Artykuł metodologiczny

Obrazowanie fluorescencyjne NADH w izolowanych, pracujących sercach królika z obiema komorami

20.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/4115

⸱

24 lipca 2012

 ,  ,  ,  , 
1Electrical and Computer Engineering Department, The George Washington University, 2Pharmacology and Physiology Department, The George Washington University

W tym artykule

Podsumowanie

Celem jest monitorowanie stanu redoks mitochondriów w izolowanych sercach w kontekście fizjologicznych ciśnień obciążenia wstępnego i następczego. Przedstawiono biventrykularny model pracującego serca królika. Do monitorowania stanu redoks mitochondriów w tkance epikardialnej wykorzystano obrazowanie fluorescencyjne NADH o wysokiej rozdzielczości czasowo-przestrzennej.

Streszczenie

Od czasu wprowadzenia tej metody przez Langendorffa1, izolowane perfundowane serce pozostaje kluczowym narzędziem w badaniach fizjologii serca2. Nie nadaje się ono jednak w pełni do badań metabolizmu serca, które wymagają, aby serce wykonywało pracę w warunkach fizjologicznego obciążenia wstępnego (preload) i następczego (afterload). Neely wprowadził modyfikacje techniki Langendorffa w celu ustanowienia odpowiedniego obciążenia wstępnego i następczego lewej komory (LV)3. Model ten jest znany jako model pracującego izolowanego serca z lewą komorą i był szeroko stosowany do badania wydajności oraz metabolizmu LV4-6. Model ten nie zapewnia jednak właściwego obciążenia prawej komory (RV). Demmy et al. jako pierwsi opisali model biventrykularny jako modyfikację modelu pracującego serca z LV7, 8. Stwierdzili oni, że objętość wyrzutowa, rzut serca oraz generowanie ciśnienia uległy poprawie w sercach przekształconych z trybu pracującej LV na tryb pracujący biventrykularny8. Prawidłowo obciążona RV zmniejsza również nieprawidłowe gradienty ciśnień w obrębie przegrody, co poprawia funkcję przegrody międzykomorowej. Wykazano, że pracujące serca biventrykularne utrzymują rzut aortalny, przepływ płucny, średnie ciśnienie w aorcie, częstość akcji serca oraz poziomy ATP w mięśniu sercowym przez okres do 3 godzin8.

Podczas badania efektów metabolicznych uszkodzenia mięśnia sercowego, takich jak niedokrwienie, często konieczna jest identyfikacja lokalizacji dotkniętej tkanki. Można to osiągnąć poprzez obrazowanie fluorescencji NADH (zredukowanej formy nikotynamidoadeninodynukleotydu)9-11, koenzymu występującego w dużych ilościach w mitochondriach. Fluorescencja NADH (fNADH) wykazuje niemal liniową odwrotną zależność od lokalnego stężenia tlenu12 i stanowi miarę stanu redoks mitochondriów13. Obrazowanie fNADH w warunkach hipoksji i niedokrwienia jest wykorzystywane jako metoda bezbarwnikowa do identyfikacji obszarów niedotlenionych14, 15 oraz do monitorowania postępu warunków hipoksycznych w czasie10.

Celem opracowanej metody jest monitorowanie stanu redoks mitochondriów w pracujących sercach dwukomorowych podczas protokołów zmieniających tempo metabolizmu miocytów, indukujących hipoksję lub łączących oba te czynniki. Serca królików rasy nowozelandzkiej zostały podłączone do systemu pracującego serca dwukomorowego (Hugo Sachs Elektronik) i perfundowane zmodyfikowanym roztworem Krebsa-Henseleit16 w temperaturze 37 °C. Rejestrowano ciśnienie w aorcie, LV, tętnicy płucnej oraz w lewym i prawym przedsionku. Aktywność elektryczną mierzono za pomocą elektrody do jednofazowego potencjału czynnościowego. W celu obrazowania fNADH światło z lampy rtęciowej było filtrowane (350±25 nm) i wykorzystywane do oświetlania epikardium. Emitowane światło było filtrowane (460±20 nm) i rejestrowane za pomocą kamery CCD. Przedstawiono zmiany poziomu fNADH w epikardium pracujących serc dwukomorowych przy różnych częstotliwościach stymulacji. Połączenie modelu serca z obrazowaniem fNADH stanowi nowe i wartościowe narzędzie eksperymentalne do badania ostrych patologii serca w kontekście realistycznych warunków fizjologicznych.

Protokół

1. Przygotowanie do badania

  1. Przygotować cztery litry zmodyfikowanego roztworu Krebsa-Henseleita 16 (w mM: 118 NaCl, 3,30 KCl, 2,00 CaCl2, 1,20 MgSO4, 24,0 NaHCO3, 1,20 KH2PO4, 10,0 glukozy, 2,00 pirogronianu sodu oraz 20,0 mg/L albuminy). Roztwór należy przygotować jak najkrócej przed rozpoczęciem eksperymentu. Wartość pH należy dostosować do 7,4 po filtracji sterylnej (rozmiar porów: 22 μm, Corning). Osmolalność roztworu powinna mieścić się w przedziale od 275 do 295 mOsm/kg.
  2. Wypłukać wszystkie probówki i komory systemu pracującego serca wodą oczyszczoną. Uruchomić pompy do czasu usunięcia całej wody z systemu.
  3. Zamontować filtry z membrany celulozowej (rozmiar porów: 5 μm, Advantec) w linii każdej z pomp perfuzyjnych (pompa perfuzyjna Langendorffa, pompa perfuzyjna lewej komory serca oraz pompa perfuzyjna prawej komory serca).
  4. Przeprowadzić kalibrację dwupunktową (0 i 60 mmHg) dla każdego czujnika ciśnienia.
  5. Włączyć łaźnie wodne. Podgrzewająca łaźnia wodna z cyrkulacją (Cole Palmer) służy do ogrzewania rurek z płaszczem wodnym i wymienników ciepła. Perfusat jest wstępnie ogrzewany w osobnej łaźni wodnej (Oakton Instruments). Obie łaźnie ustawia się tak, aby utrzymywały temperaturę roztworu 37 °C.
  6. Włączyć pompy w celu cyrkulacji perfusatu w obiegu zamkniętym. Perfusat przepływa przez mikrowłókniste natleniacze (hemofiltry) napowietrzane mieszaniną 95% O2 i 5% CO2 przy ciśnieniu 80 kPa. Natleniony perfusat przepływa następnie przez wymienniki ciepła w celu utrzymania temperatury 37 °C przed wprowadzeniem do kaniul serca.

2. Wycięcie serca

  1. Rozpocznij od ustawienia układu pracującego serca w trybie Langendorffa ze stałym ciśnieniem. Ustaw ciśnienie w bloku aorty w zakresie od 50 do 60 mmHg.
  2. Z narkozuj królika poprzez domięśniowy zastrzyk ketaminy (44 mg/Kg) i ksylazyny (10 mg/Kg). Po uspokojeniu zwierzęcia, pentobarbital (50 mg/Kg) oraz heparynę (2000 U) wstrzyknij dożylnie przez żyłę brzeżną ucha lub żyłę saphēnous boczną wewnątrz kończyny tylnej.
  3. Gdy królik stanie się całkowicie nieodpowiedni, co zostanie stwierdzone przez brak odruchu bólowego, szybko otwórz jamę klatki piersiowej, przetnij osierdzie, zaklemuj aortę, a następnie wycięte serce i płuca. Na tym etapie płuca powinny pozostać przytwierdzone do serca, aby ułatwić izolację żył płucnych.
  4. Wyizoluj aortę i przeprowadź kaniulację za pomocą kaniuli o średnicy 5 mm, podłączonej do strzykawki wypełnionej 60 mL perfuzatu i 200 jednostek heparyny. Przymocuj aortę do kaniuli jedwabną nicią chirurgiczną rozmiaru zero i powoli naciśnij tłok strzykawki, aby wypłukać krew z serca.

3. Kanulacja obu komór

  1. Podłącz serce do bloku aorty systemu pracującego serca. Zapobiegaj przedostawaniu się powietrza do aorty, co mogłoby spowodować zatorowość wieńcową. Najlepiej przymocować kaniulę do bloku aorty, zbliżając się do złącza aorty pod kątem ukośnym i pozwalając perfuzatowi delikatnie ściekać ze złącza do kaniuli podczas jej mocowania.
  2. Podczas perfuzji serca w trybie Langendorffa pod stałym ciśnieniem, usuń tłuszcz i tkankę łączną, a następnie zlokalizuj następujące naczynia: żyłę główną dolną i górną, żyłę azygos, tętnicę płucną oraz żyły płucne.
  3. Podwiąż żyłę główną górną. Przetnij tętnicę płucną tuż poniżej miejsca, w którym rozgałęzia się na prawą i lewą tętnicę płucną.
  4. Zgrupuj wszystkie pozostałe naczynia (żyły płucne) między sercem a płucami i podwiąż je wszystkie za pomocą jednego szwu. Usuń płuca.
  5. Wytnij mały otwór w narożniku uszka lewego przedsionka. Upewnij się, że LA jest wypełniony perfuzatem. Zakaniuluj LA, dbając o to, aby kaniula była całkowicie wypełniona perfuzatem podczas wprowadzania. Przyszyj kaniulę do uszka LA.
  6. Włącz pompę lewą (pompa nr 2), aby zapewnić przepływ do lewego przedsionka. Ustaw ciśnienie obciążenia wstępnego w zakresie 2 - 6 mmHg i reguluj je o ±2 mmHg, w zależności od rozszerzenia przedsionka.
  7. Przełącz serce w tryb pracującego serca, wyłączając pompę Langendorffa (pompa nr 1).
  8. Chwilowo obniż ciśnienie w aorcie do 10 mmHg, a następnie powoli zwiększaj je do zakresu od 80 do 100 mmHg. Pozwoli to zastawce aortalnej otworzyć się i funkcjonować tak, jak w normalnych warunkach fizjologicznych. Końcowe ciśnienie obciążenia następczego będzie zależeć od kurczliwości LV. Powinno zostać ustawione na wartość o około 20 mmHg niższą niż szczytowe ciśnienie w LV.
  9. Rzut serca w LV można określić, mierząc szybkość przepływu perfuzatu opuszczającego blok aorty (mL/min). Normalny rzut serca wynosi od 14,77 do 16,43 mL/min na 100 g masy ciała 17 i średnio 340 mL/min dla królika o masie 2,2 kg. Ciśnienie w aorcie powinno przypominać sygnał ciśnienia przedstawiony na Rysunku 1.
  10. Zakaniuluj RA poprzez żyłę główną dolną. Upewnij się, że zarówno RA, jak i kaniula są całkowicie wypełnione perfuzatem, i wprowadź kaniulę, zapobiegając tworzeniu się pęcherzyków powietrza. Przyszyj kaniulę do żyły.
  11. Włącz pompę prawą (pompa nr 3), aby zapewnić przepływ do prawego przedsionka. Ustaw ciśnienie na około 3 mmHg.
  12. Upewnij się, że RV jest wypełniony perfuzatem, a następnie zakaniuluj tętnicę płucną. Upewnij się, że kaniula jest całkowicie wypełniona perfuzatem podczas wprowadzania, aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków powietrza. Przyszyj kaniulę do tętnicy płucnej.

4. Pozyskiwanie sygnałów: ciśnienia, jednofazowe potencjały czynnościowe i fNADH

  1. Po zakończeniu kaniulacji obu komór, ostrożnie wprowadź cewnik przetwornika ciśnienia (Millar) do aorty poprzez kaniulę aortalną. Delikatnie przesuń go poza zastawkę aortalną do lewej komory (LV). Monitoruj sygnał ciśnienia w LV, aby zapewnić prawidłowe rozmieszczenie końcówki cewnika. Przykład ciśnienia w LV przedstawiono na Rysunku 1.
  2. Delikatnie dociśnij elektrodę do pomiaru jednofazowego potencjału czynnościowego do epikardium komory. Monitoruj sygnał, aby uzyskać odpowiednie pomiary potencjału czynnościowego. Lekki artefakt ruchowy w sygnale jest zjawiskiem normalnym.
  3. Umieść bipolarną elektrodę stymulującą w prawym przedsionku w celu stymulacji serca. W naszym protokole serca były stymulowane przy długościach cyklu od 300 do 150 msec, co odpowiada odpowiednio 200 i 400 bpm.
  4. Zmierz temperaturę powierzchni epikardialnej LV. Jeśli badanie wymaga utrzymania temperatury 37 °C, umieść serce w komorze z płaszczem wodnym lub zanurz serce w kąpieli z podgrzanym superfuzatem, aby utrzymać stałą temperaturę w całym sercu.
  5. Ustaw kamerę CCD (Andor iXon DV860, 128x128 pikseli) i ustaw ostrość obiektywu tak, aby uzyskać odpowiednie pole widzenia. Kamera jest podłączona do stacji roboczej, a obrazy są pozyskiwane z częstotliwością 2 fps przy użyciu oprogramowania Andor SOLIS.
  6. Włącz lampę rtęciową przed rozpoczęciem obrazowania. Światło jest kierowane przez filtr wzbudzenia (350±25 nm, Chroma Technology) i do światłowodowego przewodnika światła (Horiba Jobin Yvon model 1950-1M), aby oświetlić powierzchnię serca. Tłumienie światła UV w przewodniku światła jest niewielkie. Oświetlenie UV może być również zapewnione za pomocą wysokomocnego systemu LED składającego się z reflektorów LED (Mightex PLS-0365-030-S) i jednostki sterującej (Mightex SLC-SA04-US).
  7. Wyłącz światło w pomieszczeniu i zminimalizuj wszelkie oświetlenie otoczenia. Skieruj tuleje przewodnika światła (lub reflektory LED) na serce, aby uzyskać równomierne oświetlenie epikardium. Emitowana fluorescencja NADH (fNADH) przechodzi przez filtr emisyjny (460±20 nm Chroma Technology) i jest rejestrowana przez kamerę CCD.
  8. Monitoruj zmiany fNADH w czasie, wybierając obszar zainteresowania (ROI) za pomocą oprogramowania do obrazowania. Wybierz tryb aktualizacji na żywo, aby monitorować średnią intensywność pikseli w obrębie obszaru zainteresowania.
  9. Serce powinno funkcjonować w trybie pracy obu komór, aby generować odpowiednie ciśnienia. Poziomy fNADH powinny być niskie i stabilne na powierzchni epikardialnej, co potwierdza odpowiednią perfuzję wieńcową. Na tym etapie badania należy wdrożyć konkretny protokół eksperymentalny w celu zweryfikowania hipotezy.
  10. Po zakończeniu badania wyjmij serce z systemu i odlej cały perfuzat. Przepłucz przewody i komory systemu wodą oczyszczoną. W ramach rutynowej konserwacji system należy okresowo płukać roztworem Mucasol lub rozcieńczonym roztworem nadtlenku wodoru, w zależności od potrzeb.

5. Przetwarzanie obrazów fNADH w trybie off-line

  1. Jednym ze sposobów porównywania zbiorów danych NADH (fNADH(i,j,t)) pomiędzy eksperymentami jest normalizacja każdego obrazu fluorescencji przy użyciu obrazu referencyjnego (fNADH(i,j,t0)) z danego zbioru9, zgodnie z poniższym równaniem. Inną metodą normalizacji fluorescencji NADH jest umieszczenie w polu widzenia małego kawałka szkła uranylowego przed rozpoczęciem eksperymentu9, 18, 19. Szkło uranylowe wykazuje fluorescencję (450 - 550 nm) po naświetleniu światłem UV, co dostarcza sygnału, który może służyć jako stabilny punkt odniesienia.

Wzór na zmianę stężenia NADH; wyrażenie matematyczne; analiza biochemiczna; równanie badawcze.

6. Reprezentatywne wyniki

Widoki przedni i podstawny preparatu pracującego serca królika z zachowaniem funkcji obu komór przedstawiono na Ryc. 1. Ciśnienie w lewej komorze mierzono poprzez wprowadzenie cewnika z przetwornikiem ciśnienia (Millar SPR-407) poza zastawkę aortalną do lewej komory. Ciśnienia w aorcie, tętnicy płucnej oraz w lewej komorze (LVP) przedstawiono na Ryc. 1C. Rozkurczowe LVP zazwyczaj mieści się w przedziale od 0 do 10 mmHg. Minimalne rozkurczowe ciśnienie w aorcie wynosi około 60 mmHg. Szczytowe skurczowe LVP zależy od ciśnienia napełniania (obciążenia wstępnego lub ciśnienia w lewym przedsionku) oraz kurczliwości i optymalnie powinno wynosić od 80 do 100 mmHg. Maksymalne ciśnienie w aorcie oraz maksymalne LVP powinny być do siebie zbliżone, co pokazano na Ryc. 1C.

Jednofazowe potencjały czynnościowe (MAPs) z szybką fazą depolaryzacji i fazą repolaryzacji, typowe dla serca królika, przedstawiono na Rysunku 1D. MAPs można rejestrować stosunkowo łatwo z kurczącego się serca, jednak zazwyczaj występują w nich niewielkie artefakty ruchowe podczas rozkurczu, co pokazano na Rysunku 1D. MAPs są przydatne do potwierdzenia pomyślnego sprzężenia serca (wychwytu) podczas stymulacji i mogą być również wykorzystywane do pomiaru lokalnych zmian elektrofizjologicznych spowodowanych niedokrwieniem lub innymi ostrymi zaburzeniami. EKG można również zmierzyć poprzez zanurzenie serca w kąpieli z ciepłego superfuzatu i umieszczenie elektrod w kąpieli po lewej i prawej stronie serca. Trzecią, obojętną elektrodę umieszcza się w kąpieli, z dala od serca, lub mocuje do aorty. EKG dostarczy informacji na temat globalnego procesu pobudzenia i repolaryzacji, co jest przydatne do oceny ogólnej funkcji elektrycznej oraz wykrywania obecności niedokrwienia.

Obrazowanie fNADH ujawnia zmiany w stanie redoks mitochondriów w sercu, co może być wykorzystane do pomiaru czasowo-przestrzennego postępu obszarów niedokrwiennych lub niedotlenionych. W niniejszym badaniu mierzono fNADH w obrębie osierdzia, aby monitorować zmiany stanu redoks podczas stymulacji trzema częstotliwościami przy długościach cyklu (CL) wynoszących 300, 200 i 150 msec. Średnie wartości fNADH z wyznaczonego obszaru zainteresowania (czerwona ramka, Rysunek 2) wykazują, że bazowe poziomy fNADH rosną wraz ze skróceniem długości cyklu. Gdy częstotliwość stymulacji jest zbliżona do rytmu zatokowego (CL=300 msec), bazowy poziom fNADH pozostaje stosunkowo stały. Wraz ze skróceniem długości cyklu poniżej 300 msec, bazowe poziomy fNADH wzrastają, przy czym największy wzrost odnotowano dla najkrótszego CL (150 msec). Obrazowanie fNADH o wysokiej rozdzielczości całej powierzchni przedniej przy 200 i 400 bpm przedstawiono na Rysunku 3. Poziomy fNADH przy 200 bpm były stałe i jednorodne przestrzennie. Przy 400 bpm poziomy fNADH znacznie wzrosły w całym osierdziu. Zaobserwowano istotną heterogeniczność przestrzenną, a największe wzrosty wystąpiły w obszarach przegrody RV i LV.

Sygnał fNADH oscyluje wraz ze skurczem (artefakt ruchu), a częstotliwość oscylacji odpowiada częstotliwości akcji serca (Rysunek 2). W przypadku kaniulacji dwujamyzowej podstawie serca przytrzymuje 4 kaniule, co zapobiega kołysaniu się serca podczas skurczu. W związku z tym amplituda oscylacji jest zawsze mniejsza niż trendy fNADH w dłuższych skalach czasowych (5-10 sec), które są wywoływane przez niedokrwienie lub hipoksję.

Układ do pomiaru ciśnienia w sercu wraz z wykresami ciśnień komorowych, aorty i tętnicy płucnej.
Rycina 1. Typowe wartości ciśnień i monofazowe potencjały czynnościowe z izolowanego, pracującego serca królika z obiema komorami. A. Widok podstawny serca z zaznaczonymi czterema kaniulami: 1, aortą; 2, tętnicą płucną; 3, lewym przedsionkiem; oraz 4, prawym przedsionkiem. B. Widok przedni serca z zaznaczoną lewą komorą (LV) i prawą komorą (RV). C. Reprezentatywne wartości ciśnień. Góra: ciśnienie w lewej komorze (linia ciągła) i ciśnienie w aorcie (linia przerywana). Dół: ciśnienie w tętnicy płucnej. D. Reprezentatywne monofazowe potencjały czynnościowe. Sygnał jest zsynchronizowany z ciśnieniami przedstawionymi w panelu C. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą rycinię.

Obrazowanie serca z analizą NADH wykazujące efekty częstotliwości stymulacji; wykres zmiany fluorescencji NADH.
Rycina 2. Obrazowanie fNADH wyizolowanego, pracującego serca królika z obiema komorami. Góra: Przedstawiono schemat pola widzenia (po lewej) oraz trzy obrazy fNADH. Na każdym obrazie zaznaczono odpowiadającą mu długość cyklu stymulacji (CL). Obszar zainteresowania dla sygnału fNADH w dolnym panelu został zaznaczony czerwoną ramką. Końcówka elektrody do potencjału czynnościowego monofazowego jest widoczna po prawej stronie obszaru zainteresowania. Epikardium było oświetlane za pomocą lampy rtęciowej i światłowodu, jak pokazano na Rycynie 5. Oświetlona została tylko powierzchnia epikardialna otaczająca obszar zainteresowania. Dół: Średnie fNADH dla obszaru zainteresowania zaznaczonego czerwoną ramką w górnym panelu. Średnie fNADH wzrasta wraz ze skróceniem długości cyklu.

Obrazy ultrasonograficzne serca przy 200 bpm i 400 bpm z oznaczeniami RV, LV, tkanki tłuszczowej i MAP.
Rysunek 3. Obrazy fNADH całej powierzchni przedniej izolowanego, pracującego dwukomorowego serca królika. Serce było stymulowane z poziomu RA przy 200 bpm i 400 bpm. Obrazowanie fNADH (2 fps, 128x128 pikseli przy rozdzielczości 0,4 mm) przeprowadzano podczas oświetlania całego przedniego epikardium za pomocą dwóch wysokiej mocy diod LED (Mightex PLS-0365-030-S, 365 nm, 4% intensywności, max 50 mW).

Dyskusja

Izolowane serce poddane perfuzji w układzie Langendorffa pozostaje kluczowym narzędziem w badaniach fizjologii serca2. Jest ono szczególnie użyteczne w badaniach nad arytmiami serca, zwłaszcza w tych wykorzystujących obrazowanie fluorescencyjne potencjału błonowego20. Zaletą jest możliwość obserwacji całego epikardium izolowanego serca21, 22. Kolejną zaletą jest fakt, że w przeciwieństwie do krwi, perfuzja klarownym krystaloidalnym roztworem buforowym nie zakłóca sygnałów fluorescencyjnych. Ograniczeniem jest to, że technika Langendorffa nie nadaje się do badań metabolizmu serca, które często wymagają, aby serce wykonywało pracę w warunkach fizjologicznego obciążenia wstępnego i następczego.

Aby zwiększyć przydatność izolowanych preparatów serca w badaniach metabolicznych, Neely wprowadził modyfikacje w technice Langendorffa w celu ustanowienia odpowiedniego obciążenia wstępnego i następczego lewej komory (LV)3. Model ten, znany jako model pracującego izolowanego serca z lewą komorą, był szeroko stosowany do badania wydajności i metabolizmu LV4-6. Model pracującego serca z LV jest lepszy od modelu Langendorffa w ocenach funkcjonalnych, jednak nie zapewnia on właściwego obciążenia prawej komory (RV). Demmy et al. po raz pierwszy opisali model biventrykularny (LV i RV) jako modyfikację modelu pracującego serca z LV7, 8. Stwierdzili oni, że objętość wyrzutowa, rzut serca oraz rozwój ciśnienia uległy poprawie w sercach przekształconych z trybu pracy LV na tryb pracy biventrykularny8. Prawidłowo obciążona RV poprawia również funkcję przegrody, zmniejszając nieprawidłowe gradienty ciśnienia w obrębie przegrody. Wykazano, że pracujące serca biventrykularne utrzymują rzut aortalny, przepływ płucny, średnie ciśnienie aortalne, średnie ciśnienie płucne, częstotliwość akcji serca oraz poziomy ATP mięśnia sercowego i fosfokreatyny przez okres do 3 godzin8. W badaniach nad pracującym sercem biventrykularnym zazwyczaj wykorzystuje się serca małych zwierząt, takich jak szczury i króliki, ponieważ rzut serca i wymagana objętość perfuzatu są znacznie mniejsze niż w przypadku serc większych zwierząt. Niemniej jednak badania nad pracującym sercem biventrykularnym prowadzono również z wykorzystaniem serc świń, psów, a nawet ludzi23, 24.

Zapotrzebowanie metaboliczne izolowanych serc w trybie pracy dwukomorowej jest znacznie wyższe niż w przypadku perfuzji Langendorffa. Istotne jest, aby roztwór perfuzyjny dostarczał wystarczającą ilość tlenu i substratów metabolicznych do podtrzymania funkcji serca w trybie dwukomorowym. Standardowe krystaloidalne roztwory buforowe, takie jak Krebs-Henseleit16, 17, 25 lub Tyrodes26, 27, charakteryzują się rozpuszczalnością tlenu do 5,6 mg/L. Gdy roztwory te są napowietrzane karbogenem (mieszaniną gazów 95% O2 i 5% CO2) i zawierają odpowiedni substrat metaboliczny (glukozę, dekstrozę i/lub pirogronian sodu), są one odpowiednie dla serc pracujących w trybie dwukomorowym z prawidłową częstotliwością rytmu zatokowego (około 180 bpm dla królika).

Zapotrzebowanie metaboliczne wzrasta przy szybkich rytmach, a ilość tlenu rozpuszczonego w standardowych perfuzatach może być niewystarczająca do pełnego wsparcia pracującego serca dwukomorowego kurczącego się z wysoką częstotliwością. W preparatach pracującego serca stosowano krystaloidalne roztwory buforowe zawierające erytrocyty lub zmieszane z pełną krwią, aby zapewnić odpowiednią dostępność tlenu. Wcześniejsze badania wykazały, że dodanie erytrocytów do roztworu Krebsa-Henseleita poprawiło funkcję pracującego serca podczas rygorystycznych protokołów stymulacji oraz zmniejszyło częstotliwość występowania migotania komór16. Ograniczeniem w stosowaniu erytrocytów lub mieszanin pełnej krwi jest fakt, że hemoglobina zakłóca długości fal świetlnych wykorzystywanych w obrazowaniu fluorescencyjnym13. Do roztworów perfuzyjnych można również dodawać inne substraty, takie jak albumina, aby przedłużyć żywotność serca i zmniejszyć obrzęki28.

Podczas obrazowania fluorescencyjnego natężenie światła wzbudzenia powinno być wysokie, a rozkład światła jednolity. Osiągnięcie jednolitego oświetlenia nie zawsze jest łatwe ze względu na krzywiznę powierzchni epikardium. W naszych badaniach obrazujemy fNADH, filtrując światło (350±25 nm) z lampy rtęciowej. Do kierowania światłem UV na powierzchnię epikardium używa się rozgałęzionego światłowodowego prowadnika światła. Jednorodne oświetlenie można uzyskać poprzez odpowiednie rozmieszczenie dwóch tulejek wyjściowych. Można również zastosować źródła światła UV LED, co zaprezentowaliśmy na Rysunku 3. Źródła LED są stosunkowo tanie, dzięki czemu do systemu obrazowania można włączyć wiele takich źródeł. Diody LED mogą być również włączane i wyłączane z wysoką częstotliwością w celu synchronizacji światła wzbudzenia z akwizycją obrazu.

Należy zminimalizować fotobleaching NADH29 poprzez skrócenie czasu oświetlania tkanki. Można to osiągnąć, cyklicznie włączając i wyłączając oświetlenie za pomocą migawki elektronicznej i lampy lub korzystając z systemu oświetlenia LED z kontrolerem. Jeśli oświetlenie zostanie zsynchronizowane z cyklem pracy serca, akwizycję obrazów fNADH można ograniczyć do rozkurczu, co zredukuje artefakty ruchowe w sygnałach fluorescencji. Jednym ze sposobów realizacji tego celu byłoby wyzwalanie oświetlenia i akwizycji obrazów za pomocą sygnału ciśnienia, np. ciśnienia w LV.

W naszych badaniach zaobserwowaliśmy, że zmiany fNADH na jednostkę czasu mogą być ponad 5X wyższe przy 400 bpm niż przy 200 bpm. Wskazuje to, że szybkie rytmy podnoszą stan redoks serca. Kwestia tego, czy jest to spowodowane hipoksją, czy też niezdolnością miocytów do wystarczająco szybkiego utleniania NADH do NAD+, aby uniknąć akumulacji NADH, pozostaje wciąż nieodpowiedziana.

Wydajność preparatu pracującego serca dwukomorowego zależy od wielu czynników. Jednym z najważniejszych jest ustawienie odpowiedniego obciążenia wstępnego i następczego, aby odwzorować badane warunki fizjologiczne. W szczególności obciążenie następcze LV (ciśnienie aortalne) musi zostać dostosowane tak, aby reprezentowało ciśnienie systemowe. Jeśli będzie ono zbyt wysokie, LV nie będzie w stanie pokonać tego ciśnienia, co doprowadzi do cofania się krwi. Z kolei zbyt niskie ciśnienie niekorzystnie wpłynie na perfuzję wieńcową. Ciśnienie obciążenia wstępnego LV (ciśnienie w lewym przedsionku) powinno być również dostosowane tak, aby zapewnić objętość końcowodorozkurczową odpowiednią dla protokołu eksperymentalnego.

Obrazowanie fNADH w żywych tkankach jest ugruntowaną metodą obrazowania fluorescencyjnego13. Jej zastosowanie w tkance serca zostało zilustrowane przez Barlowa i Chance'a, którzy zgłosili wyraźne podwyższenie poziomu fNADH w obrębie tkanki regionalnie niedokrwionej po podwiązaniu naczynia wieńcowego14. Ich obrazy fNADH zostały zarejestrowane na kliszy za pomocą kamery oscyloskopowej Fairchild oraz fotografii z lampą błyskową UV. Coremans et al. rozwinęli tę koncepcję, wykorzystując stosunek fluorescencji NADH do odbicia UV w celu pomiaru stanu metabolicznego osierdzia w perfundowanych krwią sercach szczurów w modelu Langendorffa30. Do obrazowania wykorzystano wideofluorymetr, a dane zarejestrowano za pomocą rejestratora wideo. Później Scholz et al. użyli spektrografu i matrycy fotodiod do pomiaru średniego poziomu fNADH z dużego obszaru LV. Podejście to ograniczyło wpływ heterogeniczności fluorescencji osierdzia oraz lokalnych zmienności w ukrwieniu, ujawniając jednocześnie makroskopowe zmiany fNADH związane z pracą serca31. Metoda ta jest podobna do obliczania średnich poziomów fNADH dla obszaru zainteresowania we wszystkich klatkach zestawu danych obrazowania fNADH, co zilustrowano na Rysunku 2. Jak przedstawiliśmy w niniejszym artykule, współczesna technologia oferuje szybkie kamery CCD oraz cyfrowo sterowane, wysokoenergetyczne reflektory UV. Technologie te umożliwiają badanie dynamiki czasowo-przestrzennej fNADH i metabolizmu serca z wielu nowych perspektyw. Stosunkowo niski koszt optyki i źródła światła sprawia, że obrazowanie fNADH jest użytecznym dodatkiem do konwencjonalnych systemów optycznego mapowania serca.9, 32

Oświadczenia

Nie zgłoszono konfliktów interesów.

Podziękowania

Praca ta była wspierana przez grant z NIH (R01-HL095828 dla M. W. Kay).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
NaClSigma-AldrichS-3014
KClSigma-AldrichP3911-500G
CaCl2Fisher ScientificC77-500
MgSO4Sigma-AldrichM-7506
NaHCO3Fisher ScientificS-233
KH2PO4Fisher Scientific423-316
GlukozaSigma-Aldrich158968-500G
Pirowinian soduSigma-AldrichP2256-25G
AlbuminaSigma-AldrichA9418-100G

Bibliografia

  1. Langendorff, O. Untersuchungen am uberlebenden saugethierherzen [investigations on the surviving mammalian heart]. Arch. Gesante Physiol. 61, 291-332 Forthcoming.
  2. Skrzypiec-Spring, M., Grotthus, B., Szelag, A., Schulz, R. Isolated heart perfusion according to langendorff---still viable in the new millennium. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 55, 113-126 (2007).
  3. Neely, J. R., Liebermeister, H., Battersby, E. J., Morgan, H. E. Effect of pressure development on oxygen consumption by isolated rat heart. Am. J. Physiol. 212, 804-814 (1967).
  4. Feng, H. Z., Jin, J. P. Coexistence of cardiac troponin T variants reduces heart efficiency. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 299, H97-H105 (2010).
  5. Clemens, M. G., Forrester, T. Appearance of adenosine triphosphate in the coronary sinus effluent from isolated working rat heart in response to hypoxia. J. Physiol. 312, 143-158 (1981).
  6. Cole, M. A., Murray, A. J., Cochlin, L. E., Heather, L. C., McAleese, S., Knight, N. S., Sutton, E., Jamil, A. A., Parassol, N., Clarke, K. A high fat diet increases mitochondrial fatty acid oxidation and uncoupling to decrease efficiency in rat heart. Basic Res. Basic Res. Cardiol. 106, 447-457 (2011).
  7. Demmy, T. L., Curtis, J. J., Kao, R., Schmaltz, R. A., Walls, J. T. Load-insensitive measurements from an isolated perfused biventricular working rat heart. J. Biomed. Sci. 4, 111-119 (1997).
  8. Demmy, T. L., Magovern, G. J., Kao, R. L. Isolated biventricular working rat heart preparation. Ann. Thorac. Surg. 54, 915-920 (1992).
  9. Kay, M., Swift, L., Martell, B., Arutunyan, A., Sarvazyan, N. Locations of ectopic beats coincide with spatial gradients of NADH in a regional model of low-flow reperfusion. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 294, 2400-2405 (2008).
  10. Swift, L., Martell, B., Khatri, V., Arutunyan, A., Sarvazyan, N., Kay, M. Controlled regional hypoperfusion in langendorff heart preparations. Physiol. Meas. 29, 269-279 (2008).
  11. High resolution contrast ultrasound and NADH fluorescence imaging of myocardial perfusion in excised rat hearts. Kay, M. W., Swift, L. M., Sangave, A., Zderic, V. 30th Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society, , 1-4 (2008).
  12. Chance, B. Pyridine nucleotide as an indicator of the oxygen requirements for energy-linked functions of mitochondria. Circ. Res. 38, I31-I38 (1976).
  13. Mayevsky, A., Rogatsky, G. G. Mitochondrial function in vivo evaluated by NADH fluorescence: From animal models to human studies. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 292, C615-C640 (2007).
  14. Barlow, C. H., Chance, B. Ischemic areas in perfused rat hearts: Measurement by NADH fluorescence photography. Science. 193, 909-910 (1976).
  15. Mayevsky, A., Chance, B. Oxidation-reduction states of NADH in vivo: From animals to clinical use. Mitochondrion. 7, 330-339 (2007).
  16. Gillis, A. M., Kulisz, E., Mathison, H. J. Cardiac electrophysiological variables in blood-perfused and buffer-perfused, isolated, working rabbit heart. Am. J. Physiol. 271, H784-H789 (1996).
  17. Ôta, K., Peaker, M. Lactation in the rabbit: Mammary blood flow and cardiac output. Experimental Physiology. 64, 225-238 (1979).
  18. Ashruf, J. F., Ince, C., Bruining, H. A. Regional ischemia in hypertrophic langendorff-perfused rat hearts. Am. J. Physiol. 277, H1532-H1539 (1999).
  19. Ashruf, J. F., Coremans, J. M., Bruining, H. A., Ince, C. Increase of cardiac work is associated with decrease of mitochondrial NADH. Am. J. Physiol. 269, 856-862 (1995).
  20. Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. Optical imaging of the heart. Circ. Res. 95, 21-33 (2004).
  21. Rogers, J. M., Walcott, G. P., Gladden, J. D., Melnick, S. B., Kay, M. W. Panoramic optical mapping reveals continuous epicardial reentry during ventricular fibrillation in the isolated swine heart. Biophys. J. 92, 1090-1095 (2007).
  22. Qu, F., Ripplinger, C. M., Nikolski, V. P., Grimm, C., Efimov, I. R. Three-dimensional panoramic imaging of cardiac arrhythmias in rabbit heart. J. Biomed. Opt. 12, 044019(2007).
  23. Chinchoy, E., Soule, C. L., Houlton, A. J., Gallagher, W. J., Hjelle, M. A., Laske, T. G., Morissette, J., Iaizzo, P. A. Isolated four-chamber working swine heart model. Ann. Thorac. Surg. 70, 1607-1614 (2000).
  24. Hill, A. J., Laske, T. G., Coles, J. A., Sigg, D. C., Skadsberg, N. D., Vincent, S. A., Soule, C. L., Gallagher, W. J., Iaizzo, P. A. In vitro studies of human hearts. Ann. Thorac. Surg. 79, 168-177 (2005).
  25. Schenkman, K. A. Cardiac performance as a function of intracellular oxygen tension in buffer-perfused hearts. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 281, H2463-H2472 (2001).
  26. Pijl, A. J., Pfaffendorf, M., Mathy, M., Van Zwieten, P. A. Cardioprotection by nifedipine in isolated working hearts: A comparative study on three different types of experimental ischemia. J. Cardiovasc. Pharmacol. 21, 70-76 (1993).
  27. Khatib, S. Y., Boyett, M. R. Effects of glyburide (glibenclamide) on myocardial function in langendorff perfused rabbit heart and on myocardial contractility and slow calcium current in guinea-pig single myocytes. Mol. Cell Biochem. 242, 81-87 (2003).
  28. Kates, R. E., Yee, Y. G., Hill, I. Effect of albumin on the electrophysiologic stability of isolated perfused rabbit hearts. J. Cardiovasc. Pharmacol. 13, 168-172 (1989).
  29. Combs, C. A., Balaban, R. S. Direct imaging of dehydrogenase activity within living cells using enzyme-dependent fluorescence recovery after photobleaching (ED-FRAP). Biophys. J. 80, 2018-2028 (2001).
  30. Coremans, J. M., Ince, C., Bruining, H. A., Puppels, G. J. (Semi-)quantitative analysis of reduced nicotinamide adenine dinucleotide fluorescence images of blood-perfused rat heart. Biophys J. 72, 1849-1860 (1997).
  31. Scholz, T. D., Laughlin, M. R., Balaban, R. S., Kupriyanov, V. V., Heineman, F. W. Effect of substrate on mitochondrial NADH, cytosolic redox state, and phosphorylated compounds in isolated hearts. Am. J. Physiol. 268, 82-91 (1995).
  32. Holcomb, M. R., Woods, M. C., Uzelac, I., Wikswo, J. P., Gilligan, J. M., Sidorov, V. Y. The potential of dual camera systems for multimodal imaging of cardiac electrophysiology and metabolism. Exp. Biol. Med. (Maywood). 234, 1355-1373 (2009).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Dwukomorowe pracujące serceizolowane serce królikaprocedura kanulacjikalibracja czujnika ciśnieniastan redoks mitochondriówanaliza częstotliwości stymulacjipomiar fluorescencji epikardialnejfizjologiczny model perfuzjibadanie metabolizmu serca
Obrazowanie fluorescencyjne NADH w izolowanych, pracujących sercach królika z obiema komorami
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.