Konwersja testu ELISA wychwytującego do testu Luminex xMAP przy użyciu metody przesiewowej przeciwciał multipleksowych

Podsumowanie

Test ELISA można łatwo przekształcić w test Luminex xMAP, a dzięki korzyściom płynącym z multipleksowania, kilka przeciwciał może być jednocześnie przesiewanych w celu zidentyfikowania optymalnej pary przeciwciał, co skutkuje zwiększoną czułością i zakresem dynamicznym, przy jednoczesnym zmniejszeniu kosztów testu.

Streszczenie

Test immunoenzymatyczny (ELISA) od dawna jest podstawowym narzędziem do wykrywania interesujących analitów w próbkach biologicznych zarówno do badań z zakresu nauk przyrodniczych, jak i diagnostyki klinicznej. Test ELISA ma jednak pewne ograniczenia. Zwykle wykonuje się go na 96-dołkowej mikropłytce, a studzienki są pokryte przeciwciałem wychwytującym, co wymaga stosunkowo dużej ilości próbki do wychwycenia interesującego antygenu. Duża powierzchnia studzienek i hydrofobowe wiązanie przeciwciał wychwytujących może również prowadzić do niespecyficznego wiązania i zwiększonego tła. Ponadto większość testów ELISA opiera się na wzmocnieniu sygnału za pośrednictwem enzymu w celu uzyskania rozsądnej czułości. Takie wzmocnienie nie zawsze jest liniowe i może w związku z tym zniekształcić wyniki.

W ciągu ostatnich 15 lat pojawiła się nowa technologia, która oferuje korzyści płynące z testu ELISA, ale także umożliwia większą przepustowość, większą elastyczność, zmniejszoną objętość próbki i niższy koszt, z podobnym przepływem pracy ^{1, 2}. Technologia Luminex xMAP to platforma matrycy mikrosferycznej (perełkowej) umożliwiająca wykonywanie testów zarówno monopleksowych, jak i multipleksowych, które można stosować zarówno do zastosowań związanych z białkami, jak i kwasami nukleinowymi ^3-5. Kulki mają przeciwciało wychwytujące walencyjnie unieruchomione na mniejszej powierzchni, co wymaga mniejszej ilości przeciwciała wychwytującego i mniejszych objętości próbki w porównaniu z ELISA, a niespecyficzne wiązanie jest znacznie zmniejszone. Mniejsze objętości próbek są ważne podczas pracy z próbkami ograniczającymi, takimi jak płyn mózgowo-rdzeniowy, płyn maziowy itp. ⁶. Multipleksowanie testu jeszcze bardziej zmniejsza wymagania dotyczące objętości próbki, umożliwiając uzyskanie wielu wyników z jednej próbki.

Ostatnie ulepszenia Luminex obejmują: nowy system MAGPIX, mniejszy, tańszy, łatwiejszy w użyciu analizator; Mikrosfery magnetyczne MagPlex o niskim stężeniu, które eliminują potrzebę stosowania drogich płytek filtracyjnych i mają stężenie robocze lepiej nadające się do opracowywania testów i zastosowań o niskiej przepustowości; oraz zestaw xMAP Antibody Coupling (AbC), który zawiera protokół, odczynniki i materiały eksploatacyjne niezbędne do sprzężenia kulek z badanym przeciwciałem wychwytującym. (Szczegółowa lista zawartości zestawu znajduje się w sekcji Materiały).

W tym eksperymencie konwertujemy wstępnie zoptymalizowany test ELISA dla cytokin TNF-alfa na platformę xMAP i porównujemy wydajność dwóch metod ^7-11. TNF-alfa jest biomarkerem stosowanym w pomiarze odpowiedzi zapalnych u pacjentów z zaburzeniami autoimmunologicznymi.

Zaczynamy od sprzężenia czterech potencjalnych przeciwciał wychwytujących do czterech różnych zestawów mikrosfer lub regionów. Po zmieszaniu te cztery zestawy pozwalają na jednoczesne testowanie wszystkich czterech kandydatów za pomocą czterech oddzielnych przeciwciał detekcyjnych w celu określenia najlepszej pary przeciwciał, oszczędzając odczynniki, próbkę i czas. Następnie konstruowane są dwa testy xMAP z dwiema najbardziej optymalnymi parami przeciwciał, a ich wydajność jest porównywana z oryginalną wydajnością testu ELISA pod względem siły sygnału, zakresu dynamiki i czułości.

Protokół

I. Przygotowanie odczynnika

1. Selekcja i przygotowanie przeciwciał
   1. Zidentyfikuj przeciwciała, które mają być użyte w doświadczeniu.
      1. Cztery przeciwciała wychwytujące: specyficzne dla ludzkiego TNF-alfa, monoklonalne lub poliklonalne; wszystkie te same gatunki gospodarzy.
      2. Cztery przeciwciała detekcyjne: specyficzne dla ludzkiego TNF-alfa, niemodyfikowane, biotynylowane lub sprzężone z PE.
      3. Jedno przeciwciało potwierdzające: sprzężone z PE i specyficzne dla gatunku gospodarza przeciwciał wychwytujących.
   2. Rozpuść wszystkie przeciwciała do stężeń roboczych zalecanych przez producenta.
   3. Wybierz cztery fiolki z zestawami mikrosfer (kulek) MagPlex o niskim stężeniu lub regionami, na przykład numery części Luminex MC10012-ID, MC10013-ID, MC10014-ID i MC10015-ID.
2. Sprzężenie przeciwciał z mikrosferami MagPlex przy użyciu zestawu sprzęgającego przeciwciał xMAP (AbC)
   Zapoznaj się z instrukcją obsługi zestawu AbC (część # 89-00002-00-319), aby uzyskać pełną procedurę sprzęgania. (Uwaga: Mikrosfery światłoczułe należy chronić przed światłem, gdy tylko jest to możliwe.)
   1. Doprowadź odczynniki w zestawie AbC do temperatury pokojowej i oznacz cztery probówki reakcyjne numerami regionów kulek wybranych dla reakcji sprzęgania. Przenieść zawartość czterech fiolek z kulkami MagPlex (po 1 ml każda lub 2,5 x 10⁶ kulek) do czterech oznakowanych probówek reakcyjnych.
   2. Umyj każdy z zestawów kulek dwukrotnie w 500 μl buforu aktywacyjnego, zgodnie z opisem w instrukcji zestawu AbC.
   3. Aktywuj każdy zestaw kulek za pomocą 480 μl buforu aktywacyjnego, 10 μl Sulfo-NHS i 10 μl odczynnika EDC, zgodnie z procedurą zawartą w instrukcji zestawu AbC, i inkubuj przez 20 minut. (Uwaga: Odczynnik EDC musi być odtworzony w 250 μl buforu aktywacyjnego bezpośrednio przed tym etapem.)
   4. Powtórz poprzedni etap mycia z teraz "aktywowanymi" mikrosferami w sumie trzy razy z 500 μl buforu aktywacyjnego, zgodnie z opisem w instrukcji zestawu AbC.
   5. Przygotować cztery oddzielne roztwory, z których każdy zawiera 7,5 μg (tj. 3 μg/milion mikrosfer) przeciwciała wychwytującego w buforze aktywacyjnym.
   6. Dodaj te cztery roztwory przeciwciał wychwytujących do odpowiednich probówek reakcyjnych, natychmiast wymieszaj każdą probówkę i inkubuj przez dwie godziny na rotatorze.
   7. Powtórz poprzedni etap płukania z teraz "sprzężonymi" mikrosferami w sumie trzy razy z 500 μl buforu do płukania dołączonego do zestawu AbC.
   8. Po ostatnim etapie płukania dodaj 500 μl buforu płuczącego do każdej probówki reakcyjnej, aby uzyskać końcowe stężenie wyjściowe 5 milionów kulek sprzężonych z przeciwciałami na mililitr. Wirować i sonikować probówki reakcyjne, aby rozproszyć mikrosfery.
      UWAGA: Częściowe zanurzenie zamkniętej fiolki z mikrosferą w myjce ultradźwiękowej wypełnionej wodą demineralizowaną zapewnia skuteczną sonikację na wszystkich etapach mycia. (Szczegółowe informacje na temat wyposażenia znajdują się w tabeli materiałów.)
   9. Sprzężone koraliki należy przechowywać w temperaturze 2-8 °C i chronić przed światłem do czasu, gdy będą potrzebne.
3. Oznaczanie liczby sprzężonych mikrosfer
   1. Policz liczbę mikrosfer odzyskanych po reakcji sprzęgania za pomocą licznika komórek lub hemacytometru. Zapoznaj się z instrukcją obsługi przyrządu liczącego, aby uzyskać odpowiednie instrukcje. Odzysk z reakcji sprzęgania wynosi zwykle ponad 90%.
4. Potwierdzenie sprzężenia
   1. Potwierdź, że reakcja sprzęgania zakończyła się sukcesem, przygotowując roztwory testowe sprzężonych granulek dla każdego zestawu, z końcowym stężeniem 100 kulek/μl w buforze testowym (PBS z 1% BSA). Przygotować rozcieńczenia przeciwciała potwierdzającego IgG znakowanego fikoerytryną (PE-) w stężeniu 4 μg/ml w buforze testowym.
   2. Porcjować 50 μl każdego roztworu badanego do czterech studzienek na okrągłodennej, 96-dołkowej płytce, co daje w sumie 16 dołków. Następnie dodać 50 μl buforu testowego do ośmiu studzienek, aby zmierzyć tło, i 50 μl rozcieńczonego przeciwciała potwierdzającego do ośmiu pozostałych studzienek.
   3. Delikatnie wymieszać reakcje, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół za pomocą pipetora wielokanałowego. Przykryj płytkę i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej na wytrząsarce do płytek.
   4. Umieść płytkę na magnetycznym separatorze płytkowym na 1-2 minuty, aby wyciągnąć kulki z roztworu. Następnie usuń płyn, mocno odwracając płytkę, będąc na separatorze, nad pojemnikiem na odpady.
   5. Przemyć każdą studzienkę dwukrotnie, dodając 100 μl buforu do oznaczania i usuwając supernatant z płytki w podobny sposób za pomocą magnetycznego separatora płytkowego.
   6. Ponownie zawiesić kulki w 100 μl buforu do oznaczania, delikatnie pipetując pięć razy w górę i w dół za pomocą pipetora wielokanałowego.
   7. Analiza na urządzeniu Luminex xMAP, takim jak MAGPIX Instrument. Intensywność sygnału fluorescencyjnego tej reakcji jest wprost proporcjonalna do ilości białka na powierzchni kulek, zapewniając szybką ocenę względnej ilości białka sprzężonego z kulkami.
5. Sprzężenie biotyny z niezmodyfikowanymi przeciwciałami w celu wykrycia
   1. W przypadku stosowania niezmodyfikowanych przeciwciał detekcyjnych, należy je biotynylować odczynnikiem Thermo Fisher EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotyna (Kat. Nie. PI-21335) oraz procedurę opisaną w ulotce dołączonej do opakowania. Po biotynylacji wykryte przeciwciała mogą być później znakowane fikoerytryną streptawidyny (SA-PE) w teście (etap III.6.), aby można je było wykryć za pomocą analizatora xMAP.

II. Konfiguracja testu

1. Przygotuj początkową mieszaninę wszystkich czterech zestawów kulek, dodając 10 μl każdego z nich do 0,96 ml PBS z 1% BSA (bufor testowy. patrz tabela materiałów), aby określić, który z nich jest najbardziej skuteczny w teście xMAP.
2. Przygotować roztwory przeciwciał wykrywających, rozcieńczając je do 1 μg/ml w buforze testowym.
3. Przygotuj wzorzec białka TNF-α w systemach badawczo-rozwojowych w stężeniu 2000 pg/ml w buforze testowym.
4. Rozcieńczyć streptawidynę-rFikoerytrynę (SA-PE) (dostarczoną @ 1 mg / ml) do 8 μg / ml w buforze testowym.

III. Badania przesiewowe przeciwciał

1. Dodać 50 μl mieszaniny mikrosfer sprzężonej z przeciwciałami do każdego z 16 dołków 96-dołkowej płytki okrągłodennej Costar do testu przesiewowego.
2. Dodać 50 μl buforu testowego do 8 z 16 dołków, aby zmierzyć tło.
3. Dodaj 50 μl standardu R&D Systems TNF-α (@ 2,000 pg/ml) do pozostałych 8 dołków, aby zmierzyć odpowiedź.
4. Inkubować przez godzinę w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem, wytrząsając na wytrząsarce na płytce do testów wytrzymałościowych.
5. Dodać 50 μl każdego z czterech wykrywanych przeciwciał do czterech dołków (dwóch tła i dwóch odpowiedzi) i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem, wytrząsając na wytrząsarce na płytce testowej.
6. Dodać 50 μl odczynnika SA-PE do wszystkich studzienek i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem, wytrząsając na wytrząsarce na płytce testowej.
7. Umieść płytkę na magnetycznym separatorze płytkowym na jedną minutę, a następnie usuń płyn, mocno odwracając płytkę.
8. Dodaj 100 μl buforu testowego do każdej z 16 studzienek, umieść płytkę na magnetycznym separatorze płytkowym na jedną minutę, a następnie usuń ciecz, mocno odwracając płytkę podczas przebywania na separatorze.
9. Dodaj 100 μl buforu testowego do każdej z 16 studzienek i odczytaj płytkę za pomocą przyrządu Luminex MAGPIX; zapoznaj się z instrukcją obsługi w celu prawidłowego działania.
10. Wybierz parę przeciwciał, która spełnia żądaną siłę sygnału.

IV. Test funkcjonalny xMAP

1. Po wybraniu najlepszego przeciwciała wychwytującego należy rozcieńczyć 100 μl tego bulwarki sprzężonej z przeciwciałami (z kroku I.B.8) do 10 ml za pomocą buforu testowego.
2. Dodać 50 μl rozcieńczonych kulek do 78 dołków dwóch okrągłodennych 96-dołkowych płytek Costar. (78 dołków x 2 płytki = 156 dołków) Każda płytka zostanie wykorzystana do oceny działania innego przeciwciała wykrywającego.
3. Przygotuj 12-punktową krzywą wzorcową, zaczynającą się od 8000 pg/ml i kończącą na 4 pg/ml, z normą R&D Systems TNF-α. Dodać sześć powtórzeń po 50 μl każdego rozcieńczenia do każdej z płytek oraz sześć studzienek z 50 μl buforu do oznaczania każda, jako tło, co daje w sumie 78 dołków na płytkę.
4. Inkubować płytki przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem, wytrząsając na wytrząsarce do płytek do testów wytrzymałościowych.
5. Dodać 50 μl przeciwciała do pierwszego wykrycia do wszystkich 78 dołków pierwszej płytki. Powtórzyć te czynności dla drugiego przeciwciała wykrywającego na drugiej płytce.
6. Inkubować płytki przez 30 minut, w temperaturze pokojowej, chronić przed światłem, wytrząsając na wytrząsarce do płytek testowych.
7. Dodać 50 μl odczynnika SA-PE do wszystkich studzienek każdej płytki.
8. Inkubować dwie płytki przez 15 minut, w temperaturze pokojowej, chronić przed światłem, wytrząsając na wytrząsarce do płytek testowych.
9. Umieść płytki na magnetycznych separatorach płytowych na jedną minutę, a następnie usuń płyn, mocno odwracając płytkę, gdy znajduje się na separatorze.
10. Dodać 100 μl buforu testowego do każdego z 78 dołków na płytkach; umieścić płytki na magnetycznych separatorach płytkowych na jedną minutę, a następnie usunąć płyn, mocno odwracając płytkę.
11. Dodaj 100 μl buforu testowego do każdej z 78 studzienek na płytkach i przeanalizuj na przyrządzie MAGPIX, odnosząc się do instrukcji obsługi w celu prawidłowego działania.

V. Test ELISA

1. Postępując zgodnie z instrukcjami dołączonymi do zestawu R&D Systems Human TNF-α/TNFSF1A DuoSet ELISA (R&D Part# DY210), zmierz odpowiedź wygenerowaną przez normę dostarczoną z zestawem badawczo-rozwojowym. Powtórz test ELISA jeszcze trzy razy, zastępując przeciwciała wychwytywane i wykrywające przez systemy badawczo-rozwojowe przeciwciałami innych dostawców. Dla uproszczenia sparuj przeciwciała według dostawcy (np. przeciwciało wychwytujące Millipore z przeciwciałem wykrywającym Millipore, przeciwciało wychwytujące Abcam z przeciwciałem wykrywającym Abcam itp.).
2. Oceń każdą parę niezależnie, zgodnie z wymogami formatu ELISA, z każdym z trzech wzorców białka TNF-α.

VI. Reprezentatywne wyniki

Ten protokół pokazuje, jak typowy test ELISA może zostać przekształcony na platformę xMAP, wykorzystując jednocześnie możliwości multipleksowe technologii do szybkiej optymalizacji testu. Test ELISA użyty w tym przykładzie to zestaw ELISA DuoSet Human Tumor Necrosis Factor-alpha (TNF-α) firmy R&D Systems (R&D Part# DY210).

Oprócz pary przeciwciał dostarczonej w zestawie, trzy inne pary przeciwciał z różnych źródeł (patrz tabela Materiały) były oceniane jednocześnie za pomocą platformy xMAP. Cztery z przeciwciał oznaczono jako przeciwciała wychwytujące i sprzężono z mikrosferami o niskim stężeniu MagPlex. Pozostałe cztery przeciwciała oznaczono jako przeciwciała wykrywające; trzy z nich zostały zakupione jako sprzężone z biotyną, a czwarta została poddana biotynylacji, jak opisano w protokole.

Przeciwciała do tego badania zostały wybrane na podstawie dostępności i dostawcy. Jednak w praktyce przeciwciała powinny być wybierane na podstawie indywidualnych preferencji użytkownika i wcześniejszych doświadczeń związanych z działaniem tego przeciwciała. Chociaż eksperyment ten nie testuje przydatności przeciwciała jako przeciwciała wychwytującego w porównaniu z przeciwciałem wykrywającym, protokół ten można łatwo zmodyfikować w tym celu.

Testy Luminex xMAP zostały przeprowadzone jako multipleks, aby ocenić wszystkie cztery wychwytywane przeciwciała jako mieszaninę, poprzez połączenie czterech zestawów mikrosfer MagPlex sprzężonych z przeciwciałami TNF-α. Przeciwciała wychwytywane oceniano indywidualnie dla każdego z czterech biotynylowanych przeciwciał detekcyjnych, tak aby można było jednocześnie określić interakcję jednego przeciwciała wykrywającego z każdym z czterech przeciwciał wychwytujących. Cztery takie testy, przeprowadzone równolegle, określiły interakcje wszystkich czterech przeciwciał wykrywających ze wszystkimi czterema przeciwciałami wychwytującymi. Rysunek 1 przedstawia dane porównawcze z tych testów przesiewowych.

Wyniki wykazały, że para przeciwciał z R&D Systems DuoSet działała najlepiej z wynikową odpowiedzią na poziomie 6183 jednostek mediany intensywności fluorescencji (MFI). Zaobserwowano również, że przeciwciała detekcyjne Millipore (86% odpowiedzi par przeciwciał R&D) i Abcam (67%) zapewniły rozsądną odpowiedź w teście xMAP w połączeniu z wychwytywaniem przeciwciał przez systemy badawczo-rozwojowe. Wychwytujące przeciwciała Abcam, Millipore i Novus wywołały mniej pożądaną odpowiedź w teście xMAP.

Ważne jest, aby zauważyć, że celem tego badania niekoniecznie jest podkreślenie różnic między poszczególnymi przeciwciałami lub dostawcami, ale jedynie zilustrowanie, że istnieją obserwowalne różnice w ich działaniu, gdy są używane w podobnych warunkach, i że platforma xMAP może zaoferować skuteczny sposób oceny tych różnic.

Protokół DuoSet R&D Systems został użyty do porównania czterech par przeciwciał w formacie ELISA. Protokół R&D Systems został użyty dla wszystkich par przeciwciał, ponieważ odzwierciedla typowe protokoły ELISA powszechnie stosowane obecnie i jest analogiczny do protokołów stosowanych w technologii xMAP. Testy ELISA wykazały, że para przeciwciał z R&D Systems ponownie dała najlepsze wyniki (ryc. 2). Para przeciwciał z Abcam nie wywołała żadnej odpowiedzi, a pary przeciwciał z Millipore i Novus dały skromną odpowiedź.

Aby ocenić jakiekolwiek różnice w reaktywności przeciwciał w stosunku do wzorca, wszystkie cztery pary przeciwciał zostały przetestowane z trzema różnymi rekombinowanymi standardami białek TNF-α, od trzech różnych dostawców (zobacz tabelę Materiały). Dane na rysunku 2 pokazują, że wzorce rekombinowanych białek TNF-α od trzech dostawców dały równoważne wyniki.

Białko TNF-α z R&D Systems zostało użyte do wygenerowania standardowych krzywych za pomocą testu ELISA (Tabela 1) i testów xMAP (Tabele 2 i 3). Podczas gdy test ELISA został przeprowadzony przy użyciu pary przeciwciał R&D Systems, testy xMAP wykorzystywały przeciwciało wychwytywane przez systemy badawczo-rozwojowe oraz przeciwciało wykrywające z R&D Systems lub Millipore. Białko TNF-α firmy R&D Systems rozcieńczono w celu uzyskania zakresu stężeń od 8000 do 4 pg/ml. Tylko para przeciwciał z R&D Systems dała oczekiwany wynik w teście xMAP, z odpowiedzią >20 000 MFI, jak pokazano w tabeli 2 i na rysunku 3. Gdy przeciwciało detekcyjne firmy Millipore zostało użyte z testem xMAP zamiast przeciwciała wykrywającego systemy badawczo-rozwojowe (Tabela 3), odpowiedź (6 000 MFI) wynosiła około 30% odpowiedzi uzyskanej po wykryciu przeciwciała z R&D Systems; jak pokazano na rysunku 3.

Dane w Tabeli 1 reprezentują standardową krzywą ELISA, która miała zalecany przez producenta zakres TNF-α od 16 do 1000 pg/ml. Zakres ten był bardzo ograniczony, ponieważ OD przy 1000 pg/ml był nieco większy niż 2 jednostki OD, a spektrofotometr nie jest w stanie zmierzyć powyżej 3 OD. Ze względu na limit związany ze spektrofotometrem nie było możliwe dalsze zwiększenie zakresu testu ELISA. Ponadto dane zawarte w tabeli 1 wskazują, że test ELISA DuoSet opracowany przez R&D Systems nie jest w stanie wykryć TNF-α w stężeniach znacznie mniejszych niż 16 pg/ml. Z drugiej strony, test xMAP jest w stanie zmierzyć TNF-α w stężeniu mniejszym niż 7,8 pg/ml z przeciwciałem wychwytującym z systemów badawczo-rozwojowych w połączeniu z przeciwciałem wykrywającym z systemów badawczo-rozwojowych lub Millipore.

Zakres dynamiki i czułość obu metod jest lepiej zilustrowany, gdy jest on wykreślony w skali logarytmicznej (Rysunek 4). Można zauważyć wyraźne rozróżnienie między nachyleniem odpowiedzi ELISA a odpowiedziami z testów xMAP, co dodatkowo wskazuje na bardziej ograniczoną zdolność wykrywania TNF-α za pomocą testu ELISA, zarówno przy wyższych, jak i niższych stężeniach.

Granice wykrywalności (LOD) dla dwóch funkcjonalnych testów xMAP α TNF- zostały przybliżone poprzez zidentyfikowanie najniższego stężenia TNF-α z obserwowanym poziomem odpowiedzi (MFI) większym niż tło, plus trzykrotność jego odchylenia standardowego (SD). Aby uzyskać istotność statystyczną, wykorzystano sześć powtórzeń do wyznaczenia SD zarówno dla metody xMAP, jak i ELISA. Te szacunki LOD są optymistyczne i mają na celu zapewnienie "optymalnego" scenariusza, przy założeniu, że w normalnych warunkach operacyjnych zostaną użyte tylko dwie lub trzy powtórzenia. W tabeli 2 można zaobserwować, że przy zastosowaniu pary systemów badawczo-rozwojowych najniższe stężenie TNF-α na poziomie 3,91 pg/ml wywołało odpowiedź 66 MFI, czyli większą niż odpowiedź tła + 3SD, spełniającego to kryterium. Gdy przeciwciało detekcyjne Millipore było używane z przeciwciałem R&D Systems Capture (Tabela 3), granica wykrywalności była mniejsza niż 7,81 pg/ml. W tym przypadku drugie najniższe stężenie TNF-α dało akceptowalną odpowiedź 17 MFI; większa niż odpowiedź najniższego stężenia TNF-α plus trzykrotność jego odchylenia standardowego. (10 MIF + 3(2,4) = 16,29 MIF) Podobnie, granica wykrywalności dla testu ELISA DuoSet dla systemów badawczo-rozwojowych wynosiła od 63 pg/ml do 31 pg/ml (tabela 1).

Rysunek 1. Mediana intensywności fluorescencji (MFI) standardu R&D Systems (@ 2,000 pg/ml) dla każdej możliwej kombinacji czterech przeciwciał wychwytujących (sprzężonych z czterema różnymi regionami mikrosferycznymi) i czterech przeciwciał wykrywających. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

Rysunek 2. Gęstość optyczna (OD) trzech różnych wzorców rekombinowanych (@ 1,000 pg/mL) dla czterech kombinacji par przeciwciał do wychwytywania i wykrywania. Dla uproszczenia przeciwciała wychwytywane i wykrywające zostały arbitralnie sparowane przez dostawcę. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

Zestawy DuoSet systemów badawczo-rozwojowych pg/ml O.D. Standardowe odchylenie od dewelopera +3 do SD 1000 szt. Z drugiej strony, 2,084 pkt. 0,035 pkt. Klasa 2,187 500 szt. 1,328 pkt. 0,038 pkt. 1,441 TGL Z kolei 250 szt. 0,787 pkt. 0,025 pkt. 0,863 125 Rozdział 0,476 0,026 pkt. 0,554 pkt. Rozdział 63 0,304 pkt. 0,023 0,374 pkt. Rejon 31,3 0,212 pkt. 0,025 pkt. 0,287 pkt. Rozdział 15,6 0,167 pkt. 0,026 pkt. 0,244 pkt. 0 0,118 pkt. 0,021 pkt. 0,182 pkt.

Tabela 1. Gęstość optyczna (Øn) serii 2-krotnego rozcieńczenia, określona w ulotce dołączonej do opakowania DuoSet firmy R&D Systems, do stosowania jako krzywa wzorcowa; w tym odchylenie standardowe (SD) i szacowana granica wykrywalności (L.O.D.), między 31,3 pg/ml a 63 pg/mL.

Systemy badawczo-rozwojowe Wychwytują i wykrywają przeciwciała pg/ml Mif (MIF) Standardowe odchylenie od dewelopera +3 do SD 8000 szt. 20 320 osób Z numerem 463 21 707 osób 4000 szt. 15 594 TGL Rozdział 223 16 263 TGL Rok 2000 11 098 osób 79 Rozdział 11 336 osób 1000 szt. 6 985 osób 160 szt. 7 465 osób 500 szt. 4 149 TGL Rozdział 80 4 390 jedn. Z kolei 250 szt. 2 233 TGL 30,0 TGL 2 323 TGL 125 Rozdział 1 199 osób 43,8 pkt. 1 330 szt. Rozdział 63 636 TGLI 14,0 678 SZT. Rejon 31,3 340 szt. Pytanie 12,9 Okręg wyborczy 379 TGL Rozdział 15,6 183 Rozdział 183 Pozycja 5.9 Z numerem 201 7,8 Rozdział 103 2.2 Rozdział 109 3,9 Rozdział 66 2.4 73 Rozdział 73 0 11 0,8 Rozdział 13,8

Tabela 2. mediana intensywności fluorescencji (MFI) standardowej serii rozcieńczeń mierzona za pomocą technologii xMAP, przy użyciu pary przeciwciał dołączonej do zestawu DuoSet systemów badawczo-rozwojowych; w tym odchylenie standardowe (SD) i szacowana granica wykrywalności (L.O.D.), mniej niż 3,91 pg/ml.

Systemy badawczo-rozwojowe przechwytują Ab z wykrywaniem miliporów Ab pg/ml Mif (MIF) Standardowe odchylenie od dewelopera +3 do SD 8000 szt. 5 800 szt. 143 Rozdział 143 6 229 osób 4000 szt. 3 881 szt. 120 szt. 4 242 TGL Rok 2000 2 176 osób 73 Rozdział 73 2 396 osób 1000 szt. 1 138 TGLI Nr 32,1 1 234 TGL 500 szt. Okręg wyborczy 578 TGL Rejon 31,3 671 szt. Z kolei 250 szt. Rozdział 289 6.2 Lokal mieszkalny 307 TGL 125 Rozdział Rozdział 142 3.1 151 szt. Rozdział 63 75 Rozdział 5.3 91 SZT. Rejon 31,3 Rozdział 44 3.3 54 Rozdział 54 Rozdział 15,6 28 2.6 35,5 pkt. 7,8 17 1,5 Rozdział 21,2 3,9 10 2.0 Rozdział 16.3 0 7 1.4 Pytanie 11,4

Tabela 3. Mediana intensywności fluorescencji (MFI) standardowej serii rozcieńczeń mierzona za pomocą technologii xMAP, przy użyciu systemów badawczo-rozwojowych wychwytujących przeciwciało i przeciwciało wykrywające milipore EMD; w tym odchylenie standardowe (SD) i szacowana granica wykrywalności (L.O.D.), mniej niż 7,81 pg/ml.

Rysunek 3. Standardowe krzywe dwóch testów xMAP i systemów badawczo-rozwojowych DuoSet ELISA. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

Rysunek 4. Porównanie krzywych standardowych xMAP i krzywej standardowej ELISA w skali logarytmicznej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

Dyskusja

Konwersja testu ELISA na platformę Luminex xMAP może być tak prosta, jak zastąpienie streptawidyny peroksydazy chrzanowej (SA-HRP) w typowym zestawie ELISA fikoerytryną streptawidyny (SA-PE) i optymalizacja wydajności. Dla tych, którzy chcą stworzyć test immunologiczny xMAP od podstaw, można to osiągnąć za pomocą prostego protokołu, który umożliwia również szybką, multipleksową ocenę par przeciwciał. Odczynniki do testu xMAP można było łatwo przygotować przy użyciu zestawu do sprzęgania przeciwciał xMAP w celu sprzężenia wyznaczonych przeciwciał wychwytujących z mikrosferami o niskim stężeniu MagPlex. Zastosowanie mikrosfer o niskim stężeniu zmniejsza koszty opracowania testu, zapewniając jednocześnie taką samą wydajność testu jak mikrosfery o wyższym stężeniu. Czas potrzebny do przygotowania sprzężonych mikrosfer MagPlex wynosi około 3 godzin, czyli znacznie szybciej niż 22-24 godziny wymagane do pokrycia dołka płytki ELISA, a następnie obróbki powlekanych dołków. Wydajność testu xMAP jest również lepsza od testu ELISA pod względem granicy wykrywalności (<4 pg/ml w porównaniu z >31 pg/ml) i zakresu dynamiki (<4 pg/ml do >8000 pg/ml w porównaniu z 16 pg/ml do 1000 pg/ml). Czytniki płytek mają ograniczony zakres OD, który wynosi 3 lub 4 OD, co ogranicza górną granicę zakresu dynamiki dla testu.

Niewątpliwie nie wszystkie przeciwciała będą działać w formacie ELISA i nie wszystkie przeciwciała, które działają dobrze w teście ELISA, można łatwo przenieść do formatu testu xMAP. Ponieważ jednak testy xMAP mogą być multipleksowane (tj. uruchamiane jednocześnie), możliwa jest jednoczesna ocena kilku kombinacji przeciwciał do wychwytywania i wykrywania w celu zidentyfikowania najlepszej pary do użycia w teście. Proces ten pozwala zaoszczędzić znacznie czas i odczynniki w porównaniu z procedurą opracowywania testu ELISA, która ogranicza się do oceny jednej pary na raz. Jeśli dwie lub więcej par przeciwciał działa równoważnie; Inne parametry testu mogą być brane pod uwagę w celu określenia odpowiedniości pary (np. dostępność, koszt itp.).

Oprócz poprawy wydajności i elastyczności testu xMAP, istnieje również znaczne oszczędności kosztów. Zalecana ilość przeciwciała wymagana do pokrycia pojedynczego dołka płytki ELISA wynosi 400 ng, podczas gdy ilość wymagana dla kulek stosowanych w jednym dołku testu xMAP wynosi około 7,5 ng. W związku z tym ilość przeciwciał wymagana do jednego dołka ELISA zapewni ponad 50 wyników testu, jeśli zostanie użyta w teście xMAP. W przypadku zastosowań związanych z cennymi próbkami xMAP ma również istotną przewagę. Objętość próbki zalecana do testu ELISA wynosi 100 μl, podczas gdy objętość wymagana do testu xMAP może być o połowę mniejsza lub mniejsza.

Podsumowując, konwersja testu ELISA na platformę Luminex xMAP jest nieskomplikowana, wydajna i oszczędna, a jednocześnie pozwala uzyskać test o doskonałym zakresie dynamiki i czułości.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Ludzki zestaw ELISA TNF-α/TNFSF1A DuoSet	R D Systems	DY210	Zawiera przeciwciała poliklonalne sprzężone z monoklonalną i biotyną oraz rekombinowane TNF-α wzorzec białka
Przeciwciało monoklonalne przeciwko TNF-α	Abcam	Ab18696	Przeciwciało wychwytujące, klon CH8820
Przeciwciało monoklonalne do TNF-α	Abcam	Ab16166	Przeciwciało detekcyjne sprzężone z biotyną, klon białka alfa AS1
TNF	Abcam	Ab9642	Rekombinowany standard białka TNF-&alpha
Przeciwciało monoklonalne do TNF-α	Novus	NBP1-50115	Przeciwciało wychwytujące, klon 4H31
Przeciwciało monoklonalne przeciwko TNF-α	Novus	NB100-78162	Przeciwciało detekcyjne sprzężone z biotyną, klon MAb11
TNF alfa białko	Novus	NBC1-18460	Rekombinowany standard białka TNF-&alpha
Przeciwciało monoklonalne przeciwko TNF-α	EMD Millipore	MAB1141	Capture Antibody, klon 3C7.2
Poliklonalne przeciwciało przeciwko TNF-α	EMD Millipore	654250	Poliklonalne przeciwciało detekcyjne królika
Streptavidin-Phyc– rythrin	Moss	SAPE-001	Fluorescencyjny odczynnik reporterowy do testu Luminex xMAP
MAGPIX z oprogramowaniem xPONENT	Luminex Corporation	MAGPIX-XPONENT	Luminex Instrument
xMAP Zestaw sprzęgania przeciwciał (AbC)	Luminex Corporation	40-50016	Zawiera odczynnik EDC, odczynnik Sulfo-NHS, bufor aktywacyjny, bufor do płukania, probówki reakcyjne 1,5 ml i jednorazowe pipety
MagPlex Microspheres, Low Concentration	Luminex Corporation	MC10012-ID, MC10013-ID, MC10014-ID, MC10015-ID	Kulki o niskim stężeniu (@ 2,5 x 106 koraliki/ml)
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin	Thermo Fisher	PI-21335	Zestaw do biotynylacji do niezmodyfikowanego przeciwciała detekcji
Tecan Infinite F200 Czytnik
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami	Sigma-Aldrich	P-3688	1% PBS-BSA, Bufor testowy
Jednolitrowa kompaktowa myjka ultradźwiękowa, 115 VAC	Cole-Parmer	WU-08849-00	Wytwarzaj efektywną częstotliwość roboczą 55 kHz
Magnetyczny separator rurowy	Luminex Corporation	CN-0288-01	Do separacji magnetycznej z pojedynczą probówką 1,5 ml w etapach mycia sprzęgającego
Magnetyczny separator	płytowyLuminex Corporation	CN-0269-01	Do separacji magnetycznej na 96-dołkowej płytce w etapach mycia testowego