0, czerwony=pH 5,0). Do analizy wykorzystano piąty CV względem elektrody odniesienia Ag/AgCl oraz platynowej elektrody pomocniczej w formie drutu.

Dyskusja

Przed wykonaniem urządzenia rozważono wiele aspektów konstrukcji tego czujnika opartego na mikroigłach. Aby możliwe było zastosowanie tego czujnika do detekcji w czasie rzeczywistym, czas odpowiedzi czujnika musi być krótki; w niniejszym protokole każdy przetestowany czujnik wykazywał czas odpowiedzi poniżej piętnastu sekund. Pasty użyte w tym protokole zostały również dobrane ze względu na ich selektywność w obrębie in vivo środowiska, które zawierają elektroaktywne biomolekuły mogące zakłócać odpowiedź elektro...