W niniejszym opracowaniu przedstawiono protokół spektrofluorometryczny do pomiaru otwarcia mitochondrialnego poru przejścia przepuszczalności w izolowanych mitochondriach serca myszy. Analiza obejmuje jednoczesny pomiar gospodarki Ca2+ w mitochondriach, potencjału błony mitochondrialnej oraz objętości mitochondriów. Opisano również procedurę pozyskiwania wysokiej jakości funkcjonalnych mitochondriów serca.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wieloparametryczny pomiar otwierania poru przejścia przepuszczalności w izolowanych mitochondriach serca myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Mitochondrialny por przejścia przepuszczalności (mtPTP) jest niespecyficznym kanałem tworzącym się w wewnętrznej błonie mitochondrialnej, służącym do transportu substancji o masie cząsteczkowej mniejszej niż 1,5 kDa. Chociaż ostateczna tożsamość molekularna poru jest wciąż przedmiotem dyskusji, w jego tworzeniu uczestniczą białka takie jak cyklofilina D, VDAC i ANT. Podczas gdy zaangażowanie otwarcia mtPTP w śmierć komórek jest dobrze udokumentowane1, narastające dowody wskazują, że mtPTP pełni funkcję fizjologiczną podczas homeostazy Ca2+ w mitochondriach2, bioenergetyki oraz sygnalizacji redoks 3.
Otwarcie mtPTP jest wyzwalane przez Ca2+ w macierzy, lecz jego aktywność może być modulowana przez szereg innych czynników, takich jak stres oksydacyjny, wyczerpanie nukleotydów adeninowych, wysokie stężenia Pi, depolaryzacja lub rozprzęganie błony mitochondrialnej oraz długołańcuchowe kwasy tłuszczowe4. In vitro otwarcie mtPTP można osiągnąć poprzez zwiększenie stężenia Ca2+ wewnątrz macierzy mitochondrialnej za pomocą egzogennego dodawania Ca2+ (pojemność zatrzymywania wapnia). Gdy poziomy Ca2+ w mitochondriach osiągną określony próg, mtPTP otwiera się, co ułatwia uwalnianie Ca2+, rozproszenie siły protonomotorycznej, zapadnięcie się potencjału błonowego oraz zwiększenie objętości macierzy mitochondrialnej (obrzęk), co w konsekwencji prowadzi do przerwania zewnętrznej błony mitochondrialnej i nieodwracalnej utraty funkcji organellum.
W niniejszym opracowaniu opisujemy test fluorometryczny, który umożliwia kompleksową charakterystykę otwierania mtPTP w izolowanych mitochondriach serca myszy. Test polega na jednoczesnym pomiarze 3 parametrów mitochondrialnych, które ulegają zmianie podczas otwierania mtPTP: gospodarki mitochondrialnej Ca2+ (wychwytu i uwalniania, mierzonego na podstawie stężenia Ca2+ w medium testowym), potencjału błony mitochondrialnej oraz objętości mitochondriów. Barwnikami zastosowanymi do pomiaru Ca2+ w medium testowym oraz potencjału błony mitochondrialnej są Fura FF, nieprzenikający przez błony ratiometryczny wskaźnik, u którego w obecności Ca2+ następuje przesunięcie długości fali wzbudzenia, oraz JC-1, kationowy wskaźnik ratiometryczny, który tworzy zielone monomery lub czerwone agregaty odpowiednio przy niskim i wysokim potencjale błonowym. Zmiany objętości mitochondriów mierzy się poprzez rejestrację rozpraszania światła przez zawiesinę mitochondrialną. Ponieważ do testu otwierania mtPTP wymagane są wysokiej jakości, funkcjonalne mitochondria, opisujemy również kroki niezbędne do uzyskania nienaruszonych, silnie sprzężonych i funkcjonalnych izolowanych mitochondriów serca.
Protokół
1. Izolacja mitochondriów z serca myszy
- Aby wyizolować mitochondria serca, znieczulić i uśmiercić myszy zgodnie z procedurami zatwierdzonymi przez lokalną Komisję ds. Dobrostanu i Opieki nad Zwierzętami (Institutional Animal Care and Use Committee).
Uwaga: Wszystkie kroki protokołu izolacji mitochondriów muszą być wykonywane w lodzie. Należy używać lodowatych buforów oraz schłodzonych wcześniej szalek Petriego, probówek Falcona i probówek Eppendorfa. Podane w protokole objętości dotyczą próbki zawierającej 2 serca mysie.
- Wyjąć serca, umieścić je w zimnym buforze do izolacj....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Przedstawiony tutaj protokół opisuje niezbędne kroki eksperymentalne służące do oceny otwierania porów przejścia przepuszczalności w izolowanych mitochondriach serca (Rysunek 1 oraz Rysunek 4): procedurę izolacji mitochondriów serca myszy, kontrole oddechowe zapewniające ich integralność i funkcjonalność, parametry mitochondrialne monitorowane podczas otwierania mtPTP oraz barwniki wykorzystywane do ich pomiaru, konfigurację aparatury spektrofluorometrycznej oraz charakterystykę otwieran.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Praca ta była wspierana przez grant HL094536 (B.J.H.).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Trypsyna | Sigma-Aldrich | T3030 | |
| Inhibitor trypsyny (sojowy) | Sigma-Aldrich | T9128 | |
| hydrosiarczyn sodu | Sigma-Aldrich | 71699 | |
| Rotenon | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Cytochrom c | Sigma-Aldrich | C7752 | |
| Alametycyna | Sigma-Aldrich | A4665 | |
| CCCP | Sigma-Aldrich | C2759 | |
| Cyklosporyna A | Calbiochem | 239835 | |
| Fura FF | Invitrogen | F14180 | |
| JC-1 | Invitrogen | T3168 | |
| Homogenizator tkanek Pottera-Elvehjema z teflonowym tłuczkiem 15 ml | Wheaton Industries | ||
| Mieszadło z napędem górnym | Wheaton Industries | 903475 | |
| Oxytherm (elektroda tlenowa z kontrolą temperatury) | Hansatech Instruments | ||
| Spektrofluorometr z podwójną emisją QuantaMaster 80 | Photon Technology International, Inc. |
Bibliografia
- Kroemer, G., Galluzzi, L., Brenner, C. Mitochondrial Membrane Permeabilization in Cell Death. Physiol. Rev. 87, 99-163 (2007).
- Elrod, J., Wong, R., Mishra, S., Vagnozzi, R. J., Sakthievel, B., Goonasekera, S. A., Karch, J., Gabel, S., Farber, J., Force, T., Brown, J. H., Murphy, E., Molkentin, J. D.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
