Wieloparametryczny pomiar otwierania poru przejścia przepuszczalności w izolowanych mitochondriach serca myszy

Podsumowanie

W niniejszym opracowaniu przedstawiono protokół spektrofluorometryczny do pomiaru otwarcia mitochondrialnego poru przejścia przepuszczalności w izolowanych mitochondriach serca myszy. Analiza obejmuje jednoczesny pomiar gospodarki Ca²⁺ w mitochondriach, potencjału błony mitochondrialnej oraz objętości mitochondriów. Opisano również procedurę pozyskiwania wysokiej jakości funkcjonalnych mitochondriów serca.

Streszczenie

Mitochondrialny por przejścia przepuszczalności (mtPTP) jest niespecyficznym kanałem tworzącym się w wewnętrznej błonie mitochondrialnej, służącym do transportu substancji o masie cząsteczkowej mniejszej niż 1,5 kDa. Chociaż ostateczna tożsamość molekularna poru jest wciąż przedmiotem dyskusji, w jego tworzeniu uczestniczą białka takie jak cyklofilina D, VDAC i ANT. Podczas gdy zaangażowanie otwarcia mtPTP w śmierć komórek jest dobrze udokumentowane¹, narastające dowody wskazują, że mtPTP pełni funkcję fizjologiczną podczas homeostazy Ca²⁺ w mitochondriach², bioenergetyki oraz sygnalizacji redoks ³.

Otwarcie mtPTP jest wyzwalane przez Ca²⁺ w macierzy, lecz jego aktywność może być modulowana przez szereg innych czynników, takich jak stres oksydacyjny, wyczerpanie nukleotydów adeninowych, wysokie stężenia Pi, depolaryzacja lub rozprzęganie błony mitochondrialnej oraz długołańcuchowe kwasy tłuszczowe⁴. In vitro otwarcie mtPTP można osiągnąć poprzez zwiększenie stężenia Ca²⁺ wewnątrz macierzy mitochondrialnej za pomocą egzogennego dodawania Ca²⁺ (pojemność zatrzymywania wapnia). Gdy poziomy Ca²⁺ w mitochondriach osiągną określony próg, mtPTP otwiera się, co ułatwia uwalnianie Ca²⁺, rozproszenie siły protonomotorycznej, zapadnięcie się potencjału błonowego oraz zwiększenie objętości macierzy mitochondrialnej (obrzęk), co w konsekwencji prowadzi do przerwania zewnętrznej błony mitochondrialnej i nieodwracalnej utraty funkcji organellum.

W niniejszym opracowaniu opisujemy test fluorometryczny, który umożliwia kompleksową charakterystykę otwierania mtPTP w izolowanych mitochondriach serca myszy. Test polega na jednoczesnym pomiarze 3 parametrów mitochondrialnych, które ulegają zmianie podczas otwierania mtPTP: gospodarki mitochondrialnej Ca²⁺ (wychwytu i uwalniania, mierzonego na podstawie stężenia Ca²⁺ w medium testowym), potencjału błony mitochondrialnej oraz objętości mitochondriów. Barwnikami zastosowanymi do pomiaru Ca²⁺ w medium testowym oraz potencjału błony mitochondrialnej są Fura FF, nieprzenikający przez błony ratiometryczny wskaźnik, u którego w obecności Ca²⁺ następuje przesunięcie długości fali wzbudzenia, oraz JC-1, kationowy wskaźnik ratiometryczny, który tworzy zielone monomery lub czerwone agregaty odpowiednio przy niskim i wysokim potencjale błonowym. Zmiany objętości mitochondriów mierzy się poprzez rejestrację rozpraszania światła przez zawiesinę mitochondrialną. Ponieważ do testu otwierania mtPTP wymagane są wysokiej jakości, funkcjonalne mitochondria, opisujemy również kroki niezbędne do uzyskania nienaruszonych, silnie sprzężonych i funkcjonalnych izolowanych mitochondriów serca.

Protokół

1. Izolacja mitochondriów z serca myszy

1. Aby wyizolować mitochondria serca, znieczulić i uśmiercić myszy zgodnie z procedurami zatwierdzonymi przez lokalną Komisję ds. Dobrostanu i Opieki nad Zwierzętami (Institutional Animal Care and Use Committee).

Uwaga: Wszystkie kroki protokołu izolacji mitochondriów muszą być wykonywane w lodzie. Należy używać lodowatych buforów oraz schłodzonych wcześniej szalek Petriego, probówek Falcona i probówek Eppendorfa. Podane w protokole objętości dotyczą próbki zawierającej 2 serca mysie.

2. Wyjąć serca, umieścić je w zimnym buforze do izolacji mitochondriów (300 mM sucrose, 10 mM Na-HEPES, 200 μM EDTA, pH 7.4) i wypłukać krew.

Uwaga: Aby uzyskać optymalne wyniki, pH buforów mitochondrialnych należy dostosować za pomocą KOH i kwasu octowego.

3. Umieścić serca na chłodnej płytce Petriego, usunąć tłuszcz oraz przedsionki, a następnie drobno posiekać żarquivo do uzyskania homogenicznego produktu.
4. Przenieść posiekane serca do probówki Falcon o pojemności 50 ml, dodać 10 ml buforu do izolacji mitochondriów z dodatkiem 0,1 mg/ml trypsyny i inkubować próbkę na lodzie przez 10 min w celu trawienia.

Uwaga: Trypsyna stosowana podczas procedury izolacji zwiększa wydajność izolowanych mitochondriów i jej stężenie powinno pozostać stałe pomiędzy preparatami mitochondrialnymi. Zalecamy badanie funkcji mitochondriów na preparatach izolowanych bez użycia trypsyny, aby upewnić się, że enzym ten nie wpływa na ich funkcjonalność.

5. Dodać 10 ml Buforu do Izolacji Mitochondriów z 0,1% BSA wolnym od kwasów tłuszczowych i 5 mg inhibitora trypsyny (sojowego), a następnie wymieszać, kilkukrotnie odwracając probówkę, aby zneutralizować trypsynę.

Uwaga: Bufor do izolacji mitochondriów można przygotować z wyprzedzeniem i przechowywać w temperaturze -20 °C. Po rozmrożeniu należy sprawdzić pH. Trypsynę, inhibitor trypsyny lub BSA należy dodać do buforu do izolacji mitochondriów w dniu przeprowadzenia eksperymentu.

6. Odzyskaj trawioną tkankę poprzez wirowanie z niską lub średnią prędkością przez 1 min w temperaturze 4 °C.
7. Resuspenduj tkankę w 8 ml buforu do izolacji mitochondriów (Mitochondria Isolation Buffer) z dodatkiem 0,1% BSA wolnego od kwasów tłuszczowych i homogenizuj za pomocą zmotoryzowanego homogenizatora Dounce z teflonowym tłokiem (4-6 przejść przy prędkości 1 200-14 000 rpm). Podczas homogenizacji utrzymuj próbkę w lodzie.
8. Przenieś homogenizat do probówki typu Falcon o pojemności 15 ml i wiruj przy 800xg przez 10 min w temperaturze 4 °C, aby wytrącić jądra komórkowe i resztki tkanki.
9. Odbierz supernatant zawierający mitochondria do probówek Eppendorf i wiruj przy 8 000 x g przez 15 min w temperaturze 4 °C.
10. Ostrożnie usuń górną białą warstwę i przemyj pozostały ciemniejszy osad zawierający mitochondria w 1 ml buforu do izolacji mitochondriów (Mitochondria Isolation Buffer).
11. Wiruj przy 8000xg przez 15 min w temperaturze 4 °C. Odrzuć supernatant i resuspenduj osad mitochondrialny w 150 μl buforu do izolacji mitochondriów (Mitochondrial Isolation Buffer). Przechowuj mitochondria w lodzie do dalszych analiz.

Uwaga: Aby uzyskać najlepsze wyniki podczas testów funkcjonalnych, należy wykorzystać mitochondria w ciągu 4 hr od ich izolacji.

12. Oznaczyć ilość białka mitochondrialnego za pomocą metody Bradforda.

2. Kontrola jakości wyizolowanych mitochondriów

2.1. Pomiar współczynnika kontroli oddechowej (RCR)

1. Przeskalibrować elektrodę tlenową Oxytherm za pomocą wody nasyconej powietrzem, aby wyznaczyć linię maksymalnego stężenia tlenu. Po uzyskaniu stabilnego poziomu tlenu dodać 100 μl świeżo przygotowanego 10 mM roztworu hydrosiarczynu sodu w celu wyznaczenia linii zerowej tlenu. Pomiary przeprowadzić w temperaturze 30 °C.
2. Do komory Oxytherm dodać 2 ml buforu do respiracji mitochondriów (125 mM KCl, 20 mM HEPES, 3 mM MgCl₂, 400 μM EGTA, 300 μM DTT, 5 mM KH₂PO₄, pH 7.2) z dodatkiem 1 μM rotenonu, zamknąć komorę i rozpocząć pomiar.
3. Po ustabilizowaniu się sygnału tlenowego dodać 250 μg mitochondriów i rejestrować respirację podstawową przez 1 min. Respiracja na tym etapie powinna być bardzo niska, ponieważ mitochondria oddychają na substratach endogennych (respiracja stanu 1).
4. Dodać 5 mM bursztynianu i rejestrować sygnał przez 1 min. Zużycie tlenu powinno wzrosnąć podczas respiracji stanu 2.
5. Indukować respirację stanu 3 poprzez dodanie 150 μM ADP. Na tym etapie zużycie tlenu powinno wzrosnąć z powodu syntezy ATP w procesie fosforylacji oksydacyjnej. Rejestrować sygnał do momentu spowolnienia respiracji, co wskazuje na zużycie ADP i przejście do respiracji stanu 4. Rejestrować respirację stanu 4 przez co najmniej 1 min.
6. Dodać 1 μM CCCP i rejestrować sygnał przez 1 min. Respiracja odsprzężona powinna osiągnąć wartość maksymalną.

Uwaga: Wpływ CCCP na oddychanie mitochondrialne jest zależny od dawki: wysokie stężenia CCCP mogą hamować zużycie tlenu i dlatego powinny być starannie mianowane.

7. Oblicz współczynnik kontroli oddychania (RCR), dzieląc szybkość zużycia tlenu podczas oddychania w stanie 3 przez szybkość zużycia tlenu podczas oddychania w stanie 4. Docelowa wartość RCR powinna wynosić ≥ 4.

2.2. Ocena integralności błony mitochondrialnej (test cytochromu c)

1. Dokładnie przemyj komorę Oxytherm 70% etanolem i wodą, a następnie powtórz kroki 2.1.2 – 2.1.4.
2. Dodaj 1 mM ADP i zarejestruj zużycie tlenu przez 1 min.
3. Dodaj 10 μM cytochromu c. Ponieważ cytochrom c nie przenika przez nienaruszone błony mitochondrialne, wzrost respiracji wskazuje na przerwane lub uszkodzone błony mitochondrialne.

3. Pomiar otwarcia mitochondrialnego poru przejścia przepuszczalności

1. Skonfiguruj spektrofluorymetr do wieloparametrycznego pomiaru otwarcia mtPTP. Używając programu FelixGx, utwórz nową konfigurację sprzętową (Quanta master steady state) obejmującą źródło światła, monochromator wzbudzenia, komorę próbki oraz dwa detektory ustawione pod kątem 90° i 270° względem monochromatora wzbudzenia (Rycina 4). Aby uzyskać maksymalną rozdzielczość czasową, oba monochromatory emisji (90° i 270°) muszą zostać wyłączone, a filtry emisji przy 90° i 270° w komorze próbki włączone w menu konfiguracji sprzętowej. Ten krok wyłączy sterowanie silnikiem dla długości fal emisji i ustawi każdy monochromator na określonej długości fali. Jeśli monochromatory emisji nie zostaną wyłączone, każdy detektor będzie przełączać się między obiema długościami fal i zostaną zarejestrowane pomiary powielone.
2. Utwórz nowy protokół akwizycji, korzystając z typu Multi Dye, i wprowadź następujące barwniki:
   • Fura (wysoki poziom Ca++): wzbudzenie 340 nm, emisja 525 nm (detektor 1)
   • Fura (niski poziom Ca++): wzbudzenie 380 nm, emisja 525 nm (detektor 1)
   • JC1 (agregat): wzbudzenie 543 nm, emisja 595 nm (detektor 2)
   • JC1 (monomer): wzbudzenie 498 nm, emisja 525 nm (detektor 1)
   • Pęcznienie: wzbudzenie 525 nm, emisja 525 nm (detektor 1)
3. Ustaw szczeliny wzbudzenia i emisji na 1 nm oraz temperaturę na 37 °C.
4. Aby uzyskać sygnał ratiometryczny dla Fura i JC-1, wygeneruj dwa pochodne ślady: Fura (wysoki poziom Ca++)/Fura (niski poziom Ca++) oraz JC1 (agregat)/JC1 (monomer).
5. Ręcznie ustaw długość fali emisji detektorów 1 i 2 odpowiednio na 525 nm i 595 nm.
6. W jednorazowej 4-ściennej kuwecie z metakrylanu wymieszaj 1 ml buforu do analizy mitochondriów (120 mM KCl, 10 mM NaCl, 1 mM KH₂PO₄, 20 mM HEPES-Tris, pH 7.2) z 1 μM rotenonu, 5 mM bursztynianu i 800 nM Fura FF. Dodaj 250 μg mitochondriów i umieść próbkę w komorze pomiarowej. Upewnij się, że mieszadło magnetyczne jest włączone.
7. Rozpocznij rejestrację. Po 1 min wstrzymaj akwizycję, dodaj 500 nM JC-1, a następnie wznowij akwizycję. Sygnał stosunku JC-1 powinien wzrosnąć, co wskazuje na pobieranie barwnika przez aktywne mitochondria. Kontynuuj rejestrację, aż sygnał JC-1 osiągnie plateau (zazwyczaj w ciągu 5 min).
8. Dodaj 20 μM CaCl₂. Należy zaobserwować natychmiastowy wzrost sygnału stosunku Fura FF ze względu na zwiększoną obecność Ca²⁺ w buforze do analizy, a następnie stopniowy spadek wynikający z poboru Ca²⁺ przez mitochondria. Sygnał stosunku JC-1 powinien wykazać krótki, przejściowy spadek wskazujący na lekką depolaryzację błony mitochondrialnej.
9. Odczekaj, aż sygnał stosunku Fura FF powróci do poziomu bazowego przed dodaniem kolejnej porcji CaCl₂ (1-1,5 min). Kontynuuj dodawanie porcji w stałych odstępach czasu, aż mitochondria przestaną akumulować Ca²⁺ i zaczną uwalniać Ca²⁺ do buforu do analizy. Otwarcie mtPTP objawia się jednoczesnym wzrostem sygnału stosunku Fura FF z powodu uwalniania Ca²⁺, spadkiem sygnału stosunku JC-1 z powodu załamania potencjału błonowego oraz spadkiem rozpraszania światła z powodu pęcznienia mitochondriów (Rycina 5).
10. Po aktywacji mtPTP zweryfikuj specyficzność sygnałów Fura FF, JC-1 i pęcznienia odpowiednio za pomocą 1 mM EGTA, 1 μM CCCP i 5 μg/ml alametycyny.
11. Aby zweryfikować specyficzność otwarcia mtPTP, powtórz kroki 3.6 - 3.9 w obecności 1 μM cyklosporyny A, inhibitora cyklofiliny D (cyklofilina D jest składnikiem mtPTP). W obecności cyklosporyny A otwarcie mtPTP wymaga znacznie większej liczby porcji CaCl₂ niż w próbkach kontrolnych (Rycina 6).

4. Reprezentatywne wyniki

Rysunek 2 przedstawia typową kontrolę oddechową wyizolowanych mitochondriów serca myszy. Stan 3 oddychania uzyskuje się poprzez dodanie ADP do mitochondriów oddychających na bursztynianic, co charakteryzuje się znacznym wzrostem zużycia tlenu w porównaniu do sytuacji, gdy obecny jest sam substrat. Wyczerpanie dodanego ADP inicjuje stan 4 oddychania, podczas którego zużycie tlenu spowalnia i staje się porównywalne do szybkości osiągniętych przed dodaniem ADP. RCR oblicza się, dzieląc szybkość zużycia tlenu w stanie 3 oddychania przez szybkość zużycia tlenu w stanie 4 oddychania. Test cytochromu c jest stosowany do oceny integralności zewnętrznej błony mitochondrialnej: gdy cytochrom c zostanie dodany do mitochondriów oddychających na bursztynianic i ADP, nie obserwuje się dalszego wzrostu oddychania, co wskazuje na nienaruszone zewnętrzne błony mitochondrialne (Rysunek 3).

Reprezentacyjny obraz otwarcia mtPTP w izolowanych mitochondriach serca przedstawiono na Rysunku 4. W tym przypadku otwarcie mtPTP zostało wywołane poprzez dodanie 4 pulsów CaCl₂ (każdy po 20 μM) w odstępach 1,5 min. Otwarcie mtPTP jest widoczne poprzez niemal jednoczesne uwalnianie mitochondrialnego Ca²⁺ (wzrost sygnału stosunku Fura FF), spadek potencjału błony mitochondrialnej (spadek sygnału stosunku JC-1) oraz zwiększenie objętości mitochondriów (spadek sygnału pęcznienia). Po dodaniu cyklosporyny A, która wiąże się z komponentem cyklofiliny D mtPTP, do otwarcia mtPTP wymagane jest 7 pulsów CaCl₂ zamiast 4 (Rysunek 5).

Rysunek 1. Schemat protokołu wieloparametrycznego pomiaru otwierania porów przejścia przepuszczalności mitochondrialnej w izolowanych mitochondriach serca. Serce pobierane jest od myszy, a mitochondria są izolowane poprzez wirowanie różnicowe. Przygotowana zawiesina mitochondriów jest następnie jakościowo oceniana za pomocą pomiaru polaroograficznego współczynnika kontroli oddechowej oraz szczelności błony mitochondrialnej w obecności cytochromu c. Otwarcie porów przejścia przepuszczalności mitochondrialnej w izolowanych mitochondriach jest wyzwalane przez sekwencyjne dodawanie CaCl₂ i mierzone za pomocą spektrofluorometru poprzez monitorowanie uwalniania Ca²⁺ z mitochondriów, spadku potencjału błonowego oraz obrzęku macierzy mitochondrialnej.

Rycina 2. Pomiar wskaźnika kontroli oddychania (RCR) izolowanych mitochondriów serca. Zużycie tlenu przez izolowane mitochondria serca mierzy się podczas oddychania w stanie 3 w obecności bursztynianu i ADP oraz podczas oddychania w stanie 4 po zużyciu ADP. Reakcję izolowanych mitochondriów na odsprzęgacze mierzy się poprzez dodanie CCCP. Liczby na wykresie oznaczają tempo zużycia tlenu przez izolowane mitochondria w nmol/min/mg białka.

Rycina 3. Pomiar integralności błony izolowanych mitochondriów serca. Integralność błony mitochondrialnej określono poprzez pomiar zużycia tlenu w izolowanych mitochondriach w obecności bursztynianu i ADP oraz po dodaniu cytochromu c. Liczby na wykresie przedstawiają szybkość zużycia tlenu przez izolowane mitochondria w nmol/min/mg białka.

Rycina 4. Konfiguracja sprzętowa spektrofluorometru do wieloparametrycznego pomiaru otwarcia mtPTP. Konfiguracja sprzętowa spektrofluorometru obejmuje źródło światła, monochromator wzbudzenia, komorę na próbkę oraz dwa detektory ze stałymi długościami fal emisji wynoszącymi 525 nm i 595 nm. Detektor 1 służy do detekcji sygnału wysokiego i niskiego poziomu Ca²⁺ dla Fura FF, monomeru JC-1 oraz sygnału pęcznienia. Detektor 2 mierzy sygnał agregatów JC-1.

Rycina 5. Wieloparametryczny pomiar otwarcia mtPTP w izolowanych mitochondriach serca. Otwarcie mtPTP zostało wywołane sekwencyjnym dodawaniem 20 μM CaCl₂ i charakteryzowało się uwalnianiem Ca²⁺ z mitochondriów, zapadnięciem potencjału błonowego mitochondriów oraz zwiększeniem objętości macierzy mitochondrialnej (obrzękiem). Pozamitochondrialny poziom Ca²⁺ oraz potencjał błonowy mierzono za pomocą wskaźników ratiometrycznych Fura FF (ślad zielony) i JC-1 (ślad czerwony). Obrzęk mitochondriów mierzono poprzez rejestrację rozpraszania światła przy 525 nm (ślad czarny). Specyficzność sygnałów JC-1 i obrzęku przetestowano z użyciem 1 μM CCCP oraz 5 μg/ml alametycyny (toksyny mikrobiologicznej).

Rycina 6. Wieloparametryczny pomiar otwarcia mtPTP w izolowanych mitochondriach serca w obecności cyklosporyny A. Cyklosporyna A (1 μM) zwiększa liczbę impulsów CaCl₂ wymaganych do otwarcia mtPTP w izolowanych mitochondriach serca.

Dyskusja

Przedstawiony tutaj protokół opisuje niezbędne kroki eksperymentalne służące do oceny otwierania porów przejścia przepuszczalności w izolowanych mitochondriach serca (Rysunek 1 oraz Rysunek 4): procedurę izolacji mitochondriów serca myszy, kontrole oddechowe zapewniające ich integralność i funkcjonalność, parametry mitochondrialne monitorowane podczas otwierania mtPTP oraz barwniki wykorzystywane do ich pomiaru, konfigurację aparatury spektrofluorometrycznej oraz charakterystykę otwieran...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Trypsyna	Sigma-Aldrich	T3030
Inhibitor trypsyny (sojowy)	Sigma-Aldrich	T9128
hydrosiarczyn sodu	Sigma-Aldrich	71699
Rotenon	Sigma-Aldrich	R8875
Cytochrom c	Sigma-Aldrich	C7752
Alametycyna	Sigma-Aldrich	A4665
CCCP	Sigma-Aldrich	C2759
Cyklosporyna A	Calbiochem	239835
Fura FF	Invitrogen	F14180
JC-1	Invitrogen	T3168
Homogenizator tkanek Pottera-Elvehjema z teflonowym tłuczkiem 15 ml	Wheaton Industries
Mieszadło z napędem górnym	Wheaton Industries	903475
Oxytherm (elektroda tlenowa z kontrolą temperatury)	Hansatech Instruments
Spektrofluorometr z podwójną emisją QuantaMaster 80	Photon Technology International, Inc.