Ilościowy pomiar proteolizy macierzy zewnątrzkomórkowej zależnej od invadopodiów w kontekście jednokomórkowym i wielokomórkowym

Podsumowanie

Opisujemy prototypową metodę przygotowania szkiełek podstawowych pokrytych fluorescencyjną żelatyną w celu wizualizacji degradacji macierzy pośrednio przez invadopodia. Przedstawiono techniki obliczeniowe z wykorzystaniem dostępnego oprogramowania do kwantyfikacji poziomu proteolizy macierzy przez pojedyncze komórki w obrębie mieszanej populacji oraz przez grupy wielokomórkowe obejmujące całe pola widzenia mikroskopu.

Streszczenie

Inwazja komórkowa do tkanek lokalnych jest procesem istotnym w rozwoju i homeostazie. Nieprawidłowo regulowana inwazja i następujący po niej ruch komórek są charakterystyczne dla wielu procesów patologicznych, w tym stanów zapalnych, chorób sercowo-naczyniowych oraz przerzutów komórek nowotworowych¹. Ogniskowa degradacja proteolityczna składników macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) w błonie podstawnej nabłonka lub śródbłonka jest krytycznym krokiem w inicjowaniu inwazji komórkowej. W przypadku komórek nowotworowych szeroko zakrojone analizy in vitro wykazały, że degradacja ECM odbywa się za pośrednictwem brzusznych, bogatych w aktynę struktur wypukłych błony komórkowej, nazywanych invadopodiami^2,3. Invadopodia tworzą się w bezpośrednim sąsiedztwie ECM, gdzie modulują jej rozkład poprzez działanie metaloproteinaz macierzy (MMPs). Zdolność komórek nowotworowych do tworzenia invadopodiów koreluje bezpośrednio ze zdolnością do inwazji do lokalnego zrębu oraz powiązanych z nim komponentów naczyniowych³.

Wizualizacja degradacji ECM przez komórki za pośrednictwem invadopodiów, przeprowadzana za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z wykorzystaniem znakowanych barwnikiem białek macierzy naniesionych na szklane szkiełka coverglass, stała się najpowszechniejszą techniką oceny stopnia proteolizy macierzy oraz inwazyjnego potencjału komórek^4,5. W niniejszej pracy opisujemy wersję standardowej metody wytwarzania fluorescencyjnie znakowanych szkiełek coverglass z wykorzystaniem dostępnego komercyjnie koniugatu żelatyny Oregon Green-488. Metoda ta jest łatwo skalowalna, co pozwala na szybkie przygotowanie dużej liczby powlekanych szkiełek. Przedstawiamy niektóre z częstych artefaktów mikroskopowych, które często pojawiają się podczas tej procedury, oraz sposób ich unikania. Na koniec opisujemy znormalizowane metody z wykorzystaniem powszechnie dostępnego oprogramowania komputerowego, umożliwiające ilościową ocenę degradacji znakowanej macierzy żelatynowej pośredniczonej przez pojedyncze komórki oraz przez całe populacje komórkowe. Opisane procedury zapewniają możliwość dokładnego i powtarzalnego monitorowania aktywności invadopodiów i mogą służyć jako platforma do oceny skuteczności modulacji ekspresji białek lub testowania związków przeciwinwazyjnych w kontekście degradacji macierzy zewnątrzkomórkowej w układach pojedynczych i wielokomórkowych.

Protokół

1. Przygotowanie szkiełek nakrywkowych powlekanych żelatyną znakowaną Oregon Green 488

1. Przygotuj nieznakowany roztwór zapasowy żelatyny/sukrozy o stężeniu 5% (w/w), dodając 1,25 g żelatyny i 1,25 g sukrozy do buforu PBS do końcowej objętości 50 ml. Podgrzej zapasowy roztwór żelatyny do 37 °C i upewnij się, że jest całkowicie rozpuszczony przed użyciem. Przechowuj końcową mieszaninę w temperaturze 4 °C.
2. Oczyść szklane lamellki nr 1 o średnicy 13 mm, umieszczając pojedynczą lamellkę w każdej studzience plastikowej płytki hodowlanej z 24 dołkami. Dodaj 500 μl 20% kwasu azotowego do każdej studzience i inkubuj przez 30 min. Odsaj roztwór kwasu azotowego i przemyj lamellki trzy razy wodą dejonizowaną.
3. Pokryj lamellki 500 μl poli-L-lizyny o stężeniu 50 μg/ml (przygotowanej z 0,1% roztworu zapasowego i rozcieńczonej w wodzie dejonizowanej) w każdej studzience przez 20 min w temperaturze pokojowej. Odsaj roztwór i przemyj trzy razy buforem PBS. Powłoka z poli-L-lizyny ułatwia równomierne pokrycie i wiązanie nakładanej znakowanej żelatyny.
4. Dodaj 500 μl 0,5% glutaraldehydu (przygotowanego świeżo przed użyciem) do każdej studzience i inkubuj płytki 24-dołkowe na lodzie przez 15 min. Odsaj i przemyj trzy razy zimnym buforem PBS. Należy upewnić się, że wszystkie ślady PBS zostały usunięte przed pokryciem żelatyną. Przechowuj płytki na lodzie podczas wszystkich etapów płukania, aż do dodania żelatyny.
5. Zrekonstytuuj żelatynę sprzężoną z Oregon Green 488 zgodnie z protokołem producenta, a następnie podgrzej ją oraz nieznakowany 5% roztwór żelatyny/sukrozy z punktu (1.1) do 37 °C. Rozcieńcz jedną część żelatyny Oregon Green 488 w ośmiu częściach nieznakowanej żelatyny/sukrozy (tzn.; 500 μl żelatyny Oregon Green 488 w 4 ml 5% mieszaniny żelatynowej). Napiperetuj 100 μl rozcieńczonej mieszaniny żelatyny-488 (utrzymywanej w 37 °C) na każdą lamellkę, używając ilości żelatyny wystarczającej do pokrycia lamellki bez konieczności rozprzestrzeniania jej ręcznie (co może prowadzić do nierównomiernego pokrycia lamellki, jak pokazano na Rysunku 3B). Ważne jest, aby utrzymywać rozcieńczoną mieszaninę żelatyny-488 w temperaturze 37 °C podczas procesu pokrywania, aby zapobiec przedwczesnemu zestaleniu. Od tego momentu lamellki powinny być przechowywane w ciemności tak długo, jak to możliwe, aby uniknąć potencjalnego fotoblaknięcia. Żelatynę Oregon Green 488 można zastąpić innymi białkami ECM sprzężonymi z różnymi fluoroforami (patrz Dyskusja).
6. Po pokryciu wszystkich lamellek w jednej płytce, trzymaj płytkę 24-dołkową pod kątem i usuń nadmiar żelatyny z każdej studzience za pomocą aspiracji próżniowej. Inkubuj pokryte lamellki w ciemności przez 10 min w temperaturze pokojowej.
7. Przemyj lamellki trzy razy buforem PBS, a następnie dodaj 500 μl świeżo przygotowanego borowodorku sodu (NaBH₄) o stężeniu 5 mg/ml na 15 min w temperaturze pokojowej, aby zredukować i dezaktywować resztkową glutaraldehyd. Borowodorek sodu jest efervescentny, a wokół i na każdej lamellce pojawią się małe pęcherzyki.
8. Usuń roztwór NaBH₄ poprzez aspirację próżniową, wykonując szybki ruch zamiatający wokół zewnętrznej krawędzi każdej studzience. Należy uważać, aby nie odessać żadnych pływających lamellek, które oddzieliły się od dna płytki hodowlanej podczas obróbki NaBH₄. Oddzielone lamellki pływające na powierzchni można delikatnie docisnąć do dna studzience, jednak należy zachować ostrożność, aby nie uszkodzić powłoki białkowej. Przemyj każdą studzience trzy razy buforem PBS, a następnie inkubuj lamellki w 70% etanolu przez 30 min w temperaturze pokojowej.
9. Stosując technikę sterylną, przenieś płytki zawierające lamellki do komory z laminarnym przepływem powietrza typu IIA/B do hodowli komórkowych i przemyj lamellki trzy razy sterylnym buforem PBS. Na tym etapie lamellki mogą być przechowywane w PBS, chronione przed światłem, w temperaturze 4 °C przez co najmniej dwa miesiące.
10. Przenieś lamellki przeznaczone do testów degradacji do pustej studzience nowej płytki 24-dołkowej, ostrożnie wyjmując je za pomocą sterylnej igły i pęsety. Równoważ lamellki przez 1-24 h w pełnej pożywce odpowiedniej dla konkretnego badanego typu komórek. Należy uważać, aby nie odwrócić lamellki ani nie porysować powłoki żelatynowej (patrz Rysunek 3B).

2. Wysiewanie i przetwarzanie komórek na szkiełkach podstawkowych powlekanych żelatyną Oregon Green 488 w celu oceny degradacji ECM

1. Wysiać 3-5x10⁴ komórek na szkiełko nakrywkę w każdej studzience płytki 24-dołkowej.
2. Przeprowadzić badanie w funkcji czasu, aby określić optymalny czas niezbędny do wystąpienia aktywności degradacyjnej invadopodiów dla konkretnej linii lub typu komórek. Większość komórek inwazyjnych wymaga od 4 do 24 h, aby degradacja stała się widoczna, choć zakres ten może się znacznie różnić i powinien zostać określony empirycznie. Aby zsynchronizować aktywność invadopodiów, komórki można traktować inhibitorami MMP (np. GM 6001) przez wybrany okres, a następnie wypłukać inhibitor, aby umożliwić rozpoczęcie aktywności invadopodiów (na przykład patrz ⁶).
3. Przepłukać szkiełka nakrywki trzykrotnie za pomocą PBS, a następnie utrwalić komórki 500 μl 10% buforowanego formaliny fosforanu przez 15 min. Przepłukać trzykrotnie PBS i permeabilizować przez 4 min przy użyciu 0,4% Triton X-100 w PBS. Przepłukać trzykrotnie PBS, aby usunąć Triton X-100.
4. Oznakować komórki zgodnie z dowolnym standardowym protokołem barwienia immunofluorescencyjnego (na przykład patrz ⁷), stosując podwójne znakowanie komórek za pomocą koniugatu falloidyny z fluoforem w celu wizualizacji filamentów aktynowych (F-aktyna) oraz znanego białka markerowego lokalizującego się w invadopodiach (np. kortaktyny⁵, TKS5⁸ lub N-WASp⁹). Pamiętać, aby nie używać wtórnych przeciwciał znakowanych fluoforem 488 ani białek znakowanych GFP w przypadku stosowania żelatyny znakowanej Oregon Green 488 lub FITC, aby zapobiec interferencji sygnałów.
5. Zamontować zbarwione szkiełka nakrywki na szklanych preparatach mikroskopowych, ostrożnie odwracając szkiełko i kładąc je na kropli odczynnika antyblaknącego ProLong Gold lub podobnego reagentu.
6. Aby ocenić degradację macierzy, obrazować komórki w odpowiednich kanałach przy użyciu konwencjonalnego mikroskopu fluorescencyjnego lub konfokalnego. Degradacja żelatyny jest widoczna jako ciemniejsze obszary na szkiełku nakrywce, wynikające z proteolitycznego usunięcia fluorescencyjnej żelatyny (Rycina 4A). Znakowanie aktyny i białka markerowego invadopodiów pozwala na potwierdzenie obecności invadopodiów w miejscach degradacji macierzy na obrazach scalonych (Rycina 4A).
7. Aktywność degradacyjną można również monitorować w czasie rzeczywistym poprzez obrazowanie żywych komórek z wykorzystaniem rekombinowanych białek znakowanych fluorescencyjnie, aby śledzić tworzenie się invadopodiów i degradację macierzy^5,10,11.

3. Ilościowe oznaczenie degradacji fluorescencyjnej żelatyny poprzez pomiar znormalizowanej degradacji macierzy

Analiza ta dostarcza znormalizowaną powierzchnię degradacji macierzy w stosunku do powierzchni komórek lub ich liczby. Jest ona przydatna do analizy całych pól widzenia mikroskopowych, w których znajduje się wiele komórek poddanych zbiorczej obróbce za pomocą siRNA, czynników wzrostu lub czynników terapeutycznych. Do tej analizy wystarczające są obrazy zebrane przy mniejszym powiększeniu, co pozwala na efektywne gromadzenie informacji o populacjach komórek.

1. Otwórz obrazy w programie ImageJ¹². Wersję ImageJ do mikroskopii można pobrać ze strony http://www.macbiophotonics.ca/imagej/.
2. Sprawdź informacje o skali, wybierając z menu polecenie „Analyze/Set Scale”. Informacje te są importowane automatycznie w przypadku wielu formatów plików, ale w razie potrzeby można je wprowadzić ręcznie. Prawidłowe skalowanie jest niezbędne do raportowania pomiarów w mikronach, a nie w pikselach.
3. Wybierz odpowiednie pomiary do śledzenia, wybierając „Analyze/Set Measurements”. Zaznacz Area oraz Limit to Threshold.
4. Oblicz powierzchnię degradacji, korzystając z obrazu fluorescencyjnego żelatyny (Rycina 5A).
5. Zastosuj progowanie obrazu („Image/Adjust/Threshold”), aby ustawić górną i dolną wartość intensywności pikseli w celu zaznaczenia obszarów degradacji (podświetlonych na czerwono; Rycina 5B). W kolejnych obrazach użyj przycisku Set w oknie Threshold, aby ustawić ten sam próg dla wszystkich obrazów jako obiektywny sposób wyboru obszaru degradacji.
6. W niektórych przypadkach szkiełko podstawowe może nie być idealnie płaskie podczas pozyskiwania obrazów. Powoduje to zmianę intensywności żelatyny w obrębie obrazu. Jeśli ta zmienność sprawia problemy podczas progowania obrazu, skoryguj nierównomierne oświetlenie żelatyny poprzez odjęcie tła („Process/Subtract Background”) lub filtrowanie za pomocą filtra pasmowoprzepustowego („Process/FFT/Bandpass Filter”) lub filtra pseudo-flatfield („Process/Filters/Pseudo Flatfield”), aż intensywność tła stanie się jednolita.
7. Zmierz powierzchnię degradacji macierzy („Analyze/Analyze Particles”). W oknie Analyze Particles wybierz rozmiar cząsteczki > 0, aby usunąć szum z zaznaczenia. Wybierz Outlines, aby zidentyfikować regiony zainteresowania (ROI). Zaznacz Display Results oraz Summarize, aby wyświetlić pomiary. Jeśli rysunek precyzyjnie obrysował wszystkie obszary degradacji (Rycina 5C), skopiuj pomiar Total Area do arkusza kalkulacyjnego. Jeśli zaznaczone zostały inne obiekty (np. zanieczyszczenia), zapisz tylko powierzchnie odpowiednich ROI.
8. Oblicz powierzchnię komórek, korzystając z obrazu barwionego faloidyną (F-aktyna) (Rycina 5D).
9. Zastosuj progowanie obrazu („Image/Adjust/Threshold”), aby ustawić górną i dolną wartość intensywności pikseli w taki sposób, aby krawędzie komórek zostały zaznaczone (podświetlone na czerwono; Rycina 5E). W kolejnych obrazach użyj przycisku Set w oknie Threshold, aby ustawić ten sam próg dla wszystkich obrazów jako obiektywny sposób wyboru powierzchni komórek.
10. 10 Zmierz powierzchnię komórek („Analyze/Analyze Particles”). W oknie Analyze Particles wybierz rozmiar cząsteczki > 0, aby usunąć szum z zaznaczenia. Wybierz Outlines, aby zidentyfikować regiony do analizy (Rycina 5F). Zaznacz Display Results oraz Summarize, aby wyświetlić pomiary powierzchni. Nie zaznaczaj Include Holes, jeśli między komórkami w skupisku znajdują się wolne przestrzenie, aby niezaznaczone piksele wewnątrz skupiska nie zostały uwzględnione w obliczeniach powierzchni komórek. Wybierz OK.
11. Skopiuj wyniki Area dla odpowiednich ROI do arkusza kalkulacyjnego.
12. Oblicz powierzchnię degradacji żelatyny na całkowitą powierzchnię komórek¹³.
13. Alternatywnym podejściem byłoby podanie powierzchni degradacji na liczbę komórek wyznaczoną poprzez zliczanie jąder (Rycina 5G). Jest to konieczne, jeśli manipulacje zmieniają powierzchnię komórek pomiędzy różnymi porównywanymi grupami traktowania. Automatyczne zliczanie działa najlepiej, gdy jądra są dobrze odseparowane, mają jednolitą intensywność i okrągły kształt. Automatycznie zlicz jądra („Plugins/Particle Analysis/Nucleus Counter”). Wybierz Smallest and Largest Particle Size, Threshold Method oraz Smoothing Method. Zaznacz Subtract Background, Watershed Filter, Add Particles to ROI Manager oraz Show Summary (Rycina 5H).
14. Jeśli jądra w znacznym stopniu na siebie nachodzą lub mają nieregularny kształt lub strukturę, automatyczne zliczanie może nie dać dokładnego wyniku (Rycina 5H, strzałki po prawej). W takim przypadku zliczanie ręczne można ułatwić za pomocą narzędzia do zliczania komórek („Plugins/Particle Analysis/Cell Counter”). Narzędzie to będzie prowadzić rachubę w miarę zaznaczania komórek podczas zliczania ręcznego (Rycina 5I).
15. Skopiuj liczbę komórek (jąder) do arkusza kalkulacyjnego. Oblicz powierzchnię degradacji żelatyny na całkowitą liczbę komórek.

4. Ilościowe oznaczenie degradacji fluorescencyjnej żelatyny przez pojedyncze komórki w mieszanej populacji komórkowej

Aby ocenić degradację macierzy spowodowaną przez określone komórki w populacji w odróżnieniu od innych komórek w polu widzenia (np. komórek transfekowanych w porównaniu do nietransfekowanych), procedurę opisaną w sekcji 3 można zmodyfikować, aby zmierzyć obszar degradacji pod poszczególnymi komórkami. Do znakowania komórek transfekowanych niezbędny jest dodatkowy kanał fluorescencyjny. W takim przypadku łatwiejsza jest kwantyfikacja obrazów o większym powiększeniu i dobrze odseparowanych komórek.

1. Sprawdź informacje o skali, wybierając polecenie z menu „Analiza/Ustawienie skali. Wybierz odpowiednie pomiary do monitorowania, wybierając „Analiza/Ustawianie pomiarówSprawdź. Obszar i Ograniczenie do progu.
2. W przypadku poszczególnych komórek, które się nie stykają, należy zidentyfikować każdą komórkę, korzystając z obrazu F-aktyny (Rycina 6A). Próg obraz (patrz 3.9) (Rysunek 6B). Ważne jest, aby uchwycić krawędzie komórek, jednak wewnątrz nich mogą znajdować się obszary, które nie zostaną uwzględnione w progu intensywności. Aby wyznaczyć granice komórek, należy stosować te same wartości intensywności dla wszystkich obrazów.
3. Aby zmierzyć powierzchnię komórek, należy użyć funkcji „Analyze/Analiza cząstek. W oknie Analyze Particles wybierz parametr Size >0 (aby wyeliminować szum), Pokaż Zarysy, i sprawdź Wyświetl wyniki, Dodaj do menedżera i Uwzględnij otwory (aby zarejestrować cały obszar wewnątrz obrysu). Wybierz Proszę przesłać tekst źródłowy do tłumaczenia. a następnie zapisz wartość powierzchni (Area) dla każdej komórki z okna wyników (Results).
4. Zidentyfikuj, które komórki zostały przetransfekowane (Rycina 6C).
5. Zidentyfikuj obszary degradacji, korzystając z obrazu fluorescencyjnej żelatyny (Rysunek 6D). W razie potrzeby przefiltruj obraz żelatyny, aby uzyskać wyrównaną intensywność tła (patrz pkt 3.6). Próg aby wybrać obszary degradacji, odnotowując ustawienia progu (Rysunek 6E). Na kolejnych obrazach należy zastosować te same wartości natężenia górnego i dolnego (korzystając z Zestaw przycisk w oknie Threshold) w celu obiektywnego wyboru obszarów degradacji.
6. Zmierz obszary degradacji pod komórkami. Na obrazie fluorescencyjnym żelatyny po zastosowaniu progu (thresholding), wyznacz obrys komórek, wybierając odpowiednie obszary zainteresowania (ROI) w oknie ROI Manager i zaznaczając Pomiar (Rycina 6F). Zapisz wyniki i oblicz znormalizowaną powierzchnię degradacji na komórkę lub powierzchnię komórki.

5. Reprezentatywne wyniki

Ogólny schemat procedury przedstawiono na Rysunku 1. Procedura obejmuje przygotowanie szkiełek podstawowych i ich powlekanie żelatyną sprzężoną z fluoroforem, wysiew komórek na powlekane szkiełka w celu umożliwienia degradacji żelatyny przez komórki, utrwalenie i znakowanie komórek do analizy mikroskopowej w fluorescencji, obrazowanie fluorescencyjnej macierzy w celu oceny jej integralności oraz obiektywną kwantyfikację stopnia degradacji macierzy żelatynowej przy użyciu oprogramowania komputerowego.

Rycina 1. Ogólny schemat przedstawiający kluczowe etapy powlekania fluorescencyjną żelatyną, wysiewania komórek, ich utrwalania i immunoznakowania oraz oceny proteolizy macierzy.

Kluczowe kroki proceduralne związane z przygotowaniem i powłokowaniem szkiełek podstawowych przedstawiono na Rysunku 2.

Rysunek 2. Schemat przedstawiający poszczególne etapy przygotowania szkiełek coverglass do powlekania matrycą żelatynową. Kroki wykonywane w świetle (podświetlona żarówka), na lodzie (kostki lodu) oraz w ciemności (niepodświetlona żarówka) zostały zaznaczone symbolicznie. Kroki wykonywane w ciemności pomagają zapobiec fotobleachingowi matryc fluorescencyjnych.

W przypadku prawidłowego wykonania, szkiełka podstawowe są równomiernie pokryte żelatyną sprzężoną z Oregon Green 488, wykazując jednorodną fluorescencję podczas wizualizacji mikroskopowej (Rycina 3A). Typowe artefakty, które mogą powstać w wyniku nieprawidłowego pokrywania, obchodzenia, przechowywania i użytkowania pokrytych szkiełek, przedstawiono na Rycynie 3B.

Rysunek 3. Przykłady artefaktów występujących podczas przygotowywania i obchodzenia się z szkiełkami nakrywkami powleczonymi żelatyną. A. Widok ortogonalny stosu z-stack z mikroskopu konfokalnego, pokazujący typowy kolor i konsystencję szkiełka nakrywki powleczonego żelatyną sprzężoną z Oregon Green 488, przygotowanego zgodnie z opisanym protokołem. Szkiełka nakrywki powinny mieć jednorodną powłokę o grubości ~1-2 μm, co pokazano w płaszczyznach konfokalnych X-Z (dół) i Y-Z (prawo). B. Artefakty, które mogą wystąpić podczas powlekania i przetwarzania szkiełkek nakrywek powleczonych żelatyną, obejmują: nieprawidłowe pokrycie szkiełka podczas procesu powlekania z powodu złego wymieszania, ręcznego rozprowadzania lub częściowej krzepnięcia mieszaniny żelatynowej (nierówna powłoka), usunięcie powleczonej macierzy poprzez zarysowanie igłami lub pęsetą podczas manipulacji (zarysowanie), wysychanie powierzchni szkiełka podczas długiego przechowywania, co skutkuje wyglądem przypominającym „brukowanie” (odwodnienie) oraz fotoblaknięcie fluorescencyjnej powierzchni żelatyny podczas obrazowania z powodu przedłużonej lub wysokiej intensywności ekspozycji na światło (blaknięcie). Biała strzałka wskazuje wybielony obszar obejmujący wysianą komórkę raka płaskiego nabłonka głowy i szyi OSC19. Żelatyna sprzężona z Oregon Green 488 została sztucznie pokolorowana na biało w celu zwiększenia kontrastu obrazu. Pasek skali, 10 μm.

Cienkie macierze otrzymane podczas tej procedury stanowią czuły sposób oceny zdolności komórek do degradacji ECM. Rysunek 4 przedstawia przykład aktywności invadopodiów komórki OSC19 wysianej na szkiełku podstawowym z żelatyną sprzężoną z Oregon Green-488, obrazowanej za pomocą konwencjonalnej mikroskopii konfokalnej, a także poprzez renderowanie obrazu z wypełnieniem objętościowym po trójwymiarowej dekonwolucji.

Rycina 4. Reprezentatywne przykłady aktywności degradacji macierzy przez invadopodia. A. Wizualizacja invadopodiów i odpowiadającej im proteolizy macierzy żelatynowej. Komórki OSC19 wysiane na szkiełkach nakrywkowych z żelatyną sprzężoną z Oregon Green 488 przez 10 hr zostały utrwalone i znakowane falloidyną sprzężoną z rhodaminą (F-aktyna) oraz przeciwciałami anty-kortaktynowymi (wizualizowanymi za pomocą wtórnego przeciwciała Alexa Fluor 647 i pseudokolorowanymi na zielono). Invadopodia są widoczne jako ogniskowe koncentracje cytoplazmatyczne F-aktyny i kortaktyny, które pokrywają się z obszarami przejaśnienia żelatyny (ciemne otwory w macierzy) na obrazie scalonym. Obszary w ramkach z grotami strzałek wskazują poszczególne invadopodia i miejsca ogniskowej proteolizy macierzy, pokazane na powiększonych fragmentach poniżej. Pasek skali, 10 μm. B. Wizualizacja wypełnienia objętościowego penetracji ECM przez invadopodia. Komórki OSC19 wysiane i barwione jak w (A) zostały odwzorowane wizualnie poprzez uzyskanie 23 kolejnych optycznych przekrojów z w osi z o grubości 0.32 μm, co łącznie dało 7.04 μm dla falloidyny sprzężonej z rhodaminą i żelatyny sprzężonej z Oregon Green 488. Natywne zestawy plików LSM dla każdego kanału otwarto w oprogramowaniu AutoQuant X2.2 i wykonano ślepą dekonwolucję 3D każdego stosu obrazów przy użyciu zalecanych ustawień (10 iteracji, średni szum). Przetworzone obrazy zapisano jako stosy TIFF, które następnie otwarto w programie NIS Elements i wyrenderowano jako widok objętościowy z blendingiem alfa. Dostosowano tablice LUT i utworzono podobjętość, aby pokazać krawędź wewnątrz komórki, w której znajdują się invadopodia. Widok krawędzi grzbietowej pokazuje invadopodia (czerwone, strzałki) wnikające w znajdującą się poniżej żelatynę (zielona). Widok krawędzi brzusznej pokazuje wypukłe invadopodia i obszary degradacji żelatyny pod szkiełkiem nakrywkowym jako czerwone regiony obecne w zielonej macierzy (groty strzałek). Przedstawione całkowite pole obrazu zostało przycięte do 77 x 65 μm; komórka ma rozmiar ~ 60 x 40 μm.

Rysunek 5 przedstawia niektóre z kluczowych etapów ilościowego oznaczania znormalizowanej degradacji macierzy żelatynowej, opisanych w kroku 3 protokołu. Procedura ta została opracowana w celu umożliwienia obiektywnego pomiaru ilościowego degradacji żelatyny w całym polu widzenia i jest odpowiednia dla degradacji macierzy przypisywanej wielu komórkom w obrębie tego pola.

Rycina 5. Zrzuty ekranu przedstawiające kluczowe kroki wspomaganej komputerowo kwantyfikacji znormalizowanej degradacji żelatyny dla komórek w obrębie całego obrazu mikroskopowego, zgodnie z opisem w kroku 3 protokołu. Wszystkie obrazy fluorescencyjne zostały przekonwertowane na skalę szarości, aby lepiej zobrazować czerwone progi wartości (thresholding) i oznaczenia ROI. A. Obraz żelatyny sprzężonej z Oregon Green 488, pokazujący ciemne obszary („dziury”), w których doszło do degradacji (krok 3.4). B. Obraz żelatyny po progowaniu, zaznaczający obszary degradacji kolorem czerwonym (krok 3.5). C. Schemat przedstawiający ROI mierzone w celu określenia powierzchni degradacji (krok 3.7). D. Barwienie F-aktyny rodaminą falloidyną (krok 3.8). E. Obraz aktyny po progowaniu, zaznaczający całkowitą powierzchnię komórek kolorem czerwonym (krok 3.9). F. Schemat przedstawiający obszary komórkowe do pomiaru (krok 3.10). G. Obraz jąder komórkowych barwionych DAPI (krok 3.13). H. Czerwone kontury przedstawiają wyniki automatycznego liczenia jąder (krok 3.13). Filtr Watershed pozwala na rozdzielenie stykających się jąder (biała strzałka). W przypadku znacznego nakładania się jąder mogą one nie zostać rozdzielone na pojedyncze obiekty (czerwona strzałka). Jeśli jądro ma nieregularny kształt, może zostać rozdzielone na kilka obiektów (żółta strzałka). I. Wyniki zaznaczania jąder podczas ręcznego liczenia przy użyciu narzędzia do liczenia komórek (krok 3.14).

Rysunek 6 przedstawia wybrane etapy ilościowego oznaczania degradacji fluorescencyjnej żelatyny przez pojedyncze komórki w obrębie mieszanej populacji komórkowej, zgodnie z opisem w kroku 4 protokołu. Tutaj degradacja macierzy przez komórki przetransfekowane może być analizowana w mieszanej populacji komórek przetransfekowanych i nieprzetransfekowanych.

Rysunek 6. Zrzuty ekranu przedstawiające etapy ilościowego oznaczania degradacji żelatyny przez poszczególne komórki transfekowane w populacji komórkowej. Jako przykład pokazano analizę pojedynczej transfekowanej komórki OSC19 nadprodukującej rekombinantową kortaktynę połączoną z epitopem FLAG. Wszystkie obrazy fluorescencyjne przekształcono na skalę szarości, aby lepiej zobrazować czerwone progi (thresholding) oraz żółte oznaczenia ROI. A. Obraz konfokalny trzech komórek znakowanych rodaminą-falloidyną (krok 4.2). B. Obrys całkowitego obszaru komórki na podstawie barwienia F-aktyny po zastosowaniu funkcji Threshold i Analyze Particles (krok 4.2-3). C. Obraz konfokalny immunoznakowania populacji komórek przeciwciałem anty-FLAG, wykazujący pojedynczą komórkę wykazującą ekspresję kortaktyny z tagiem FLAG (oznaczoną *) (krok 4.4). D. Obraz żelatyny sprzężonej z Oregon Green 488, wykazujący ciemne obszary („dziury”), w których nastąpiła degradacja (krok 4.5). E. Obraz żelatyny po zastosowaniu progu, wyróżniający ciemne obszary degradacji na czerwono (krok 4.5). F. Obraz żelatyny po zastosowaniu progu, na który nałożono obrysy komórek z panelu B (krok 4.6). Należy zauważyć, że w analizie zliczane są tylko piksele przekraczające próg znajdujące się wewnątrz obrysów komórek. Obszary degradacji poza obecną lokalizacją komórki (biała strzałka) wynikają z migracji komórki po żelatynie w czasie i nie są uwzględniane w analizie.

Dyskusja

Zdolność do wizualizacji komórek degradujących macierz pozakomórkową pomogła w odkryciu mechanizmów molekularnych wykorzystywanych we wczesnych etapach inwazji komórkowej. Metoda polegająca na powlekaniu szklanych szkiełek podstawkowych białkami pozakomórkowymi znakowanymi fluorescencyjnie w celu późniejszej analizy mikroskopowej, zapoczątkowana przez Wen-Tien Chen na początku lat 80. XX wieku^4,14,15, stała się główną techniką oceny funkcji invadopodiów w szerokim zakresie typów komórek. Przedstawiony protokół...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
żelatyna	Sigma	G1890	skóra wieprzowa
sacharoza	Fisher	BP220
szkiełka nakrywkowe 12 mm	Fisher	50-121-5159
płytki 24-dołkowe	Fisher	08-772-1	BD Falcon
kwas azotowy	Ricca	R5326000	roztwór 20%
poli-L-lizyna	Electron Microscopy Sciences	19320-B	roztwór 0,1%
glutaraldehyd	Sigma	G7526	roztwór 8%
żelatyna sprzężona z Oregon Green 488	Invitrogen	G-13186
borowodorek sodu	Sigma	213462
Triton X-100	Fisher	BP151
rodamina-falloidyna	Invitrogen	R415
przeciwciało anty-kortaktyna (klon 4F11)	Millipore	05-180
przeciwciało anty-FLAG	Millipore	MAB3118
Alexa Fluor 647 Goat anti-mouse IgG	Invitrogen	A21235
ProLong Gold antifade	Invitrogen	P36930
mikroskop konfokalny LSM 510	Zeiss
oprogramowanie ImageJ	Domena publiczna		http://www.macbiophotonics.ca/imagej/
oprogramowanie AutoQuant X2.2	Media Cybernetics
oprogramowanie NIS Elements	Nikon