Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ilościowy pomiar proteolizy macierzy zewnątrzkomórkowej zależnej od invadopodiów w kontekście jednokomórkowym i wielokomórkowym

19.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/4119

⸱

27 sierpnia 2012

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurobiology and Anatomy, Program in Cancer Cell Biology, Mary Babb Randolph Cancer Center, West Virginia University

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy prototypową metodę przygotowania szkiełek podstawowych pokrytych fluorescencyjną żelatyną w celu wizualizacji degradacji macierzy pośrednio przez invadopodia. Przedstawiono techniki obliczeniowe z wykorzystaniem dostępnego oprogramowania do kwantyfikacji poziomu proteolizy macierzy przez pojedyncze komórki w obrębie mieszanej populacji oraz przez grupy wielokomórkowe obejmujące całe pola widzenia mikroskopu.

Streszczenie

Inwazja komórkowa do tkanek lokalnych jest procesem istotnym w rozwoju i homeostazie. Nieprawidłowo regulowana inwazja i następujący po niej ruch komórek są charakterystyczne dla wielu procesów patologicznych, w tym stanów zapalnych, chorób sercowo-naczyniowych oraz przerzutów komórek nowotworowych1. Ogniskowa degradacja proteolityczna składników macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) w błonie podstawnej nabłonka lub śródbłonka jest krytycznym krokiem w inicjowaniu inwazji komórkowej. W przypadku komórek nowotworowych szeroko zakrojone analizy in vitro wykazały, że degradacja ECM odbywa się za pośrednictwem brzusznych, bogatych w aktynę struktur wypukłych błony komórkowej, nazywanych invadopodiami2,3. Invadopodia tworzą się w bezpośrednim sąsiedztwie ECM, gdzie modulują jej rozkład poprzez działanie metaloproteinaz macierzy (MMPs). Zdolność komórek nowotworowych do tworzenia invadopodiów koreluje bezpośrednio ze zdolnością do inwazji do lokalnego zrębu oraz powiązanych z nim komponentów naczyniowych3.

Wizualizacja degradacji ECM przez komórki za pośrednictwem invadopodiów, przeprowadzana za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z wykorzystaniem znakowanych barwnikiem białek macierzy naniesionych na szklane szkiełka coverglass, stała się najpowszechniejszą techniką oceny stopnia proteolizy macierzy oraz inwazyjnego potencjału komórek4,5. W niniejszej pracy opisujemy wersję standardowej metody wytwarzania fluorescencyjnie znakowanych szkiełek coverglass z wykorzystaniem dostępnego komercyjnie koniugatu żelatyny Oregon Green-488. Metoda ta jest łatwo skalowalna, co pozwala na szybkie przygotowanie dużej liczby powlekanych szkiełek. Przedstawiamy niektóre z częstych artefaktów mikroskopowych, które często pojawiają się podczas tej procedury, oraz sposób ich unikania. Na koniec opisujemy znormalizowane metody z wykorzystaniem powszechnie dostępnego oprogramowania komputerowego, umożliwiające ilościową ocenę degradacji znakowanej macierzy żelatynowej pośredniczonej przez pojedyncze komórki oraz przez całe populacje komórkowe. Opisane procedury zapewniają możliwość dokładnego i powtarzalnego monitorowania aktywności invadopodiów i mogą służyć jako platforma do oceny skuteczności modulacji ekspresji białek lub testowania związków przeciwinwazyjnych w kontekście degradacji macierzy zewnątrzkomórkowej w układach pojedynczych i wielokomórkowych.

Protokół

1. Produkcja szkiełek zakrywkowych powlekanych żelatyną Oregon Green 488

  1. Przygotować nieznakowany roztwór zapasowy żelatyny/sacharozy o stężeniu 5% (w/w), dodając 1,25 g żelatyny i 1,25 g sacharozy do PBS do końcowej objętości 50 ml. Podgrzać roztwór zapasowy żelatyny do 37 °C i upewnić się, że jest całkowicie rozpuszczona przed użyciem. Przechowywać końcową mieszaninę w temperaturze 4 °C.
  2. Oczyścić szklane laski przykrywki nr 1 o średnicy 13 mm, umieszczając pojedynczą przykrywkę w każdym dołku plastikowej 24-dołkowej płytki do hodowli tkanek. Dodać 500 μl 20% kwasu azotowego do każdego dołka i inkubować przez 30 min. Odessać roztwór kwasu azotowego i trzykrotnie przemyć przykrywki wodą dejonizowaną.
  3. Pokryć przykrywki, dodając 500 μl poli-L-lizyny o stężeniu 50 μg/ml (przygotowanej z 0,1% roztworu zapasowego i rozcieńczonej w wodzie dejonizowanej) do każdego dołka na 20 min w temperaturze pokojowej. Odessać roztwór i trzykrotnie przemyć PBS. Pokrycie poli-L-lizyną ułatwia równomierne naniesienie i wiązanie nakładanej znakowanej żelatyny.
  4. Dodać 500 μl 0,5% glutaraldehydu (przygotowanego bezpośrednio przed użyciem) do każdego dołka i inkubować płytki 24-dołkowe na lodzie przez 15 min. Odessać i trzykrotnie przemyć zimnym PBS. Należy upewnić się, że przed nałożeniem żelatyny usunięto wszystkie ślady PBS. Przechowywać płytki na lodzie podczas wszystkich etapów płukania, aż do dodania żelatyny.
  5. Zrekonstytuować żelatynę sprzężoną z Oregon Green 488 zgodnie z protokołem producenta, a następnie podgrzać ją oraz nieznakowany 5% roztwór żelatyny/sacharozy z kroku (1.1) do 37 °C. Rozcieńczyć jedną część żelatyny Oregon Green 488 w ośmiu częściach nieznakowanej żelatyny/sacharozy (tj. 500 μl żelatyny Oregon Green 488 w 4 ml 5% mieszaniny żelatyny). Napiperetkować 100 μl rozcieńczonej mieszaniny 488-żelatyny (utrzymywanej w 37 °C) na każdą przykrywkę, używając ilości żelatyny wystarczającej do pokrycia przykrywki bez manualnego rozprowadzania (co może prowadzić do nierównomiernego pokrycia przykrywki, jak pokazano na Rysunku 3B). Ważne jest utrzymywanie rozcieńczonej mieszaniny 488-żelatyny w temperaturze 37 °C podczas procedury pokrywania, aby zapobiec przedwczesnemu zestaleniu. Od tego momentu przykrywki powinny być przechowywane w ciemności tak długo, jak to możliwe, aby uniknąć potencjalnego fotowybielania. Zamiast żelatyny Oregon Green 488 można zastosować inne białka ECM sprzężone z różnymi fluoroforami (patrz Dyskusja).
  6. Po pokryciu wszystkich przykrywek w jednej płytce, trzymać płytkę 24-dołkową pod kątem i usunąć nadmiar żelatyny z każdego dołka za pomocą aspiracji próżniowej. Inkubować pokryte przykrywki w ciemności przez 10 min w temperaturze pokojowej.
  7. Przemyć przykrywki trzykrotnie PBS, a następnie dodać 500 μl świeżo przygotowanego borowodorku sodu (NaBH4) o stężeniu 5 mg/ml na 15 min w temperaturze pokojowej, aby zredukować i dezaktywować resztkową glutaraldehyd. Borowodorek sodu jest musujący i wokół oraz na każdej przykrywce pojawią się małe pęcherzyki.
  8. Usunąć roztwór NaBH4 poprzez aspirację próżniową szybkim ruchem omiatającym zewnętrzną krawędź każdego dołka. Należy uważać, aby nie wciągnąć żadnych pływających przykrywek, które oddzieliły się od dna płytki do hodowli tkanek podczas obróbki NaBH4. Oddzielone przykrywki pływające na powierzchni można delikatnie docisnąć do dna dołka, ale należy uważać, aby nie uszkodzić powłoki białkowej. Przemyć każdy dołek trzykrotnie PBS, a następnie inkubować przykrywki w 70% etanolu przez 30 min w temperaturze pokojowej.
  9. Stosując technikę sterylną, przenieść płytki z przykrywkami do laminarnej komory do hodowli komórek typu IIA/B i trzykrotnie opłukać przykrywki sterylnym PBS. Na tym etapie przykrywki mogą być przechowywane w PBS w ciemności w temperaturze 4 °C przez co najmniej dwa miesiące.
  10. Przenieść przykrywki przeznaczone do testów degradacji do pustego dołka nowej płytki 24-dołkowej, ostrożnie wyjmując je za pomocą sterylnej igły i pęsety. Równoważyć przykrywki przez 1-24 h w pełnej pożywce odpowiedniej dla konkretnego badanego typu komórek. Należy uważać, aby nie odwrócić przykrywki ani nie zarysować powłoki żelatynowej (patrz Rysunek 3B).

2. Wysiewanie i przetwarzanie komórek na szkiełkach podstawkowych powlekanych żelatyną Oregon Green 488 w celu oceny degradacji ECM

  1. Wysiać 3-5x104 komórek na szkiełko nakrywkę w każdym dołku płytki 24-dołkowej.
  2. Przeprowadzić badanie przebiegu czasowego w celu ustalenia optymalnego czasu wymaganego dla aktywności degradacyjnej invadopodiów dla danej linii lub typu komórek. Większość komórek inwazyjnych wymaga czasu od 4-24 h, aby degradacja stała się widoczna, choć zakres ten może się znacznie różnić i powinien zostać ustalony empirycznie. Aby zsynchronizować aktywność invadopodiów, komórki można traktować inhibitorami MMP (np. GM 6001) przez określony czas, a następnie wypłukać inhibitor, aby umożliwić rozpoczęcie aktywności invadopodiów (patrz na przykład6).
  3. Opłukać szkiełka nakrywki trzykrotnie za pomocą PBS, a następnie utrwalić komórki 500 μl 10% buforowanego formaliny fosforanowej przez 15 min. Opłukać trzykrotnie PBS i permeabilizować przez 4 min za pomocą 0,4% Triton X-100 w PBS. Opłukać trzykrotnie PBS, aby usunąć Triton X-100.
  4. Oznakować komórki zgodnie z dowolnym standardowym protokołem barwienia immunofluorescencyjnego (patrz na przykład 7), stosując współoznakowanie komórek koniugatem fluorescencyjnej faloidyny w celu wizualizacji filamentów aktynowych (F-aktyny) oraz białkiem markerowym lokalizującym się w invadopodiach (np. kortaktyną5, TKS58 lub N-WASp9). Należy pamiętać, aby unikać stosowania przeciwciał wtórnych znakowanych 488 lub białek znakowanych GFP w przypadku użycia żelatyny znakowanej Oregon Green 488 lub FITC, aby zapobiec interferencji sygnałów.
  5. Zamontować zabarwione szkiełka nakrywki na szklanych przedmiotach szkiełek, ostrożnie odwracając szkiełko nakrywkę i kładąc je na kropli odczynnika antyblakowego ProLong Gold lub podobnego reagentu.
  6. W celu oceny degradacji macierzy obrazować komórki w odpowiednich kanałach przy użyciu konwencjonalnego mikroskopu fluorescencyjnego lub konfokalnego. Degradacja żelatyny jest wizualizowana jako ciemniejsze obszary na szkiełku nakrywce z powodu proteolitycznego usunięcia fluorescencyjnej żelatyny (Ryc. 4A). Oznakowanie komórek pod kątem aktyny i białka markerowego invadopodiów pozwala na potwierdzenie obecności invadopodiów w miejscach degradacji macierzy na obrazach złożonych (Ryc. 4A).
  7. Aktywność degradacyjną można również monitorować w czasie rzeczywistym poprzez obrazowanie żywych komórek z użyciem rekombinowanych białek znakowanych fluorescencyjnie, aby śledzić formowanie się invadopodiów i degradację macierzy5,10,11.

3. Ilościowe oznaczenie degradacji fluorescencyjnej żelatyny poprzez pomiar znormalizowanej degradacji macierzy

Analiza ta dostarcza znormalizowaną powierzchnię degradacji macierzy w stosunku do powierzchni komórek lub ich liczby. Jest ona przydatna do analizy całych mikroskopowych pól widzenia, w których znajduje się wiele komórek poddanych zbiorczo działaniu siRNA, czynników wzrostu lub środków terapeutycznych. Do tej analizy wystarczające są obrazy wykonane przy mniejszym powiększeniu, co pozwala na efektywne gromadzenie informacji o populacjach komórek.

  1. Otwórz obrazy w programie ImageJ12. Program ImageJ do mikroskopii można pobrać ze strony http://www.macbiophotonics.ca/imagej/.
  2. Sprawdź informacje o skali, wybierając polecenie z menu „Analyze/Set Scale”. Informacje te są automatycznie importowane dla wielu formatów plików, ale w razie potrzeby można je wprowadzić ręcznie. Prawidłowe skalowanie jest niezbędne do raportowania pomiarów w mikronach, a nie w pikselach.
  3. Wybierz odpowiednie parametry pomiaru w opcji „Analyze/Set Measurements”. Zaznacz Area oraz Limit to Threshold.
  4. Oblicz powierzchnię degradacji, korzystając z obrazu fluorescencyjnego żelatyny (Rysunek 5A).
  5. Zastosuj progowanie obrazu („Image/Adjust/Threshold”), aby ustawić górną i dolną wartość intensywności pikseli w celu zaznaczenia obszarów degradacji (wyróżnione na czerwono; Rysunek 5B). W kolejnych obrazach używaj przycisku Set w oknie Threshold, aby dla wszystkich obrazów ustawić ten sam próg, co stanowi obiektywną metodę wyboru obszaru degradacji.
  6. W niektórych przypadkach szkiełko podstawowe może nie być idealnie płaskie podczas akwizycji obrazów. Powoduje to zmianę intensywności żelatyny w obrębie obrazu. Jeśli ta zmienność sprawia problemy podczas progowania, skoryguj nierównomierne oświetlenie żelatyny poprzez odjęcie tła („Process/Subtract Background”) lub filtrowanie filtrem pasmowym („Process/FFT/Bandpass Filter”) bądź filtrem pseudo-flatfield („Process/Filters/Pseudo Flatfield”), aż intensywność tła stanie się jednolita.
  7. Zmierz powierzchnię degradacji macierzy („Analyze/Analyze Particles”). W oknie Analyze Particles wybierz rozmiar cząstki > 0, aby usunąć szum z zaznaczenia. Włącz opcję Outlines, aby zidentyfikować interesujące obszary (ROI). Zaznacz Display Results i Summarize, aby wyświetlić pomiary. Jeśli program dokładnie obrysował wszystkie obszary degradacji (Rysunek 5C), skopiuj pomiar Total Area do arkusza kalkulacyjnego. Jeśli zaznaczone zostały inne obiekty (np. zanieczyszczenia), zapisz powierzchnię tylko dla odpowiednich ROI.
  8. Oblicz powierzchnię komórek, korzystając z obrazu barwionego faloidyną (F-aktyna) (Rysunek 5D).
  9. Zastosuj progowanie obrazu („Image/Adjust/Threshold”), aby ustawić górną i dolną wartość intensywności pikseli w taki sposób, by zaznaczone zostały krawędzie komórek (wyróżnione na czerwono; Rysunek 5E). W kolejnych obrazach używaj przycisku Set w oknie Threshold, aby dla wszystkich obrazów ustawić ten sam próg, co stanowi obiektywną metodę wyboru powierzchni komórek.
  10. 10 Zmierz powierzchnię komórek („Analyze/Analyze Particles”). W oknie Analyze Particles wybierz rozmiar cząstki > 0, aby usunąć szum z zaznaczenia. Włącz opcję Outlines, aby zidentyfikować obszary do analizy (Rysunek 5F). Zaznacz Display Results i Summarize, aby wyświetlić pomiary powierzchni. Nie zaznaczaj opcji Include Holes, jeśli między komórkami w klastrze znajdują się wolne przestrzenie, aby nie wybrany piksele wewnątrz klastra nie były wliczane do obliczeń powierzchni komórek. Wybierz OK.
  11. Skopiuj wyniki Area dla odpowiednich ROI do arkusza kalkulacyjnego.
  12. Oblicz powierzchnię degradacji żelatyny w przeliczeniu na całkowitą powierzchnię komórek13.
  13. Alternatywnym podejściem byłoby raportowanie powierzchni degradacji na liczbę komórek wyznaczoną poprzez liczenie jąder (Rysunek 5G). Jest to konieczne, jeśli manipulacje zmieniają powierzchnię komórek pomiędzy porównywanymi grupami traktowania. Automatyczne liczenie działa najlepiej, gdy jądra są dobrze odseparowane, mają jednolitą intensywność i są okrągłe. Automatycznie policz jądra („Plugins/Particle Analysis/Nucleus Counter”). Wybierz Smallest and Largest Particle Size, Threshold Method oraz Smoothing Method. Zaznacz Subtract Background, Watershed Filter, Add Particles to ROI Manager oraz Show Summary (Rysunek 5H).
  14. Jeśli jądra w znacznym stopniu na siebie nachodzą lub mają nieregularny kształt bądź teksturę, automatyczne liczenie może nie dać dokładnego wyniku (Rysunek 5H, strzałki po prawej). W takim przypadku liczenie ręczne można ułatwić za pomocą narzędzia cell counter („Plugins/Particle Analysis/Cell Counter”). Pozwala ono na bieżąco liczyć komórki podczas ich zaznaczania w trakcie ręcznego liczenia (Rysunek 5I).
  15. Skopiuj liczbę komórek (jąder) do arkusza kalkulacyjnego. Oblicz powierzchnię degradacji żelatyny w przeliczeniu na całkowitą liczbę komórek.

4. Ilościowe określenie degradacji fluorescencyjnej żelatyny przez pojedyncze komórki w mieszanej populacji komórkowej

Aby ocenić degradację macierzy spowodowaną przez konkretne komórki w populacji w odróżnieniu od innych komórek w polu widzenia (np. komórki transfekowane w porównaniu z nietransfekowanymi), procedurę opisaną w sekcji 3 można zmodyfikować, aby zmierzyć obszar degradacji pod poszczególnymi komórkami. Do oznaczenia komórek transfekowanych wymagany jest dodatkowy kanał fluorescencyjny. W takim przypadku łatwiej jest przeprowadzić kwantyfikację przy użyciu obrazów o większym powiększeniu oraz dobrze odseparowanych komórek.

  1. Sprawdź informacje o skali, wybierając polecenie z menu „Analyze/Set Scale”. Wybierz odpowiednie parametry pomiarowe do śledzenia, wybierając „Analyze/Set Measurements”. Zaznacz Area oraz Limit to Threshold.
  2. W przypadku pojedynczych komórek, które się nie stykają, zidentyfikuj każdą komórkę na obrazie F-aktyny (Rysunek 6A). Wykonaj Threshold obrazu (patrz 3.9) (Rysunek 6B). Ważne jest uchwycenie krawędzi komórek, jednak wewnątrz mogą znajdować się obszary nieobjęte progiem. Używaj tych samych wartości intensywności we wszystkich obrazach w celu wyznaczenia granic komórek.
  3. Aby zmierzyć powierzchnię komórek, użyj funkcji „Analyze/Analyze Particles”. W oknie Analyze Particles wybierz parametr Size >0 (aby wyeliminować szum), zaznacz Show Outlines, oraz zaznacz Display Results, Add to Manager i Include Holes (aby zarejestrować cały obszar wewnątrz konturu). Wybierz OK i zapisz powierzchnię (Area) dla każdej komórki z okna wyników (Results).
  4. Zidentyfikuj komórki transfekowane (Rysunek 6C).
  5. Zidentyfikuj obszary degradacji na obrazie fluorescencyjnym żelatyny (Rysunek 6D). W razie potrzeby przefiltruj obraz żelatyny, aby wyrównać intensywność tła (patrz 3.6). Wykonaj Threshold, aby zaznaczyć obszary degradacji, odnotowując ustawienia progu (Rysunek 6E). Na kolejnych obrazach stosuj te same górne i dolne wartości intensywności (używając przycisku Set w oknie Threshold) w celu obiektywnego wyboru obszarów degradacji.
  6. Zmierz obszary degradacji pod komórkami. Na obrazie fluorescencyjnym żelatyny z ustawionym progiem wyświetl kontury komórek, wybierając odpowiednie ROI w oknie ROI Manager i wybierając Measure (Rysunek 6F). Zapisz wyniki i oblicz znormalizowany obszar degradacji na komórkę lub stosunek do powierzchni komórki.

5. Reprezentatywne wyniki

Ogólny schemat procedury przedstawiono na Rysunku 1. Procedura obejmuje przygotowanie szkiełek podstawowych i pokrycie ich żelatyną sprzężoną z fluoroforem, wysianie komórek na pokryte szkiełka w celu umożliwienia degradacji żelatyny, utrwalenie i znakowanie komórek do analizy w mikroskopie fluorescencyjnym, obrazowanie fluorescencyjnej macierzy w celu oceny jej integralności oraz obiektywną kwantyfikację stopnia degradacji macierzy żelatynowej przy użyciu oprogramowania komputerowego.

Proces obrazowania komórek; schemat; pokrywanie szkiełek, wysiewanie komórek, fiksacja, barwienie, kwantyfikacja; analiza danych mikroskopowych.
Rysunek 1. Ogólny schemat przedstawiający kluczowe etapy powlekania żelatyną fluorescencyjną, wysiewania komórek, fiksacji i immunoznakowania oraz oceny proteolizy macierzy.

Kluczowe kroki proceduralne związane z przygotowaniem i powlekaniem szkiełek podstawkowych przedstawiono na Rysunku 2.

Schemat procesu powlekania żelatyną; kroki obejmują przemywanie kwasem, powlekanie, dodanie NaBH4, a następnie pipetowanie.
Rysunek 2. Schemat przedstawiający poszczególne etapy przygotowania szkiełek coverglass do powlekania macierzą żelatynową. Etapy przeprowadzane w świetle (podświetlona żarówka), na lodzie (kostki lodu) oraz w ciemności (niepodświetlona żarówka) są zaznaczone symbolicznie. Kroki wykonywane w ciemności pomagają zapobiec fotobleachingowi macierzy fluorescencyjnych.

Przy prawidłowym wykonaniu szkiełka nakrywkowe są równomiernie pokryte żelatyną sprzężoną z Oregon Green 488, wykazując jednorodną fluorescencję w obrazowaniu mikroskopowym (Rycina 3A). Typowe artefakty, które mogą pojawić się w wyniku niewłaściwego pokrycia, obchodzenia się, przechowywania i użytkowania pokrytych szkiełek, przedstawiono na Rycini 3B.

Wyniki mikroskopii fluorescencyjnej; nierównomierna powłoka, zadrapania, efekty dehydratacji, analiza fotowybielania.
Rysunek 3. Przykłady artefaktów występujących podczas przygotowywania i obchodzenia się z szkiełkami nakrywkami powlecznymi żelatyną. A. Widok ortogonalny stosu z-stack z mikroskopu konfokalnego, pokazujący typowy kolor i konsystencję szkiełka nakrywek powleczonego żelatyną sprzężoną z Oregon Green 488, przygotowanego zgodnie z opisanym protokołem. Szkiełka powinny mieć homogeniczną powłokę o grubości ~1-2 μm, jak pokazano w płaszczyznach konfokalnych X-Z (dół) i Y-Z (prawo). B. Artefakty, które mogą wystąpić podczas powlekania i przetwarzania szkiełek nakrywek powleczonych żelatyną, obejmują: niewłaściwe pokrycie szkiełka podczas procesu powlekania z powodu złego wymieszania, ręcznego rozprowadzania lub częściowego zestalenia mieszaniny żelatyny (nierównomierna powłoka), usunięcie powlekanej matrycy poprzez zarysowanie igłą lub pęsetą podczas manipulacji (zadrapanie), wysychanie powierzchni szkiełka podczas długotrwałego przechowywania, co skutkuje wyglądem przypominającym „bruk” (dehydratacja) oraz fotowybielanie fluorescencyjnej powierzchni żelatyny podczas obrazowania z powodu przedłużonej lub wysokiej intensywności ekspozycji na światło (wybielanie). Biała strzałka wskazuje wybielony obszar obejmujący wysianą komórkę raka płaskonabłonkowego głowy i szyi OSC19. Żelatyna sprzężona z Oregon Green 488 została pseudokolorowana na biało w celu zwiększenia kontrastu obrazu. Pasek skali, 10 μm.

Cienkie macierze uzyskane podczas tej procedury stanowią czułe narzędzie do oceny zdolności komórek do degradacji ECM. Rysunek 4 przedstawia przykład aktywności invadopodiów komórki OSC19 wysianej na szkiełku podstawowym z żelatyną sprzężoną z Oregon Green-488, obrazowanej za pomocą konwencjonalnej mikroskopii konfokalnej oraz poprzez renderowanie obrazu wypełnienia objętościowego po trójwymiarowej dekonwolucji.

Kolokalizacja F-aktyny i kortaktyny, mikroskopia fluorescencyjna, analiza obrazowania krawędzi grzbietowej i brzusznej komórki.
Rysunek 4. Reprezentatywne przykłady aktywności degradacji macierzy przez invadopodia. A. Wizualizacja invadopodiów i odpowiadającej im proteolizy macierzy żelatynowej. Komórki OSC19 wysiane na szkiełkach podstawkowych z żelatyną sprzężoną z Oregon Green 488 przez 10 hr zostały utrwalone i znakowane faloidyną sprzężoną z rhodaminą (F-aktyna) oraz przeciwciałami anty-kortaktynowymi (wizualizowanymi za pomocą wtórnego przeciwciała Alexa Fluor 647 i pseudokolorowanymi na zielono). Invadopodia są widoczne jako ogniskowe koncentracje cytoplazmatyczne F-aktyny i kortaktyny, które pokrywają się z obszarami przejaśnienia żelatyny (ciemne otwory w macierzy) na obrazie scalonym. Obramowane obszary z grotami strzałek wskazują poszczególne invadopodia i obszary ogniskowej proteolizy macierzy, pokazane na powiększonych fragmentach poniżej. Pasek skali, 10 μm. B. Wizualizacja wypełnienia objętościowego penetracji ECM przez invadopodia. Komórki OSC19 wysiane i barwione jak w (A) zostały odwzorowane wizualnie poprzez uzyskanie 23 kolejnych optycznych przekrojów z w obszarze z 0,32 μm, co łącznie dało 7,04 μm dla faloidyny sprzężonej z rhodaminą oraz żelatyny sprzężonej z Oregon Green 488. Rodzimy zestaw plików LSM dla każdego kanału otwarto w oprogramowaniu AutoQuant X2.2 i wykonano ślepą dekonwolucję 3D każdego stosu obrazów przy użyciu zalecanych ustawień (10 iteracji, średni szum). Przetworzone obrazy zapisano jako stosy TIFF, które następnie otwarto w programie NIS Elements i odwzorowano jako widok objętościowy z mieszaniem alfa. Dostosowano tablice LUT i utworzono podobjętość, aby pokazać krawędź wewnątrz komórki, w której obecne są invadopodia. Widok krawędzi grzbietowej pokazuje invadopodia (czerwone, strzałki) wnikające w podścielającą je żelatynę (zielona). Widok krawędzi brzusznej pokazuje protrudujące invadopodia i obszary degradacji żelatyny pod szkiełkiem podstawkowym jako regiony czerwone obecne w zielonej macierzy (groty strzałek). Całkowite przedstawione pole obrazu zostało przycięte do 77 x 65 μm; komórka ma wymiary ~ 60 x 40 μm.

Rysunek 5 przedstawia niektóre z kluczowych etapów ilościowego oznaczania znormalizowanej degradacji matrycy żelatynowej, opisanych w kroku 3 protokołu. Procedura ta została opracowana w celu umożliwienia bezstronnego pomiaru ilościowego degradacji żelatyny w całym polu widzenia i jest odpowiednia dla degradacji matrycy przypisanej wielu komórkom w obrębie tego pola.

Schemat analizy obrazów komórkowych przedstawiający segmentację i etykietowanie wyników mikroskopii fluorescencyjnej.
Rysunek 5. Zrzuty ekranu przedstawiające kluczowe kroki wspomaganej komputerowo kwantyfikacji znormalizowanej degradacji żelatyny dla komórek w obrębie całego obrazu mikroskopowego, zgodnie z opisem w kroku 3 protokołu. Wszystkie obrazy fluorescencyjne zostały przekształcone w skalę szarości, aby lepiej zobrazować czerwone progi i oznaczenia ROI. A. Obraz żelatyny sprzężonej z Oregon Green 488, wykazujący ciemne obszary („dziury”), w których doszło do degradacji (krok 3.4). B. Obraz żelatyny po zastosowaniu progu, wyróżniający obszary degradacji na czerwono (krok 3.5). C. Rysunek przedstawiający ROI mierzone pod kątem powierzchni degradacji (krok 3.7). D. Barwienie F-aktyny rodaminową falloidyną (krok 3.8). E. Obraz aktyny po zastosowaniu progu, wyróżniający całkowitą powierzchnię komórek na czerwono (krok 3.9). F. Rysunek przedstawiający obszary komórek do pomiaru (krok 3.10). G. Obraz jąder komórkowych barwionych DAPI (krok 3.13). H. Czerwone obrysy przedstawiają wyniki automatycznego liczenia jąder (krok 3.13). Filtr Watershed ma potencjał do rozdzielania stykających się jąder (biała strzałka). Jeśli jądra znacznie na siebie nachodzą, mogą nie zostać rozdzielone na pojedyncze obiekty (czerwona strzałka). Jeśli jądro ma nieregularny kształt, może zostać rozdzielone na wiele obiektów (żółta strzałka). I. Wyniki zaznaczania jąder podczas ręcznego liczenia przy użyciu narzędzia do liczenia komórek (krok 3.14).

Rysunek 6 przedstawia wybrane etapy ilościowego oznaczania degradacji fluorescencyjnej żelatyny przez poszczególne komórki w mieszanej populacji komórkowej, zgodnie z opisem w kroku 4 protokołu. Tutaj degradacja macierzy przez komórki przetransfekowane może być analizowana w mieszanej populacji komórek przetransfekowanych i nieprzetransfekowanych.

Analiza morfologii komórek; mikroskopia fluorescencyjna, sekwencja obrazów; wizualizacja struktury komórkowej.
Rysunek 6. Zrzuty ekranu przedstawiające kroki ilościowego oznaczania degradacji żelatyny przez pojedyncze przetransfekowane komórki w populacji komórkowej. Jako przykład pokazano kwantyfikację pojedynczej przetransfekowanej komórki OSC19 nadprodukującej rekombinowaną kortaktynę połączoną z epitopem FLAG. Wszystkie obrazy fluorescencyjne zostały przekonwertowane na skalę szarości, aby lepiej zobrazować czerwone progi (thresholding) oraz żółte oznaczenia ROI. A. Obraz konfokalny trzech komórek znakowanych rodaminą-falloidyną (krok 4.2). B. Obrys całkowitego obszaru komórki na podstawie barwienia F-aktyny po zastosowaniu funkcji Threshold i Analyze Particles (krok 4.2-3). C. Obraz konfokalny immunoznakowania przeciwciałem anty-FLAG populacji komórek, wykazujący pojedynczą komórkę ekspresującą kortaktynę z tagiem FLAG (oznaczoną *) (krok 4.4). D. Obraz żelatyny sprzężonej z Oregon Green 488, wykazujący ciemne obszary („dziury”), w których nastąpiła degradacja (krok 4.5). E. Obraz żelatyny po progowaniu, z zaznaczonymi na czerwono ciemnymi obszarami degradacji (krok 4.5). F. Obraz żelatyny po progowaniu z nałożonymi konturami komórek z panelu B (krok 4.6). Należy zwrócić uwagę, że w analizie zliczano tylko progizowane piksele w obrębie konturów komórek. Obszary degradacji poza aktualnym położeniem komórki (biała strzałka) wynikają z migracji komórek po żelatynie w czasie i nie są uwzględniane w analizie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Zdolność do wizualizacji komórek degradujących macierz pozakomórkową pomogła w odkryciu mechanizmów molekularnych wykorzystywanych we wczesnych etapach inwazji komórkowej. Metoda polegająca na powlekaniu szklanych szkiełek podstawkowych białkami pozakomórkowymi znakowanymi fluorescencyjnie w celu późniejszej analizy mikroskopowej, zapoczątkowana przez Wen-Tien Chen na początku lat 80. XX wieku4,14,15, stała się główną techniką oceny funkcji invadopodiów w szerokim zakresie typów komórek. Przedstawiony protokół...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Praca ta była finansowana z funduszy wieczystych West Virginia University Mary Babb Randolph Cancer Center. Dziękujemy Susette Mueller (Georgetown University) oraz Laurze Kelley za wczesne rady i pomoc. Wyrażamy wdzięczność za możliwość korzystania z West Virginia University Microscopy Imaging Facility (wspieranej przez Mary Babb Randolph Cancer Center oraz granty NIH P20 RR16440, P30 RR032138 i P30 GM103488).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
żelatynaSigmaG1890skóra wieprzowa
sacharozaFisherBP220
szkiełka nakrywkowe 12 mmFisher50-121-5159
płytki 24-dołkoweFisher08-772-1BD Falcon
kwas azotowyRiccaR5326000roztwór 20%
poli-L-lizynaElectron Microscopy Sciences19320-Broztwór 0,1%
glutaraldehydSigmaG7526roztwór 8%
żelatyna sprzężona z Oregon Green 488InvitrogenG-13186
borowodorek soduSigma213462
Triton X-100FisherBP151
rodamina-falloidynaInvitrogenR415
przeciwciało anty-kortaktyna (klon 4F11)Millipore05-180
przeciwciało anty-FLAGMilliporeMAB3118
Alexa Fluor 647 Goat anti-mouse IgGInvitrogenA21235
ProLong Gold antifadeInvitrogenP36930
mikroskop konfokalny LSM 510Zeiss
oprogramowanie ImageJDomena publicznahttp://www.macbiophotonics.ca/imagej/
oprogramowanie AutoQuant X2.2Media Cybernetics
oprogramowanie NIS ElementsNikon

Bibliografia

  1. Ridley, A. J. Life at the leading edge. Cell. 145, 1012-1022 (2011).
  2. Murphy, D. A., Courtneidge, S. A. The 'ins' and 'outs' of podosomes and invadopodia: characteristics, formation and function. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 12, 413-426 (2011).
  3. Linder, S., Wiesner, C., Himmel, M. Degrading Devices: Invadosomes in Proteolytic Cell Invasion. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. , (2010).
  4. Chen, W. T., Chen, J. M., Parsons, S. J., Parsons, J. T. Local degradation of fibronectin at sites of expression of the transforming gene product pp60src. Nature. 316, 156-158 (1985).
  5. Artym, V. V., Zhang, Y., Seillier-Moiseiwitsch, F., Yamada, K. M., Mueller, S. C. Dynamic interactions of cortactin and membrane type 1 matrix metalloproteinase at invadopodia: defining the stages of invadopodia formation and function. Cancer Res. 66, 3034-3043 (2006).
  6. Ayala, I., et al. Multiple regulatory inputs converge on cortactin to control invadopodia biogenesis and extracellular matrix degradation. J. Cell Sci. , (2008).
  7. Ammer, A. G., et al. Saracatinib impairs head and neck squamous cell carcinoma invasion by disrupting invadopodia function. J. Cancer Sci. Ther. 1, 52-61 (2009).
  8. Seals, D. F., et al. The adaptor protein Tks5/Fish is required for podosome formation and function, and for the protease-driven invasion of cancer cells. Cancer Cell. 7, 155-165 (2005).
  9. Yamaguchi, H., et al. Molecular mechanisms of invadopodium formation: the role of the N-WASP-Arp2/3 complex pathway and cofilin. J. Cell Biol. 168, 441-452 (2005).
  10. Kopp, P., et al. The kinesin KIF1C and microtubule plus ends regulate podosome dynamics in macrophages. Mol. Biol. Cell. 17, 2811-2823 (2006).
  11. Oser, M., et al. Cortactin regulates cofilin and N-WASp activities to control the stages of invadopodium assembly and maturation. J. Cell. Biol. 186, 571-587 (2009).
  12. Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11 (7), 36-42 (2004).
  13. Kelley, L. C., et al. Oncogenic Src requires a wild-type counterpart to regulate invadopodia maturation. J. Cell Sci. 123, 3923-3932 (2010).
  14. Chen, W. T., Singer, S. J. Fibronectin is not present in the focal adhesions formed between normal cultured fibroblasts and their substrata. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77, 7318-7322 (1980).
  15. Chen, W. T., Olden, K., Bernard, B. A., Chu, F. F. Expression of transformation-associated protease(s) that degrade fibronectin at cell contact sites. J. Cell Biol. 98, 1546-1555 (1984).
  16. Bharti, S., et al. Src-dependent phosphorylation of ASAP1 regulates podosomes. Mol. Cell Biol. 27, 8271-8283 (2007).
  17. Albrechtsen, R., Stautz, D., Sanjay, A., Kveiborg, M., Wewer, U. M. Extracellular engagement of ADAM12 induces clusters of invadopodia with localized ectodomain shedding activity. Exp. Cell Res. 317 (10), 195-209 (2011).
  18. Scott, R. W., et al. kinases are required for invasive path generation by tumor and tumor-associated stromal cells. J. Cell Biol. 191, 169-185 (2010).
  19. Mueller, S. C., Yeh, Y., Chen, W. T. Tyrosine phosphorylation of membrane proteins mediates cellular invasion by transformed cells. J. Cell. Biol. 119, 1309-1325 (1992).
  20. Bowden, E. T., Coopman, P. J., Mueller, S. C. Invadopodia: unique methods for measurement of extracellular matrix degradation in vitro. Methods Cell Biol. 63, 613-627 (2001).
  21. Baldassarre, M., et al. Dynamin participates in focal extracellular matrix degradation by invasive cells. Mol. Biol. Cell. 14, 1074-1084 (2003).
  22. Alexander, N. R., et al. Extracellular matrix rigidity promotes invadopodia activity. Curr. Biol. 18, 1295-1299 (2008).
  23. Artym, V. V., Yamada, K. M., Mueller, S. C. ECM degradation assays for analyzing local cell invasion. Methods Mol. Biol. 522, 211-219 (2009).
  24. Schoumacher, M., Goldman, R. D., Louvard, D., Vignjevic, D. M. Actin, microtubules, and vimentin intermediate filaments cooperate for elongation of invadopodia. J. Cell Biol. 189, 541-556 (2010).
  25. Clark, E. S., Whigham, A. S., Yarbrough, W. G., Weaver, A. M. Cortactin is an essential regulator of matrix metalloproteinase secretion and extracellular matrix degradation in invadopodia. Cancer Res. 67, 4227-4235 (2007).
  26. Yamaguchi, H., et al. Phosphoinositide 3-kinase signaling pathway mediated by p110alpha regulates invadopodia formation. J. Cell Biol. 193, 1275-1288 (2011).
  27. Li, A., et al. The actin-bundling protein fascin stabilizes actin in invadopodia and potentiates protrusive invasion. Curr. Biol. 20, 339-345 (2010).
  28. Yamaguchi, H., et al. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate and PIP5-kinase Ialpha are required for invadopodia formation in human breast cancer cells. Cancer Sci. , (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Tworzenie invadopodiówproteoliza ECMfluorescencyjna żelatynadegradacja macierzyinwazja komórkowamikroskopia fluorescencyjnaanaliza obrazupowlekanie żelatynąOregon Green 488degradacja żelatyny
Ilościowy pomiar proteolizy macierzy zewnątrzkomórkowej zależnej od invadopodiów w kontekście jednokomórkowym i wielokomórkowym
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.