Wieloparametrowy pomiar przepuszczalności otworu porów przejściowych w izolowanych mitochondriach serca myszy

Summary

Protokół spektrofluorometryczny do pomiaru otwarcia porów przejściowych przepuszczalności mitochondriów w izolowanych mitochondriach serca myszy jest przedstawiony tutaj. Test polega na jednoczesnym pomiarze obsługi mitochondriów Ca²⁺, potencjału błony mitochondrialnej i objętości mitochondriów. Opisano również procedurę uzyskiwania wysokiej jakości i funkcjonalnych mitochondriów serca.

Abstract

Pory przejściowe przepuszczalności mitochondriów (mtPTP) to niespecyficzny kanał, który tworzy się w wewnętrznej błonie mitochondrialnej do transportu substancji rozpuszczonych o masie cząsteczkowej mniejszej niż 1,5 kDa. Chociaż ostateczna tożsamość molekularna porów jest nadal przedmiotem dyskusji, białka takie jak cyklofilina D, VDAC i ANT przyczyniają się do powstawania mtPTP. Podczas gdy udział otwarcia mtPTP w śmierci komórki jest dobrze znany¹, coraz więcej dowodów wskazuje, że mtPTP pełni rolę fizjologiczną podczas homeostazy mitochondrialnej Ca^{2 + 2}, bioenergetyki i sygnalizacji redoks ³.

mtPTP otwarcie jest wyzwalane przez matrycę Ca²⁺, ale jego aktywność może być modulowana przez kilka innych czynników, takich jak stres oksydacyjny, zubożenie nukleotydów adeninowych, wysokie stężenia Pi, depolaryzacja lub rozprzęganie błony mitochondrialnej oraz długołańcuchowe kwasy tłuszczowe⁴. In vitro otwarcie mtPTP można osiągnąć poprzez zwiększenie stężenia^Ca2+ wewnątrz macierzy mitochondrialnej poprzez egzogenne dodatki^Ca2+ (zdolność zatrzymywania wapnia). Gdy poziom Ca^{2 +} w mitochondriach osiąga pewien próg, mtPTP otwiera się i ułatwia uwalnianie Ca^{2 +}, rozpraszanie siły napędowej protonów, zapadanie się potencjału błonowego i wzrost objętości macierzy mitochondrialnej (obrzęk), co ostatecznie prowadzi do pęknięcia zewnętrznej błony mitochondrialnej i nieodwracalnej utraty funkcji organelli.

Tutaj opisujemy test fluorometryczny, który pozwala na kompleksową charakterystykę otwarcia mtPTP w izolowanych mitochondriach serca myszy. Test polega na jednoczesnym pomiarze 3 parametrów mitochondrialnych, które zmieniają się, gdy następuje otwarcie mtPTP: obsługa mitochondrialnego Ca²⁺ (wychwyt i uwalnianie, mierzone stężeniem Ca²⁺ w pożywce testowej), potencjał błony mitochondrialnej i objętość mitochondriów. Barwniki stosowane do pomiaru Ca²⁺ w pożywce testowej i mitochondrialnym potencjale błonowym to Fura FF, nieprzepuszczalny dla błony, wskaźnik ratiometryczny, który ulega przesunięciu długości fali wzbudzenia w obecności Ca²⁺ oraz JC-1, kationowy wskaźnik ratiometryczny, który tworzy zielone monomery lub czerwone agregaty o niskim i wysokim potencjale błonowym, odpowiednio. Zmiany objętości mitochondriów mierzy się, rejestrując rozpraszanie światła przez zawiesinę mitochondrialną. Ponieważ do testu otwarcia mtPTP wymagane są wysokiej jakości, funkcjonalne mitochondria, opisujemy również kroki niezbędne do uzyskania nienaruszonych, wysoce sprzężonych i funkcjonalnych izolowanych mitochondriów serca.

Protocol

1. Izolacja mitochondriów od serca myszy

1. Aby wyizolować mitochondria serca, znieczulenie i poświęcenie myszy zgodnie z procedurami zatwierdzonymi przez lokalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt.

Uwaga: Wszystkie etapy protokołu izolacji mitochondriów muszą być wykonywane na lodzie. Używaj lodowatych i wstępnie schłodzonych szalek Petriego, probówek Falcona i probówek Eppendorfa. Objętości podane w protokole dotyczą próbki zawierającej 2 serca myszy.

2. Wyjmij serca, umieść je w zimnym buforze do izolacji mitochondriów (300 mM sacharozy, 10 mM Na-HEPES, 200 μM EDTA, pH 7,4) i spłucz krew.

Uwaga: Aby uzyskać optymalne wyniki, pH mitochondrialnych powinno być dostosowane za pomocą KOH i kwasu octowego.

3. Ułóż serca na zimnej szalce Petriego, usuń tłuszcz i przedsionki i drobno zmiel za pomocą ostrza, aż uzyskasz jednorodny produkt.
4. Przenieść zmielone serca do 50 ml probówki Falcon, dodać 10 ml buforu do izolacji mitochondriów z 0,1 mg/ml trypsyny i pozostawić próbkę do trawienia na lodzie przez 10 minut.

Uwaga: Trypsyna podczas procedury izolacji zwiększa wydajność izolowanych mitochondriów i powinna być utrzymywana na stałym poziomie pomiędzy preparatami mitochondrialnymi. Zalecamy testowanie funkcji mitochondriów na preparatach wyizolowanych pod kątem braku trypsyny, aby upewnić się, że enzym nie zakłóca funkcjonalności.

5. Dodać 10 ml buforu izolacyjnego mitochondriów z 0,1% BSA wolnym od kwasów tłuszczowych i 5 mg inhibitora trypsyny (soja) i wymieszać, kilkakrotnie odwracając probówkę, aby zneutralizować trypsynę.

Uwaga: Bufor do izolacji mitochondriów może być przygotowany wcześniej i może być przechowywany w temperaturze -20 °C. Sprawdź pH po rozmrożeniu. Trypsyna, inhibitor trypsyny lub BSA muszą być dodane do buforu izolacyjnego mitochondriów w dniu eksperymentu.

6. Odzyskać strawioną tkankę przez wirowanie z niską lub średnią prędkością przez 1 minutę w temperaturze 4 °C.
7. Ponownie zawiesić tkankę w 8 ml buforu izolacyjnego mitochondriów z 0,1% BSA wolnym od kwasów tłuszczowych i homogenizować za pomocą zmotoryzowanego homogenizatora Dounce z tłuczkiem teflonowym (4-6 przejść przy 1,200-14,00 obr./min). Utrzymuj próbkę na lodzie podczas homogenizacji.
8. Przenieść homogenat do probówki Falcon o pojemności 15 ml i odwirować przy 800 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia jąder i resztek tkankowych.
9. Odzyskać supernatant zawierający mitochondria do probówek Eppendorfa i odwirować przy 8 000 x g przez 15 minut, w temperaturze 4 °C.
10. Ostrożnie usunąć górną białą warstwę i umyć pozostały ciemniejszy osad zawierający mitochondria w 1 ml buforu do izolacji mitochondriów.
11. Wirować przy 8000xg przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad mitochondriów w 150 μl mitochondrialnego buforu izolacyjnego. Utrzymuj mitochondria na lodzie do dalszych testów.

Uwaga: Aby uzyskać najlepsze wyniki podczas testów funkcjonalnych, użyj mitochondriów w ciągu 4 godzin od izolacji.

12. Określ ilościowo białko mitochondrialne za pomocą testu Bradforda.

2. Kontrola jakości izolowanych mitochondriów

2.1. Pomiar współczynnika kontroli oddechu (RCR)

1. Skalibruj elektrodę tlenową Oxytherm z wodą nasyconą powietrzem, aby ustalić maksymalną linię tlenową. Po uzyskaniu stabilnego poziomu tlenu dodać 100 μl świeżo przygotowanego 10 mM roztworu wodorosiarczynu sodu w celu ustalenia linii zerowej tlenu. Pomiary należy wykonywać w temperaturze 30 °C.
2. Dodać 2 ml buforu do oddychania mitochondriów (125 mM KCl, 20 mM HEPES, 3 mM MgCl₂, 400 μM EGTA, 300 μM DTT, 5 mM KH₂PO₄, pH 7,2) z 1 μM rotenonem do komory Oxytherm, uszczelnić komorę i rozpocząć nagrywanie.
3. Gdy sygnał tlenowy jest stabilny, dodaj 250 μg mitochondriów i rejestruj oddychanie podstawowe przez 1 minutę. Oddychanie w tym momencie powinno być bardzo niskie, ponieważ mitochondria oddychają na endogennych substratach (oddychanie stanu 1).
4. Dodaj 5 mM bursztynianu i nagrywaj sygnał przez 1 minutę. Zużycie tlenu powinno wzrosnąć podczas oddychania w stanie 2.
5. Wywołaj oddychanie w stanie 3, dodając 150 μM ADP. W tym momencie zużycie tlenu powinno wzrosnąć ze względu na syntezę ATP poprzez fosforylację oksydacyjną. Nagrywaj sygnał, aż oddech zwolni, wskazując zużycie ADP i przejście do stanu 4 oddychania. Rejestruj stan 4 oddychania przez co najmniej 1 minutę.
6. Dodaj 1 μM CCCP i nagrywaj sygnał przez 1 minutę. Oddychanie bez sprzęgania powinno być maksymalne.

Uwaga: Wpływ CCCP na oddychanie mitochondrialne jest zależny od dawki: wysokie stężenia CCCP mogą hamować zużycie tlenu i dlatego powinny być starannie miareczkowane.

7. Oblicz współczynnik kontroli oddechu (RCR), dzieląc wskaźnik zużycia tlenu podczas oddychania w stanie 3 przez wskaźnik zużycia tlenu podczas oddychania w stanie 4. Docelowy RCR powinien wynosić ≥ 4.

2.2. Ocena integralności błony mitochondrialnej (test cytochromu c)

1. Dokładnie umyj komorę Oxytherm 70% etanolem i wodą i powtórz kroki 2.1.2 -2.1.4.
2. Dodaj 1 mM ADP i rejestruj zużycie tlenu przez 1 minutę.
3. Dodać 10 μM cytochromu c. Ponieważ cytochrom c jest nieprzepuszczalny dla nienaruszonych błon mitochondrialnych, zwiększenie oddychania wskazuje na uszkodzone lub uszkodzone błony mitochondrialne.

3. Pomiar przepuszczalności mitochondriów i otwarcia porów przejściowych

1. Ustaw spektrofluorometr do wieloparametrowego pomiaru otwarcia mtPTP. Za pomocą programu FelixGx należy utworzyć nową konfigurację sprzętową (Quanta master steady state) składającą się ze źródła światła, monochromatora wzbudzenia, komory próbki i dwóch detektorów ustawionych pod kątem 90° i 270° w stosunku do monochromatora wzbudzenia (rys. 4). Aby osiągnąć maksymalną rozdzielczość czasową, oba monochromatory emisyjne (90° i 270°) muszą być wyłączone, a filtry emisyjne pod kątem 90° i 270° w komorze próbki muszą być włączone w menu konfiguracji sprzętowej. Ten krok usunie kontrolę silnika nad długościami fal emisji i ustawi każdy monochromator na określonej długości fali. Jeśli monochromatory emisyjne nie zostaną wyłączone, każdy detektor będzie przełączał się między obiema długościami fal i rejestrowane będą zduplikowane pomiary.
2. Utwórz nowy protokół akwizycji przy użyciu typu Multi Dye i wprowadź następujące barwniki:
   • Fura (wysoka Ca++): wzbudzenie 340 nm, emisja 525 nm (detektor 1)
   • Fura (low Ca++): wzbudzenie 380 nm, emisja 525 nm (detektor 1)
   • JC1 (agregat): wzbudzenie 543 nm, emisja 595 nm (detektor 2)
   • JC1 (monomer): wzbudzenie 498 nm, emisja 525 nm (detektor 1)
   • Pęcznienie: wzbudzenie 525 nm, emisja 525 nm (detektor 1)
3. Ustawić szczeliny wzbudzenia i emisji na 1 nm, a temperaturę na 37 °C.
4. Aby uzyskać sygnał ratiometryczny dla Fura i JC-1, należy wygenerować dwie pochodne ścieżki: Fura (wysoka Ca++)/Fura (niska Ca++) i JC1 (agregacja)/JC1 (monomer).
5. Ręcznie dostosuj długość fali emisji detektorów 1 i 2 odpowiednio do 525 nm i 595 nm.
6. Wymieszaj 1 ml buforu do oznaczania mitochondriów (120 mM KCl, 10 mM NaCl, 1 mM KH₂PO₄, 20 mM HEPES-Tris, pH 7,2) z 1 μM rotenonem, 5 mM bursztynianem i 800 nM Fura FF w jednorazowej 4-stronnej kuwecie z metakrylanu. Dodać 250 μg mitochondriów i umieścić próbkę w komorze na próbkę. Upewnij się, że mieszadło magnetyczne jest włączone.
7. Rozpocznij nagrywanie. Po 1 minucie wstrzymaj akwizycję, dodaj 500 nM JC-1, a następnie uruchom ponownie akwizycję. Sygnał stosunku JC-1 powinien wzrosnąć, co wskazuje na wychwyt barwnika przez aktywne mitochondria. Kontynuuj nagrywanie, aż sygnał JC-1 osiągnie plateau (zwykle w ciągu 5 minut).
8. Dodać 20 μM CaCl₂. Natychmiastowy wzrost sygnału stosunku Fura FF powinien być obserwowany przez zwiększoną obecność Ca^{2 +} w buforze testowym, po której następuje stopniowy spadek z powodu mitochondrialnego wychwytu Ca^{2 +}. Sygnał stosunku JC-1 powinien wykazywać krótki przejściowy spadek wskazujący na niewielką depolaryzację błony mitochondrialnej.
9. Poczekaj, aż sygnał stosunku Fura FF powróci do poziomu podstawowego przed dodaniem kolejnego impulsu CaCl₂ (1-1,5 min). Kontynuuj pulsowanie w ustalonych odstępach czasu, aż mitochondria nie będą w stanie zgromadzić Ca²⁺ i zaczną uwalniać Ca²⁺ do buforu testowego. Otwarcie mtPTP jest wizualizowane przez jednoczesny wzrost sygnału stosunku Fura FF spowodowany uwolnieniem Ca^{2 +}, spadek stosunku sygnału JC-1 z powodu załamania się potencjału błony i spadek rozpraszania światła z powodu obrzęku mitochondriów (ryc. 5).
10. Po aktywacji mtPTP należy sprawdzić swoistość sygnałów Fura FF, JC-1 i pęcznienia odpowiednio za pomocą 1 mM EGTA, 1 μM CCCP i 5 μg/ml alatetycyny.
11. Aby sprawdzić swoistość otwarcia mtPTP, powtórz kroki 3.6 - 3.9 w obecności 1 μM inhibitora cyklofiliny D cyklosporyny A (cyklofilina D jest składnikiem mtPTP). W obecności cyklosporyny A otwarcie mtPTP wymaga znacznie więcej impulsów CaCl₂ niż w próbkach kontrolnych (ryc. 6).

4. Reprezentatywne wyniki

Rysunek 2 pokazuje typową kontrolę oddechową izolowanych mitochondriów serca myszy. Oddychanie w stanie 3 osiąga się poprzez dodanie ADP do mitochondriów oddychających na bursztynianie i charakteryzuje się znacznie zwiększonym zużyciem tlenu w stosunku do samego substratu. Wyczerpanie dodanego ADP inicjuje oddychanie w stanie 4, podczas którego zużycie tlenu zwalnia i jest porównywalne z szybkościami osiąganymi przed dodaniem ADP. RCR uzyskuje się, dzieląc wskaźnik zużycia tlenu dla oddychania w stanie 3 przez wskaźnik oddychania w stanie 4. Test cytochromu c służy do oceny integralności zewnętrznej błony mitochondrialnej: gdy cytochrom c jest dodawany do mitochondriów oddychających na bursztynianach i ADP, nie obserwuje się dalszego wzrostu oddychania, co wskazuje na nienaruszone zewnętrzne błony mitochondrialne (ryc. 3).

Reprezentatywny obraz dla otwarcia mtPTP w izolowanych mitochondriach serca jest pokazany na rysunku 4. W tym przypadku otwarcie mtPTP zostało wywołane przez dodanie 4 impulsów CaCl₂ (po 20 μM każdy) w odstępach 1,5 minuty. Otwarcie mtPTP jest widoczne przez prawie równoczesne uwolnienie mitochondrialnego Ca^{2 +} (wzrost sygnału Fura FF ratio), załamanie się potencjału błony mitochondrialnej (spadek sygnału stosunku JC-1) i zwiększenie objętości mitochondriów (zmniejszenie sygnału obrzęku). Po dodaniu cyklosporyny A, która wiąże się ze składnikiem cyklofiliny D mtPTP, otwarcie mtPTP wymaga 7 impulsów CaCl₂ zamiast 4 (ryc. 5).

Rysunek 1. Schemat blokowy wieloparametrowego protokołu otwierania porów przejściowych przepuszczalności mitochondriów dla izolowanych mitochondriów serca. Serce jest zbierane od myszy, a mitochondria są izolowane przez wirowanie różnicowe. Preparat mitochondrialny jest następnie oceniany jakościowo za pomocą polarograficznego pomiaru współczynnika kontroli oddechowej i nienaruszonego błony mitochondrialnej w obecności cytochromu c. Przepuszczalność mitochondriów, przejście otwarcia porów w izolowanych mitochondriach jest wyzwalane przez sekwencyjne dodatki CaCl₂ i jest mierzone za pomocą spektrofluorometru, monitorując uwalnianie Ca^{2 +} z mitochondriów, zapadanie się potencjału błonowego i obrzęk macierzy mitochondrialnej.

Rysunek 2. Pomiar współczynnika kontroli oddechowej (RCR) izolowanych mitochondriów serca. Zużycie tlenu przez izolowane mitochondria serca mierzy się podczas oddychania w stanie 3 w obecności bursztynianu i ADP oraz podczas oddychania w stanie 4 po spożyciu ADP. Odpowiedź izolowanych mitochondriów na rozprzęgacze mierzy się przez dodanie CCCP. Liczby na wykresie to wskaźniki zużycia tlenu przez izolowane mitochondria w nmol/min/mg białka.

Rysunek 3. Pomiar integralności błony izolowanych mitochondriów serca. Integralność błony mitochondrialnej określa się poprzez pomiar zużycia tlenu w izolowanych mitochondriach w obecności bursztynianu i ADP oraz po dodaniu cytochromu c. Liczby na wykresie to wskaźniki zużycia tlenu przez izolowane mitochondria w nmol/min/mg białka.

Rysunek 4. Konfiguracja sprzętowa spektrofluorometru do wieloparametrowego pomiaru otwarcia mtPTP. Konfiguracja sprzętowa spektrofluorometru obejmuje źródło światła, monochromator wzbudzenia, komorę próbki i dwa detektory o stałych długościach fal emisji przy 525 nm i 595 nm. Detektor 1 służy do wykrywania sygnału Fura FF o wysokim i niskim poziomie Ca²⁺, monomeru JC-1 oraz sygnału pęcznienia. Detektor 2 mierzy zagregowany sygnał JC-1.

Rysunek 5. Wieloparametrowy pomiar otwarcia mtPTP w izolowanych mitochondriach serca. Otwarcie mtPTP było wyzwalane przez sekwencyjne dodawanie 20 μM CaCl₂ i charakteryzowało się uwalnianiem Ca^{2 +} z mitochondriów, zapadaniem się potencjału błony mitochondrialnej i zwiększoną objętością macierzy mitochondrialnej (obrzękiem). Pozamitochondrialny Ca²⁺ i potencjał błonowy mierzono za pomocą wskaźników ratiometrycznych Fura FF (ślad zielony) i JC-1 (ślad czerwony). Pęcznienie mitochondriów mierzono poprzez rejestrację rozpraszania światła przy długości fali 525 nm (ślad). Swoistość sygnałów JC-1 i pęcznienia badano za pomocą 1 μM CCCP i 5 μg/ml alametycyny (toksyny mikrobiologicznej).

Rysunek 6. Wieloparametrowy pomiar otwarcia mtPTP w izolowanych mitochondriach serca w obecności cyklosporyny A. Cyklosporyna A (1 μM) zwiększa liczbę impulsów CaCl₂ wymaganych do otwarcia mtPTP w izolowanych mitochondriach serca.

Discussion

Przedstawiony tutaj protokół opisuje niezbędne kroki eksperymentalne w celu oceny przepuszczalności otworu porów przejściowych w izolowanych mitochondriach serca (ryc. 1 i ryc. 4): procedura izolowania mitochondriów serca myszy, mechanizmy kontroli układu oddechowego, które zapewniają ich integralność i funkcjonalność, parametry mitochondrialne monitorowane podczas otwierania mtPTP oraz barwniki stosowane do ich pomiaru, ustawienie oprzyrządowania spektrofluorometrycznego, oraz charakte...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Trypsyna	Sigma-Aldrich	T3030
Inhibitor trypsyny (soja)	Sigma-Aldrich	T9128
Wodorosiarczyn sodu	Sigma-Aldrich	71699
Rotenon	Sigma-Aldrich	R8875
Cytochrom c	Sigma-Aldrich	C7752
Alametycyna	Sigma-Aldrich	A4665
CCCP	Sigma-Aldrich	C2759
Cyclosporin A	Calbiochem	239835
Fura FF	Invitrogen	F14180
JC-1	Invitrogen	T3168
Młynek do tkanek Potter-Elvehjem z tłuczkiem teflonowym 15 ml	Mieszadło górne Wheaton Industries
	Wheaton Industries	903475
Oxytherm (elektroda tlenowa z kontrolowaną temperaturą)	Hansatech Instruments
Spektrofluorometr z podwójną emisją QuantaMaster 80	Photon Technology International, Inc.