Test ELISA można łatwo przekształcić w analizę Luminex xMAP, a dzięki zaletom multipleksowania można jednocześnie przesiewowo badać kilka przeciwciał w celu zidentyfikowania optymalnej pary przeciwciał, co prowadzi do zwiększenia czułości i zakresu dynamicznego przy jednoczesnym obniżeniu kosztów analizy.
Artykuł metodologiczny
Konwersja testu ELISA typu capture na test Luminex xMAP z wykorzystaniem metody wielipleksowego przesiewania przeciwciał
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Test immunoenzymatyczny (ELISA) od dawna stanowi główne narzędzie do wykrywania interesujących analitytów w próbkach biologicznych, zarówno w badaniach nad naukami o życiu, jak i w diagnostyce klinicznej. Metoda ELISA posiada jednak pewne ograniczenia. Zazwyczaj jest ona przeprowadzana w mikropłytce 96-dołkowej, a dołki są pokryte przeciwciałem wychwytującym, co wymaga stosunkowo dużej ilości próbki w celu wychwycenia interesującego antygenu. Duża powierzchnia dołków oraz hydrofobowe wiązanie przeciwciała wychwytującego mogą również prowadzić do niespecyficznego wiązania i zwiększenia tła. Ponadto większość testów ELISA opiera się na enzymatycznej amplifikacji sygnału w celu uzyskania odpowiedniej czułości. Taka amplifikacja nie zawsze jest liniowa, co może prowadzić do zafałszowania wyników.
W ciągu ostatnich 15 lat pojawiła się nowa technologia, która oferuje zalety testu ELISA, a jednocześnie umożliwia wyższą przepustowość, większą elastyczność, zmniejszenie objętości próbki oraz niższe koszty, przy zachowaniu podobnego schematu postępowania 1, 2. Technologia Luminex xMAP to platforma macierzy mikrocząsteczek (kuleczek), umożliwiająca przeprowadzanie analiz monopleksowych i multipleksowych, które mogą być stosowane zarówno w aplikacjach białkowych, jak i kwasów nukleinowych 3-5. Kuleczki mają przeciwciało wychwytujące unieruchomione kowalencyjnie na mniejszej powierzchni, co w porównaniu z testem ELISA wymaga mniejszej ilości przeciwciała wychwytującego i mniejszych objętości próbek, a wiązanie nieswoiste jest znacznie zredukowane. Mniejsze objętości próbek są istotne podczas pracy z próbkami o ograniczonej ilości, takimi jak płyn mózgowo-rdzeniowy, płyn stawowy itp. 6. Multipleksowanie analizy dodatkowo zmniejsza wymagania dotyczące objętości próbki, umożliwiając uzyskanie wielu wyników z jednej próbki.
Ostatnie ulepszenia wprowadzone przez firmę Luminex obejmują: nowy system MAGPIX, będący mniejszym, tańszym i łatwiejszym w obsłudze analizatorem; magnetyczne mikrosfery MagPlex o niskim stężeniu (Low-Concentration Magnetic MagPlex Microspheres), które eliminują potrzebę stosowania kosztownych płytek filtrujących i są dostępne w stężeniu roboczym lepiej dostosowanym do opracowywania testów oraz zastosowań o niskiej przepustowości; oraz zestaw xMAP Antibody Coupling (AbC) Kit, który zawiera protokół, odczynniki i materiały eksploatacyjne niezbędne do sprzęgania kulek z wybranym przeciwciałem wychwytującym. (Szczegółową listę zawartości zestawu można znaleźć w sekcji Materiały).
W niniejszym eksperymencie przenosimy zoptymalizowany test ELISA dla cytokiny TNF-alpha na platformę xMAP i porównujemy wydajność obu metod 7-11. TNF-alpha jest biomarkerem stosowanym w pomiarze odpowiedzi zapalnych u pacjentów z chorobami autoimmunologicznymi.
Proces rozpoczynamy od sprzężenia czterech kandydackich przeciwciał wychwytujących z czterema różnymi zestawami lub regionami mikrokürełek. Po wymieszaniu te cztery zestawy umożliwiają jednoczesne testowanie wszystkich czterech kandydatów przy użyciu czterech oddzielnych przeciwciał detekcyjnych w celu wyłonienia najlepszej pary przeciwciał, co pozwala zaoszczędzić odczynniki, próbki i czas. Następnie konstruuje się dwa testy xMAP z wykorzystaniem dwóch najbardziej optymalnych par przeciwciał i porównuje ich wydajność z oryginalnym testem ELISA pod kątem siły sygnału, zakresu dynamicznego i czułości.
Protokół
I. Przygotowanie odczynników
- Wybór i przygotowanie przeciwciał
- Zidentyfikuj przeciwciała do wykorzystania w eksperymencie.
- Cztery przeciwciała wychwytujące: specyficzne dla ludzkiego TNF-alpha, monoklonalne lub poliklonalne; wszystkie pochodzące od tego samego gatunku gospodarza.
- Cztery przeciwciała detekcyjne: specyficzne dla ludzkiego TNF-alpha, niemodyfikowane, biotinylowane lub sprzężone z PE.
- Jedno przeciwciało potwierdzające: sprzężone z PE i specyficzne dla gatunku gospodarza przeciwciał wychwytujących.
- Zrekonstytuuj wszystkie przeciwciała do stężeń roboczych zalecanych przez producenta.
- Wybierz cztery fiolki zestawów lub regionów mikrosfer (kulek) MagPlex o niskim stężeniu, na przykład Luminex numery katalogowe MC10012-ID, MC10013-ID, MC10014-ID oraz MC10015-ID.
- Zidentyfikuj przeciwciała do wykorzystania w eksperymencie.
- Sprzęganie przeciwciał z mikrosferami MagPlex przy użyciu zestawu xMAP Antibody (AbC) Coupling Kit
Zapoznaj się z instrukcją obsługi zestawu AbC (Part# 89-00002-00-319) w celu uzyskania pełnej procedury sprzęgania. (Uwaga: Mikrosfery światłoczułe powinny być chronione przed światłem tak często, jak to możliwe).- Dostosuj odczynniki z zestawu AbC do temperatury pokojowej i opisz cztery probówki reakcyjne numerami regionów kulek wybranych do reakcji sprzęgania. Przenieś zawartość czterech fiolek kulek MagPlex (po 1 mL lub 2,5 x 106 kulek) do czterech opisanych probówek reakcyjnych.
- Przemyj każdy z zestawów kulek dwukrotnie w 500 μL buforu aktywacyjnego (Activation Buffer), zgodnie z opisem w instrukcji zestawu AbC.
- Aktywuj każdy zestaw kulek za pomocą 480 μL buforu aktywacyjnego, 10 μL Sulfo-NHS oraz 10 μL odczynnika EDC, zgodnie z procedurą w instrukcji zestawu AbC, i inkubuj przez 20 minut. (Uwaga: Odczynnik EDC musi zostać zrekonstytuowany w 250 μL buforu aktywacyjnego bezpośrednio przed tym krokiem).
- Powtórz poprzedni krok płukania dla teraz „aktywowanych” mikrosfer łącznie trzy razy, używając 500 μL buforu aktywacyjnego, zgodnie z instrukcją zestawu AbC.
- Przygotuj cztery oddzielne roztwory, z których każdy zawiera 7,5 μg (tj. 3 μg/milion mikrosfer) przeciwciała wychwytującego w buforze aktywacyjnym.
- Dodaj te cztery roztwory przeciwciał wychwytujących do odpowiednich probówek reakcyjnych, natychmiast wymieszaj każdą probówkę w wortexie i inkubuj przez dwie godziny na rotatorze.
- Powtórz poprzedni krok płukania dla teraz „sprzęgniętych” mikrosfer łącznie trzy razy, używając 500 μL buforu płuczącego (Wash Buffer) dołączonego do zestawu AbC.
- Po końcowym etapie płukania dodaj 500 μL buforu płuczącego do każdej probówki reakcyjnej, aby uzyskać końcowe stężenie zapasu 5 milionów kulek sprzężonych z przeciwciałem na mililitr. Wymieszaj probówki reakcyjne w wortexie i poddaj sonikacji, aby rozproszyć mikrosfery.
UWAGA: Częściowe zanurzenie zamkniętej fiolki z mikrosferami w myjce ultradźwiękowej wypełnionej wodą DI zapewnia skuteczną sonikację we wszystkich krokach płukania. (Szczegóły dotyczące sprzętu znajdują się w tabeli Materiały). - Przechowuj sprzężone kulki w temperaturze 2-8 °C, chroniąc je przed światłem do momentu użycia.
- Wyliczenie sprzężonych mikrosfer
- Policz liczbę mikrosfer odzyskanych po reakcji sprzęgania za pomocą licznika komórek lub hemocytometru. W celu uzyskania odpowiednich instrukcji zapoznaj się z instrukcją obsługi urządzenia pomiarowego. Odzysk z reakcji sprzęgania zazwyczaj przekracza 90%.
- Potwierdzenie sprzęgania
- Potwierdź powodzenie reakcji sprzęgania, przygotowując roztwory testowe zapasów sprzężonych kulek dla każdego zestawu, z końcowym stężeniem 100 kulek/μL w buforze do analizy (Assay Buffer; PBS z 1% BSA). Przygotuj rozcieńczenia przeciwciała potwierdzającego anty-IgG specyficznego dla gatunku, znakowanego fykoerytryną (PE), o stężeniu 4 μg/mL w buforze do analizy.
- Nanieś po 50 μL każdego roztworu testowego do czterech studni płytki 96-dołkowej o okrągłym dnie, co daje łącznie 16 studni. Następnie dodaj 50 μL buforu do analizy do ośmiu studni, aby zmierzyć tło, oraz 50 μL rozcieńczonego przeciwciała potwierdzającego do pozostałych ośmiu studni.
- Delikatnie wymieszaj reakcje, pipetując w górę i w dół kilka razy za pomocą pipety wielokanałowej. Przykryj płytkę i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej na wstrząsarce do płytek.
- Umieść płytkę na magnetycznym separatorze płytek na 1-2 minuty, aby ściągnąć kulki z roztworu. Następnie usuń ciecz, gwałtownie odwracając płytkę nad pojemnikiem na odpady, podczas gdy znajduje się ona na separatorze.
- Przemyj każdą studnię dwukrotnie, dodając 100 μL buforu do analizy i usuwając supernatant z płytki w podobny sposób, używając magnetycznego separatora płytek.
- Resuspenduj kulki w 100 μL buforu do analizy, delikatnie pipetując w górę i w dół pięć razy za pomocą pipety wielokanałowej.
- Przeanalizuj próbki na urządzeniu Luminex xMAP, takim jak analizator MAGPIX. Intensywność sygnału fluorescencyjnego w tej reakcji jest bezpośrednio proporcjonalna do ilości białka na powierzchni kulek, co pozwala na szybką ocenę względnej ilości białka sprzężonego z kulkami.
- Sprzęganie biotyny z niemodyfikowanymi przeciwciałami do detekcji
- W przypadku użycia niemodyfikowanych przeciwciał detekcyjnych, zbiotinyluj te przeciwciała za pomocą odczynnika Thermo Fisher EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin (Katalog nr PI-21335) zgodnie z procedurą opisaną w ulotce dołączonej do produktu. Po biotinylacji przeciwciała detekcyjne mogą zostać później znakowane streptawidyną-fykoerytryną (SA-PE) podczas analizy (Krok III.6.), aby mogły być wykryte za pomocą analizatora xMAP.
II. Konfiguracja testu
- Przygotuj początkową mieszaninę wszystkich czterech zestawów kulek, dodając po 10 μL każdego z nich do 0,96 mL PBS z 1% BSA (bufor do analizy, patrz tabela Materiały), aby ustalić, który z nich jest najskuteczniejszy w analizie xMAP.
- Przygotuj roztwory przeciwciał detekcyjnych, rozcieńczając każde z nich do stężenia 1 μg/mL w buforze do analizy.
- Przygotuj standard białka TNF-α firmy R&D Systems o stężeniu 2000 pg/mL w buforze do analizy.
- Rozcieńcz streptawidynę-rFikoerytrynę (SA-PE) (dostarczoną w stężeniu 1 mg/mL) do stężenia 8 μg/mL w buforze do analizy.
III. Przesiew przeciwciał
- Do każdego z 16 dołków płyty 96-dołkowej o dnie okrągłym firmy Costar przeznaczonej do analizy przesiewowej dodaj 50 μL mieszaniny mikrosfer sprzęgniętych z przeciwciałami.
- Do 8 z 16 dołków dodaj 50 μL buforu do analizy (Assay Buffer) w celu pomiaru tła.
- Do pozostałych 8 dołków dodaj 50 μL standardu TNF-α firmy R&D Systems (@ 2,000 pg/mL) w celu pomiaru odpowiedzi.
- Inkubuj przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem, przy jednoczesnym mieszaniu na wstrząsarzu do płytek analitycznych.
- Do czterech dołków (dwóch z tłem i dwóch z odpowiedzią) dodaj po 50 μL każdego z czterech przeciwciał detekcyjnych i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem, przy jednoczesnym mieszaniu na wstrząsarzu do płytek analitycznych.
- Do wszystkich dołków dodaj 50 μL odczynnika SA-PE i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem, przy jednoczesnym mieszaniu na wstrząsarzu do płytek analitycznych.
- Umieść płytkę na magnetycznym separatorze do płytek na jedną minutę, a następnie usuń ciecz poprzez energiczne odwrócenie płytki.
- Do każdego z 16 dołków dodaj 100 μL buforu do analizy (Assay Buffer), umieść płytkę na magnetycznym separatorze do płytek na jedną minutę, a następnie usuń ciecz poprzez energiczne odwrócenie płytki, gdy wciąż znajduje się ona na separatorze.
- Do każdego z 16 dołków dodaj 100 μL buforu do analizy (Assay Buffer) i odczytaj płytkę za pomocą instrumentu Luminex MAGPIX, postępując zgodnie z instrukcją obsługi w celu zapewnienia prawidłowego działania.
- Wybierz parę przeciwciał, która zapewnia pożądaną siłę sygnału.
IV. Funkcyjny test xMAP
- Po wybraniu najlepszego przeciwciała wychwytującego, rozcieńczyć 100 μL zapasu kulek sprzężonych z tym przeciwciałem (z kroku I.B.8) do 10 mL za pomocą buforu do analizy (Assay Buffer).
- Dodać 50 μL rozcieńczonych kulek do 78 studni dwóch płytek 96-dołkowych o okrągłym dnie Costar. (78 studni x 2 płytki = 156 studni). Każda płytka zostanie wykorzystana do oceny wydajności innego przeciwciała detekcyjnego.
- Przygotować 12-punktową krzywą standardową, zaczynając od 8000 pg/mL i kończąc na 4 pg/mL, przy użyciu standardu TNF-α firmy R&D Systems. Dodać sześć powtórzeń po 50 μL każdego rozcieńczenia do każdej z płytek, oraz sześć studni z 50 μL buforu do analizy (Assay Buffer) jako tło, co daje łącznie 78 studni na płytkę.
- Inkubować płytki przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej, chroniąc je przed światłem, podczas mieszania na wstrząsarce do płytek analitycznych.
- Dodać 50 μL pierwszego przeciwciała detekcyjnego do wszystkich 78 studni pierwszej płytki. Powtórzyć czynność dla drugiego przeciwciała detekcyjnego na drugiej płytce.
- Inkubować płytki przez 30 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc je przed światłem, podczas mieszania na wstrząsarce do płytek analitycznych.
- Dodać 50 μL odczynnika SA-PE do wszystkich studni każdej płytki.
- Inkubować obie płytki przez 15 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc je przed światłem, podczas mieszania na wstrząsarce do płytek analitycznych.
- Umieścić płytki na magnetycznych separatorach płytek na jedną minutę, a następnie usunąć ciecz poprzez energiczne odwrócenie płytki podczas przebywania na separatorze.
- Dodać 100 μL buforu do analizy (Assay Buffer) do każdej z 78 studni na płytkach; umieścić płytki na magnetycznych separatorach płytek na jedną minutę, a następnie usunąć ciecz poprzez energiczne odwrócenie płytki.
- Dodać 100 μL buforu do analizy (Assay Buffer) do każdej z 78 studni na płytkach i przeanalizować na urządzeniu MAGPIX, korzystając z instrukcji obsługi w celu zapewnienia prawidłowego działania.
V. Test ELISA
- Zgodnie z instrukcjami dołączonymi do zestawu R&D Systems Human TNF-α/TNFSF1A DuoSet ELISA (R&D Part# DY210), zmierz odpowiedź generowaną przez standard dostarczony w zestawie R&D. Powtórz test ELISA jeszcze trzy razy, zastępując przeciwciała wychwytujące i detekcyjne firmy R&D Systems przeciwciałami od innych dostawców. Dla uproszczenia paruj przeciwciała według dostawcy (np. przeciwciało wychwytujące Millipore z przeciwciałem detekcyjnym Millipore, przeciwciało wychwytujące Abcam z przeciwciałem detekcyjnym Abcam itd.).
- Oceń każdą parę niezależnie, zgodnie z wymaganiami formatu ELISA, z każdym z trzech standardów białka TNF-α.
VI. Reprezentatywne wyniki
Niniejszy protokół demonstruje, w jaki sposób typowy test ELISA może zostać przeniesiony na platformę xMAP, wykorzystując możliwości multipleksowania tej technologii do szybkiej optymalizacji analizy. W tym przykładzie wykorzystano zestaw ELISA Human Tumor Necrosis Factor-alpha (TNF-α) DuoSet firmy R&D Systems (R&D Part# DY210).
Oprócz pary przeciwciał dostarczonej w zestawie, jednocześnie oceniono trzy inne pary przeciwciał z różnych źródeł (patrz tabela Materiały) przy użyciu platformy xMAP. Cztery z przeciwciał wyznaczono jako przeciwciała wychwytujące i sprzęgnięto je z mikrosferami MagPlex Low Concentration. Pozostałe cztery przeciwciała wyznaczono jako przeciwciała detekcyjne; trzy z nich zakupiono jako sprzęgnięte z biotyną, a czwarte zbiotynylizowano zgodnie z opisem w protokole.
Przeciwciała do niniejszego badania wybrano na podstawie dostępności i dostawcy. Jednak w praktyce przeciwciała powinny być dobierane zgodnie z preferencjami użytkownika oraz wcześniejszym doświadczeniem dotyczącym wydajności danego przeciwciała. Chociaż niniejszy eksperyment nie testuje przydatności przeciwciała jako przeciwciała wychwytującego w stosunku do przeciwciała detekcyjnego, protokół ten można łatwo zmodyfikować w tym celu.
Analizy Luminex xMAP przeprowadzono w formie multipleksowej w celu oceny mieszaniny wszystkich czterech przeciwciał przechwytujących, łącząc cztery zestawy mikrosfer MagPlex sprzężonych z przeciwciałami anty-TNF-α. Przeciwciała przechwytujące oceniano indywidualnie z każdym z czterech biotynylowanych przeciwciał detekcyjnych, aby umożliwić jednoczesne określenie interakcji jednego przeciwciała detekcyjnego z każdym z czterech przeciwciał przechwytujących. Cztery takie analizy, przeprowadzone równolegle, pozwoliły określić interakcje wszystkich czterech przeciwciał detekcyjnych ze wszystkimi czterema przeciwciałami przechwytującymi. Rycina 1 przedstawia dane porównawcze z tych analiz przesiewowych.
Wyniki wykazały, że para przeciwciał z zestawu R&D Systems DuoSet wykazała najlepsze działanie, dając odpowiedź na poziomie 6183 jednostek średniej intensywności fluorescencji (MFI). Zaobserwowano również, że przeciwciała detekcyjne firmy Millipore (86% odpowiedzi pary przeciwciał R&D) oraz Abcam (67%) zapewniły zadowalającą odpowiedź w analizie xMAP, gdy zostały połączone z przeciwciałem wychwytującym firmy R&D Systems. Przeciwciała wychwytujące od Abcam, Millipore i Novus wywołały mniej korzystną odpowiedź w analizie xMAP.
Należy zauważyć, że celem niniejszego badania nie jestkoniecznie podkreślenie różnic między konkretnymi przeciwciałami lub dostawcami, lecz jedynie zilustrowanie, że istnieją zauważalne różnice w ich działaniu przy zastosowaniu podobnych warunków, a platforma xMAP może stanowić wydajny sposób oceny tych różnic.
Do porównania czterech par przeciwciał w formacie ELISA zastosowano protokół R&D Systems DuoSet. Protokół R&D Systems został wykorzystany dla wszystkich par przeciwciał, ponieważ odzwierciedla on typowe protokoły ELISA powszechnie stosowane obecnie i jest analogiczny do protokołów używanych w technologii xMAP. Testy ELISA wykazały, że para przeciwciał z R&D Systems ponownie dała najlepsze wyniki (Rysunek 2). Para przeciwciał z Abcam nie wywołała żadnej odpowiedzi, a pary przeciwciał z Millipore i Novus wywołały umiarkowane odpowiedzi.
W celu oceny wszelkich różnic w reaktywności przeciwciał względem standardu, wszystkie cztery pary przeciwciał przetestowano z użyciem trzech różnych standardów rekombinowanego białka TNF-α, pochodzących od trzech różnych dostawców (patrz tabela Materiały). Dane przedstawione na Rysunku 2 wykazują, że standardy rekombinowanego białka TNF-α od trzech dostawców dały równoważne wyniki.
Białko TNF-α firmy R&D Systems zostało wykorzystane do wygenerowania krzywych standardowych w testach ELISA (Tabela 1) oraz xMAP (Tabela 2 i 3). Podczas gdy test ELISA przeprowadzono z użyciem pary przeciwciał firmy R&D Systems, w testach xMAP zastosowano przeciwciało chwytające firmy R&D Systems oraz przeciwciało detekcyjne firmy R&D Systems lub Millipore. Białko TNF-α firmy R&D Systems rozcieńczono w celu uzyskania zakresu stężeń od 8000 do 4 pg/mL. Tylko para przeciwciał firmy R&D Systems zapewniła oczekiwany wynik w teście xMAP, z odpowiedzią >20 000 MFI, co przedstawiono w Tabeli 2 i na Rysunku 3. Gdy w teście xMAP zamiast przeciwciała detekcyjnego firmy R&D Systems użyto przeciwciała detekcyjnego firmy Millipore (Tabela 3), odpowiedź (6 000 MFI) stanowiła około 30% odpowiedzi uzyskanej przy użyciu przeciwciała detekcyjnego firmy R&D Systems, co pokazano na Rysunku 3.
Dane w Tabeli 1 przedstawiają krzywą standardową testu ELISA, dla której producent zalecił zakres TNF-α od 16 do 1000 pg/mL. Zakres ten był bardzo ograniczony, ponieważ wartość OD przy 1000 pg/mL była nieco wyższa niż 2 jednostki OD, a spektrofotometr nie jest w stanie mierzyć wartości powyżej 3 OD. Ze względu na ograniczenia spektrofotometru nie było możliwe dalsze zwiększenie zakresu testu ELISA. Ponadto dane w Tabeli 1 wskazują, że zestaw R&D Systems DuoSet ELISA nie jest w stanie wykryć TNF-α przy stężeniach znacznie niższych niż 16 pg/mL. Z drugiej strony test xMAP jest w stanie mierzyć TNF-α przy stężeniu poniżej 7,8 pg/mL przy zastosowaniu przeciwciała wychwytującego od R&D Systems w połączeniu z przeciwciałem detekcyjnym od R&D Systems lub Millipore.
Zakres dynamiczny i czułość obu metod są lepiej zobrazowane na wykresie w skali logarytmicznej (Rysunek 4). Wyraźna różnica między nachyleniem odpowiedzi w teście ELISA a odpowiedziami w testach xMAP wskazuje na większe ograniczenia w wykrywaniu TNF-α za pomocą metody ELISA, zarówno przy wyższych, jak i niższych stężeniach.
Granice wykrywalności (LOD) dla dwóch funkcjonalnych testów xMAP dla TNF-α określono w przybliżeniu, identyfikując najniższe stężenie TNF-α, dla którego obserwowany poziom odpowiedzi (MFI) był wyższy od poziomu tła powiększonego o trzykrotność jego odchylenia standardowego (SD). Aby uzyskać istotność statystyczną, do wyznaczenia SD dla obu metod, xMAP i ELISA, wykorzystano sześć powtórzeń. Szacunki LOD te są optymistyczne i mają na celu przedstawienie scenariusza „najlepszego przypadku”, przy założeniu, że w normalnych warunkach operacyjnych stosowane będą tylko dwa lub trzy powtórzenia. W Tabeli 2 można zauważyć, że przy zastosowaniu pary R&D Systems najniższe stężenie TNF-α wynoszące 3,91 pg/mL wygenerowało odpowiedź na poziomie 66 MFI, co przekracza odpowiedź tła + 3SD, spełniając tym samym to kryterium. Gdy przeciwciało detekcyjne Millipore zastosowano z przeciwciałem wychwytującym R&D Systems (Tabela 3), granica wykrywalności była mniejsza niż 7,81 pg/mL. W tym przypadku drugie najniższe stężenie TNF-α wygenerowało akceptowalną odpowiedź wynoszącą 17 MFI; wartość ta była wyższa od odpowiedzi najniższego stężenia TNF-α powiększonej o trzykrotność jego odchylenia standardowego (10 MFI + 3(2,4) = 16,29 MFI). Podobnie, granicę wykrywalności dla testu R&D Systems DuoSet ELISA oszacowano na wartość między 63 pg/mL a 31 pg/mL (Tabela 1).
Rycina 1. Mediana intensywności fluorescencji (MFI) standardu R&D Systems (@ 2,000 pg/mL) dla każdej możliwej kombinacji czterech przeciwciał wychwytujących (sprzężonych z czterema różnymi obszarami mikrosfer) i czterech przeciwciał detekcyjnych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinę.
Rysunek 2. Gęstość optyczna (O.D.) trzech różnych standardów rekombinowanych (@ 1,000 pg/mL) dla czterech kombinacji par przeciwciał przechwytujących i detekcyjnych. Przeciwciała przechwytujące i detekcyjne zostały dobrany w pary arbitralnie według dostawcy w celu uproszczenia procedury. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek.
| R&D Systems DuoSet | |||
| pg/mL | Absorpcja (O.D.) | Odchylenie std. | +3 SD |
| 1000 | 2.084 | 0.035 | 2.187 |
| 500 | 1.328 | 0.038 | 1.441 |
| 250 | 0.787 | 0.025 | 0.863 |
| 125 | 0.476 | 0.026 | 0.554 |
| 63 | 0.304 | 0.023 | 0.374 |
| 31.3 | 0.212 | 0.025 | 0.287 |
| 15.6 | 0.167 | 0.026 | 0.244 |
| 0 | 0.118 | 0.021 | 0.182 |
Tabela 1. Gęstość optyczna (O.D.) serii rozcieńczeń dwukrotnych określonych w ulotce zestawu R&D Systems DuoSet, wykorzystana do stworzenia krzywej wzorcowej; w tym odchylenie standardowe (SD) oraz szacowana granica wykrywalności (L.O.D.), mieszcząca się w zakresie od 31.3 pg/mL do 63 pg/mL.
| Przeciwciała wychwytujące i detekcyjne R&D Systems | |||
| pg/mL | MFI | Odch. std. | +3 SD |
| 8000 | 20,320 | 463 | 21,707 |
| 4000 | 15,594 | 223 | 16,263 |
| 2000 | 11,098 | 79 | 11,336 |
| 1000 | 6,985 | 160 | 7,465 |
| 500 | 4,149 | 80 | 4,390 |
| 250 | 2,233 | 30.0 | 2,323 |
| 125 | 1,199 | 43.8 | 1,330 |
| 63 | 636 | 14.0 | 678 |
| 31.3 | 340 | 12.9 | 379 |
| 15.6 | 183 | 5.9 | 201 |
| 7.8 | 103 | 2.2 | 109 |
| 3.9 | 66 | 2.4 | 73 |
| 0 | 11 | 0.8 | 13.8 |
Tabela 2. Mediana intensywności fluorescencji (MFI) standardowej serii rozcieńczeń zmierzonej za pomocą technologii xMAP, z wykorzystaniem pary przeciwciał dołączonej do zestawu R&D Systems DuoSet; obejmuje odchylenie standardowe (SD) oraz szacowaną granicę wykrywalności (L.O.D.), która wynosi mniej niż 3.91 pg/mL.
| Przeciwciało wychwytujące R&D Systems z przeciwciałem detekcyjnym Millipore | |||
| pg/mL | MFI | Odchylenie std. | +3 SD |
| 8000 | 5,800 | 143 | 6,229 |
| 4000 | 3,881 | 120 | 4,242 |
| 2000 | 2,176 | 73 | 2,396 |
| 1000 | 1,138 | 32.1 | 1,234 |
| 500 | 578 | 31.3 | 671 |
| 250 | 289 | 6.2 | 307 |
| 125 | 142 | 3.1 | 151 |
| 63 | 75 | 5.3 | 91 |
| 31.3 | 44 | 3.3 | 54 |
| 15.6 | 28 | 2.6 | 35.5 |
| 7.8 | 17 | 1.5 | 21.2 |
| 3.9 | 10 | 2.0 | 16.3 |
| 0 | 7 | 1.4 | 11.4 |
Tabela 3. Mediana intensywności fluorescencji (MFI) dla standardowej serii rozcieńczeń zmierzonej metodą xMAP, przy użyciu przeciwciała przechwytującego R&D Systems oraz przeciwciała detekcyjnego EMD Millipore; obejmuje odchylenie standardowe (SD) oraz szacowaną granicę wykrywalności (L.O.D.), wynoszącą poniżej 7.81 pg/mL.
Rycina 3. Krzywe wzorcowe dla dwóch testów xMAP oraz testu ELISA R&D Systems DuoSet. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinę.
Rycina 4. Porównanie krzywych standardowych xMAP i krzywej standardowej ELISA w skali log-log. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinę.
Dyskusja
Konwersja testu ELISA na platformę Luminex xMAP może być tak prosta, jak zastąpienie streptawidyny z peroksydazą chrzanową (SA-HRP) w typowym zestawie ELISA streptawidyną z fikoerytryną (SA-PE) i optymalizacja parametrów wydajności. Dla osób pragnących stworzyć immunoassay xMAP od podstaw, można to osiągnąć za pomocą prostego protokołu, który umożliwia również szybką, multipleksową ocenę par przeciwciał. Odczynniki do testu xMAP zostały łatwo przygotowane przy użyciu zestawu xMAP Antibody Coupling w celu sprzężenia wybranych przeciwciał wychwytujących z mikrosfer MagPlex o niskim stężeniu. Zastosowanie mikrosfer o niskim stężeniu obniża koszty opracowania testu, zapewniając jednocześnie taką samą wydajność, jak w przypadku mikrosfer o wyższym stężeniu. Czas wymagany do przygotowania sprzężonych mikrosfer MagPlex wynosi około 3 godzin, co jest znacznie szybsze niż 22 - 24 godziny wymagane do pokrycia dołków płytki ELISA, a następnie ich obróbki. Wydajność testu xMAP jest również wyższa niż w przypadku ELISA pod względem granicy wykrywalności (<4 pg/mL vs. >31 pg/mL) oraz zakresu dynamicznego (<4 pg/mL do >8000 pg/mL vs. 16 pg/mL do 1000 pg/mL). Czytniki płytek mają ograniczony zakres OD, wynoszący 3 lub 4 OD, co ogranicza górną granicę zakresu dynamicznego testu.
Bez wątpienia nie wszystkie przeciwciała będą działać w formacie ELISA, a nie wszystkie przeciwciała, które dobrze sprawdzają się w teście ELISA, można łatwo przenieść do formatu testu xMAP. Jednakże, ponieważ testy xMAP mogą być wykonywane w trybie multipleksowym (tj. jednocześnie), możliwe jest jednoczesne ocenienie kilku kombinacji przeciwciał wychwytujących i detekcyjnych w celu zidentyfikowania najlepszej pary do zastosowania w analizie. Proces ten pozwala zaoszczędzić znaczną ilość czasu i odczynników w porównaniu z procedurą opracowywania testu ELISA, która ogranicza się do oceny jednej pary na raz. W przypadku gdy dwie lub więcej par przeciwciał wykażą równoważną skuteczność, można rozważyć inne parametry testu, aby określić odpowiedniość danej pary (np. dostępność, koszt itp.).
Oprócz poprawy wydajności i elastyczności analizy xMAP, możliwe są również znaczne oszczędności kosztów. Zalecana ilość przeciwciał potrzebna do pokrycia jednej studzienki płytki ELISA wynosi 400ng, podczas gdy ilość wymagana dla kulek użytych w jednej studnience analizy xMAP to około 7,5 ng. Zatem ilość przeciwciał potrzebna do jednej studzienki ELISA pozwoli na uzyskanie ponad 50 wyników testów, jeśli zostanie wykorzystana w analizie xMAP. W zastosowaniach obejmujących cenne próbki xMAP ma również znaczącą przewagę. Objętość próbki zalecana dla metody ELISA to 100 μL, podczas gdy objętość wymagana dla analizy xMAP może być o połowę mniejsza lub jeszcze niższa.
Podsumowując, konwersja testu ELISA na platformę Luminex xMAP jest prosta, wydajna i ekonomiczna, a jednocześnie pozwala na opracowanie testu o szerszym zakresie dynamicznym i wyższej czułości.
Oświadczenia
Praca ta została wykonana w Luminex Corporation przy użyciu sprzętu wyprodukowanego przez Luminex Corporation.
Firmy R&D Systems oraz EMD Millipore są strategicznymi partnerami Luminex Corporation i posiadają licencję na opracowywanie oraz komercjalizację testów multipleksowych opartych na technologii xMAP.
Podziękowania
Praca ta była finansowana przez Luminex Corporation.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Zestaw ELISA Human TNF-α/TNFSF1A DuoSet | R D Systems | DY210 | Zawiera przeciwciała monoklonalne i poliklonalne sprzężone z biotyną oraz rekombinowany standard białka TNF-α |
| Przeciwciało monoklonalne przeciw TNF-α | Abcam | Ab18696 | Przeciwciało chwytające, klon CH8820 |
| Przeciwciało monoklonalne przeciw TNF-α | Abcam | Ab16166 | Przeciwciało detekcyjne sprzężone z biotyną, klon AS1 |
| Białko TNF alfa | Abcam | Ab9642 | Rekombinowany standard białka TNF-α |
| Przeciwciało monoklonalne przeciw TNF-α | Novus | NBP1-50115 | Przeciwciało chwytające, klon 4H31 |
| Przeciwciało monoklonalne przeciw TNF-α | Novus | NB100-78162 | Przeciwciało detekcyjne sprzężone z biotyną, klon MAb11 |
| Białko TNF alfa | Novus | NBC1-18460 | Rekombinowany standard białka TNF-α |
| Przeciwciało monoklonalne przeciw TNF-α | EMD Millipore | MAB1141 | Przeciwciało chwytające, klon 3C7.2 |
| Przeciwciało poliklonalne przeciw TNF-α | EMD Millipore | 654250 | Królicze poliklonalne przeciwciało detekcyjne |
| Streptawidyna-Fyk–erytryna | Moss | SAPE-001 | Fluorescencyjny odczyn raportujący do analizy Luminex xMAP |
| MAGPIX z oprogramowaniem xPONENT | Luminex Corporation | MAGPIX-XPONENT | Urządzenie Luminex |
| Zestaw do sprzęgania przeciwciał xMAP (AbC) | Luminex Corporation | 40-50016 | Zawiera odczyn EDC, odczyn Sulfo-NHS, bufor aktywacyjny, bufor do mycia, probówki reakcyjne 1,5 mL i pipety jednorazowe |
| Mikrosfery MagPlex, niskie stężenie | Luminex Corporation | MC10012-ID, MC10013-ID, MC10014-ID, MC10015-ID | Kulek o niskim stężeniu (@ 2,5 x 106 kulek/mL) |
| EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin | Thermo Fisher | PI-21335 | Zestaw do biotynylacji niemodyfikowanych przeciwciał detekcyjnych |
| Czytnik Tecan Infinite F200 | Tecan | Czytnik płytek ELISA | |
| Bufor fosforanowy (PBS) | Sigma-Aldrich | P-3688 | 1% PBS-BSA, bufor do analizy |
| Kompaktowa myjka ultradźwiękowa One-Pint, 115 VAC | Cole-Parmer | WU-08849-00 | Zapewnia efektywną częstotliwość pracy 55 kHz |
| Magnetyczny separator do probówek | Luminex Corporation | CN-0288-01 | Do separacji magnetycznej pojedynczej probówki 1,5 mL w etapach mycia podczas sprzęgania |
| Magnetyczny separator do płytek | Luminex Corporation | CN-0269-01 | Do separacji magnetycznej płytek 96-dołkowych w etapach mycia podczas analizy |
Bibliografia
- Fulton, J. R., McDade, R. L., Smith, P. L., Kienker, L. J., Kettman, J. R. Advanced multiplexed analysis with the FlowMetrix system. Clinical Chemistry. 43, 1749-1756 (1997).
- Carson, R. T., Vignali, A. A. Simultaneous quantation of 15 cytokines using a multiplexed flow cytometric assay. J. Immunol. Methods. 227, 41-52 (1999).
- Peck, D., Crawford, E. D., Ross, K. N., Stegmaier, K., Golub, T. R., Lamb, J. A method for high-throughput gene expression signature analysis. Genome Biol. 7, 61(2006).
- VanDerMeid, K. R., Su, S. P., Krenzer, K. L., Ward, K. W., Zhang, J. Z. A method to extract cytokines and matrix metalloproteinases from Schirmer strips and analyze using Luminex. Mol Vis. 17, 1056-1063 (2011).
- Liu, J., Kibiki, G., Maro, V., Maro, A., Kumburu, H., Swai, N., Taniuchi, M., Gratz, J., Toney, D., Kang, G., Houpt, E. Multiplex reverse transcription PCR Luminex assay for detection and quantitation of viral agents of gastroenteritis. J. Clin. Virol. 50, 308-313 (2011).
- de Jager, W., Prakken, B. J., Bijlsma, J., WJ Kuis, W., Rijkers, G. T. Improved multiplex immunoassay performance in human plasma and synovial fluid following removal of interfering heterophilic antibodies. J. Immunol. Methods. 300, 124-135 (2005).
- Codorean, E., Nichita, C., Albulescu, L., Raducan, E., Popescu, I. D., Lonita, A. C., Albulescu, R. Correlation of xMAP and ELISA cytokine profiles; development and validation for immunotoxicological studies in vitro. Roum. Arch. Microbiol. Immunol. 69, 3-19 (2010).
- de Jager, W., te Velthuis, H., Prakken, B. J., Kuis, W., Rijkers, G. T. Simultaneous detection of 15 human cytokines in a single sample of stimulated peripheral blood mononuclear cells. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 10, 133-139 (2003).
- DuPont, N. C., Wang, K. H., Wadhwa, P. D., Culhane, J. F., Nelson, E. L. Validation and comparison of Luminex multiplex cytokine analysis kits with ELISA: Determinations of a panel of nine cytokines in clinical sample culture supernatants. J. Reprod. Immunol. 66, 175-191 (2005).
- Richens, J. L., Urbanowicz, R. A., Metcalf, R., Corne, J., O'Shea, P., Fairclough, L. Quantitative validation and comparison of multiplex cytokine kits. Journal of Biomolecular Screening. 15, 562-568 (2010).
- Rizzi, G., Zhang, Y. J., Latek, R., Weiner, R., Rhyne, P. W. Characterization and development of a Luminex-based assay for the detection of human IL-23. Bioanalysis. 2, 1561-1572 (2010).
Przedruki i uprawnienia
