Opisano model in vitro do badań genetycznych nad regeneracją aksonów z wykorzystaniem hodowli neuronów z zwojów korzeni grzbietowych dorosłych myszy. Metoda obejmuje etap resuspensji i ponownego wysiewu, aby umożliwić ponowny wzrost aksonów z neuronów poddanych manipulacjom genetycznym. Podejście to jest szczególnie przydatne w badaniach nad utratą funkcji w procesie regeneracji aksonów z wykorzystaniem wyciszania ekspresji białek opartego na RNAi.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Genetyczne badanie regeneracji aksonów w hodowlach neuronów z dorosłych zwojów korzeni grzbietowych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Powszechnie wiadomo, że dojrzałe neurony w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) nie potrafią regenerować swoich aksonów po urazach ze względu na osłabioną wewnętrzną zdolność do wspierania wzrostu aksonów oraz wrogie środowisko w dojrzałym OUN1,2. W przeciwieństwie do nich, dojrzałe neurony w obwodowym układzie nerwowym (OUN) regenerują się łatwo po urazach3. Wiadomo, że neurony zwojów korzeni grzbietowych (DRG) u osobników dorosłych wykazują silną regenerację po urazach nerwów obwodowych. Każdy neuron DRG wypuszcza z somy jeden akson, który rozgałęzia się na dwie odnogi: obwodową, unerwiającą cele obwodowe, oraz centralną, biegnącą do rdzenia kręgowego. Uraz obwodowych aksonów DRG prowadzi do znaczącej regeneracji aksonów, podczas gdy aksony centralne w rdzeniu kręgowym regenerują się słabo po urazie. Jednakże, jeśli uraz aksonu obwodowego wystąpi przed urazem rdzenia kręgowego (proces ten nazywany jest uszkodzeniem kondycjonującym), regeneracja aksonów centralnych ulega znacznej poprawie4. Co więcej, aksony centralne neuronów DRG dzielą to samo wrogie środowisko co zstępujące aksony korowo-rdzeniowe w rdzeniu kręgowym. W związku z tym postawiono hipotezę, że mechanizmy molekularne kontrolujące regenerację aksonów u dorosłych neuronów DRG mogą zostać wykorzystane do wzmocnienia regeneracji aksonów w OUN. W rezultacie neurony DRG u osobników dorosłych są obecnie powszechnie wykorzystywane jako system modelowy do badania regeneracyjnego wzrostu aksonów5-7.
W niniejszej pracy opisujemy metodę hodowli dorosłych neuronów z zwojów korzeni grzbietowych (DRG), która może być wykorzystana do badań genetycznych nad regeneracją aksonów in vitro. W tym modelu dorosłe neurony DRG są modyfikowane genetycznie za pomocą transfekcji genów indukowanej elektroporacją6,8. Dzięki transfekcji neuronów plazmidowym DNA lub si/shRNA podejście to umożliwia przeprowadzanie eksperymentów typu gain-of-function oraz loss-of-function w celu zbadania roli dowolnego genu w obrębie wzrostu aksonów z dorosłych neuronów DRG. W przypadku transfekcji neuronów si/shRNA, docelowe białko endogenne jest zazwyczaj wyczerpywane po 3-4 dniach hodowli, podczas których następuje już intensywny wzrost aksonów, co obniża skuteczność badań typu loss-of-function. Aby rozwiązać ten problem, opisana tutaj metoda obejmuje etap resuspensji i ponownego wysiewania po transfekcji, co pozwala aksonom na ponowny wzrost z neuronów w nieobecności docelowego białka. Na koniec przedstawiamy przykład wykorzystania tego modelu in vitro do zbadania roli genu związanego z regeneracją aksonów, c-Jun, w pośredniczeniu wzrostu aksonów z dorosłych neuronów DRG9.
Protokół
1. Przygotowanie szkiełek nakrywkowych, pożywki hodowlanej i enzymów trawiennych
- Do hodowli neuronów wykorzystuje się okrągłe szklane laski przykrywkowe nr 1 o średnicy 12 mm. Przykrywki są czyszczone w 10% HCl przez całą noc, a następnie poddawane trzykrotnemu myciu ultradźwiękowemu w wodzie destylowanej i dejonizowanej (po 20 min każdy cykl). Oczyszczone laski przykrywkowe są przechowywane w 70% etanolu do późniejszego użycia. Przed każdym doświadczeniem laski przykrywkowe są suszone na powietrzu i umieszczane w płytce hodowlanej.
- W celu powlekania wysuszonych lasek przykrywkowych, na każdą z nich nanosi się 100 μl roztworu powlekającego zawierającego 100 μg/ml Poly-D-Lysine oraz 10 μg/ml roztworu roboczego lamininy, a płytkę hodowlaną przenosi się do inkubatora w temperaturze 37 °C. Po 1-2 godz. roztwór powlekający jest usuwany, a laski przykrywkowe są płukane 3 razy sterylnym 1X PBS.
- W celu przygotowania pożywki hodowlanej, do Minimum Essential Medium (MEM) dodaje się 5% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 1X roztwór penicyliny i streptomycyny (500 jednostek penicyliny i 500 μg streptomycyny), 1X suplement GlutaMAX-I oraz odczynniki antymitotyczne zawierające 20 μM 5-fluoro-2-deoxyuridine i 20 μM uridine (FDU/R). W przypadku pożywki bezsurowiczej, FBS zastępuje się suplementem B27.
- Roztwór kolagenazy A przygotowuje się poprzez rozpuszczenie proszku kolagenazy A w MEM do uzyskania stężenia roboczego 1 mg/ml. W przypadku trypsyny stosuje się 1X TrypLE Express.
2. Disekcja i pobieranie neuronów z zwojów korzeni grzbietowych (DRG) dorosłej myszy
- Po uśmierceniu dorosłej myszy w wieku od 6 do 10 tygodni, usuń skórę grzbietową i wytnij cały kręgosłup. Przemyj usunięty kręgosłup 2-3 razy w 1 X PBS.
- Przymocuj usunięty kręgosłup szpilkami do płytki sekcyjnej stroną brzuszną do góry, a następnie pod mikroskopem sekcyjnym ostrożnie usuń mięśnie, aby odsłonić nerwy czuciowe. Nerwy połączone z zwojami korzeni grzbietowych (DRG) na poziomie lędźwiowym są najgrubsze i najłatwiejsze do zlokalizowania. Dlatego w większości eksperymentów pobiera się tylko lędźwiowe DRG.
- Przetnij każdy kręg wzdłuż linii środkowej małymi nożyczkami i ostrożnie usuń krążki międzykręgowe. Używając pęsety, rozdziel każdy kręg, aby odsłonić rdzeń kręgowy.
- Aby wypreparować lędźwiowe DRG, unieś każdą lędźwiową strukturę nerwową pęsetą i podążaj w kierunku rdzenia kręgowego, aby zlokalizować powiązane lędźwiowe DRG (od L1 do L6).
- Odetnij każde DRG od przyłączonego nerwu obwodowego oraz korzeni grzbietowych i brzusznych za pomocą nożyczek sprężynowych, a następnie umieść je w probówce do mikrocentryfugi z medium MEM, trzymanej na lodzie. W razie potrzeby w podobny sposób można wypreparować więcej DRG z różnych poziomów kręgosłupa (np. piersiowe DRG).
3. Trawienie i dysocjacja neuronów z zwojów korzeni grzbietowych (DRG) dorosłej myszy
- Po zebraniu wszystkich wypreparowanych zwojów korzeni grzbietowych (DRG), zastąp pożywkę MEM 1 ml roztworu kolagenazy A i inkubuj probówkę wirówkową w temperaturze 37 °C przez 90 min.
- Zastąp roztwór kolagenazy A 500 μl 1X roztworu TrypLE Express i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 15-20 min.
- Usuń roztwór TrypLE Express i przemyj DRG 1 ml przygotowanej pożywki hodowlanej (zawierającej 5% FBS), powtarzając czynność 3 razy.
- Dodaj 600 μl pożywki hodowlanej i delikatnie pipetuj w górę i w dół, aby rozbić tkanki poprzez triturację 20-30 razy, używając niebieskiego, graduowanego końcówki do pipety o objętości 1 ml.
- Po trituracji poczekaj, aż niedysocjowane tkanki opadną na dno probówki wirówkowej, a następnie przenieś zawiesinę komórkową do sterylnej probówki o pojemności 10 ml. Dodaj kolejne 600 μl pożywki hodowlanej i powtarzaj etap trituracji, aż większość tkanek zostanie zdysocjowana. Otrzymana zawiesina komórkowa zawiera zarówno neurony, jak i komórki nieneuronalne. W większości przypadków komórki z 6 DRG (~5 x104) są wykorzystywane do jednej reakcji elektroporacji.
4. Manipulacja genetyczna neuronów za pomocą elektroporacji
- Przygotować roztwór do transfekcji, mieszając roztwór do nukleofekcji Amaxa dla neuronów mysich z plazmidami DNA (~10 μg) lub oligonukleotydami siRNA (~0,2 nmol), aby uzyskać końcową objętość 100 μl na każdą transfekcję.
- Odwirować zdysocjowane komórki przy 680 rpm przez 7 min w temperaturze pokojowej i w możliwie największym stopniu usunąć supernatant. Dodać przygotowany roztwór do transfekcji i delikatnie pipetować w górę i w dół 3-4 razy za pomocą końcówek do pipety 200 μl, aby resuspenderć komórki.
- Przenieść zawiesinę komórkową zmieszaną z roztworem do transfekcji do kuwety do elektroporacji i poddać komórki elektroporacji, korzystając z programu G-013 systemu Amaxa Nucleofector.
- Bezpośrednio po elektroporacji dodać do kuwety 500 μl uprzednio ogrzanej (37 °C) pożywki hodowlanej zawierającej FBS i przenieść cały roztwór (~600 μl) na powlekaną płytkę hodowlaną w pożądanej gęstości komórek. W przypadku eksperymentów wymagających resuspensji i ponownego wysiewania, neurony hoduje się bezpośrednio na plastikowej płytce hodowlanej w wysokiej gęstości (10000-20000 komórek/studnia). W przypadku eksperymentów bezpośrednio badających wzrost aksonów, neurony wysiewa się na powlekane szklane nakryweczki w niższej gęstości (3000-5000 komórek/studnia). Umieścić płytkę hodowlaną w inkubatorze (37 °C, 5% CO2).
- Cztery godziny po wysianiu, gdy neurony przywrą do podłoża, delikatnie wymienić pożywkę hodowlaną (zawierającą roztwór do nukleofekcji Amaxa) na 500 μl świeżej i uprzednio ogrzanej pożywki hodowlanej i zwrócić płytkę do inkubatora w celu dalszej hodowli (37 °C, 5% CO2). Na tym etapie można zastosować zarówno pożywkę hodowlaną z FBS, jak i pożywkę bezzużytkową (wolną od surowicy).
5. Hodowla dorosłych neuronów z zwojów korzeni grzbietowych (DRG) do analizy wzrostu aksonów
- W przypadku neuronów przetransfekowanych plazmidami DNA ekspresję genu zainteresowania (np. EGFP) można zaobserwować już kilka godzin po elektroporacji. W przypadku neuronów przetransfekowanych siRNA zazwyczaj oczekujemy 3-4 dni, aby umożliwić wystarczające wyczerpanie endogennych białek. Hodowane neurony można albo bezpośrednio utrwalić w celu analizy wzrostu aksonów w różnych punktach czasowych (1-4 dni po elektroporacji), albo ponownie zawiesić i wysiać w celu analizy odrostu aksonów (patrz poniżej).
- W badaniach utraty funkcji pośredniczonej przez RNAi hodowane neurony można ponownie zawiesić i wysiać, aby umożliwić odrost aksonów z neuronów, w których docelowe białka są już wyczerpane. W tym celu należy zastąpić starą pożywkę hodowlaną neuronów o wysokiej gęstości 1 ml uprzednio ogrzanej świeżej pożywki i delikatnie pipetować w górę i w dół 6-10 razy, aby odseparować przytwierdzone neurony od płytki hodowlanej. Ponieważ komórki nieneuronalne (np. komórki Schwanna) przylegają do naczynia hodowlanego znacznie mocniej niż neurony, zawiesina komórek składa się głównie z neuronów.
- Przenieś zawiesinę neuronów do probówki do mikrowirówki i delikatnie trituruj 10-15 razy, aby rozbić skupiska komórek do postaci zawiesiny pojedynczych komórek.
- Ponownie wysiej rozdzielone neurony na nowo przygotowane szkiełka nakrywkowe przy niskiej gęstości (3000-5000 cells/well) i hoduj przez noc (16-24 hr).
6. Fixacja, immunobarwienie i obrazowanie fluorescencyjne
- Odssać medium i dodać 4% paraformaldehyd (PFA) (200 μl/dołek), aby utrwalić komórki przez 15-20 min w temperaturze pokojowej. Utrwalone komórki należy następnie przemyć 1X PBS trzy razy.
- Odssać PBS i dodać roztwór blokujący (1% albuminy surowicy wołowej, 0,1% Triton X-100 oraz 2,0% normalnej surowicy koziej w 1X PBS) do utrwalonych neuronów na 60 min w temperaturze pokojowej.
- Aby znakować aksony, neurony poddaje się immunobarwieniu przeciwciałami anty-neurofilamentowymi lub anty-βIII tubuliną. W tym celu na parafilmie należy umieścić kroplę 30 μl roztworu przeciwciała pierwszorzędowego (rozcieńczenie 1:1200 dla przeciwciała anty-βIII tubulinę) dla każdego szkiełka nakrywkowego. Odwrócić szkiełka nakrywkowe i położyć je na roztworze przeciwciał pierwszorzędowych na 60 min w temperaturze pokojowej.
- Przenieść szkiełka nakrywkowe z powrotem do oryginalnej płytki hodowlanej i przemyć je 1X PBS trzy razy.
- Powtórzyć tę samą procedurę dla przeciwciał wtórnych.
- Przemyć szkiełka nakrywkowe wodą destylowaną trzy razy, a następnie zamontować je na szkiełkach przedmiotowych przy użyciu medium montażowego (np. ProLong Gold Antifade).
- Zbarwione neurony można obrazować za pomocą dowolnego systemu mikroskopii fluorescencyjnej wyposażonego w kamerę cyfrową. Długości aksonów mierzy się i analizuje za pomocą oprogramowania do analizy obrazu.
7. Reprezentatywne wyniki
W przypadku braku dodatkowych czynników wzrostu zewnątrzkomórkowych, neurony z dorosłych zwojów korzeni grzbietowych (DRG) zazwyczaj zaczynają rozwijać aksony 48 h po pierwszym wysianiu. Aksony te często wykazują morfologię rozgałęzioną (Rysunek 1). W przeciwieństwie do nich, neurony przesiane zaczynają wydłużać aksony zaledwie kilka godzin po wysianiu, a aksony te wydłużają się przy znacznie mniejszym stopniu rozgałęzienia (Rysunek 2). Wyniki te sugerują, że neurony przesiane wykazują właściwości podobne do neuronów po uszkodzeniu poddanych kondycjonowaniu. Wykorzystując to podejście, przeprowadziliśmy niedawno badania utraty funkcji, aby zbadać rolę czynnika transkrypcyjnego c-Jun, powiązanego z regeneracją aksonów, w wzroście aksonów z dorosłych neuronów DRG in vitro. Wyniki wykazały, że elektroporacja grupy 4 różnych siRNA nakierowanych na różne regiony c-Jun (ON-TARGETplus) znacznie obniżyła poziom białka c-Jun w dorosłych neuronach DRG 3 dni po transfekcji (Rysunek 3)9. Po przesianiu neuronów i ich hodowli przez noc, wzrost aksonów z neuronów z wyciszonym c-Jun był znacznie zredukowany (Kontrola: 348,37± 16,21mm; si-c-Jun: 262,32±15,69 μm, Rysunek 3)9. Wyniki te wskazują, że hodowlane dorosłe neurony DRG stanowią użyteczny model badawczy do analizy wzrostu aksonów z dorosłych neuronów.
Rycina 1. Neurony z zwojów korzeni grzbietowych (DRG) dorosłej myszy hodowane przy niskiej gęstości przez 3 dni. Neurony zabarwiono przeciwciałem anty--βIII tubulinie. Zauważ, że większość aksonów wykazuje morfologię rozgałęzioną. Pasek skali: 125 μm.
Rycina 2. Ponowny wysiew neuronów z zwojów korzeni grzbietowych (DRG) dorosłej myszy po 3 dniach hodowli. (A) Neurony DRG dorosłego zwierzęcia hodowane w wysokiej gęstości przez 3 dni. (B) Ponownie wysiane neurony DRG hodowane w niskiej gęstości przez noc. Zauważalna jest wydłużona morfologia większości aksonów przy niewielkim stopniu ich rozgałęzienia. Pasek skali: 250 μm w A i 125 μm w B.
Rysunek 3. Rola c-Jun wyroście aksonów z neuronów zwojów korzeni grzbietowych (DRG) dorosłych osobników in vitro. (A) Analiza Western blot białka c-Jun w neuronach DRG dorosłych myszy po elektroporacji siRNA przeciwko c-Jun. Wynik wykazuje znaczny spadek poziomu c-Jun. (B) Neurony kontrolne przetransfekowane EGFP wytworzyły długie aksony po ponownym wysianiu i nocnej hodowli. (C) Współtransfekcja siRNA przeciwko c-Jun oraz EGFP upośledziła wzrost aksonów z neuronów DRG dorosłych osobników po ponownym wysianiu i nocnej hodowli. Kolor czerwony: barwienie Tuj-1; kolor zielony: EGFP. Pasek skali: 125 μm. Wyniki te zostały opublikowane w pracy Saijilafu i wsp.9.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Dojrzałe neurony zzębów korzeniowych tylnych (DRG) wykazują silną zdolność do regeneracji aksonów po uszkodzeniu nerwów obwodowych in vivo oraz in vitro, stanowiąc tym samym użyteczny system do badania regeneracji aksonów u dorosłych zwierząt. Hodowla dojrzałych neuronów DRG in vitro staje się powszechnie stosowaną metodą badania mechanizmów molekularnych regulujących regenerację aksonów. Przedstawiona tutaj procedura hodowli dojrzałych mysich neuronów DRG in vitro umożliwia szybkie i ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Praca ta została sfinansowana z grantów przyznanych F. Z. przez NIH (R01NS064288) oraz Craig H. Neilsen Foundation.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| MEM | Invitrogen | 11090-081 | |
| Hydrobromian poli-D-lizyny | Sigma-Aldrich | P6407 | |
| Laminina | Invitrogen | 23017-015 | |
| 5-fluoro-2-deoksyurydyna | Sigma-Aldrich | F0503 | |
| Urydyna | Sigma-Aldrich | U3003 | |
| Kollagenaza A | Roche | 10103578001 | |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604-013 | |
| Płodowa surowica bydlęca | Invitrogen | 10270-098 | |
| Penicylina-streptomycyna (100X) | Invitrogen | 15140-122 | |
| GlutaMAX-I (100X) | Invitrogen | 35050-038 | |
| Szkiełka nakrywkowe (#1) | Nauki o mikroskopii elektronowej | 72196-12 | |
| płytka do hodowli komórkowej 24-dołkowa | Becton Dickinson | 35-3047 | |
| 1X PBS | Mediatech | 21-040-CV | |
| Woda sterylna, destylowana i dejonizowana | Mediatech | 25-055-CV | |
| Zestawy do nukleofekcji i elektroporacji neuronów mysich | Lonza | VPG-1001 | |
| ON-TARGETplus siRNA przeciwko c-Jun | Dharmacon | L-043776 | |
| Przeciw-βprzeciwciało przeciwko tubulinie III (Tuj-1) | Covance | MMS-435P | |
| roztwór montażowy przeciwwyblakający ProLong Gold Antifade | Invitrogen | P36930 |
Bibliografia
- Yiu, G., He, Z. Glial inhibition of CNS axon regeneration. Nat. Rev. Neurosci. 7, 617-627 (2006).
- Liu, K., Tedeschi, A., Park, K. K., He, Z. Neuronal Intrinsic Mechanisms of Axon Regeneration. Annu. Rev. Neurosci. , (2010).
- Zhou, F. Q., Snider, W. D. Intracellular control of developmental and regenerative axon growth. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 361, 1575-1592 (2006).
- Neumann, S., Woolf, C. J. Regeneration of dorsal column fibers into and beyond the lesion site following adult spinal cord injury. Neuron. 23, 83-91 (1999).
- Liu, R. Y., Snider, W. D. Different signaling pathways mediate regenerative versus developmental sensory axon growth. J. Neurosci. 21, RC164(2001).
- Zhou, F. Q. Neurotrophins support regenerative axon assembly over CSPGs by an ECM-integrin-independent mechanism. J. Cell Sci. 119, 2787-2796 (2006).
- Zou, H., Ho, C., Wong, K., Tessier-Lavigne, M. Axotomy-induced Smad1 activation promotes axonal growth in adult sensory neurons. J. Neurosci. 29, 7116-7123 (2009).
- Zhou, F. Q., Zhou, J., Dedhar, S., Wu, Y. H., Snider, W. D. NGF-induced axon growth is mediated by localized inactivation of GSK-3beta and functions of the microtubule plus end binding protein APC. Neuron. 42, 897-912 (2004).
- Saijilafu,, Hur, E. M., Zhou, F. Q. Genetic dissection of axon regeneration via in vivo electroporation of adult mouse sensory neurons. Nat. Commun. 2, 543-54 (2011).
- Costigan, M. Replicate high-density rat genome oligonucleotide microarrays reveal hundreds of regulated genes in the dorsal root ganglion after peripheral nerve injury. BMC Neurosci. 3, 16(2002).
- Xiao, H. S. Identification of gene expression profile of dorsal root ganglion in the rat peripheral axotomy model of neuropathic pain. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 8360-8365 (2002).
- Michaelevski, I. Signaling to transcription networks in the neuronal retrograde injury response. Sci. Signal. 3, ra53(2010).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
