Pusty czujnik mikroigłowy do multipleksowanego transdermalnego wykrywania elektrochemicznego

Summary

Ten artykuł szczegółowo opisuje budowę multipleksowanego czujnika opartego na mikroigłach. Urządzenie jest opracowywane do pobierania próbek in situ i analizy elektrochemicznej wielu analitów w szybki i selektywny sposób. Przewidujemy zastosowania tych czujników opartych na mikroigłach w medycynie klinicznej i badaniach biomedycznych.

Abstract

Opracowanie minimalnie inwazyjnego multipleksowanego systemu monitorowania do szybkiej analizy biologicznie istotnych cząsteczek mogłoby zaoferować osobom cierpiącym na przewlekłe schorzenia łatwą ocenę ich bezpośredniego stanu fizjologicznego. Co więcej, może służyć jako narzędzie badawcze do analizy złożonych, wieloczynnikowych schorzeń. Aby taki czujnik wieloanalitowy mógł zostać zrealizowany, musi być minimalnie inwazyjny, pobieranie próbek płynu śródmiąższowego musi odbywać się bez bólu i szkody dla użytkownika, a analiza musi być szybka i selektywna.

Początkowo opracowane do bezbolesnego dostarczania leków, mikroigły były używane do dostarczania szczepionek i środków farmakologicznych (np. insuliny) przez skórę. ^1-2 Ponieważ urządzenia te mają dostęp do przestrzeni śródmiąższowej, mikroigły zintegrowane z mikroelektrodami mogą być używane jako transdermalne czujniki elektrochemiczne. Selektywne wykrywanie glukozy, glutaminianu, mleczanu, nadtlenku wodoru i kwasu askorbinowego wykazano przy użyciu zintegrowanych urządzeń z elektrodami mikroigłowymi z włóknami węglowymi, zmodyfikowanymi pastami węglowymi i mikroigłami polimerowymi pokrytymi platyną służącymi jako elementy transdukcyjne. ^3-7,8

Ta technologia czujników mikroigłowych umożliwiła nowatorskie i wyrafinowane podejście analityczne do in-situ i jednoczesnego wykrywania wielu analitów. Multipleksowanie oferuje możliwość monitorowania złożonych mikrośrodowisk, które w innym przypadku są trudne do scharakteryzowania w szybki i minimalnie inwazyjny sposób. Na przykład, technologia ta może być wykorzystana do jednoczesnego monitorowania zewnątrzkomórkowych poziomów glukozy, mleczanu i pH^{, które} są ważnymi wskaźnikami metabolicznymi stanów chorobowych^7,10-14 (np. proliferacji raka) i kwasicy wywołanej wysiłkiem fizycznym. ¹⁵

Protocol

1. Produkcja mikroigieł

1. Korzystając z oprogramowania do modelowania trójwymiarowego Solidworks (Dassault Systemes SA, Velizy, Francja), zaprojektuj pusty w środku układ mikroigłowy w kształcie piramidy (rysunek 1). ^3-5
Rozdział
2. Zaprojektuj konstrukcję nośną dla układu mikroigłowego za pomocą oprogramowania Magics RP 13 (Materialise NV, Leuven, Belgia). Konstrukcja nośna umożliwia odpływ żywicy z urządzenia podczas produkcji i stanowi podstawę, na której zbudowane są mikroigły. Przykładowa konstrukcja podporowa jest pokazana na rysunku 1.
3. Połączone pliki podpór i matryc mikroigłowych są przesyłane do oprogramowania Perfactory RP (EnvisionTEC GmbH, Gladbeck, Niemcy), które kontroluje proces produkcji. W tym pakiecie oprogramowania wybierz liczbę matryc mikroigłowych do wytworzenia i określ rozmieszczenie urządzeń na płycie produkcyjnej.
4. Uruchom kalibrację w trybie ultrafioletowym przy 180 mW dla systemu szybkiego prototypowania Perfactory i sprawdź, czy odchylenie energii mieści się w zakresie ±2 mW.
5. Po zakończeniu produkcji wyjmij matryce mikroigłowe z płytki podstawy i rozwijaj w izopropanolu przez 15 minut. Wysuszyć matryce sprężonym powietrzem i utwardzić mikroigły w temperaturze pokojowej przez 50 sekund w systemie Otoflash Postcuring System (EnvisionTEC GmbH, Gladbeck, Niemcy), aby zapewnić pełną polimeryzację.
6. Zweryfikuj wytwarzanie mikroigieł za pomocą mikroskopii i sprawdź, czy każdy otwór mikroigłowy jest pusty i drożny. W pełni wykonane mikroigły pokazano na rysunku 2.

2. Produkcja matryc elektrod z pasty węglowej

1. Użyj rastrowego/wektorowego systemu laserowego Model 6.75 CO₂ o mocy 60 W (Universal Laser Systems, Inc., Scottsdale, AZ), aby wyciąć otwory i odsłonić leżące pod spodem, indywidualnie adresowalne przewody miedziane połączeniowe w płaskim elastycznym (21039-0249), który został uzyskany ze źródła komercyjnego (Molex Connector Corp., Lisle, IL) (Rysunek 3 (A i B)). Umieść płaskie, elastyczne w przyrządzie, aby prawidłowo ustawić je na płytce do ablacji laserowej. Użyj podejścia rastrowego, aby utworzyć wgłębienia o średnicy 500 μm w izolacyjnej części elastycznego. Szablony do ablacji są tworzone w programie CorelDraw (Corel, Ottawa, Ontario) i przesyłane do systemu laserowego.
2. Oczyść zmodyfikowane płaskie, elastyczne za pomocą aerografu, który rozpyla aceton pod ciśnieniem 40 psi. Zakończ ich czyszczenie, spłukując izopropanolem i wodą dejonizowaną. Sprawdź pod mikroskopem, czy na odsłoniętych paskach miedzianych nie pozostała żadna folia izolacyjna.
3. Kolejnym krokiem jest stworzenie wnęki mocującej do pakowania past węglowych. Taśma Melinex (grubość 0,002 cala pokryta jednostronnie klejem akrylowym wrażliwym na nacisk) jest ablana z tym samym wzorem, co paski elektrod, zorientowana na ablowane paski elektrod i ściskana pod ciśnieniem 3000 psi przez 2 minuty, aby zapewnić prawidłowe połączenie. W tym przypadku średnica wnęki wynosi 750 μm.
4. Dodatkowa warstwa taśmy Melinex (o grubości 0,004 cala pokryta z dwóch stron klejem akrylowym wrażliwym na nacisk) jest następnie ablowana w ten sam wzór, co jednostronna taśma klejąca i jest używana po wyrównaniu do łączenia matryc mikroigłowych z matrycami elektrod z pasty węglowej.

3. Synteza funkcjonalnych past węglowych i upakowanie wnęk elektrod

1. Wrażliwa na glukozę pasta węglowa oparta jest na poprzedniej recepturze i jest otrzymywana przez zmieszanie 10 mg oksydazy glukozowej i 2,2 mg poli(etyleniminy) do uzyskania jednorodnej mieszaniny. ¹⁶ Do tej mieszaniny dodaje się 60 mg rodu na proszku węglowym (5% obciążenia). Dodaje się 40 mg oleju mineralnego, a następnie miesza. Pasty przechowuje się w temperaturze 4 °C do czasu użycia; Pasty stosuje się do tygodnia po przygotowaniu.
2. Wrażliwa na pH pasta węglowa jest otrzymywana przez zmieszanie 30% (w/w) oleju mineralnego i 70% (w/w) proszku grafitowego. Umieścić pastę we wnęce elektrody w sposób opisany w sekcji 3.4. Sporządzić roztwór 10 mM soli diazoniowej Fast Blue RR (sól chlorku 4-benzoiloamino-2,5-dimetoksybenzenodiazonium hemi (chlorku)) w 0,5 M kwasie fosforowym. ¹⁷, Umieść kroplę 20 μl tego roztworu na wypełnionej elektrodzie pasty na 30 minut, aby spontanicznie chemisorbować sól diazoniową Fast Blue PR. Spłucz wodą dejonizowaną i przechowuj w buforze lub wodzie dejonizowanej, gdy nie jest używana.
3. Wrażliwa na mleczan pasta węglowa jest oparta na poprzedniej recepturze i jest otrzymywana przez zmieszanie 2,5 mg rodu z proszkiem węglowym i 2,5 mg oksydazy mleczanowej, naprzemiennie przez 5 minut sonikacji i 5 minut wirowania przez pięć obrotów. ^{Rozdział 18}
4. Pakowanie zmodyfikowanych past do przygotowanego płaskiego elastycznego odbywa się poprzez nałożenie odpowiednich past na wnęki elektrod. Używając cienkiego kawałka plastiku (np. krawędzi plastikowej łódki do ważenia) jako kielni i upakować pastę, aż uzyskasz gładką powierzchnię. Powtórz z drugą czystą łodzią wagową, aż nadmiar pasty zostanie usunięty. Umyć wodą dejonizowaną. Schemat przedstawiający ablację laserową w celu wytworzenia ubytków, upakowanie past węglowych i integrację mikroigłową (opisaną w sekcji 2 i 3) przedstawiono na rysunku 3.

4. Wykrywanie i kalibracja czujnika

1. Wykrywanie mleczanów odbywa się poprzez pomiar odpowiedzi chronoamperometrycznej czujnika przy napięciu -0,15 V i zarejestrowanie prądu po 15 sekundach w buforze fosforanowym 0,1 M (pH = 7,5). Rysunek 4(a) zawiera schemat reakcji elektrokatalitycznej służącej do wykrywania mleczanu.
2. Detekcja glukozy odbywa się w podobny sposób poprzez pomiar odpowiedzi chronoamperometrycznej czujnika przy napięciu -0,05 V i zarejestrowanie prądu po 15 sekundach w buforze fosforanowym 0,1 M (pH 7,0). Rysunek 4(b) zawiera schemat reakcji elektrokatalitycznej w celu wykrycia glukozy.
3. pH jest monitorowane poprzez przeprowadzanie cyklicznych skanów woltamperometrycznych od -0,7 V do 0,8 V przy 100 mV/s i rejestrowanie położenia pikowego potencjału oksydacyjnego. Schemat reakcji redoks do wykrywania pH pokazano na rysunku 5.
4. Krzywe kalibracyjne dla czujników glukozy i mleczanu mogą być tworzone przez kolejne dodawanie odpowiedniego analitu; pomiary chronoamperometryczne wykonuje się po każdym dodaniu analitu, jak opisano w sekcjach 5.1 i 5.2. Alternatywnie, pomiary chronoamperometryczne o stałym potencjale można wykonać przy mieszaniu, pozostawiając wystarczający czas (~10-100 sekund) między każdym dodaniem analitu w celu stabilizacji prądu.
5. Krzywe kalibracyjne pH można utworzyć, mierząc położenie pikowego potencjału oksydacyjnego w szeregu znanych wartości pH od 5 do 8 w przyrostach co 1,0 jednostki pH i rejestrując cykliczne woltammogramy zgodnie z opisem w sekcji 5.3.

5. Reprezentatywne wyniki

Podczas uzyskiwania krzywych chronoamperometrycznych (np. do wykrywania glukozy lub mleczanu) w roztworach spoczynkowych z mikroigłami wypełnionymi zmodyfikowaną pastą węglową, prąd natychmiast spadnie po zastosowaniu odpowiedniego potencjału detekcji. W końcu rozpadnie się do wartości w stanie ustalonym. Reprezentatywny wynik przedstawiono na rysunku 6; wynik ten uzyskano z 2 mM dodatków mleczanu i zapisu na mikroigłach mleczanowych. Roztwór należy krótko wymieszać po każdym dodaniu mleczanu. Prąd po 15 sekundach wzrasta po zwiększeniu stężenia mleczanu; Aktualna odpowiedź może być następnie wykorzystana do określenia stężenia mleczanu w nieznanym roztworze. Alternatywnie, ciągłe monitorowanie można zastosować w roztworze mieszanym (lub w roztworze płynącym), jak pokazano dla roztworu o rosnącym stężeniu glukozy (ryc. 5). Ponownie, wzrost prądu po zwiększeniu stężenia glukozy może być wykorzystany do standaryzacji odpowiedzi glukozy na nieznany roztwór. Po każdym skoku należy odczekać wystarczająco dużo czasu, aby roztwór mógł się ustabilizować. Cykliczne woltammogramy przy czułej na pH mikroigłowej w buforze fosforanowym 0,1 M przedstawiono na rysunku 6 w czterech różnych roztworach pH z przyrostem od 5 do 8 w 1 jednostce pH. Szczytowy potencjał oksydacyjny zmienia się wraz ze wzrostem pH; zjawisko to jest wykorzystywane jako wskaźnik wartości pH.

Rysunek 1. Obrazy pliku STL układu mikroigłowego utworzonego w Solidworks (A) oraz zrzutu ekranu, który pokazuje konstrukcję podporową (B).

Rysunek 2. Skaningowe mikrofotografie elektronowe układu mikroigłowego (A) i pojedynczej mikroigły w tej matrycy (B).

Rysunek 3. Schemat montażu płaskiego elastycznego. Wymagane kroki obejmują modyfikację płaskiego elastycznego (A), ablację wzorzystych okręgów (B), dodanie początkowo ablowanej warstwy Melinex, która jest wypełniona pastą węglową (C), a także dodanie drugiej warstwy ablowanej Melinex i dopasowanie układu mikroigłowego (D). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

Rysunek 4. Kalibracja pasty wrażliwej na mleczan za pomocą 15-sekundowych skanów chronoamperometrycznych przy -0,15 V w 0,1 M buforze fosforanowym (pH = 7,5). Każdy wzrost prądu odpowiada dodatkowi mleczanu o 2 mM.

Rysunek 5. Kalibracja pasty wrażliwej na glukozę przebiega skany chronoamperometryczne przy napięciu -0,05 V. Każdy spadek odpowiedzi odpowiada dodatkowi glukozy o 2 mM. 0,1 M roztwór buforowy fosforanu (pH = 7,0) mieszano podczas kalibracji. W pracy wykorzystano zewnętrzne elektrody referencyjne i przeciwprądowe Ag/AgCl i Pt.

Rysunek 6. Cykliczny woltammogram (CV) pasty węglowej wrażliwej na pH w 0,1 M buforze fosforanowym w przyrostach pH 5-8 w 1 jednostce pH (turkusowy = pH 8,0, zielony = pH 7,0, fioletowy = pH 6,0, czerwony = pH 5,0). Do analizy wykorzystano piąty CV w porównaniu z elektrodami referencyjnymi Ag/AgCl i przeciwelektrodami z drutu Pt.

Discussion

Przed wyprodukowaniem urządzenia wzięto pod uwagę wiele aspektów konstrukcji tego czujnika opartego na mikroigłach. Aby użyć tego czujnika do wykrywania w czasie rzeczywistym, czas reakcji czujnika musi być krótki; W tym protokole każdy testowany czujnik wykazywał czas reakcji poniżej piętnastu sekund. Pasty użyte w tym protokole zostały również wybrane ze względu na ich selektywność w środowiskach in vivo , które zawierają elektroaktywne biomolekuły, które mogą zakłócać odpowiedź elektrody. Oprócz składu pasty...