Obrazowanie fluorescencyjne NADH izolowanych dwukomorowych pracujących serc królików

Podsumowanie

Celem jest monitorowanie mitochondrialnego stanu redoks izolowanych serc w kontekście fizjologicznego ciśnienia obciążenia wstępnego i następczego. Przedstawiono dwukomorowy model pracującego serca królika. Obrazowanie fluorescencyjne NADH o wysokiej rozdzielczości czasoprzestrzennej służy do monitorowania mitochondrialnego stanu redoks tkanki nasierdzia.

Streszczenie

Od momentu powstania przez Langendorffa¹, izolowane perfundowane serce pozostaje ważnym narzędziem do badania fizjologii serca². Nie nadaje się jednak do badań nad metabolizmem serca, które wymagają od serca wykonywania pracy w kontekście fizjologicznego ciśnienia obciążenia wstępnego i następczego. Neely wprowadził modyfikacje do techniki Langendorffa w celu ustalenia odpowiednich ciśnień napięcia wstępnego i następczego w lewej komorze (LV)³. Model ten jest znany jako izolowany model pracy lewej komory nadkomórczej i jest szeroko stosowany do badania wydajności lewej komory i metabolizmu^4-6. Model ten nie zapewnia jednak prawidłowo obciążonej prawej komory (RV). Demmy i wsp. po raz pierwszy opisano model dwukomorowy jako modyfikację modelu pracy serca LV^{7, 8}. Odkryli, że objętość wyrzutowa, pojemność minutowa serca i rozwój ciśnienia poprawiły się w sercach przestawionych z trybu pracy LV na dwukomorowy^{tryb pracy 8}. Prawidłowo obciążony RV zmniejsza również nieprawidłowe gradienty ciśnienia w przegrodzie, aby poprawić funkcję przegrody. Wykazano, że dwukomorowe serca pracujące utrzymują pojemność minutową aorty, przepływ w płucach, średnie ciśnienie w aorcie, częstość akcji serca i poziomy ATP mięśnia sercowego przez okres do 3 godzin⁸.

Podczas badania metabolicznych skutków uszkodzenia mięśnia sercowego, takiego jak niedokrwienie, często konieczne jest zidentyfikowanie lokalizacji uszkodzonej tkanki. Można to zrobić, obrazując fluorescencję NADH (zredukowanej formy dinukleotydu nikotynamidoadeninowego)^9-11, koenzymu występującego w dużych ilościach w mitochondriach. Fluorescencja NADH (fNADH) wykazuje prawie liniowo odwrotną zależność od lokalnego stężenia tlenu¹² i zapewnia pomiar mitochondrialnego stanu redoks¹³. Obrazowanie fNADH w stanach niedotlenienia i niedokrwiennego było stosowane jako metoda bezbarwnikowa do identyfikacji regionów niedotlenienia^{14, 15} i monitorowania postępu stanów niedotlenienia w czasie¹⁰.

Celem metody jest monitorowanie mitochondrialnego stanu redoks w dwukomorowych sercach podczas protokołów, które zmieniają tempo metabolizmu miocytów lub indukują niedotlenienie lub tworzą kombinację tych dwóch. Serca białych królików nowozelandzkich podłączono do dwukomorowego układu pracy serca (Hugo Sachs Elektronik) i perfuzjono zmodyfikowanym roztworem Krebsa-Henseleita¹⁶ w temperaturze 37 °C. Zarejestrowano ciśnienie w aorcie, LV, tętnicy płucnej oraz lewym i prawym przedsionku. Aktywność elektryczną mierzono za pomocą jednofazowej elektrody potencjału czynnościowego. Aby zobrazować fNADH, światło z lampy rtęciowej zostało przefiltrowane (350±25 nm) i wykorzystane do oświetlenia nasierdzia. Emitowane światło zostało przefiltrowane (460±20 nm) i zobrazowane za pomocą kamery CCD. Przedstawiono zmiany w nasierdziowym fNADH dwukomorowych pracujących serc podczas różnych temp stymulacji. Połączenie modelu serca i obrazowania fNADH stanowi nowe i cenne narzędzie eksperymentalne do badania ostrych patologii serca w kontekście realistycznych warunków fizjologicznych.

Protokół

1. Przygotowanie do badania

1. Przygotować cztery litry zmodyfikowanego roztworu Krebsa-Henseleita ¹⁶ (w mM: 118 NaCl, 3,30 KCl, 2,00 CaCl₂, 1,20_MgSO4, 24,0 NaHCO₃, 1,20 KH₂PO₄, 10,0 glukozy, 2,00 NaPirogronian i 20,0 mg/L albuminy). Roztwór należy przygotować jak najbliżej rozpoczęcia eksperymentu. pH należy dostosować do 7,4 po sterylnym filtrowaniu (wielkość porów: 22 μm, Corning). Osmolalność roztworu powinna wynosić od 275 do 295 mOsm/kg.
2. Przepłucz wszystkie rurki i komory pracującego układu serca oczyszczoną wodą. Uruchom pompy, aż cała woda zostanie usunięta z systemu.
3. Dodać celulozowe filtry membranowe (wielkość porów: 5 μm, Advantec) w jednej linii z każdą z pomp perfuzyjnych (pompa perfuzyjna Langendorffa, pompa perfuzyjna lewego serca i pompa perfuzyjna prawego serca).
4. Wykonaj dwupunktową kalibrację (0 i 60 mmHg) dla każdego czujnika ciśnienia.
5. Włącz łaźnie wodne. Podgrzewana kąpiel wodna obiegowa (Cole Palmer) służy do ogrzewania rur i wymienników ciepła z płaszczem wodnym. Perfuzat jest wstępnie podgrzewany w oddzielnej łaźni wodnej (Oakton Instruments). Obie kąpiele są ustawione tak, aby utrzymywać temperaturę roztworu 37 °C.
6. Włącz pompy, aby perfuzat krążył w zamkniętej pętli. Perfuzat przechodzi przez oksygenatory z mikrofibry (hemofiltry) zagazowane 95%_O2 i 5% CO₂ przy 80 kPa. Natleniony perfuzat przepływa następnie przez wymienniki ciepła, aby utrzymać go w temperaturze 37 °C przed dostaniem się do kaniul serca.

2. Wycięcie serca

1. Zacznij od ustawienia pracującego układu serca tak, aby działał w trybie Langendorffa ze stałym ciśnieniem. Ustaw ciśnienie bloku aorty w zakresie od 50 do 60 mmHg.
2. Znieczulić królika domięśniowym wstrzyknięciem ketaminy (44 mg/kg) i ksylazyny (10 mg/kg). Po uspokojeniu królika pentobarbital (50 mg/kg) i heparynę (2000 j.) wstrzykuje się dożylnie przez żyłę ucha brzeżnego lub żyłę odpiszczelową boczną po wewnętrznej stronie kończyny tylnej.
3. Kiedy królik całkowicie nie reaguje, co wynika z braku odruchu bólowego, klatka piersiowa jest szybko otwierana, osierdzie jest cięte, aorta jest zaciskana, a serce i płuca są wycinane. W tym momencie płuca powinny być przyczepione do serca, aby pomóc w izolacji żył płucnych.
4. Wyizoluj i kaniuluj aortę za pomocą kaniuli o średnicy 5 mm, która jest przymocowana do strzykawki wypełnionej 60 ml perfuzatu i 200 jednostkami heparyny. Przymocuj aortę do kaniuli za pomocą jedwabnego szwu w rozmiarze zero i powoli wciśnij strzykawkę, aby przepłukać serce z krwi.

3. Kaniulacja dwukomorowa

1. Podłącz serce do bloku aorty pracującego układu sercowego. Zapobiegaj przedostawaniu się powietrza do aorty, co może spowodować zatorowość wieńcową. Najlepiej jest przymocować kaniulę do bloku aorty, zbliżając się do łącznika aorty pod kątem i pozwalając, aby perfuzat delikatnie kapał z łącznika do kaniuli, gdy jest on podłączony.
2. Podczas gdy serce jest perfundowane w trybie Langendorffa pod stałym ciśnieniem, usuń tłuszcz i tkankę łączną i zlokalizuj następujące naczynia: żyła główna dolna i górna, żyła azygotyczna, tętnica płucna, żyły płucne.
3. Podwiązywać żyłę główną górną. Przetnij tętnicę płucną tuż poniżej miejsca, w którym rozgałęzia się na prawą i lewą tętnicę płucną.
4. Zgrupuj wszystkie pozostałe naczynia (żyły płucne) między sercem a płucami i podwiąż je wszystkie za pomocą jednego szwu. Usuń płuca.
5. Wytnij mały otwór w rogu lewego uszka przedsionka. Upewnij się, że LA jest wypełniony perfuzatem. Kanuluj LA, upewniając się, że kaniula jest całkowicie wypełniona perfuzatem podczas jej wkładania. Zszyj kaniulę do wyrostka LA.
6. Włącz pompę po lewej stronie (pompa #2), aby zapewnić przepływ do lewego przedsionka. Ustaw ciśnienie napięcia wstępnego w zakresie 2 - 6 mmHg i wyreguluj ±2 mmHg, zgodnie z rozszerzeniem przedsionków.
7. Przełącz serce w tryb pracy serca, wyłączając pompę Langendorffa (pompa #1).
8. Chwilowo zmniejsz ciśnienie w aorcie do 10 mmHg, a następnie powoli zwiększaj je do zakresu od 80 do 100 mmHg. Umożliwi to otwarcie zastawki aortalnej i funkcjonowanie tak, jak w normalnych warunkach fizjologicznych. Końcowe ciśnienie obciążenia następczego będzie zależało od kurczliwości LV. Powinien być ustawiony na wartość, która jest o około 20 mmHg mniejsza niż szczytowe ciśnienie LV.
9. Rzut serca lewej komory narzutowej można określić, mierząc szybkość przepływu perfuzatu wychodzącego z bloku aorty (ml/min). Prawidłowy rzut serca wynosi od 14,77 do 16,43 ml/min na 100 g masy ^ciała17 i wynosi średnio 340 ml/min dla królika o wadze 2,2 kg. Ciśnienie w aorcie powinno przypominać sygnał ciśnienia pokazany na rysunku 1.
10. Kannilować RZS przez żyłę główną dolną. Upewnij się, że zarówno RA, jak i kaniula są całkowicie wypełnione perfuzatem i włóż kaniulę, zapobiegając tworzeniu się pęcherzyków powietrza. Zszyj kaniulę do żyły.
11. Włącz pompę po prawej stronie (pompa #3), aby zapewnić przepływ do prawego przedsionka. Ustaw ciśnienie na około 3 mmHg.
12. Upewnij się, że RV jest wypełniony perfuzatem i kanulacją tętnicy płucnej. Upewnij się, że kaniula jest całkowicie wypełniona perfuzatem, gdy jest wkładana, aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków powietrza. Zszyj kaniulę do tętnicy płucnej.

4. Akwizycja sygnału: Ciśnienia, Monofazowe Potencjały Czynnościowe i fNADH

1. Po zakończeniu kaniulacji dwukomorowej ostrożnie włóż cewnik przetwornika ciśnienia (Millar) do aorty za pomocą kaniuli aorty. Delikatnie przesuń go obok zastawki aortalnej i do LV. Monitoruj sygnał ciśnienia lewej komory, aby zapewnić prawidłowe ustawienie końcówki cewnika. Przykład ciśnienia niskiego napięcia pokazano na rysunku 1.
2. Delikatnie dociśnij elektrodę potencjału czynnościowego jednofazowego do nasierdzia komorowego. Monitoruj sygnał, aby uzyskać odpowiednie pomiary potencjału czynnościowego. Niewielki artefakt ruchu w sygnale jest normalny.
3. Umieść bipolarną elektrodę bodźcową na prawym przedsionku, aby przyspieszyć pracę serca. W naszym protokole serca były stymulowane w cyklach o długości od 300 do 150 ms, co odpowiada odpowiednio 200 i 400 uderzeń na minutę.
4. Zmierz temperaturę powierzchni nasierdzia LV. Jeśli badanie wymaga, aby temperatura była utrzymywana na poziomie 37 °C, należy umieścić serce w komorze serca z płaszczem wodnym lub zanurzyć serce w podgrzanej kąpieli superfuzacyjnej, aby utrzymać stałą temperaturę w całym sercu.
5. Ustaw kamerę CCD (Andor iXon DV860, 128x128 pikseli) i ustaw ostrość obiektywu tak, aby obserwowane było odpowiednie pole view. Kamera jest podłączona do stacji roboczej, a obrazy są rejestrowane z prędkością 2 kl./s za pomocą oprogramowania Andor SOLIS.
6. Włącz lampę rtęciową przed rozpoczęciem obrazowania. Światło jest kierowane przez filtr wzbudzenia (350±25 nm, technologia Chroma) i do światłowodu światłowodowego (Horiba Jobin Yvon model 1950-1M) w celu oświetlenia powierzchni serca. Tłumienie światła UV przez światłowód jest niewielkie. Oświetlenie UV można również zapewnić za pomocą systemu LED dużej mocy składającego się z reflektorów LED (Mightex PLS-0365-030-S) i jednostki sterującej (Mightex SLC-SA04-US).
7. Wyłącz światło w pomieszczeniu i zminimalizuj oświetlenie otoczenia. Skieruj tuleje światłowodu (lub reflektorów LED) na serce, aby uzyskać równomierne oświetlenie nasierdzia. Emitowana fluorescencja NADH (fNADH) przechodzi przez filtr emisyjny (technologia Chroma 460±20 nm) i jest obrazowana przez kamerę CCD.
8. Monitoruj zmiany fNADH w czasie, wybierając obszar zainteresowania za pomocą oprogramowania do obrazowania. Wybierz tryb aktualizacji na żywo, aby monitorować średnią intensywność pikseli w obszarze zainteresowania.
9. Serce powinno funkcjonować w dwukomorowym trybie pracy, aby wytworzyć odpowiednie ciśnienie. Poziomy fNADH powinny być niskie i stabilne na powierzchni nasierdzia, aby potwierdzić odpowiednią perfuzję wieńcową. Na tym etapie badania należy wdrożyć określony protokół eksperymentalny w celu przetestowania hipotezy.
10. Po zakończeniu badania należy usunąć serce z układu i odprowadzić cały perfuzat. Przepłucz przewody i komory układu oczyszczoną wodą. W celu rutynowej konserwacji system należy okresowo przepłukiwać roztworem Mucasol lub rozcieńczonym roztworem nadtlenku wodoru, w zależności od potrzeb.

5. Przetwarzanie obrazów fNADH w trybie off-line

1. Jednym ze sposobów porównania zestawów danych NADH (fNADH(i,j,t)) między eksperymentami jest normalizacja każdego obrazu fluorescencji przy użyciu obrazu referencyjnego (fNADH(i,j,t₀)) ze zbioru danych⁹, jak pokazano w poniższym równaniu. Innym sposobem normalizacji fluorescencji NADH jest umieszczenie małego kawałka szkła uranylowego w polu widzenia przed eksperymentem^{9, 18, 19}. Szkło uranylowe ulega fluorescencji (450 - 550 nm) po oświetleniu światłem UV, aby zapewnić sygnał, który można wykorzystać jako stabilne odniesienie.

6. Reprezentatywne wyniki

Przednie i podstawowe widoki dwukomorowego preparatu serca królika są pokazane na rysunku 1. Ciśnienie w lewej komorze mierzono poprzez nawigację cewnika przetwornika ciśnienia (Millar SPR-407) obok zastawki aortalnej i do lewej komory. Ciśnienie w aorcie, tętnicy płucnej i lewej komorze (LVP) pokazano na rysunku 1C. Rozkurczowy LVP wynosi zwykle od 0 do 10 mmHg. Minimalne rozkurczowe ciśnienie w aorcie wynosi około 60 mmHg. Szczytowy skurczowy LVP zależy od ciśnienia napełniania (napięcia wstępnego lub ciśnienia LA) i kurczliwości i optymalnie powinien wynosić od 80 do 100 mmHg. Maksymalne ciśnienie w aorcie i maksymalne LVP powinny być ściśle zgodne, jak pokazano na rysunku 1C.

Monofazowe potencjały czynnościowe (MAP) z fazą szybkiej depolaryzacji i fazą repolaryzacji, które są typowe dla serc królików, są pokazane na rysunku 1D. MAP można stosunkowo łatwo zarejestrować z kurczącego się serca, ale zwykle będą one miały niewielki artefakt ruchu podczas rozkurczu, jak pokazano na rysunku 1D. MAP są przydatne do potwierdzania pomyślnego porywania serca (wychwytywania) podczas stymulacji, a także mogą być używane do pomiaru lokalnych zmian elektrofizjologicznych spowodowanych niedokrwieniem lub innymi ostrymi zaburzeniami. EKG można również zmierzyć, zanurzając serce w kąpieli z ciepłym superfuzalatem i umieszczając elektrodę w kąpieli po lewej i prawej stronie serca. Trzecia, obojętna elektroda jest albo umieszczana w wannie, z dala od serca, albo jest przymocowana do aorty. EKG dostarczy informacji dotyczących globalnego procesu pobudzenia i repolaryzacji, co jest przydatne do oceny ogólnej funkcji elektrycznej i ujawnienia obecności niedokrwienia.

fNADH obrazowanie ujawnia zmiany w mitochondrialnym stanie redoks serca, które mogą być użyte do pomiaru czasoprzestrzennego postępu obszarów niedokrwiennych lub niedotlenionych. W tym badaniu zmierzono nasierdziowe fNADH w celu monitorowania zmian stanu redoks podczas trzech szybkości stymulacji przy długościach cyklu (CL) wynoszących 300, 200 i 150 ms. Średnie wartości fNADH z obszaru zainteresowania (czerwona ramka, rysunek 2) pokazują, że wyjściowe poziomy fNADH rosną wraz ze skracaniem długości cyklu. Gdy tempo stymulacji jest zbliżone do rytmu zatokowego (CL = 300 ms), wyjściowy poziom fNADH jest względnie stały. Gdy długość cyklu skraca się poniżej 300 ms, wyjściowe poziomy fNADH wzrastają, przy czym największy wzrost występuje przy najkrótszym CL (150 ms). Obrazowanie fNADH w wysokiej rozdzielczości całej przedniej powierzchni przy 200 i 400 uderzeniach na minutę przedstawiono na rycinie 3. Poziomy fNADH przy 200 uderzeniach na minutę były stałe i jednorodne przestrzennie. Przy 400 uderzeniach na minutę poziom fNADH znacznie wzrósł w całym nasierdziu. Zaobserwowano znaczną niejednorodność przestrzenną, przy czym największe wzrosty wystąpiły w obrębie obszarów przegrody RV i LV.

Sygnał fNADH oscyluje ze skurczem (artefakt ruchu), a częstotliwość oscylacji odpowiada częstości akcji serca (Rysunek 2). W kaniulacji dwukomorowej podstawa serca jest utrzymywana przez 4 kaniule, co pomaga zapobiegać kołysaniu się serca podczas skurczu. Dlatego amplituda oscylacji jest zawsze mniejsza niż jakiekolwiek dłuższe trendy w skali czasowej (5-10 sekund) w fNADH, które są spowodowane niedokrwieniem lub niedotlenieniem.

Rysunek 1. Typowe ciśnienia i jednofazowe potencjały czynnościowe z izolowanego dwukomorowego pracującego serca królika. ZA. Podstawowy widok serca z czterema kaniulami: 1, aortą; 2, tętnica płucna; 3, lewy przedsionek; i 4, prawy przedsionek. Ur. Widok przedni serca pokazujący lewą komorę (LV) i prawą komorę (RV). C. Naciski przedstawicielskie. U góry: ciśnienie w lewej komorze (linia ciągła) i ciśnienie w aorcie (linia przerywana). Na dole: ciśnienie płucne. D. Reprezentatywne jednofazowe potencjały czynnościowe. Sygnał jest wyrównany z ciśnieniami pokazanymi na panelu C. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy rysunek.

Rycina 2. Obrazowanie fNADH izolowanego dwukomorowego pracującego serca królika. U góry: Pokazana jest kreskówka pola widzenia (po lewej) i trzy obrazy fNADH. Odpowiednia długość cyklu stymulacji (CL) jest wskazywana na każdym obrazie. Obszar zainteresowania dla sygnału fNADH w dolnym panelu jest oznaczony czerwonym polem. Końcówka monofazowej elektrody potencjału czynnościowego jest widoczna po prawej stronie obszaru zainteresowania. Nasierdzie zostało oświetlone za pomocą lampy rtęciowej i światłowodu, jak pokazano na rysunku 5. Oświetlona została jedynie powierzchnia nasierdzia otaczająca obszar zainteresowania. dno: Średnia wartość fNADH dla obszaru zainteresowania wskazanego przez czerwoną ramkę w górnym panelu. Średnia wartość fNADH wzrasta wraz ze zmniejszeniem długości cyklu.

Rycina 3. Obrazy fNADH pełnej przedniej powierzchni izolowanego dwukomorowego pracującego serca królika. Serce było pobudzone od RZS przy 200 uderzeniach na minutę i 400 uderzeń na minutę. fNADH został zobrazowany (2 kl./s, 128x128 pikseli w rozdzielczości 0,4 mm) przy jednoczesnym oświetleniu całego przedniego nasierdzia za pomocą dwóch diod LED dużej mocy (Mightex PLS-0365-030-S, 365 nm, 4% natężenia, 50 mW max).

Dyskusja

Izolowane perfundowane serce Langendorffa pozostaje ważnym narzędziem do badania fizjologii serca². Jest to szczególnie przydatne w badaniach zaburzeń rytmu serca, szczególnie tych, w których wykorzystuje się obrazowanie fluorescencyjne potencjału transbłonowego²⁰. Zaletą jest to, że można zaobserwować całe nasierdzie izolowanego serca^{21, 22}. Kolejną zaletą jest to, że w przeciwieństwie do krwi, perfuzja z przezroczystym krystaloidalnym roztworem buforowym nie zakłóca sygnałów fluorescencyjnych. Ograniczeniem jest to, że technika Langendorffa nie nadaje się dobrze do badań nad metabolizmem serca, które często wymaga od serca wykonywania pracy w kontekście fizjologicznego ciśnienia obciążenia wstępnego i następczego.

Aby zwiększyć znaczenie izolowanych preparatów serca w badaniach metabolicznych, Neely wprowadził modyfikacje do techniki Langendorffa w celu ustalenia odpowiedniego ciśnienia obciążenia wstępnego i następczego lewej komory (LV)³. Model ten jest znany jako izolowany model pracy lewej komory nadkomórczej i jest szeroko stosowany do badania wydajności lewej komory i metabolizmu^4-6. Model pracy niskiego napięcia serca jest lepszy od modelu Langendorffa w ocenie funkcjonalnej, ale nie zapewnia prawidłowo obciążonej prawej komory (RV). Demmy i wsp. po raz pierwszy opisano model dwukomorowy (LV i RV) jako modyfikację modelu pracy serca LV^{7, 8}. Odkryli, że objętość wyrzutowa, pojemność minutowa serca i rozwój ciśnienia poprawiły się w sercach przestawionych z trybu pracy LV na dwukomorowy^{tryb pracy 8}. Prawidłowo obciążony RV poprawia również funkcję przegrody poprzez zmniejszenie nieprawidłowych gradientów ciśnienia w przegrodzie. Wykazano, że dwukomorowe serca pracujące utrzymują pojemność aortalną, przepływ w płucach, średnie ciśnienie w aorcie, średnie ciśnienie w płucach, częstość akcji serca i ATP mięśnia sercowego oraz poziom fosforanu kreatyny przez okres do^{3 godzin8}. Dwukomorowe badania pracy serca zazwyczaj wykorzystują serca małych zwierząt, takich jak szczury i króliki, ponieważ pojemność minutowa serca i wymagana objętość perfuzatu są znacznie mniejsze niż w przypadku serc większych zwierząt. Jednak badania dwukomorowego serca roboczego przeprowadzono przy użyciu serc świń, psów, a nawet ludzi^{23, 24}.

Zapotrzebowanie metaboliczne izolowanych serc w dwukomorowym trybie pracy jest znacznie wyższe niż w przypadku perfuzji Langendorffa. Ważne jest, aby roztwór perfuzatu dostarczał wystarczającą ilość tlenu i substratu metabolicznego, aby wspomóc dwukomorową czynność serca. Standardowe roztwory krystaloidowych, takie jak Krebs-Henseleit^{16, 17, 25} lub Tyrodes^{26, 27}, mają rozpuszczalność tlenu na poziomie 5,6 mg/l. Gdy roztwory te są gazowane karbogenem (mieszanina gazów 95%_O2 i 5% CO₂ ) i zawierają odpowiedni substrat metaboliczny (glukozę, dekstrozę i/lub pirogronian sodu), są one odpowiednie dla dwukomorowych serc pracujących z prawidłową częstością występowania w zatokach (około 180 uderzeń na minutę u królika).

Wzrasta zapotrzebowanie metaboliczne na szybkie rytmy, a ilość tlenu rozpuszczonego w standardowych perfuzatach może nie wystarczyć, aby w pełni wesprzeć dwukomorowe pracujące serce, które kurczy się w szybkim tempie. Krystaloidowe roztwory buforowe zawierające erytrocyty lub zmieszane z krwią pełną były stosowane w preparatach nasercowych w celu zapewnienia odpowiedniej dostępności tlenu. Wcześniejsze badania wykazały, że dodanie erytrocytów do roztworu Krebsa-Henseleita poprawiło pracę serca podczas rygorystycznych protokołów stymulacji, a także zmniejszyło częstość występowania migotania komór¹⁶. Ograniczeniem stosowania erytrocytów lub mieszanin krwi pełnej jest to, że hemoglobina zakłóca długości fal świetlnych, które są używane do obrazowania fluorescencyjnego¹³. Inne substraty, takie jak albumina, mogą być również dodawane do roztworów perfuzyjnych w celu przedłużenia żywotności serca i zmniejszenia obrzęku²⁸.

Podczas obrazowania fluorescencyjnego natężenie światła wzbudzonego powinno być wysokie, a rozsył światła równomierny. Uzyskanie równomiernego oświetlenia nie zawsze jest łatwe ze względu na krzywiznę powierzchni nasierdzia. W naszych badaniach obrazujemy fNADH poprzez filtrowanie światła (350±25 nm) z lampy rtęciowej. Rozwidlony światłowód światłowodowy służy do kierowania światła UV na powierzchnię nasierdzia. Równomierne oświetlenie można uzyskać poprzez odpowiednie ustawienie dwóch tulejek wyjściowych. Można również zastosować źródła światła UV LED, jak pokazaliśmy na rysunku 3. Źródła LED są stosunkowo niedrogie, więc wiele źródeł można włączyć do systemu obrazowania. Diody LED można również włączać i wyłączać z dużą szybkością, aby zsynchronizować światło wzbudzenia z akwizycją obrazu.

Fotowybielanie NADH powinno być zminimalizowane²⁹ poprzez skrócenie czasu oświetlenia tkanek. Można to zrobić, włączając i wyłączając oświetlenie za pomocą elektronicznej migawki i lampy lub za pomocą systemu oświetlenia LED i sterownika. Jeśli oświetlenie jest zsynchronizowane z cyklem pracy serca, wówczas akwizycja obrazu fNADH może być ograniczona do rozkurczu, co zmniejszyłoby artefakt ruchu w sygnałach fluorescencyjnych. Jednym ze sposobów na osiągnięcie tego celu byłoby wyzwalanie oświetlenia i akwizycja obrazu za pomocą sygnału ciśnienia, takiego jak ciśnienie LV.

W naszych badaniach zaobserwowaliśmy, że zmiany fNADH w jednostce czasu mogą być ponad 5 razy wyższe przy 400 uderzeniach na minutę niż przy 200 uderzeniach na minutę. Oznacza to, że szybkie rytmy podnoszą stan redoks serca. To, czy jest to spowodowane niedotlenieniem, czy też niezdolnością miocytów do utleniania NADH do NAD+ wystarczająco szybko, aby uniknąć akumulacji NADH, jest nadal pytaniem bez odpowiedzi.

Wykonanie dwukomorowego preparatu pracy serca zależy od wielu czynników. Jednym z najważniejszych jest ustawienie odpowiednich ciśnień napięcia wstępnego i następczego, aby naśladować badane warunki fizjologiczne. W szczególności obciążenie następcze lewej komory (ciśnienie w aortach) musi być dostosowane tak, aby odzwierciedlało ciśnienie ogólnoustrojowe. Jeśli jest zbyt wysokie, LV nie będzie w stanie pokonać ciśnienia, co spowoduje niedomykałkę. Zbyt niskie ciśnienie niekorzystnie wpłynie na perfuzję wieńcową. Ciśnienie napięcia wstępnego lewej komory (ciśnienie w lewym przedsionku) powinno być również dostosowane, aby zapewnić końcową objętość rozkurczową, która jest odpowiednia dla protokołu doświadczalnego.

Obrazowanie fNADH żywej tkanki jest uznanym sposobem obrazowania fluorescencyjnego¹³. Jego zastosowanie do tkanki serca zostało zilustrowane przez Barlowa i Chance'a, kiedy zgłosili uderzające zwiększenie fNADH w tkance niedokrwiennej regionalnie po podwiązaniu naczynia wieńcowego¹⁴. Ich obrazy fNADH zostały zarejestrowane na kliszy za pomocą kamery oscyloskopowej Fairchild i fotografii z lampą błyskową UV. Coremans i wsp. rozszerzono tę koncepcję za pomocą stosunku fluorescencji/odbicia UV NADH do pomiaru stanu metabolicznego nasierdzia serc szczurów perfundowanych krwią Langendorffa³⁰. Do obrazowania użyto wideofluorymetru, a dane zarejestrowano za pomocą magnetowidu. Później Scholz i wsp. wykorzystano spektrograf i matrycę fotodiod do pomiaru średniego fNADH z dużego obszaru LV. Podejście to zmniejszyło wpływ niejednorodności fluorescencji nasierdzia i lokalnych zmian w krążeniu, ujawniając jednocześnie makroskopowe zmiany fNADH³¹ związane z pracą. Podejście to jest podobne do obliczania średnich poziomów fNADH dla obszaru zainteresowania we wszystkich klatkach zestawu danych obrazowania fNADH, jak pokazano na rysunku 2. Jak przedstawiliśmy w tym artykule, dzisiejsza technologia zapewnia szybkie kamery CCD oraz cyfrowo sterowane reflektory UV o dużej mocy. Technologie te umożliwiają badanie czasoprzestrzennej dynamiki fNADH i metabolizmu serca z wielu nowych perspektyw. Stosunkowo niski koszt optyki i źródła światła sprawia, że obrazowanie fNADH jest użytecznym akcesorium do konwencjonalnych systemów mapowania optycznego serca. ^{9, 32}

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
NaCl	Sigma-Aldrich	S-3014
KCl	Sigma-Aldrich	P3911-500G
CaCl2	Fisher Scientific	C77-500
MgSO4	Sigma-Aldrich	M-7506
NaHCO3	Fisher Scientific	S-233
KH< sub>2PO4	Fisher Scientific	423-316
Glukoza	Sigma-Aldrich	158968-500G
NaPirogronian	Sigma-Aldrich	P2256-25G
Albumina	Sigma-Aldrich	A9418-100G