Artykuł metodologiczny

Ilościowy pomiar proteolizy macierzy zewnątrzkomórkowej zależnej od invadopodiów w kontekście jednokomórkowym i wielokomórkowym

DOI:

10.3791/4119

⸱

27 sierpnia 2012

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurobiology and Anatomy, Program in Cancer Cell Biology, Mary Babb Randolph Cancer Center, West Virginia University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy prototypową metodę przygotowania szkiełek podstawowych pokrytych fluorescencyjną żelatyną w celu wizualizacji degradacji macierzy pośrednio przez invadopodia. Przedstawiono techniki obliczeniowe z wykorzystaniem dostępnego oprogramowania do kwantyfikacji poziomu proteolizy macierzy przez pojedyncze komórki w obrębie mieszanej populacji oraz przez grupy wielokomórkowe obejmujące całe pola widzenia mikroskopu.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Inwazja komórkowa do tkanek lokalnych jest procesem istotnym w rozwoju i homeostazie. Nieprawidłowo regulowana inwazja i następujący po niej ruch komórek są charakterystyczne dla wielu procesów patologicznych, w tym stanów zapalnych, chorób sercowo-naczyniowych oraz przerzutów komórek nowotworowych1. Ogniskowa degradacja proteolityczna składników macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) w błonie podstawnej nabłonka lub śródbłonka jest krytycznym krokiem w inicjowaniu inwazji komórkowej. W przypadku komórek nowotworowych szeroko zakrojone analizy in vitro wykazały, że degradacja ECM odbywa się za pośrednictwem brzusznych, bogatych w aktynę struktur wypukłych błony komórkowej, nazywanych invadopodiami2,3. Invadopodia tworzą się w bezpośrednim sąsiedztwie ECM, gdzie modulują jej rozkład poprzez działanie metaloproteinaz macierzy (MMPs). Zdolność komórek nowotworowych do tworzenia invadopodiów koreluje bezpośrednio ze zdolnością do inwazji do lokalnego zrębu oraz powiązanych z nim komponentów naczyniowych3.

Wizualizacja degradacji ECM przez komórki za pośrednictwem invadopodiów, przeprowadzana za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z wykorzystaniem znakowanych barwnikiem białek macierzy naniesionych na szklane szkiełka coverglass, stała się najpowszechniejszą techniką oceny stopnia proteolizy macierzy oraz inwazyjnego potencjału komórek4,5. W niniejszej pracy opisujemy wersję standardowej metody wytwarzania fluorescencyjnie znakowanych szkiełek coverglass z wykorzystaniem dostępnego komercyjnie koniugatu żelatyny Oregon Green-488. Metoda ta jest łatwo skalowalna, co pozwala na szybkie przygotowanie dużej liczby powlekanych szkiełek. Przedstawiamy niektóre z częstych artefaktów mikroskopowych, które często pojawiają się podczas tej procedury, oraz sposób ich unikania. Na koniec opisujemy znormalizowane metody z wykorzystaniem powszechnie dostępnego oprogramowania komputerowego, umożliwiające ilościową ocenę degradacji znakowanej macierzy żelatynowej pośredniczonej przez pojedyncze komórki oraz przez całe populacje komórkowe. Opisane procedury zapewniają możliwość dokładnego i powtarzalnego monitorowania aktywności invadopodiów i mogą służyć jako platforma do oceny skuteczności modulacji ekspresji białek lub testowania związków przeciwinwazyjnych w kontekście degradacji macierzy zewnątrzkomórkowej w układach pojedynczych i wielokomórkowych.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie szkiełek podstawowych powlekanych żelatyną z Oregon Green 488

  1. Przygotować nieznakowany roztwór stokowy żelatyny i sacharozy o stężeniu 5% (w/w), dodając 1,25 g żelatyny i 1,25 g sacharozy do PBS do uzyskania końcowej objętości 50 ml. Podgrzać roztwór stokowy żelatyny do 37 °C i przed użyciem upewnić się, że jest całkowicie rozpuszczona. Gotową mieszaninę przechowywać w temperaturze 4 °C.
  2. Oczyścić szklane lamellki nr 1 o średnicy 13 mm, umieszczając pojedynczą lamellkę w każdym dołku plastikowej 24-dołkowej płytki do hodowli tkanek. Do każdego dołka dodać 500 μl 20% kwasu azotowego i inkubować przez 30 min. Odessać roztwór kwasu azotowego i trzykrotnie wypłukać lamellki wodą dejonizowaną.
  3. Pokryć lamellki, dodając do każdego dołka 500 μl poli-L-lizyny o stężeniu 50 μg/ml (przygotowanej z 0,1% roztworu stokowego i rozcieńczonej w wodzie dejonizowanej) na 20 min w temperaturze pokojowej. Odessać roztwór i trzykrotnie wypłukać PBS. Powlekanie poli-L-lizyną ułatwia równomierne pokrycie i wiązanie nakładanej znakowanej żelatyny.
  4. Do każdego dołka dodać 500 μl 0,5% glutaraldehydu (przygotowanego świeżo przed użyciem) i inkubować 24-dołkowe płytki na lodzie przez 15 min. Odessać i trzykrotnie wypłukać zimnym PBS. Przed powlekaniem żelatyną należy upewnić się, że usunięto wszelkie ślady PBS. Płytki należy trzymać na lodzie podczas wszystkich etapów płukania, aż do dodania żelatyny.
  5. Zrekonstytuować żelatynę sprzężoną z Oregon Green 488 zgodnie z protokołem producenta, a następnie podgrzać ją oraz nieznakowany 5% roztwór żelatyny/sacharozy z punktu (1.1) do 37 °C. Rozcieńczyć jedną część żelatyny Oregon Green 488 w ośmiu częściach nieznakowanej żelatyny/sacharozy (tzn. 500 μl żelatyny Oregon Green 488 w 4 ml 5% mieszaniny żelatyny). Pipetować 100 μl rozcieńczonej mieszaniny 488-żelatyny (utrzymywanej w 37 °C) na każdą lamellkę, używając ilości żelatyny wystarczającej do pokrycia lamellki bez rozprzestrzeniania jej ręcznie (co może prowadzić do nierównomiernego powlekania lamellki, jak pokazano na Ryc. 3B). Ważne jest utrzymywanie rozcieńczonej mieszaniny 488-żelatyny w temperaturze 37 °C podczas procedury powlekania, aby zapobiec przedwczesnemu zestaleniu. Od tego etapu lamellki powinny być przechowywane w ciemności w miarę możliwości, aby uniknąć potencjalnego fotoblaknięcia. Zamiast żelatyny Oregon Green 488 można zastosować inne białka ECM sprzężone z innymi fluoroforami (patrz Dyskusja).
  6. Po powleczeniu wszystkich lamellek w jednej płytce, trzymać 24-dołkową płytkę pod kątem i usunąć nadmiar żelatyny z każdego dołka za pomocą aspiracji próżniowej. Inkubować powleczone lamellki w ciemności przez 10 min w temperaturze pokojowej.
  7. Wypłukać lamellki trzykrotnie PBS, a następnie dodać 500 μl świeżo przygotowanego borowodorku sodu (NaBH4) o stężeniu 5 mg/ml na 15 min w temperaturze pokojowej, aby zredukować i dezaktywować resztki glutaraldehydu. Borowodorek sodu jest efervescentny, a na każdej lamellce i wokół niej pojawią się małe pęcherzyki.
  8. Usunąć roztwór NaBH4 za pomocą aspiracji próżniowej, wykonując szybki ruch zamiatający wokół zewnętrznej krawędzi każdego dołka. Należy uważać, aby nie odessać pływających lamellek, które mogły oddzielić się od dna płytki do hodowli tkanek podczas traktowania NaBH4. Oddzielone lamellki, które wypłynęły na powierzchnię, można delikatnie docisnąć do dna dołka, jednak należy uważać, aby nie uszkodzić powłoki białkowej. Wypłukać każdy dołek trzykrotnie PBS, a następnie inkubować lamellki w 70% etanolu przez 30 min w temperaturze pokojowej.
  9. Stosując techniki sterylne, przenieść płytki z lamellkami do dygestorium z laminarnym przepływem powietrza typu IIA/B i trzykrotnie wypłukać lamellki sterylnym PBS. Na tym etapie lamellki można przechowywać w PBS, chroniąc przed światłem w temperaturze 4 °C przez co najmniej dwa miesiące.
  10. Przenieść lamellki przeznaczone do testów degradacji do pustego dołka nowej 24-dołkowej płytki, ostrożnie wyjmując je za pomocą sterylnej igły i pincety. Równoważyć lamellki przez 1-24 h w pełnej pożywce odpowiedniej dla konkretnego badanego typu komórek. Należy uważać, aby nie odwrócić lamellki ani nie zarysować powłoki żelatynowej (patrz Ryc. 3B).

2. Wysiewanie i przetwarzanie komórek na szkiełkach podstawkowych pokrytych żelatyną Oregon Green 488 w celu oceny degradacji ECM

  1. Wysiać 3-5x104 komórek na zakrywkę w każdej studzience płytki 24-dołkowej.
  2. Przeprowadzić badanie czasowe w celu ustalenia optymalnego czasu wymaganego dla aktywności degradacyjnej invadopodiów dla danej linii lub typu komórek. Większość komórek inwazyjnych wymaga czasu od 4-24 h, aby degradacja stała się widoczna, choć zakres ten może być bardzo zróżnicowany i powinien zostać ustalony empirycznie. Aby zsynchronizować aktywność invadopodiów, komórki można traktować inhibitorami MMP (np. GM 6001) przez wybrany okres czasu, a następnie wypłukać inhibitor, aby umożliwić przebieg aktywności invadopodiów (patrz na przykład6).
  3. Przepłukać zakrywki trzykrotnie PBS, a następnie utrwalić komórki za pomocą 500 μl 10% buforowanej formaliny fosforanowej przez 15 min. Przepłukać trzykrotnie PBS i permeabilizować przez 4 min za pomocą 0,4% Triton X-100 w PBS. Przepłukać trzykrotnie PBS, aby usunąć Triton X-100.
  4. Oznaczyć komórki zgodnie z dowolnym standardowym protokołem barwienia immunofluorescencyjnego (patrz na przykład 7), stosując współoznaczenie komórek koniugowaną z fluoresceiną faloidyną w celu wizualizacji filamentów aktynowych (F-aktyny) oraz znanym białkiem markerowym lokalizującym się w invadopodiach (np. kortaktyną5, TKS58 lub N-WASp9). Należy pamiętać, aby unikać stosowania przeciwciał wtórnych znakowanych 488 lub białek znakowanych GFP w przypadku użycia żelatyny znakowanej Oregon Green 488 lub FITC, aby zapobiec interferencji sygnałów.
  5. Zamontować zabarwione zakrywki na szklanych przedmiotach szkiełek, ostrożnie odwracając zakrywkę i kładąc ją na kropli odczynnika przeciwwyblakowego ProLong Gold lub podobnego reagentu.
  6. Aby ocenić degradację macierzy, obrazować komórki w odpowiednich kanałach przy użyciu konwencjonalnego mikroskopu fluorescencyjnego lub konfokalnego. Degradacja żelatyny jest widoczna jako ciemniejsze obszary na zakrywce z powodu proteolitycznego usunięcia fluorescencyjnej żelatyny (Rycina 4A). Oznaczenie aktyny i białka markerowego invadopodiów w komórkach pozwala na potwierdzenie obecności invadopodiów w miejscach degradacji macierzy na obrazach scalonych (Rycina 4A).
  7. Aktywność degradacyjną można również monitorować w czasie rzeczywistym za pomocą obrazowania żywych komórek z zastosowaniem rekombinowanych białek znakowanych fluorescencyjnie, aby śledzić tworzenie się invadopodiów i degradację macierzy5,10,11.

3. Ilościowe oznaczenie degradacji fluorescencyjnej żelatyny poprzez pomiar znormalizowanej degradacji macierzy

Analiza ta pozwala na wyznaczenie znormalizowanej powierzchni degradacji macierzy w stosunku do powierzchni komórek lub ich liczby. Jest ona przydatna do analizy całych mikroskopowych pól widzenia, w których znajduje się wiele komórek poddanych zbiorczej obróbce za pomocą siRNA, czynników wzrostu lub środków terapeutycznych. Do tej analizy wystarczające są obrazy zebrane przy mniejszym powiększeniu, co pozwala na efektywne gromadzenie informacji o populacjach komórek.

  1. Otwórz obrazy w programie ImageJ12. Program ImageJ dla mikroskopii można pobrać ze strony http://www.macbiophotonics.ca/imagej/.
  2. Sprawdź informacje o skali, wybierając polecenie z menu „Analyze/Set Scale”. Informacje te są importowane automatycznie dla wielu formatów plików, ale w razie potrzeby można je wprowadzić ręcznie. Prawidłowe skalowanie jest niezbędne do raportowania pomiarów w mikronach, a nie w pikselach.
  3. Wybierz odpowiednie pomiary do śledzenia, wybierając „Analyze/Set Measurements”. Zaznacz opcje Area oraz Limit to Threshold.
  4. Oblicz powierzchnię degradacji, korzystając z obrazu żelatyny fluorescencyjnej (Rycina 5A).
  5. Zastosuj progowanie obrazu („Image/Adjust/Threshold”), aby ustawić górne i dolne wartości intensywności pikseli w celu zaznaczenia obszarów degradacji (wyróżnione na czerwono; Rycina 5B). W kolejnych obrazach użyj przycisku Set w oknie Threshold, aby ustawić ten sam próg dla wszystkich obrazów jako obiektywny sposób wyboru obszaru degradacji.
  6. W niektórych przypadkach szkiełko cover-slip może nie być idealnie płaskie podczas akwizycji obrazów. Powoduje to zmianę intensywności żelatyny na całym obrazie. Jeśli ta zmienność sprawia problemy podczas progowania obrazu, skoryguj nierównomierne oświetlenie żelatyny poprzez odjęcie tła („Process/Subtract Background”) lub filtrowanie filtrem pasmowo-przepustowym („Process/FFT/Bandpass Filter”) bądź filtrem pseudo-flatfield („Process/Filters/Pseudo Flatfield”), aż intensywność tła stanie się jednorodna.
  7. Zmierz powierzchnię degradacji macierzy („Analyze/Analyze Particles”). W oknie Analyze Particles wybierz rozmiar cząsteczki > 0, aby usunąć szum z zaznaczenia. Wyświetl Outlines, aby zidentyfikować obszary zainteresowania (ROI). Zaznacz Display Results i Summarize, aby wyświetlić pomiary. Jeśli program dokładnie obrysował wszystkie obszary degradacji (Rycina 5C), skopiuj pomiar Total Area do arkusza kalkulacyjnego. Jeśli zaznaczone zostały inne obiekty (np. zanieczyszczenia), zapisz powierzchnie tylko dla odpowiednich ROI.
  8. Oblicz powierzchnię komórek, korzystając z obrazu barwionego faloidyną (F-aktyna) (Rycina 5D).
  9. Zastosuj progowanie obrazu („Image/Adjust/Threshold”), aby ustawić górne i dolne wartości intensywności pikseli w taki sposób, aby zaznaczone zostały krawędzie komórek (wyróżnione na czerwono; Rycina 5E). W kolejnych obrazach użyj przycisku Set w oknie Threshold, aby ustawić ten sam próg dla wszystkich obrazów jako obiektywny sposób wyboru powierzchni komórek.
  10. 10 Zmierz powierzchnię komórek („Analyze/Analyze Particles”). W oknie Analyze Particles wybierz rozmiar cząsteczki > 0, aby usunąć szum z zaznaczenia. Wyświetl Outlines, aby zidentyfikować obszary do analizy (Rycina 5F). Zaznacz Display Results i Summarize, aby wyświetlić pomiary powierzchni. Nie zaznaczaj opcji Include Holes, jeśli między komórkami w klastrze istnieją przerwy, tak aby niezaznaczone piksele wewnątrz klastra nie były wliczane do obliczeń powierzchni komórki. Wybierz OK.
  11. Skopiuj wyniki Area dla odpowiednich ROI do arkusza kalkulacyjnego.
  12. Oblicz powierzchnię degradacji żelatyny na całkowitą powierzchnię komórek13.
  13. Alternatywnym podejściem byłoby raportowanie powierzchni degradacji na liczbę komórek wyznaczoną poprzez liczenie jąder (Rycina 5G). Jest to konieczne, jeśli manipulacje zmieniają powierzchnię komórki pomiędzy różnymi porównywanymi grupami traktowania. Automatyczne liczenie działa najlepiej, gdy jądra są dobrze odseparowane, mają jednolitą intensywność i są okrągłe. Policz automatycznie jądra („Plugins/Particle Analysis/Nucleus Counter”). Wybierz Smallest and Largest Particle Size, Threshold Method oraz Smoothing Method. Zaznacz opcje Subtract Background, Watershed Filter, Add Particles to ROI Manager oraz Show Summary (Rycina 5H).
  14. Jeśli jądra znacznie na siebie nachodzą lub mają nieregularny kształt lub teksturę, automatyczne liczenie może nie dać dokładnego wyniku (Rycina 5H, strzałki po prawej). W takim przypadku liczenie ręczne można ułatwić za pomocą narzędzia do liczenia komórek („Plugins/Particle Analysis/Cell Counter”). Pozwala to na aktualizację liczby w miarę zaznaczania komórek podczas liczenia ręcznego (Rycina 5I).
  15. Skopiuj liczbę komórek (jąder) do arkusza kalkulacyjnego. Oblicz powierzchnię degradacji żelatyny na całkowitą liczbę komórek.

4. Ilościowe określenie degradacji fluorescencyjnej żelatyny przez poszczególne komórki w mieszanej populacji komórkowej

Aby ocenić degradację macierzy wynikającą z obecności specyficznych komórek w populacji w odróżnieniu od innych komórek w polu widzenia (np. komórek transfekowanych w porównaniu z nietransfekowanymi), procedurę z sekcji 3 można zmodyfikować, aby zmierzyć obszar degradacji pod poszczególnymi komórkami. Do oznaczenia komórek transfekowanych niezbędny jest dodatkowy kanał fluorescencyjny. W tym przypadku łatwiejsza do kwantyfikacji jest analiza obrazów przy większym powiększeniu oraz dobrze odseparowanych komórek.

  1. Sprawdź informacje o skali, wybierając polecenie z menu „Analyze/Set Scale”. Wybierz odpowiednie pomiary do śledzenia, wybierając „Analyze/Set Measurements”. Zaznacz Area oraz Limit to Threshold.
  2. W przypadku pojedynczych komórek, które się nie stykają, zidentyfikuj każdą komórkę, korzystając z obrazu F-aktyny (Rysunek 6A). Zastosuj Threshold (progowanie) obrazu (patrz pkt 3.9) (Rysunek 6B). Ważne jest uchwycenie krawędzi komórek, jednak wewnątrz mogą znajdować się otwory, które nie zostaną włączone do progu. Aby wybrać granice komórek, stosuj te same wartości intensywności we wszystkich obrazach.
  3. Aby zmierzyć pole powierzchni komórek, użyj funkcji „Analyze/Analyze Particles”. W oknie Analyze Particles wybierz Size >0 (aby wyeliminować szum), Show Outlines, oraz zaznacz Display Results, Add to Manager i Include Holes (aby zarejestrować cały obszar wewnątrz obrysu). Wybierz OK i zapisz wartość Area dla każdej komórki z okna Results.
  4. Zidentyfikuj komórki, które zostały przetransformowane (Rysunek 6C).
  5. Zidentyfikuj obszary degradacji, korzystając z fluorescencyjnego obrazu żelatyny (Rysunek 6D). W razie potrzeby przefiltruj obraz żelatyny, aby wyrównać intensywność tła (patrz pkt 3.6). Zastosuj Threshold, aby zaznaczyć obszary degradacji, zanotowując ustawienia progu (Rysunek 6E). Na kolejnych obrazach użyj tych samych górnych i dolnych wartości intensywności (korzystając z przycisku Set w oknie Threshold), aby obiektywnie wyznaczyć obszary degradacji.
  6. Zmierz obszary degradacji pod komórkami. Na obrazie fluorescencyjnym żelatyny z zastosowanym progowaniem wyświetl obrys komórek, wybierając ROI w oknie ROI Manager i wybierając Measure (Rysunek 6F). Zapisz wyniki i oblicz znormalizowaną powierzchnię degradacji na komórkę lub powierzchnię komórki.

5. Reprezentatywne wyniki

Ogólny schemat procedury przedstawiono na Rysunku 1. Procedura obejmuje przygotowanie szkiełek nakrywkowych i ich powlekanie żelatyną sprzężoną z fluoresceincją, wysiewanie komórek na powlekone szkiełka w celu umożliwienia degradacji żelatyny przez komórki, utrwalanie i znakowanie komórek do analizy mikroskopowej fluorescencyjnej, obrazowanie fluorescencyjnej macierzy w celu oceny jej integralności oraz obiektywną kwantyfikację stopnia degradacji macierzy żelatynowej przy użyciu oprogramowania komputerowego.

figure-protocol-1
Rysunek 1. Ogólny schemat przedstawiający kluczowe etapy powlekania fluorescencyjną żelatyną, wysiewania komórek, fiksacji i immunoznakowania oraz oceny proteolizy macierzy.

Kluczowe kroki procedury przygotowania i powlekania szkiełek podstawowych przedstawiono na Rysunku 2.

figure-protocol-2
Rycina 2. Schemat przedstawiający poszczególne etapy przygotowania szkiełek podstawkowych do powlekania macierzą żelatynową. Kroki wykonywane w świetle (podświetlona żarówka), w lodzie (kostki lodu) oraz w ciemności (niepodświetlona żarówka) są zaznaczone symbolicznie. Kroki wykonywane w ciemności pomagają zapobiec fotobleachingowi fluorescencyjnych macierzy.

Przy prawidłowym wykonaniu szkiełka podstawowe są równomiernie pokryte żelatyną sprzężoną z Oregon Green 488, wykazując jednorodną fluorescencję podczas obrazowania mikroskopowego (Rycina 3A). Typowe artefakty, które mogą wystąpić w wyniku nieprawidłowego pokrywania, obchodzenia, przechowywania i użytkowania pokrytych szkiełek, przedstawiono na Rycini 3B.

figure-protocol-3
Rysunek 3. Przykłady artefaktów występujących podczas przygotowywania i obchodzenia się z szkiełkami nakrywką powlekanymi żelatyną. A. Widok ortogonalny stosu z-stack z konfokalnego mikroskopu, pokazujący typowy kolor i konsystencję szkiełka nakrywką powlekanego żelatyną sprzężoną z Oregon Green 488, przygotowanego zgodnie z opisanym protokołem. Szkiełka powinny posiadać jednorodną powłokę o grubości ~1-2 μm, co pokazano w płaszczyznach konfokalnych X-Z (na dole) i Y-Z (po prawej). B. Artefakty, które mogą wystąpić podczas powlekania i przetwarzania szkiełka nakrywką powlekanego żelatyną, obejmują: nieprawidłowe pokrycie szkiełka podczas procesu powlekania z powodu słabego wymieszania, ręcznego rozprowadzania lub częściowego zestalenia mieszaniny żelatynowej (nierównomierna powłoka), usunięcie powlekłej matrycy poprzez zadrapanie igłami lub pęsetą podczas manipulacji (zadrapanie), wysychanie powierzchni szkiełka podczas długotrwałego przechowywania, co skutkuje wyglądem przypominającym „brukowaną uliczkę” (odwodnienie) oraz fotoblaknięcie fluorescencyjnej powierzchni żelatyny podczas obrazowania z powodu przedłużonej lub wysokiej intensywności ekspozycji na światło (blaknięcie). Biała strzałka wskazuje obszar wybielony, obejmujący wysianą komórkę raka płaskonabłonkowego głowy i szyi OSC19. Żelatyna sprzężona z Oregon Green 488 została zabarwiona na biało (pseudokolor), aby zwiększyć kontrast obrazu. Pasek skali, 10 μm.

Cienkie macierze otrzymane w wyniku tej procedury stanowią czułą metodę oceny zdolności komórek do degradacji ECM. Rysunek 4 przedstawia przykład aktywności invadopodiów komórki OSC19 wysianej na szkiełku nakrywkowym z żelatyną sprzężoną z Oregon Green-488, obrazowanej za pomocą konwencjonalnej mikroskopii konfokalnej, a także poprzez rendering obrazu wypełnienia objętościowego po trójwymiarowej dekonwolucji.

figure-protocol-4
Rysunek 4. Reprezentatywne przykłady aktywności degradacji macierzy przez invadopodia. A. Wizualizacja invadopodiów i odpowiadającej im proteolizy macierzy żelatynowej. Komórki OSC19 wysiane na szkiełkach podstawkowych z żelatyną sprzężoną z Oregon Green 488 przez 10 hr zostały utrwalone i znakowane falloidyną sprzężoną z rodamyną (F-aktyna) oraz przeciwciałami anty-kortaktynowymi (wizualizowanymi za pomocą wtórnego przeciwciała Alexa Fluor 647 i pseudokolorowanymi na zielono). Invadopodia są widoczne jako ogniskowe stężenia cytoplazmatycznej F-aktyny i kortaktyny, które nakładają się na obszary przejaśnienia żelatyny (ciemne otwory w macierzy) na obrazie złożonym. Obszary w ramkach z grotami strzałek wskazują poszczególne invadopodia oraz obszary ogniskowej proteolizy macierzy, pokazane na powiększeniach poniżej. Pasek skali, 10 μm. B. Wizualizacja wypełnienia objętościowego penetracji ECM przez invadopodia. Komórki OSC19 wysiane i barwione jak w (A) zostały zrenderowane wizualnie poprzez uzyskanie 23 kolejnych optycznych przekrojów z w osi z o grubości 0.32 μm, co łącznie dało 7.04 μm dla falloidyny sprzężonej z rodamyną oraz żelatyny sprzężonej z Oregon Green 488. Natywny zestaw plików LSM dla każdego kanału otwarto w oprogramowaniu AutoQuant X2.2 i wykonano ślepą dekonwolucję 3D każdego stosu obrazów zgodnie z zalecanymi ustawieniami (10 iteracji, średni szum). Przetworzone obrazy zapisano jako stosy TIFF, które następnie otwarto w programie NIS Elements i zrenderowano jako widok objętościowy z mieszaniem alfa. Dostosowano tablice LUT i stworzono podobjętość, aby pokazać krawędź wewnątrz komórki, w której obecne są invadopodia. Widok krawędzi grzbietowej (dorsal-edge) pokazuje invadopodia (czerwone, strzałki) wnikające w podścielającą je żelatynę (zielona). Widok krawędzi brzusznej (ventral-edge) pokazuje wysunięte invadopodia i obszary degradacji żelatyny pod szkiełkiem podstawkowym jako czerwone obszary w zielonej macierzy (groty strzałek). Przedstawione całkowite pole obrazu zostało przycięte do 77 x 65 μm; komórka ma rozmiar ~ 60 x 40 μm.

Rysunek 5 przedstawia niektóre z kluczowych kroków ilościowego oznaczenia znormalizowanej degradacji macierzy żelatynowej, opisanych w kroku 3 protokołu. Procedura ta została opracowana w celu umożliwienia obiektywnego pomiaru degradacji żelatyny w całym polu widzenia i jest odpowiednia dla degradacji macierzy przypisywanej wielu komórkom w obrębie tego pola.

figure-protocol-5
Rycina 5. Zrzuty ekranu przedstawiające kluczowe etapy wspomaganej komputerowo kwantyfikacji znormalizowanej degradacji żelatyny dla komórek w obrębie całego obrazu mikroskopowego, zgodnie z opisem w kroku 3 protokołu. Wszystkie obrazy fluorescencyjne zostały przekształcone w skalę szarości, aby lepiej zobrazować czerwone progi odcięcia oraz oznaczenia ROI. A. Obraz żelatyny sprzężonej z Oregon Green 488, wykazujący ciemne obszary („dziury”), w których doszło do degradacji (krok 3.4). B. Obraz żelatyny po zastosowaniu progu odcięcia, z zaznaczonymi na czerwono obszarami degradacji (krok 3.5). C. Schemat przedstawiający ROI mierzone w celu określenia powierzchni degradacji (krok 3.7). D. Barwienie F-aktyny rodaminą falloidyną (krok 3.8). E. Obraz aktyny po zastosowaniu progu odcięcia, z zaznaczoną na czerwono całkowitą powierzchnią komórek (krok 3.9). F. Schemat przedstawiający obszary komórek przeznaczone do pomiaru (krok 3.10). G. Obraz jąder komórkowych barwionych DAPI (krok 3.13). H. Czerwone obrysy przedstawiają wyniki automatycznego liczenia jąder (krok 3.13). Filtr Watershed pozwala na rozdzielenie stykających się jąder (biała strzałka). W przypadku znacznego nakładania się jąder, mogą one nie zostać rozdzielone na pojedyncze obiekty (czerwona strzałka). Jeśli jądro ma nieregularny kształt, może zostać rozdzielone na kilka obiektów (żółta strzałka). I. Wyniki zaznaczania jąder podczas ręcznego liczenia przy użyciu narzędzia do liczenia komórek (krok 3.14).

Rysunek 6 przedstawia wybrane etapy ilościowego oznaczania degradacji fluorescencyjnej żelatyny przez poszczególne komórki w obrębie mieszanej populacji komórkowej, zgodnie z opisem w kroku 4 protokołu. W tym układzie degradacja macierzy przez komórki ztransfected może być analizowana w mieszanej populacji komórek ztransfected i nieztransfected.

figure-protocol-6
Rycina 6. Zrzuty ekranu przedstawiające etapy ilościowego oznaczania degradacji żelatyny przez pojedyncze transfected komórki w populacji komórkowej. Jako przykład pokazano ilościowe oznaczenie jednej transfected komórki OSC19 z nadekspresją rekombinacyjnej kortaktyny połączonej z epitopem FLAG. Wszystkie obrazy fluorescencyjne przekształcono w skalę szarości, aby lepiej zobrazować czerwone progi (thresholding) i żółte oznaczenia ROI. A. Obraz konfokalny trzech komórek znakowanych rodaminą-falloidyną (krok 4.2). B. Obrys całkowitego obszaru komórki na podstawie barwienia F-aktyny po zastosowaniu funkcji Threshold oraz Analyze Particles (kroki 4.2-3). C. Obraz konfokalny immunoznakowania anty-FLAG populacji komórkowej, wykazujący pojedynczą komórkę wykazującą ekspresję kortaktyny z tagiem FLAG (oznaczoną symbolem *) (krok 4.4). D. Obraz żelatyny sprzężonej z Oregon Green 488, pokazujący ciemne obszary („dziury”), w których nastąpiła degradacja (krok 4.5). E. Obraz żelatyny po zastosowaniu progu, z zaznaczonymi na czerwono ciemnymi obszarami degradacji (krok 4.5). F. Obraz żelatyny po zastosowaniu progu z nałożonymi obrysami komórek z panelu B (krok 4.6). Należy zauważyć, że w analizie liczone są tylko piksele powyżej progu znajdujące się w obrębie obrysów komórek. Obszary degradacji poza aktualną lokalizacją komórki (biała strzałka) wynikają z migracji komórek przez żelatynę w czasie i nie są uwzględniane w analizie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zdolność do wizualizacji komórek degradujących macierz pozakomórkową pomogła w odkryciu mechanizmów molekularnych wykorzystywanych we wczesnych etapach inwazji komórkowej. Metoda polegająca na powlekaniu szklanych szkiełek podstawkowych białkami pozakomórkowymi znakowanymi fluorescencyjnie w celu późniejszej analizy mikroskopowej, zapoczątkowana przez Wen-Tien Chen na początku lat 80. XX wieku4,14,15, stała się główną techniką oceny funkcji invadopodiów w szerokim zakresie typów komórek. Przedstawiony protokół...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Praca ta była finansowana z funduszy wieczystych West Virginia University Mary Babb Randolph Cancer Center. Dziękujemy Susette Mueller (Georgetown University) oraz Laurze Kelley za wczesne rady i pomoc. Wyrażamy wdzięczność za możliwość korzystania z West Virginia University Microscopy Imaging Facility (wspieranej przez Mary Babb Randolph Cancer Center oraz granty NIH P20 RR16440, P30 RR032138 i P30 GM103488).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
żelatynaSigmaG1890skóra wieprzowa
sacharozaFisherBP220
szkiełka nakrywkowe 12 mmFisher50-121-5159
płytki 24-dołkoweFisher08-772-1BD Falcon
kwas azotowyRiccaR5326000roztwór 20%
poli-L-lizynaElectron Microscopy Sciences19320-Broztwór 0,1%
glutaraldehydSigmaG7526roztwór 8%
żelatyna sprzężona z Oregon Green 488InvitrogenG-13186
borowodorek soduSigma213462
Triton X-100FisherBP151
rodamina-falloidynaInvitrogenR415
przeciwciało anty-kortaktyna (klon 4F11)Millipore05-180
przeciwciało anty-FLAGMilliporeMAB3118
Alexa Fluor 647 Goat anti-mouse IgGInvitrogenA21235
ProLong Gold antifadeInvitrogenP36930
mikroskop konfokalny LSM 510Zeiss
oprogramowanie ImageJDomena publicznahttp://www.macbiophotonics.ca/imagej/
oprogramowanie AutoQuant X2.2Media Cybernetics
oprogramowanie NIS ElementsNikon

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ridley, A. J. Life at the leading edge. Cell. 145, 1012-1022 (2011).
  2. Murphy, D. A., Courtneidge, S. A. The 'ins' and 'outs' of podosomes and invadopodia: characteristics, formation and function. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 12, 413-426 (2011).
  3. Linder, S., Wiesner, C., Himmel, M. Degrading Devices: Invadosomes in Proteolytic Cell Invasion. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. , (2010).
  4. Chen, W. T., Chen, J. M., Parsons, S. J., Parsons, J. T. Local degradation of fibronectin at sites of expression of the transforming gene product pp60src. Nature. 316, 156-158 (1985).
  5. Artym, V. V., Zhang, Y., Seillier-Moiseiwitsch, F., Yamada, K. M., Mueller, S. C. Dynamic interactions of cortactin and membrane type 1 matrix metalloproteinase at invadopodia: defining the stages of invadopodia formation and function. Cancer Res. 66, 3034-3043 (2006).
  6. Ayala, I., et al. Multiple regulatory inputs converge on cortactin to control invadopodia biogenesis and extracellular matrix degradation. J. Cell Sci. , (2008).
  7. Ammer, A. G., et al. Saracatinib impairs head and neck squamous cell carcinoma invasion by disrupting invadopodia function. J. Cancer Sci. Ther. 1, 52-61 (2009).
  8. Seals, D. F., et al. The adaptor protein Tks5/Fish is required for podosome formation and function, and for the protease-driven invasion of cancer cells. Cancer Cell. 7, 155-165 (2005).
  9. Yamaguchi, H., et al. Molecular mechanisms of invadopodium formation: the role of the N-WASP-Arp2/3 complex pathway and cofilin. J. Cell Biol. 168, 441-452 (2005).
  10. Kopp, P., et al. The kinesin KIF1C and microtubule plus ends regulate podosome dynamics in macrophages. Mol. Biol. Cell. 17, 2811-2823 (2006).
  11. Oser, M., et al. Cortactin regulates cofilin and N-WASp activities to control the stages of invadopodium assembly and maturation. J. Cell. Biol. 186, 571-587 (2009).
  12. Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11 (7), 36-42 (2004).
  13. Kelley, L. C., et al. Oncogenic Src requires a wild-type counterpart to regulate invadopodia maturation. J. Cell Sci. 123, 3923-3932 (2010).
  14. Chen, W. T., Singer, S. J. Fibronectin is not present in the focal adhesions formed between normal cultured fibroblasts and their substrata. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77, 7318-7322 (1980).
  15. Chen, W. T., Olden, K., Bernard, B. A., Chu, F. F. Expression of transformation-associated protease(s) that degrade fibronectin at cell contact sites. J. Cell Biol. 98, 1546-1555 (1984).
  16. Bharti, S., et al. Src-dependent phosphorylation of ASAP1 regulates podosomes. Mol. Cell Biol. 27, 8271-8283 (2007).
  17. Albrechtsen, R., Stautz, D., Sanjay, A., Kveiborg, M., Wewer, U. M. Extracellular engagement of ADAM12 induces clusters of invadopodia with localized ectodomain shedding activity. Exp. Cell Res. 317 (10), 195-209 (2011).
  18. Scott, R. W., et al. kinases are required for invasive path generation by tumor and tumor-associated stromal cells. J. Cell Biol. 191, 169-185 (2010).
  19. Mueller, S. C., Yeh, Y., Chen, W. T. Tyrosine phosphorylation of membrane proteins mediates cellular invasion by transformed cells. J. Cell. Biol. 119, 1309-1325 (1992).
  20. Bowden, E. T., Coopman, P. J., Mueller, S. C. Invadopodia: unique methods for measurement of extracellular matrix degradation in vitro. Methods Cell Biol. 63, 613-627 (2001).
  21. Baldassarre, M., et al. Dynamin participates in focal extracellular matrix degradation by invasive cells. Mol. Biol. Cell. 14, 1074-1084 (2003).
  22. Alexander, N. R., et al. Extracellular matrix rigidity promotes invadopodia activity. Curr. Biol. 18, 1295-1299 (2008).
  23. Artym, V. V., Yamada, K. M., Mueller, S. C. ECM degradation assays for analyzing local cell invasion. Methods Mol. Biol. 522, 211-219 (2009).
  24. Schoumacher, M., Goldman, R. D., Louvard, D., Vignjevic, D. M. Actin, microtubules, and vimentin intermediate filaments cooperate for elongation of invadopodia. J. Cell Biol. 189, 541-556 (2010).
  25. Clark, E. S., Whigham, A. S., Yarbrough, W. G., Weaver, A. M. Cortactin is an essential regulator of matrix metalloproteinase secretion and extracellular matrix degradation in invadopodia. Cancer Res. 67, 4227-4235 (2007).
  26. Yamaguchi, H., et al. Phosphoinositide 3-kinase signaling pathway mediated by p110alpha regulates invadopodia formation. J. Cell Biol. 193, 1275-1288 (2011).
  27. Li, A., et al. The actin-bundling protein fascin stabilizes actin in invadopodia and potentiates protrusive invasion. Curr. Biol. 20, 339-345 (2010).
  28. Yamaguchi, H., et al. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate and PIP5-kinase Ialpha are required for invadopodia formation in human breast cancer cells. Cancer Sci. , (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Tworzenie invadopodi wproteoliza ECMfluorescencyjna elatynadegradacja macierzyinwazja kom rkowamikroskopia fluorescencyjnaanaliza obrazupowlekanie elatynOregon Green 488degradacja elatyny

Powiązane artykuły